Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidig vurdering av slektskap, divisjonsnummer og fenotype via flowcytometri for hematopoietiske stam- og stamceller

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64918
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 1, 2, 1
1Quantitative Immuno-hematology, CNRS UMR168, Institut Curie, 2Hamilton Institute, Maynooth University, 3Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3348, Orsay, 4Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, CNRS UMR 3348, Orsay

Summary

Her presenteres en flowcytometribasert teknikk som gjør det mulig å måle antall celledelinger, overflatecellefenotype og cellulær slektskap samtidig. Disse egenskapene kan testes statistisk ved hjelp av et permutasjonsbasert rammeverk.

Abstract

Få teknikker kan vurdere fenotype og skjebne for samme celle samtidig. De fleste av de nåværende protokollene som brukes til å karakterisere fenotype, selv om de er i stand til å generere store datasett, nødvendiggjør ødeleggelsen av cellen av interesse, noe som gjør det umulig å vurdere dens funksjonelle skjebne. Heterogene biologiske differensieringssystemer som hematopoiese er derfor vanskelig å beskrive. Ved å bygge på celledelingssporingsfargestoffer, videreutviklet vi en protokoll for samtidig å bestemme slektskap, divisjonsnummer og differensieringsstatus for mange enkelt hematopoietiske forfedre. Denne protokollen tillater vurdering av ex vivo differensieringspotensialet for murine og humane hematopoietiske progenitorer, isolert fra forskjellige biologiske kilder. Dessuten, siden den er basert på flowcytometri og et begrenset antall reagenser, kan den raskt generere en stor mengde data, på encellenivå, på en relativt billig måte. Vi tilbyr også den analytiske pipelinen for enkeltcelleanalyse, kombinert med et robust statistisk rammeverk. Siden denne protokollen tillater kobling av celledeling og differensiering på enkeltcellenivå, kan den brukes til kvantitativt å vurdere symmetrisk og asymmetrisk skjebneforpliktelse, balansen mellom selvfornyelse og differensiering, og antall divisjoner for en gitt forpliktelsesskjebne. Til sammen kan denne protokollen brukes i eksperimentelle design som tar sikte på å løse de biologiske forskjellene mellom hematopoietiske forfedre, fra et enkeltcelleperspektiv.

Introduction

Det siste tiåret ble preget av den verdensomspennende spredningen av enkeltcellede tilnærminger til cellulær og molekylærbiologi. Etter å ha fulgt i trinnene til enkeltcellegenomikk1,2, er det i dag mulig å studere mange komponenter i en enkelt celle (f.eks. DNA, RNA, proteiner), med nye enkeltcelle-omics-teknikker som spirer hvert år. Disse teknikkene har kastet lys over gamle og nye spørsmål for feltene immunologi, nevrobiologi, onkologi og andre, både ved hjelp av menneskelige og modellorganismeceller3. Ved å fremheve forskjellene mellom individuelle celler, førte enkeltcelle-omics til definisjonen av en ny modell for hematopoiesis, sentrert på heterogeniteten til hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCs) og beveget seg bort fra den klassiske modellen for diskrete homogene populasjoner 4,5.

En av de få ulempene ved alle -omics-teknikkene er ødeleggelsen av cellen av interesse, og utelukker muligheten til å vurdere funksjonaliteten. Omvendt gir andre enkeltcellemetoder, som enkeltcelletransplantasjonsanalyse og avstamningssporingsteknologier, en avlesning av funksjonaliteten til forfedrecellen ved å vurdere skjebnen til individuelle celler in vivo 6,7. Avstamningssporingsteknologier innebærer å merke cellen av interesse med en arvelig genetisk7 eller en fluorescerende etikett8,9, slik at skjebnen til flere enkeltceller kan følges samtidig. Imidlertid er karakteriseringen av startcellene vanligvis begrenset til et begrenset antall parametere, for eksempel ekspresjonen av noen få overflateproteiner vurdert ved flowcytometri10. I tillegg krever enkeltcellede avstamningssporingsteknologier møysommelig deteksjon av den cellulære etiketten, vanligvis via DNA / RNA-sekvensering eller bildebehandling. Dette siste punktet begrenser spesielt antall forhold som kan testes i et enkelt eksperiment.

En annen klasse av metoder som brukes til å studere funksjonaliteten til enkeltceller er ex vivo celledyrkingssystemer av enkle HSPCer. Disse gullstandardanalysene er enkle å utføre, og involverer sortering av individuelle celler i cellekulturbeholdere med 96 brønner, og etter kultur karakteriserer celleavkomfenotypen, vanligvis ved flowcytometri eller morfologisk analyse. Disse analysene har for det meste blitt brukt til å karakterisere den langsiktige differensieringen av HSPCer i modne celler, vanligvis etter 2-3 uker med kultur11,12. Alternativt har de blitt brukt til å forsøke å opprettholde og utvide ex vivo HSPCs 13,14,15,16,17,18, med løfte om medisinsk fordel for human stamcelletransplantasjon 19. Til slutt har de blitt brukt til å studere HSPCs tidlige engasjement ved bruk av kortsiktig kultur20, med det lave antallet celler generert i denne kulturen som den viktigste begrensende faktoren. En ulempe med disse forskjellige typer ex vivo-analyser er at de bare delvis reflekterer in vivo-kompleksiteten; Likevel er de en av de sjeldne måtene å studere menneskelig HSPC-differensiering på.

En manglende informasjon fra eksisterende enkeltcellemetoder (enkeltcelle-omikk, avstamningssporing og ex vivo-kultur) er nøyaktig påvisning av celledelinger, en viktig parameter å vurdere når man studerer HSPC-dynamikk21. En enkel måte å vurdere antall divisjoner via flowcytometri er bruk av løselige "proteinfargestoffer", som 5- (og 6)-karboksyfluoresceindiacetat succinimidylester (CFSE)22. Disse delingsfargestoffene diffunderer inne i cytoplasma av de fargede cellene, og fortynnes med halvparten og overføres til de to dattercellene ved hver celledeling, slik at de kan oppregne opptil 10 divisjoner. Ved å kombinere flere divisjonsfarger er det mulig å frø flere individuelle forfedre i samme brønn, da hvert enkelt fargestoff tillater separasjon av de forskjellige etterkommerne. Dette er prinsippet bak bruken av cellefargestoffer for multiplex klonal og divisjonssporing som først ble introdusert for murine lymfocytter23,24.

Her presenterer vi utviklingen av MultiGen-analysen for bruk med murine og humane HSPCer. Det tillater testing av mange enkeltceller samtidig for deres egenskaper av differensiering, divisjon og slektskap ex vivo. Denne høye gjennomstrømningen, enkel å utføre og billig analyse gjør det mulig å måle den cellulære fenotypen, antall divisjoner som utføres, og cellenes slektskap og klonale forhold til de andre cellene i brønnen, alt på samme tid. Den kan brukes til å kvantitativt vurdere symmetrisk og asymmetrisk skjebneforpliktelse, balansen mellom selvfornyelse og differensiering, og antall divisjoner som er nødvendige for en gitt forpliktelsesskjebne. Protokollen krever en fluorescensaktivert cellesorterer (FACS) og et flowcytometer med en plateleser, pluss utstyret som er nødvendig for å utføre cellekultur. I tillegg til den tekniske protokollen for utførelse av analysen på humane HSPCer, gir vi også det detaljerte analyserammeverket, inkludert statistisk testing som er nødvendig for å vurdere cellulære egenskaper relatert til begrepet cellefamilie25. Denne protokollen har allerede blitt brukt med hell for å beskrive murine HSPC-rommet26,27.

Følgende protokoll bruker magnetisk berikede CD34+-celler som utgangsmateriale28. På denne måten er det mulig å effektivt flekke og isolere humane HSPCer fra forskjellige blodkilder (f.eks. Navlestrengsblod, benmarg, perifert blod). Det er viktig å ikke forkaste CD34-fraksjonen, da den vil bli brukt som en del av protokollen for å angi forskjellige typer eksperimentelle kontroller. De nevnte cellemengdene og volumene kan skaleres opp eller ned, i henhold til eksperimentell arbeidsflyt og nødvendigheter. På samme måte kan protokollen tilpasses studiet av forskjellige typer progenitorer, ganske enkelt ved å modifisere antistoffene som brukes til cellesortering og flowcytometritrinn.

Protocol

For den følgende protokollen ble avidentifisert navlestrengsblod brukt som HSPC-kilde og samlet inn i samsvar med retningslinjene definert av Saint-Louis Hospital cord blood biobank (autorisasjon AC-2016-2759) og med Helsinkideklarasjonen.

MERK: Før du starter, må du kontrollere at alle reagenser og utstyr som er nødvendig for denne protokollen, er tilgjengelige, som oppført i materialfortegnelsen og nevnt i protokollen. Forbered de relevante reagensene friske og ikke oppbevar dem, med mindre det er uttrykkelig nevnt.

1. Farging av cellefarge

MERK: Denne delen beskriver farging med fire kombinasjoner av CFSE og fiolett fargestoff (CTV) celledelingsfarger. Behandle alle rørene samtidig, selv om ingen cellefargestoffoppløsning tilsettes. Alle trinn utføres under sterile forhold for å tillate følgende cellekulturtrinn. Påkrevd tid: ca. 100 min.

  1. Behandle navlestrengsblodenheten i henhold til en magnetisk sorteringsprotokoll29. Sørg for at to fraksjoner er tilgjengelige: en stor CD34- fraksjon og en mindre CD34+ fraksjon. Spinn begge rørene i 5 minutter ved 300 x g. Aspirer supernatanten uten å forstyrre pelleten.
  2. For CD34+-fraksjonen, resuspender den i 1 ml Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) uten føtalt bovint serum (FBS). Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer; celletettheten bør ikke være høyere enn 3 x 106 celler/ml. Hvis dette er tilfelle, tilpass volumet deretter. For CD34-fraksjonen, resuspender i DMEM uten FBS, og juster volumet til maksimalt 6 x 106 celler/ml.
  3. Aliquot 250 μL av CD34+-fraksjonen i fire 15 ml polypropylenrør. Merk tubene som følger: CD34+/CF (CFSE_only), CD34+/CV (CFSE_high CTV_low), CD34+/VC (CFSE_low CTV_high) og CD34+/VI (CTV_high). Aliquot 250 μL av CD34- fraksjonen i ytterligere fire 15 ml polypropylenrør. Merk rørene som følger: CD34-/CF (CFSE_only), CD34-/CV (CFSE_high CTV_low), CD34-/VC (CFSE_low CTV_high) og CD34-/VI (CTV_high). De resterende cellene fra CD34-fraksjonen kan kasseres.
  4. Forbered to CFSE-løsninger, kalt CFSE_high og CFSE_low. For CFSE_high (10 μM), bland 1,1 ml DMEM uten FBS med 2,2 μL CFSE-lager (5 mM) løsning. For CFSE_low (5 μM), bland 550 mikrol DMEM uten FBS og 0,55 mikrol CFSE-lager (5 mM) løsning.
  5. Tilsett 250 μL av den CFSE_high løsningen til CF- og CV-rørene, 250 μL av den CFSE_low oppløsningen til VC-rørene og 250 μL DMEM w / o FBS til VI-røret. For å sikre en effektiv blanding av celleoppheng og cellefargestoff, skråstill røret med nesten 90 grader, og sett CFSE-løsningene på rørveggen. Hold deretter røret vertikalt for å blande de to løsningene, og pipett tre eller fire ganger for å sikre en rask blanding av CFSE-løsningene med de resuspenderte cellene. Inkuber ved 37 °C i nøyaktig 8 minutter.
  6. Etter inkubasjonen, tilsett 5 ml DMEM + 10% FBS. Hold slangene ved 37 °C i 5 minutter.
  7. Spinn rørene i 5 minutter ved 300 x g. Fjern supernatanten via aspirasjon uten å forstyrre pelleten, og vask pelleten med 5 ml fosfatbufret saltvann 1x/etylendiamintetraeddiksyre (PBS 1x/EDTA). Spinn igjen i 5 min ved 300 x g. Kast supernatanten uten å forstyrre pelleten, og resuspender cellepelleten i 250 mikrol 1x PBS/EDTA.
  8. Forbered to CTV-løsninger, kalt CTV_high og CTV_low. For CTV_high (10 μM), bland 1,1 ml PBS 1x/EDTA og 2,2 μL CTV-lager (5 mM). For CTV_low (5 μM), bland 550 μL PBS 1x/EDTA med 0,55 μL CTV-lager (5 mM).
  9. Tilsett 250 μL av den CTV_high løsningen til VC- og VI-rørene, 250 μL av den CTV_low løsningen til CV-røret og 250 μL 1x PBS / EDTA til CF-røret. Bruk samme teknikk som beskrevet i trinn 1.5. Inkuber ved 37 °C i nøyaktig 8 minutter.
  10. Etter inkubasjonen, tilsett 5 ml DMEM + 10% FBS. Oppbevares ved 37 °C i 5 minutter.
  11. Sentrifuger rørene i 5 minutter ved 300 x g, kast supernatanten uten å forstyrre pelleten, og vask deretter pelleten med 5 ml 1x PBS/EDTA. Spinn igjen i 5 min ved 300 x g.
  12. Kast supernatanten uten å forstyrre pelleten, og resuspender CD34- fraksjonene i 1x PBS/EDTA for en endelig konsentrasjon på 1,5 x 106 celler/ml. Resuspender CD34+ -fraksjonene i 40 μL fargebuffer, og overfør cellene til 1,5 ml rør.

2. Antistofffarging

MERK: Antistofffarging kan tilpasses i henhold til eksperimentelle behov. Bare CD34+ -fraksjonene gjennomgår antistofffarging; CD34- fraksjonene brukes som en enkelt fargekontroll for celledelingsfargekombinasjonene (CV-, VC-, CF- og VI-fraksjoner). Følgende panel er skreddersydd for påvisning av fire typer HSPCer: hematopoietiske stamceller (HSC), multipotente progenitorer (MPP), lymfoidprimede multipotente progenitorer (LMPP) og hematopoietiske stamceller (HPC)12. Imidlertid presenteres identifisering av HSCs og MPPs. Påkrevd tid: 75 min.

  1. Forbered enkeltfargingen for overflatefarging, bruk kompensasjonsperler. Bland negative perler og immunglobulin G (IgG) perler i forholdet 1:1, for et totalvolum tilsvarende 20 μL x antall overflatemarkører (f.eks. 120 μL hvis fargepanelet inneholder seks antistoffer).
  2. Send 20 μl perler i individuelle 1,5 ml rør for hver markør. Legg til volumet som tilsvarer fortynningsfaktoren for hvert antistoff i det tilsvarende røret (f.eks. hvis fortynningsfaktoren er 1:20, tilsett 1 μL).
  3. For å farge CD34+ -cellene, lag en masterblanding av antistoffer12, basert på tabell 1. Bland antistoffene i et enkelt 0,5 ml rør. Tilsett 7 μL fra antistoffmasterblandingen til hver av de fire CD34+-tilstandene.
  4. Inkuber kompensasjonskulene og CD34+ -prøvene ved 4 °C i minst 30 minutter.
    MERK: Inkubasjonstiden må tilpasses de tekniske detaljene til antistoffene som brukes til farging.
  5. Under inkubering, klargjør 96-brønns rundbunnsplaten som skal brukes til sortering, og tilsett 100 μL cellekulturmedium til hver brønn ved hjelp av en flerkanalspipettte.
    MERK: La brønnene H8-H12 stå tomme.
  6. Merk 5 ml polypropylenrør for overflatefargekontrollene (5, ved bruk av perler), celledelingsfargestoffkontrollene (4, ved bruk av CD34-fraksjonene) og CD34+-prøvene (4).
  7. På slutten av inkubasjonen, vask cellene og perlene med 1 ml fargebuffer. Overfør totalvolumet til 5 ml polypropylenrør. Sentrifuger rørene i 5 minutter ved 300 x g, og aspirer deretter supernatanten uten å forstyrre pelleten.
  8. Resuspender cellene i fargebuffer ved å bruke ca. 500 μL hver for perlene og CD34+-cellene, og 1 ml for CD34-rørene.

Tabell 1: Mal for å klargjøre antistoffet mastermix for et cellesorteringseksperiment. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

3. Cell sortering

De sorterte cellenumrene kan variere i henhold til den totale mengden celler som er tilgjengelige. I protokollen angis et minimum cellenummer for hver kontroll. Tid som kreves (for en enkelt plate): 100 min.

  1. Åpne maleksperimentet, eller angi et nytt eksperiment. Lag en enkelt prøve og flere rør, en per hver tilstand.
  2. Angi gatingstrategien som er beskrevet i figur 1, og lag seks punktdiagrammer. Først visualiserer du cellene på et FSC-A/SSC-A-punktplott, og dobbeltklikker på polygongatingverktøyet for å velge en populasjon med lav sidespredning (figur 1A). I det følgende punktplottet (FSC-A / FSC-H), høyreklikk på plottet og velg porten "Celler" fra rullegardinmenyen ved å klikke på den. Bruk det samme gatingverktøyet til å velge en tett populasjon på diagonalen mellom de to aksene (figur 1B).
  3. I det tredje punktplottet (APC vs. FSH-H), vis populasjonen "Single Cells" og gate cellene negative for uttrykket av APC Lineage (Lin) (figur 1C). I det fjerde plottet (CFSE vs. CTV), vis populasjonen "Lin-" og opprett fire atskilte porter, en for hver fargekombinasjon (figur 1D).
    MERK: Disse portene må være tette, for å velge bare en liten brøkdel av homogent fargede celler.
  4. Bruk det femte og sjette plottet (APC-Cy7 vs. BV650 og PE-Cy7 vs. PE) for å identifisere forfedrene av interesse. Generøst gate CD34 + CD38-populasjonen og CD34 + CD38 + i det femte plottet (figur 1E). Velg deretter CD34+CD38-populasjonen i det sjette plottet, og tegn tre porter, i henhold til figur 1F.
  5. Kjør de enkle fargerørene som inneholder kompensasjonsperlene, og klikk på Oppkjøp-knappen . Juster fotomultiplikatorrørspenningene (PMT) fra rullegardinmenyen Parametere , spesielt for celledelingsfargestoffene (mellom 104 og 105 på en bieksponentiell skala).
  6. Finjuster kompensasjonsmatrisen i samsvar med panelet som brukes til sortering, ved hjelp av kategorien Kompensasjon . Ta opp minst 5000 hendelser i perleporten, ved å klikke på Record-knappen .
  7. Kjør CD34-fraksjonene og kontroller kompensasjonsmatrisen på nytt. Ta opp minst 10 000 hendelser i encelleporten.
  8. Kjør CD34+ -brøkene, og ta opp minst 5000 hendelser i encelleporten. Juster porten for hver fargestoffkombinasjon, og still inn en tett port for å velge en homogen populasjon (figur 1D). På samme måte justerer du gatingen for å velge HSC-er og MPP-er.
  9. Når analysen er fullført og alle rør er registrert, sett platen inn i riktig holder, etter å ha utført standard Aria-kalibrering for sortering på 96-brønnplater. Kjøling av platen anbefales.
  10. Forbered platesorteringsmalen i henhold til skjemaet som presenteres i tabell 2, ved hjelp av eksperimentets sorteringsoppsett. Brønnene med navnet "CD34-" inneholder 5.000-10.000 celler, sortert på CF/CV/VC/VI-porten. "Bulk"-brønnene inneholder minst 500 celler, sortert på porten CD34+CD38-. Til slutt inneholder encellebrønnene bare én hendelse per celledelingsfargekombinasjon per brønn, så totalt fire hendelser per brønn.
    MERK: "Bulk" -populasjonene kan tilpasses spesifikke forfedres delmengde; Ikke sorter mindre enn 500 celler.
  11. For sorteringen, fortsett i rekkefølge, fullfør hver celledelingsfargekombinasjon før du går til neste. Start for eksempel med å sortere CD34- CF, i renhetsmodus . Klikk på oppkjøpsknappen, deretter på sorteringsknappen.
  12. På slutten av CD34-sorteringen setter du inn CF CD34+-røret. Skaff deg, og klikk deretter på sorteringsknappen, og sørg for å ha krysset 0/16/0 som renhetsgrad. Til slutt sorterer du cellene av interesse, en celle per brønn, i encelle renhet, og sørg for å krysse av for alternativet Indekssortering.
  13. Gå til følgende fargestoffkombinasjon for celledeling, og gjenta samme rekkefølge. Som referanse gir tabell 2 et eksempel på en sortert plate.
    MERK: Indekssorteringsfunksjonen genererer individuelle filer for hver sorterte betingelse.
  14. På slutten av sorteringen eksporterer du filene som .fcs 3.0-filer. Sett cellene i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Cellene dyrkes i flere dager, i henhold til eksperimentell design, i minst 24 timer26.

Tabell 2: Mal for cellesortering 96-brønns plate, basert på spesifikke krav til suksessiv flowcytometrianalyse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

4. Dataanalyse av cellesortering

MERK: For å validere kvaliteten på cellesortering, er FACS-dataanalysen nødvendig før du går videre. Hovedresultatet av dette trinnet er genereringen av et regneark som inneholder markørintensitetene til hver sortert individuell celle.

  1. Last opp .fcs 3.0-filene i analyseprogramvaren.
  2. Kontroller kompensasjonsinnstillingen som brukes under cellesortering, ved hjelp av de enkle fargefilene som er registrert før den faktiske sorteringen.
  3. Angi den reviderte gatingstrategien ved å bruke filene som tilsvarer den forskjellige bulken. Kopier og lim inn disse portene på indekssorteringsfilene.
  4. Kontroller at indekssorterte celler falt i den angitte porten. Hvis det er noen sorterte celler som ble feilaktig gated, kan de identifiseres ved å eksportere platekoordinatene som ble registrert under indekssortering, og fjernes senere i analysen.
  5. Eksporter hendelsen fra indekssorteringsfilene som kompenserte parametere. Eksporter dem som .csv filer, merk av for alternativene "skalaverdier" og "kompenserte parametere". Disse filene skal eksporteres i en mappe som heter "Eksporterte filer".
  6. Kombiner alle filene i én enkelt .csv fil ved hjelp av skriptet i tilleggsfil 1. Sett riktig vei med funksjonen "setwd". Resultatet av dette skriptet er et regneark som inneholder alle de forskjellige gated hendelser og den relative intensiteter for alle parametrene.

5. Etter kultur antistofffarging

MERK: Utfør denne delen av protokollen under sterile forhold; Flere reagenser deles med de tidligere trinnene, og må holde seg sterile. For flowcytometrianalysen, bruk et flowcytometer med plateleser. Dette gjør det mulig å utføre fargingen direkte i vevskulturplaten, og redusere celletapet til et minimum ved å begrense mengden pipettering og spinning. Forbered overflatemarkøren ensfarget farging ved hjelp av kompensasjonsperlene, bortsett fra brønnene A1-A4, som representerer enkeltfargingen for CF / CV / VC / VI-fargene og allerede er til stede i 96-brønnplaten. Bulkpopulasjonene sortert etter cellefargen bidrar til å sette gatingstrategien for antall divisjoner og den generelle gating. Påkrevd tid: 120 min.

  1. Før du starter protokollen, merk brønnene som inneholder minst en celle ved å sjekke platen under et omvendt mikroskop. Dette trinnet gjør det mulig å optimalisere mengden antistoff som brukes til farging og fremskynder prosedyren.
  2. Forbered antistoffet mastermix, i henhold til tabell 3. Siden det er en betydelig mengde pipettering, tar tabellen hensyn til den tekniske feilen som skyldes pipettering, inkludert et ekstra volum på 5 %. Antistoffene beskrevet i tabellen tillater å karakterisere en rekke HSPCer fra humane ledningsblodprøver12.
  3. Sentrifuger platen i 5 min ved 300 x g. Snu platen raskt under panseret og over et papirhåndkle for å fjerne supernatanten.
  4. Tilsett 8 μL fargebuffer til brønnene A1-A4. Tilsett 8 μL av blandingen til de andre brønnene.
  5. Bland de negative kulene og IgG-kompensasjonsperlene i forholdet 1:1, for et totalt volum tilsvarende 120 μL. Send 20 μL i ett 1,5 ml rør per markør. Legg til antistoffvolumet som tilsvarer fortynningsfaktoren (f.eks. hvis fortynningsfaktoren er 1:20, tilsett 1 μL).
    MERK: Tilpass totalvolumet til antall markører som brukes til fargingen (f.eks. 100 μL hvis fargepanelet inneholder fem antistoffer).
  6. Inkuber platen og de enkle fargestoffkompensasjonskontrollene ved +4 °C i minst 30 minutter.
    MERK: Inkubasjonstiden må tilpasses de tekniske detaljene til antistoffene som brukes til fargingen.
  7. Vask perlene med 1 ml fargebuffer. Overfør totalvolumet til 5 ml polypropylenrør som tidligere er merket. Sentrifuger rørene i 5 minutter ved 300 x g, og fjern deretter supernatanten via aspirasjon.
  8. Vask cellene i platen ved å tilsette 100 μL fargebuffer per brønn ved hjelp av en flerkanalspipettte. Sentrifuger platen ved 300 x g i 5 minutter, snu deretter platen raskt under panseret og over et papirhåndkle for å fjerne supernatanten.
  9. Suspender cellene på nytt i 85 μL fargebuffer ved hjelp av en flerkanalspipettte.
  10. Start analysen på flowcytometeret (oppkjøpsmodus), bruk den dedikerte malen og klikk på tilpasset. Denne tilpassede malen tar hensyn til de tekniske egenskapene til den 96-brønns rundbunnsplaten, spesielt dimensjonene til hver brønn (diameter, dybde og tykkelse). Sonden må nå bunnen av brønnen, så sett den nøyaktig midt i brønnene A1 og H12.
  11. Etter å ha valgt fluoroforene av interesse fra listen foreslått av programvaren, sett plateoppsettet etter platemalen i tabell 2, korrigert for antall brønner som inneholder minst en celle.
  12. Velg 100 μL som volumgrense for innsamlingen. Merk av for agitasjonsalternativet . Sett innsamlingsraten til 1 μL/s maks, da lavere hastighet forbedrer det totale volumet som analyseres per brønn.
  13. Legg til passende rengjørings- og vaskeløsninger til brønner H8-H12. Malen i tabell 2 lar spesifikt brønnene H8-H12 stå tomme, da strømningscytometeret må kjøre en rekke vaskeforhold på slutten av analysen.
    MERK: Dette trinnet er tilpasset spesifikasjonene til flowcytometeret som brukes.
  14. I plott og porter-delen angir du først encelleporten, ved hjelp av FSC-A/SSC-A scatterplot og deretter FSC-H/FSC-A scatterplot. Lag et histogram for hver markør av interesse.
  15. Når innstillingene er bekreftet, fortsett til analysedelen . Analyser enkeltfargingen først, og registrer ikke mindre enn 5000 hendelser (optimalt område: 5000-15 000 hendelser), både for kompensasjonsperlene og CD34-fargede fraksjoner. Juster spenningene om nødvendig.
  16. Når de enkelte flekkene er registrert, er det mulig å starte selve anskaffelsen ved å klikke på Oppkjøp-funksjonen .

Tabell 3: Antistoff mastermix for et flowcytometrieksperiment, spesielt for identifisering av HSPCer fra humant ledningsblod. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

6. Dataanalyse av flowcytometri etter kultur

MERK: Dataanalysen som beskrives, er spesifikk for programvaren som er nevnt i materialfortegnelsen. Hovedproduksjonen er genereringen av et regneark som inneholder informasjon for overflatemarkørintensitet, antall divisjoner og slektskap per hver analysert celle. Inkludert i denne delen av protokollen er et skript skrevet i R, som er nødvendig for denne arbeidsflyten for å generere det endelige analyseregnearket.

  1. Eksporter filer fra flowcytometeret som .fcs-filer. Last dem opp til analyseprogramvaren, gruppere dem sammen som "single staining", "bulk" og "single cell".
  2. Forbered en kompensasjonsmatrise ved hjelp av de enkle fargefilene, og bruk den på de to andre gruppene ved å dra og slippe.
    MERK: Hvis du bruker et automatisk kompensasjonsverktøy, må du kontrollere kvaliteten for hånd før du fortsetter.
  3. For å ha en representativ gating, sammenkoble de forskjellige bulkbrønnene i en enkelt fil. Dette trinnet fremhever raskt hvis to farger overlapper hverandre (vanligvis CV og VC) eller andre uregelmessigheter, og derfor må utelukkes. Etter å ha klikket på alternativet for sammenkoblingspopulasjoner , velg alle ukompenserte parametere fra "parametere" -menyen, og klikk deretter på sammenkoble.
  4. Last opp den sammenkjedede filen til arbeidsområdet, og bruk deretter kompensasjonsmatrisen via dra og slipp.
  5. Forbered gatingstrategien som er definert i figur 2 , ved hjelp av den sammenkjedede filen. I encelleporten viser du hendelsene på et punktdiagram med CFSE og CTV. Opprett en første port kalt Merket, inkludert alle fire fargene og unntatt mulig automatisk fluorescens (figur 2C). Deretter porter du hver farge individuelt.
  6. Celler merket med CV og VC trenger en transformert verdi, med tanke på at fargen er et resultat av CFSE- og CTV-signalene. De to koordinerte signalene roteres derfor på en logaritmisk skala med 45°, slik at delingsfortynningen kan fortsette parallelt med x-aksen. Denne transformerte verdien avledes manuelt, klikker på Verktøy og deretter Derive Parameter. Lim inn følgende formel i formelboksen :
    Equation 1
    MERK: Ligningen26 forutsetter at CFSE og CTV er parameterne 03 og 17.
  7. For å visualisere denne nye parameteren med navnet Avledet parameter på riktig måte, angi en lineær akse som strekker seg ~ 3-7, klikker på alternativet Akseparameter og velger Tilpass akse.
  8. Bruk gating til hver farge individuelt som et histogramplott: for CF og VI, sett CFSE-A og CTV-A på henholdsvis x-aksen . For CV og VC angir du den nylig avledede parameteren på x-aksen. Sett porter som tilsvarer hver topp, som vist i figur 3.
  9. Påfør gating til hver enkelt enkeltcellebrønn. Sørg for å legge til den avledede parameteren til hver analysert brønn. Kontroller manuelt hver fargeport for hver brønn for å oppdage hendelser som er feilaktig tilordnet til en gitt topp. Eksempler på gating er vist i figur 4.
  10. Etter at analysen er fullført, og alle brønnene er verifisert, velger du alle CF/CV/VC/VI-portene som inneholder minst én celle. Eksporter dem som .csv filer, kryss av for alternativene "skalaverdier" og "kompenserte parametere". Disse filene eksporteres i en mappe som heter "Eksporterte filer".
  11. Kombiner alle filene i ett enkelt .csv ved hjelp av R-skriptet i tilleggsfil 1. Husk å sette riktig vei med funksjonen "setwd". Resultatet av dette skriptet er et regneark som inneholder alle de forskjellige gated hendelser og den relative intensiteter for alle parametrene.
  12. Åpne regnearket og gi nytt navn til kolonnene for hver parameter, for eksempel ved å bruke følgende navn: CFSE, CTV, CD90, CD123, CD45RA, CD34, CD38. Disse navnene vil bli brukt til å identifisere gating-terskelen for riktig å tilordne hver celle deres identitet.
  13. Legg til seks kolonner med navnet "Well", "Condition", "Color", "Generation", "Original_cell" og "Culture_time". Disse variablene er de som er definert eksperimentelt og utledes fra hver rad:
    export_A10 CD34 + PBS_CV_Peak 1.csv.1 = A10 (brønn), CD34+ (Original_cell), PBS (tilstand), CV (farge) Peak_1 (generasjon).
  14. Eksporter bulkbrønnene for å identifisere terskelverdiene for gating: eksporter den kompenserte populasjonen av interesse (f.eks. CD34 + CD38-) som .csv filer, kryss av for alternativene "skalaverdier" og "kompenserte parametere." Eksporter disse filene i en mappe som heter "Eksporterte filer".
  15. For å finne terskelverdien for CD38, identifiser den største numeriske verdien for denne parameteren. Omvendt, for å finne terskelen for CD34, identifiser den minste numeriske verdien for denne parameteren. Gjenta denne prosessen for alle parametrene av interesse.
    MERK: For analysen som presenteres i protokollen, brukes markøren CD45RA både til å identifisere LMPP-er i CD34+CD38-porten og CMP/GMP i CD34+CD38+-porten. Dette betyr at to forskjellige terskelverdier må trekkes ut for denne markøren.
  16. Kopier og lim inn terskelverdiene i en Excel-fil kalt "gating_matrix". Denne filen er organisert i henhold til tabell 4, og tillater analyse av flere uavhengige eksperimenter. Det er veldig viktig å navngi hver kolonne nøyaktig med dette skjemaet: XXYYMMDD_xxh, der XX står for de to initialene til operatøren, YY de to siste tallene for året, MM for måneden, DD for dagen og xx for analysetidspunktet.

Tabell 4: Gittermatrise for celleskjebnetildelingen, før statistisk analyse. CD45h refererer til intensiteten til CD45RA for HPC-undergruppen gating, mens CD45l refererer til intensiteten til CD45RA for CD34 + CD38-undergruppene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

7. Statistisk analyse

MERK: Den statistiske testingen av dataene som genereres, involverer en skreddersydd analysepipeline, kodet ved hjelp av programmeringsspråket Python (tilleggsfil 2, tilleggsfil 3 og tilleggsfil 4). Skriptet er organisert i tre blokker: den første for behandling av regnearket, den andre blokken for å generere varmekartet for datavisualisering, og den siste blokken for å generere flere histogrammer for å analysere og teste differensiering og divisjonsegenskaper.

  1. Start fra blokken "0_process_data" (tilleggsfil 2), sørg for at gating_matrix og dataregnearkbanene er riktig definert i skriptet.
  2. Definer "cell_cols" -ordboken for å tilordne de relevante celleskjebnene til hver celle. I det spesifikke tilfellet er skjebnene HSC-er, MPP-er, LMPP-er, vanlige myeloide progenitorer (CMP), granulomonocytiske forfedre (GMP), megakaryocytisk-erytroide forfedre (MEP) og CD34-.
  3. Ved hjelp av terskelverdiene definert fra bulkbrønnene (trinn 6.16), definer "cell_class_exp_time" -funksjonen. Det er viktig å være konsekvent i kolonnenavngivningen, for å definere disse tersklene riktig, ved å bruke samme navn som brukes til å definere hver kolonne i trinn 6.12.
  4. Cellefenotypene defineres i skriptet ved hjelp av en serie "if-else"-setninger, basert på tersklene som oppdages under flowcytometrianalysen.
    MERK: Ulike fenotyper kan vises ved å endre disse setningene for å imøtekomme andre markørkombinasjoner.
  5. Spesifiser de eksperimentelle spesifikke forholdene, ved hjelp av funksjonen "cond_rule" (f.eks. Forskjellige eksperimentelle behandlinger). For det angitte datasettet kalles betingelsene "GT" og "Diff". Beskriv de to forskjellige cellekulturmediene som brukes til å dyrke cellene. Denne informasjonen vil bli brukt av blokken "1_dot_plot" (tilleggsfil 3) for å plotte varmekartet.
  6. I blokken "2_bar_plot" (tilleggsfil 4) definerer du ordboken "class_dct", inkludert de diskrete celleskjebnene av interesse. For datasettet som er oppgitt, er celleskjebnene av interesse de samme som beskrevet for "cell_cols" -ordboken.
  7. Definer "conds" (betingelser), "or_cells" (opprinnelig celle), "sym_labs" (symmetrietiketter) og "times" (det eksperimentelle tidspunktet). Dette er gjentakende filtre som er nødvendige for plotting. "conds" tar betingelsene definert i "cond_rule" igjen, "or_cells" er HSCs og MPPs, og "sym_labs" beskriver typen divisjoner.
  8. I blokken "2_bar_plot" er det mulig å plotte celler som har kommet opp til divisjon 6.
    MERK: Datasettet som følger med, inneholder bare celler opp til divisjon 4, så en feilmelding dukker opp, men dette forhindrer ikke skriptet i å fungere.
  9. Tallene som genereres av skriptet kan hentes i mappen "figurer" som pdf-filer. Filene med navnet "Test" representerer de forskjellige statistiske testene som utføres for det tilsvarende histogrammet.

Representative Results

FACS-sortering
Sorteringsstrategiene som presenteres i denne protokollen er basert på allment aksepterte strategier 12,30,31. For gatingstrategien presentert i figur 1 er utgangsmaterialet navlestrengsblodprogenitorer tidligere renset via CD34+ magnetisk anrikning, noe som forklarer den ubetydelige prosentandelen av Lineage-positive celler. Det er viktig å bruke tette porter for de fire intracellulære fargestoffkombinasjonene (f.eks. CTV i figuren), for å forbedre toppenes oppløsning under den følgende analysen og for å portere riktig cellepopulasjon (figur 1D). I tilfellet som vises i figuren, velger portene for den største og bedre definerte populasjonen. Tilstedeværelsen av flere, nære populasjoner for hver celledelingsfargekombinasjon er etter vår erfaring ikke representativ for biologiske forskjeller. I stedet kan det indikere a) en ikke-optimal fargeprosedyre, eller b) en stor heterogenitet (spesielt i størrelse) i startbassenget av celler. Dette er ikke uventet når man starter fra navlestrengsblod eller andre komplekse biologiske kilder (f.eks. benmargsaspirer, perifert blod). Hvis porten ikke er tett definert, kan den progressive fortynningen av de forskjellige fargekombinasjonene føre til sammenslåing av de senere toppene, spesielt for forholdene CV og VC (figur 2D). En annen negativ konsekvens av en suboptimal gating er manglende evne til effektivt å skille forskjellige topper etter cellekultur, da en heterogen startpopulasjon kan føre til grunne topper.

Figure 1
Figur 1: Gating strategi for cellesortering. (A) FSC-A versus SSC-A, for å utelukke rusk og forurensende celler. (B) FSC-A versus FSC-H, for å utelukke dubletter og celleklumper. (C) Lin versus FSC-H, for å utelate celler som er Lin+. (D) CTV versus CFSE, for entydig å identifisere cellene farget med fargestoffkombinasjonene CF, CV, VC og VI. Portene bør være strenge nok til å inkludere en homogen befolkning. (E) CD34 versus CD38, for å skille de begrensede forfedrene CD34+CD38+ (også kalt HPC) fra det multipotente rommet CD34+CD38-. (F) CD45RA versus CD90, fra CD34+CD38-populasjonen, for å skille mellom de mest umodne forfedrene beriket i HSC (CD90+CD45RA-), LMPP (CD90midCD45RA+), og den mer engasjerte MPP (CD90-CD45RA-). (G) Indekssorterte hendelser, representert her for deres cellefargestoffkombinasjonsfarging og (H) uttrykket av overflatemarkørene CD90 og CD45RA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Flowcytometrianalyse etter cellekultur
Dataene i figur 2 er representative for HSC i humant navlestrengsblod, holdt i kultur i 72 timer, i nærvær av flere cytokiner som kan støtte en rekke myeloide progenitorer og forløpere. Panelene 2A til 2D representerer gatingen som er nødvendig for å etablere slektskapet til hver av de enkelte cellene, mens panelene 2E til 2G tillater cellulær fenotyping. Den reduserte tilstedeværelsen av parlamentsmedlemmer i figuren er sannsynligvis en konsekvens av kulturbetingelsene som ble brukt for dette representative eksperimentet (figur 2F). Bruk av forskjellige cytokiner og kulturbetingelser endrer den relative prosentandelen av hver delmengde, på samme måte som å velge forskjellige startceller for eksperimentet.

Figure 2
Figur 2: Gating strategi for flowcytometrianalysen. (A) FSC-A versus SSC-A, for å utelukke rusk og forurensende celler. (B) FSC-A versus FSC-H, for å utelukke dubletter og celleklumper. (C) CTV versus CFSE, porten merket tillater å utelukke enhver automatisk fluorescerende hendelse som kan påvirke dataoppløsningen. (D) CTV versus CFSE. Det er ekstremt viktig å strengt begrense de fire populasjonene, basert på celledelingsfargestofffortynningene. (E) CD34 versus CD38, for å skille mellom engasjerte forløpere (CD34-), begrensede forfedre (HPC) (CD34+CD38+) og umodne forfedre (CD34+CD38-). (F) CD45RA versus CD123, for å skille mellom tre typer begrensede forfedre: CMP (CD123+CD45RA-), MEP (CD123-CD45RA-) og GMP (CD123+CD45RA+). (G) CD45RA versus CD90, fra CD34+CD38-, for å identifisere HSC-er, LMPP-er og MPP-er. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Toppdefinisjonen og tildelingstrinnene (figur 3 og figur 4) er viktige aspekter ved protokollen og krever definisjon av strenge porter. For toppdefinisjonen (figur 3) er det nødvendig med minst 1000 hendelser for en pålitelig identifisering. I denne forstand kan det være fordelaktig å isolere flere celler under cellesorteringstrinnet for "Bulk" -brønnene. Figur 4 beskriver fire eksempler på enkeltbrønner med flere familier. Denne figuren tydeliggjør betydningen av figur 2D og figur 3 gating, spesielt for identifisering av hver familie og hver topp. Figur 4A illustrerer et enkelt eksempel, da alle cellene i porten CF er svært nær hverandre og lett kan tilordnes til en enkelt topp. Figur 4C viser et annet eksempel på en familie fordelt entydig på to godt adskilte topper, slik det tydelig vises i histogrammet i figur 4D. Figur 4E,G viser viktigheten av streng gating basert på et stort antall hendelser; De viser begge få hendelser som er nære, men utenfor fargekombinasjonsportene. Disse hendelsene kan feilaktig inkluderes i VI- og CF-portene, utelukkende basert på enkeltbrønnsanalysen. Til slutt viser figur 4F,H to forskjellige eksempler på familier spredt på flere topper, med ett eksempel på to like intensitetstopper (figur 4F) og ett med to ulike intensitetstopper (figur 4H).

Figure 3
Figur 3: Toppdefinisjon for flowcytometrianalysen. (A-D) Topper bør defineres med minst 500 hendelser, for å sikre en god representasjon for hver enkelt topp. (A) Histogram for CFSE-A-intensiteten. Flere topper kan identifiseres, hver tilsvarer en annen populasjon av delende celler. (B,C) Histogrammer for intensiteten av den avledede parameteren, som representerer CFSE-CTV blandingen, henholdsvis CV (B) og VC (C). (D) Histogram for CTV-A-intensiteten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Topptildeling . (A,B) Bare én topp kan påvises for denne brønnen, i CF-porten. (C,D) To topper med nesten lik intensitet kan påvises i denne brønnen, i VI-porten. Toppene er godt løst. (E,F) To topper med sammenlignbar intensitet kan detekteres i denne brønnen, i VI-porten. Bare hendelsene i porten har blitt vurdert, basert på strategien satt ved hjelp av bulkbrønnene. (VG Nett) To topper med ulik intensitet kan oppdages i denne brønnen, i porten CF. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Datarepresentasjon og statistisk testing
Figur 5 viser ulike typer datarepresentasjon av to separate eksperimenter, begge utført etter 72 timer cellekultur. HSC og MPP har blitt dyrket i to forskjellige cellekulturmedier, antatt å endre celledeling og differensieringsegenskaper. Disse mediene heter "Diff" (Differensiering)32 og "GT"33; den første fremmer myeloid og erytroid differensiering, da den inneholder erytropoietin (EPO) og granulomonocytisk kolonistimulerende faktor (GM-CSF), mens den andre er utviklet i sammenheng med kliniske genterapistudier, med mål om å opprettholde og forsterke en høy prosentandel av HSPCer. Figur 5A er et representativt varmekart for tilstanden "Diff", som representerer en rekke cellefamilier, både i celleskjebner og divisjoner. I dette varmekartet representerer hver rad en individuell familie, hver firkant en individuell celle, og kolonnene grupperer alle celler som er i samme generasjon (f.eks. celler i generasjon 2 delt minst to ganger). Det er mulig å skille svært homogene familier, sammensatt av en enkelt celletype og viser samme antall divisjoner (f.eks. familie # 63), og heterogene familier, inkludert tre celletyper over to generasjoner (f.eks. familie # 84). Fordi den cellulære utvinningsgraden for denne analysen er omtrent 70%, observeres sjelden komplette familier, som er definert ved å ha alle cellene sine gjenvunnet i muligens forskjellige generasjoner (f.eks. En familie av en celle i generasjon 1 og to celler i generasjon 2) (viser en hashtag ved siden av ID-nummeret i figur 5A). Det er flere forklaringer som forklarer den ufullstendige deteksjonen, som kan være teknisk (fargeproblem, celletap på grunn av protokollen) eller biologisk (celledød og / eller apoptose). Tekniske begrensninger kan overvinnes ved hjelp av en analysator designet for å redusere dødvolumet forbundet med den enkelte prøven, og ved å utføre cellefargingen direkte i cellekulturplaten for å redusere volumpipetteringen. Omvendt kan ortogonale metoder for å bestemme mengden celledød (f.eks. via levende cellebildeeksperimenter) bidra til å skille mellom de tekniske og biologiske faktorene som resulterer i ufullstendig deteksjon.

Figur 5Bi viser hvordan man visualiserer effekten av dyrkningsbetingelsen på celletypesammensetningen, som om man hadde utført en bulkanalyse. Her fremmer Diff-tilstanden et større antall skjebner, og en høyere prosentandel av CD34+ -celler (definert som alle celletypene unntatt CD34-). Konfidensintervallene beregnes i skriptet via grunnleggende bootstrap, med 250 000 bootstrapped datasett34. Det er verdt å merke seg at alle de andre histogrammene i figur 5 viser konfidensintervaller beregnet på samme måte. Tabell 5 rekapitulerer all informasjon om antall familier og antall celler i hver generasjon.

Figur 5Bii representerer grafisk resultatet av den statistiske testingen utført i skriptet "2_bar_plot". En formell beskrivelse av det statistiske rammeverket er tilgjengelig26. Kort sagt, dette rammeverket muliggjør statistisk hypotesetesting mens man antar at celler fra samme familie er avhengige (en antagelse som i seg selv er testbar), i motsetning til klassisk statistikk som ville kreve uavhengighet mellom alle observerte celler. I det spesifikke tilfellet som presenteres i figuren, utfordrer den statistiske testen hypotesen om at celleskjebnevalgene til MPP, målt som frekvensene til de forskjellige celletypene som er tilstede i kulturen, er uavhengige av cellekulturbetingelsene som brukes. For det første brukes G-teststatistikken til å evaluere avviket mellom celletypefrekvenser fra forskjellige cellemedier (for eksemplet i Bii er denne statistikken representert med den røde linjen). Deretter utføres en randomisering av dataene via permutasjon, og bytter hele familier av celler mellom de to cellekulturforholdene. Dette er for å bevare avhengigheten mellom familierelaterte celler, samtidig som antall familier i hvert sett holdes konsistente med de opprinnelige dataene. G-teststatistikken beregnes ut fra det randomiserte datasettet. De blå verdiene representert i 5Bii er G-teststatistikken for 250 000 permutasjoner. Til slutt beregnes p-verdien for å vurdere i hvilken grad det opprinnelige datasettet avviker fra fordelingen av de permuterte. I eksemplet avviker den opprinnelige statistikken i stor grad fra fordelingen, noe som resulterer i en liten p-verdi og dermed avviser hypotesen om at celleskjebnen til MPP er uavhengig av kulturbetingelsene.

Figur 5C representerer prosentandelen av cellefamilier per maksimal generasjon, for å undersøke hvordan ulike forhold endrer celledeling per cellefamilie. Dette dataplottet viser at ved 72 timer fullfører cellene dyrket i Diff-tilstanden et større antall divisjoner enn celler i GT-tilstanden. Representert er antall maksimale generasjoner per hver familie, så en familie som viser celler i generasjon 1 og 2 regnes som generasjon 2. Det samme statistiske rammeverket som brukes til figur 5B , kan brukes til å statistisk teste uavhengigheten mellom celledeling og kulturtilstand.

Figur 5D utforsker typen symmetri/asymmetri av den første divisjonen for de forskjellige forfedretypene (HSCs eller MPPs). For de komplette cellefamiliene i generasjon 1 - den eneste generasjonen der det er mulig å definitivt etablere de to dattercellene som søsterceller - kan fire forskjellige typer symmetri / asymmetri defineres: etiketten "Sym Undiff" beskriver familier der begge døtrene beholder fenotypen til opprinnelsescellen. "Sym Diff" betyr at begge døtrene har samme fenotype, og det er forskjellig fra opprinnelsescellen. "Asym Undiff" betyr at en datter bare beholder fenotypen til opprinnelsescellen. Til slutt beskriver "Asym Diff" familier der begge døtrene har forskjellige fenotyper, og ingen av dem er de samme som opprinnelsescellen. For å få statistisk styrke til å vurdere disse symmetriske/asymmetriske skjebnene, er det ønskelig å utføre MultiGen-analysen på tidlige tidspunkter, for å observere flere familier hvis avkom er funnet i generasjon 1.

Til slutt representerer figur 5E prosentandelen av celletyper som en funksjon av antall divisjoner, for å få innsikt i differensieringsmønsterprogresjonen på tvers av divisjoner. For eksempel antyder dataene som vises i figuren at celler utvikler seg til CD34-tilstanden, med over 50% av oppdagede celler i denne klassen etter bare tre divisjoner. Videre er det mulig å konkludere at MPP ikke favoriserer selvfornyelsesdeling, da en liten prosentandel av cellene beholder den opprinnelige fenotypen. Noen av disse konklusjonene kan deretter testes ved hjelp av det statistiske rammeverket presentert i de tidligere tallene.

Figure 5
Figur 5: Eksempel på datarepresentasjon for et 72-timers eksperiment ved bruk av navlestrengsblod-HSPCer. (A) Varmekart for et valgt datasett (HSC, i "Diff" medium, etter 72 timers kultur). Plottene representerer alle individuelle celler (firkanter) i henhold til deres slektskap (rader), antall divisjoner utført (kolonner, kalt generasjon) og fenotype (farger). (VG Nett) Histogram som sammenligner proporsjoner av celletyper av celleprogeniene til HSCs og MPPs, mellom tilstanden GT og tilstanden Diff. (Bii) Grafen representerer de statistiske testene som ble utført i "2_bar_plot" -skriptet for MPPs ved 72h kultur, sammenligning mellom "Diff" og "GT" cytokincocktailer. Den eksperimentelle verdien vises i rødt, og verdiene generert via 250 000 permutasjoner i blått. P. -verdien til G-testen er angitt øverst til høyre med antall familier som brukes til testen. (C) Histogram som sammenligner prosentandelen av familier (totalt 314 familier) i hver generasjon (fargekodet), for HSC og MPP per kulturtilstand. Konfidensintervallene beregnes med 250 000 oppstartede datasett. (D) Histogram som representerer typen symmetri/asymmetri mellom skjebnen til dattercellene for familiene med to celler i generasjon 1: Sym Undiff (begge døtrene beholder fenotypen til opprinnelsescellen), Sym Diff (begge døtrene har samme fenotype, og den er forskjellig fra opprinnelsescellen), Asym Undiff (bare en datter beholder fenotypen til opprinnelsescellen), og Asym Diff (begge døtrene har forskjellige fenotyper og ingen av dem ligner opprinnelsescellen). (E) Histogrammer av bidraget fra celletyper klassifisert per generasjon for MPP-er dyrket med "Diff" -cocktailen; n = 204 celler og 97 familier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 5: Beskrivelse av antall analyserte familier og celler per hver eksperimentelle tilstand (opprinnelsescelle og cellekulturmedium). Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

MultiGen-analysen er en høy gjennomstrømning, enkel å utføre og billig analyse, som har vært medvirkende til å studere lymfocytt 23,24,35 og murine hematopoietiske celler 26,27. Her presenterer vi en ny utvikling av tilnærmingen som gjør det mulig å dechiffrere ex vivo den tidlige fasen av menneskelig HSPC-forpliktelse, på enkeltcellenivå ved hjelp av kortsiktig kultur (figur 6). Encellede ex vivo-kultursystemer brukes vanligvis til å vurdere den langsiktige skjebnen til HSPCer i modne celler, men noen skjebner forekommer tidligere enn andre36, noe som potensielt forstyrrer analysen mot færre skjebner. I tillegg savner disse kultursystemene vanligvis informasjon om divisjoner under skjebneforpliktelsen. De første forpliktelsestrinnene har vist seg å skje så tidlig som i begynnelsen av kulturen, noen ganger uten divisjon26,37, noe som gjør kortsiktig kultur og sporingsdeling avgjørende for å studere tidlig skjebneforpliktelse. Ved samtidig å følge skjebnen, divisjonen og slektskapet, gjør denne analysen det mulig å forstå rollen som den første divisjonen og skjebnebeslutningen i menneskelige HSPCer. Ved hjelp av analysen er det mulig å utlede etter hvor mange divisjoner forpliktelsesprosessen oppstår, balansen mellom selvfornyelse og differensiering for de tidlige forfedrene, og hvordan disse egenskapene arves over generasjoner. Så vidt vi vet, er dette den eneste analysen som tillater denne typen målinger for humane HSPCer, ved encelleoppløsning. I tillegg, ved å bruke forskjellige kombinasjoner av celledelingsfarger, økte vi gjennomstrømningen av analysen, noe som gjør denne analysen til et verdifullt verktøy for å generere store datasett raskt. Fargestoffkombinasjonene tillater å følge flere familier i de samme brønnene, og øker antall celler som er tilgjengelige for analyse i kortsiktig kultur. Antall kombinasjoner kan potensielt økes enda mer, ved tilsetning av andre fargestoffer (f.eks. Gult fargestoff) eller modifisering av forholdet mellom CFSE og CTV. Dette reduserer imidlertid antall andre parametere som kan analyseres.

Figure 6
Figur 6: Skjematisk fremstilling av protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å utføre analysen vellykket, på grunn av det store antallet brønner og det reduserte antall celler som skal analyseres, er det nødvendig å kjøre flowcytometrianalysen på en analysator utstyrt med en plateleser. Den nye generasjonen benkanalysatorer er spesielt tilpasset denne analysen, da de fleste av dem har et mindre dødvolum for å redusere prosentandelen av celletap. Dette garanterer i sin tur en høyere effektivitet i å gjenvinne hele hver brønn, noe som gir en effektivitet estimert i 70% -området26. Estimering av celletap under flowcytometri-oppkjøpet er avgjørende for analysen av hver enkelt familie. For eksempel, forutsatt ingen celledød og teller antall divisjoner, er det mulig å estimere antall celler per hver familie. Likevel er det ønskelig å kjøre noen bekreftende eksperimenter, spesielt i estimering av celledød i de testede kulturforholdene og måling av utvinningsgraden eksperimentelt ved bruk av et definert antall celler.

Et av de avgjørende trinnene i denne protokollen er toppoppdraget. Som allerede nevnt er en toppfordeling av god kvalitet sterkt avhengig av isolering av svært smale topper ved cellesortering. Likevel er det fortsatt vanskelig å tildele riktig antall divisjoner basert unikt på fordelingen. Siden cellesortering og flowcytometrianalyse utføres på to forskjellige maskiner, er det ikke mulig å sammenligne intensiteten til hvert signal direkte, så det kan være vanskelig å vite om den første toppen observert i høyre ende av histogrammet er topp 0 eller topp 1. I denne forbindelse er få løsninger mulige; En måte er å utføre et ortogonalt eksperiment for nøyaktig å måle antall divisjoner utført av disse cellene (f.eks. Levende celleavbildning). En annen mulighet er å bare telle antall celler i brønnen under et invertert lysfeltmikroskop, før du kjører flowcytometrianalysen. Dette vil utlede et gjennomsnittlig antall divisjoner (forutsatt ingen celledød). Endelig er en post-hoc-løsning for toppoppdrag påvisning av et uvanlig antall "umulige familier"; Disse familiene er sammensatt av et større enn mulig antall celler per generasjon (f.eks. Fem celler i generasjon 2, eller to celler i generasjon 1 og en celle i generasjon 2). Muligheten til å ekskludere umulige familier er kodet i det statistiske analysetrinnet, og flagger den umulige familien. Dersom forekomsten av disse feilene er for høy, er det rimelig å anta at topptildelingen må revideres.

I denne protokollen inkluderte vi noen få eksempler på datarepresentasjon og analyse for analysen, da dette har blitt et viktig trinn i generering og tolkning av store datasett38. Det første eksemplet er varmekartet som viser totaliteten av alle analyserte celler, organisert per familie. Dette er et effektivt verktøy for å utforske de generelle egenskapene til dataene og potensielle konklusjoner: er familier sammensatt av flere celletyper eller har de en tendens til å være homogene i sammensetningen? Er familier spredt over flere generasjoner, eller deler de stort sett like mange ganger? Denne utforskende analysen må deretter suppleres med mer spesifikke plott og statistisk testing. Den kan brukes til kvantitativt å vurdere symmetrisk og asymmetrisk skjebneforpliktelse, differensiering uten divisjon, balansen mellom selvfornyelse og differensiering, og antall divisjoner for en gitt forpliktelsesskjebne. Det er grunnleggende, under eksperimentell planlegging, å sette cellekulturlengden i samsvar med typen spørsmål som stilles; For eksempel, for de to første spørsmålene (symmetrisk / asymmetrisk balanse og differensiering uten divisjon), tillater planlegging av svært korte kulturer trinn isolering av et stort antall familier som bare har utført en eller ingen divisjoner i det heletatt 26. Omvendt tillater lengre eksperimenter utforskning av antall divisjoner som kreves for en bestemt celleforpliktelse, da de prøver familier på forskjellige stadier av differensiering. Likevel er denne metoden ikke designet for langsiktige kulturer (2-3 uker), da cellefargestofffortynning ikke er i stand til nøyaktig å spore mer enn syv eller åtte divisjoner22. Som en konsekvens er dette verktøyet for det meste tilpasset for å studere tidlig engasjement av hematopoietiske progenitorer, og er ikke designet for å gjøre robuste konklusjoner om de langsiktige differensieringsegenskapene til disse cellene.

Det statistiske rammeverket ble utviklet spesielt for analyse av denne typen data og basert på begrepet permutasjoner26. Dette var nødvendig på grunn av observasjonen av en familiær avhengighet av celletypefordelingen og på antall utførte divisjoner. Med andre ord, celler som er en del av samme familie er også mer sannsynlig å vise lignende fenotyper og dele seg samme antall ganger. Selv om en grundig analyse ligger utenfor omfanget av dette arbeidet, bør det gitte settet med statistiske tester være tilstrekkelig når man vurderer forskjellige forhold.

Avslutningsvis utgjør denne protokollen et verdifullt verktøy for å vurdere den cellulære dynamikken til hematopoietiske stam- og stamceller ex vivo, på en rask og billig måte. På grunn av sin fleksibilitet og allsidighet med hensyn til tidspunkt, kulturforhold og type HSPCer analysert, tillater det å teste en rekke eksperimentelle forhold. Som en flowcytometribasert analyse kan den implementeres i de fleste laboratorier, og den krever ikke omfattende forkunnskaper, noe som gjør den til en god kandidat for screeninger og piloteksperimenter.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter som er relevante for dette arbeidet. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og tolkning, eller beslutningen om å sende inn arbeidet for publisering.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke medlemmene av Institut Curie Flow Facility for deres hjelp med å sette opp flowcytometri-eksperimentene. Vi ønsker også å anerkjenne bidragene fra de andre medlemmene av Team Perié under flere diskusjoner. Vi takker Dr. Julia Marchingo og Prof. Phil Hodgkin (Walter end Eliza Hall Institute of Medical Research) for å dele sin protokoll for multipleksing av celledelingsfarger på lymfocytter. Vi takker Saint Louis hospital cord blood biobank for å gi de biologiske ressursene som er nødvendige for utviklingen av denne protokollen. Studien ble støttet av et ATIP-Avenir-tilskudd fra CNRS og Bettencourt-Schueller Foundation (til LP), tilskudd fra Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (til LP og AD), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (til LP), Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, til LP), og ITMO MIIC-tilskuddet (21CM044, til LP). I tillegg til finansiering fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram ERC StG 758170-Microbar (til LP), ble AD støttet av et stipend fra Fondation de France.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes vWR 87003-294
15-mL polypropylene tubes vWR 734-0451
50-mL polypropylene tubes vWR 734-0448
96-well U-bottom culture plate  Falcon 353077
Anti-human Lin APC Thermo Fisher 22-7776-72 Dilution 1/40
ARIA III BD Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Life Technologies C34570
Cell Trace Violet (CTV)  Life Technologies C34571
Compensation beads  BD 552843
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies 11320033
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Thermo Scientific J62948-36 Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water
FC block Fc1.3216 BD 564220 Dilution 1/50
Fetal Bovine Serum (FBS) Dutscher S1900-500C Batch S00CH
FlowJo v10.8.1 BD
Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a Biolegend 312216 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3 BD 564195 Dilution 1/15
Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581 Biolegend 343513 Dilution 1/40
Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7 Biolegend 356620 Dilution 1/40
Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100 BD 560673 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100 BD 560675 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10 Biolegend 328110 Dilution 1/20
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Life Technologies 10010001
Python
R
Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes Falcon
ZE5  Biorad Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader
Laboratory prepared
Cell culture media Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 °C until use
DMEM + 10% FBS Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM
PBS 1X + EDTA 0.1% Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X
Staining buffer Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. Single-cell immunology: Past, present, and future. Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).
  2. Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity. Bioessays. 44 (11), 2200084 (2022).
  3. Regev, A., et al. The human cell atlas. Elife. 6, 27041 (2017).
  4. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  5. Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
  6. Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies. Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).
  7. Perié, L., Duffy, K. R. Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods. FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).
  8. Yu, V. W. C., et al. Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells. Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).
  9. Ganuza, M., et al. Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny. Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).
  10. Naik, S. H., Schumacher, T. N., Perié, L. Cellular barcoding: A technical appraisal. Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).
  11. Quek, L., et al. Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 − acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage. The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).
  12. Karamitros, D., et al. Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells. Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).
  13. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  14. Delaney, C., et al. Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).
  15. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  16. Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. Antagonism of PPAR-γ 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis. Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).
  17. Vannini, N., et al. The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
  18. Gupta, R., et al. Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity. Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).
  19. Horwitz, M. E., et al. Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study. Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).
  20. Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation. Science. 367 (6479), 3381 (2020).
  21. Loeffler, D., Schroeder, T. Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification. Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).
  22. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. Journal of Visualized Experiments. (70), e4287 (2012).
  23. Marchingo, J. M., et al. T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate. Nature Communications. 7, 13540 (2016).
  24. Horton, M. B., et al. Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing. Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).
  25. Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. Testing statistical hypotheses. , Springer. New York. 784 (2005).
  26. Tak, T., et al. HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity. Elife. 10, 360624 (2021).
  27. Sommerkamp, P., et al. Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).
  28. Kato, K., Radbruch, A. Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting. Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).
  29. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
  30. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  31. Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
  32. Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
  33. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
  34. Davison, A. C., Hinkley, D. V. Bootstrap Methods and their Application. , Cambridge University Press. (1997).
  35. Horton, M. B., et al. Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable. Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).
  36. Notta, F., et al. Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
  37. Grinenko, T., et al. Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice. Nature Communications. 9 (1), 1898 (2018).
  38. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

Tags

Tilbaketrekking utgave 193
Samtidig vurdering av slektskap, divisjonsnummer og fenotype <em>via</em> flowcytometri for hematopoietiske stam- og stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donada, A., Tak, T., Prevedello, G., … More

Donada, A., Tak, T., Prevedello, G., Milo, I., Duffy, K. R., Perié, L. Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64918, doi:10.3791/64918 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter