Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidig vurdering af slægtskab, divisionsnummer og fænotype via flowcytometri for hæmatopoietiske stam- og stamceller

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64918
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 1, 2, 1
1Quantitative Immuno-hematology, CNRS UMR168, Institut Curie, 2Hamilton Institute, Maynooth University, 3Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3348, Orsay, 4Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, CNRS UMR 3348, Orsay

Summary

Præsenteret her er en flowcytometribaseret teknik, der giver mulighed for samtidig måling af antallet af celledelinger, overfladecellefænotype og cellulært slægtskab. Disse egenskaber kan testes statistisk ved hjælp af en permutationsbaseret ramme.

Abstract

Få teknikker kan vurdere fænotype og skæbne for den samme celle samtidigt. De fleste af de nuværende protokoller, der bruges til at karakterisere fænotype, selvom de er i stand til at generere store datasæt, nødvendiggør ødelæggelsen af cellen af interesse, hvilket gør det umuligt at vurdere dens funktionelle skæbne. Heterogene biologiske differentierende systemer som hæmatopoiesis er derfor vanskelige at beskrive. Med udgangspunkt i celledelingssporingsfarvestoffer videreudviklede vi en protokol til samtidig bestemmelse af slægtskab, divisionsnummer og differentieringsstatus for mange enkelte hæmatopoietiske forfædre. Denne protokol gør det muligt at vurdere ex vivo-differentieringspotentialet hos murine og humane hæmatopoietiske forfædre, isoleret fra forskellige biologiske kilder. Da det desuden er baseret på flowcytometri og et begrænset antal reagenser, kan det hurtigt generere en stor mængde data på enkeltcelleniveau på en relativt billig måde. Vi leverer også den analytiske pipeline til enkeltcelleanalyse kombineret med en robust statistisk ramme. Da denne protokol tillader sammenkædning af celledeling og differentiering på enkeltcelleniveau, kan den bruges til kvantitativt at vurdere symmetrisk og asymmetrisk skæbneforpligtelse, balancen mellem selvfornyelse og differentiering og antallet af divisioner for en given forpligtelsesskæbne. Alt i alt kan denne protokol bruges i eksperimentelle designs, der sigter mod at optrævle de biologiske forskelle mellem hæmatopoietiske forfædre fra et enkeltcelleperspektiv.

Introduction

Det sidste årti var præget af den verdensomspændende spredning af enkeltcellede tilgange til cellulær og molekylærbiologi. Efter at have fulgt trinene i enkeltcellegenomik1,2 er det i dag muligt at studere mange komponenter i en enkelt celle (f.eks. DNA, RNA, proteiner), med nye enkeltcelle-omics-teknikker, der spirer hvert år. Disse teknikker har kastet lys over gamle og nye spørgsmål inden for immunologi, neurobiologi, onkologi og andre, både ved hjælp af humane og modelorganismeceller3. Ved at fremhæve forskellene mellem individuelle celler foranledigede enkeltcelle-omics definitionen af en ny model af hæmatopoiesis, centreret om heterogeniteten af hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC'er) og bevægede sig væk fra den klassiske model af diskrete homogene populationer 4,5.

En af de få ulemper ved alle -omics-teknikkerne er ødelæggelsen af den relevante celle, hvilket udelukker muligheden for at vurdere dens funktionalitet. Omvendt giver andre enkeltcellemetoder, såsom enkeltcelletransplantationsanalyse og afstamningssporingsteknologier, en aflæsning af forfadercellens funktionalitet ved at vurdere individuelle cellers skæbne in vivo 6,7. Afstamningssporingsteknologier involverer mærkning af den interessante celle med en arvelig genetisk7 eller en fluorescerende etiket8,9, hvilket gør det muligt at følge skæbnen for flere enkeltceller på samme tid. Imidlertid er karakteriseringen af startcellerne typisk begrænset til et begrænset antal parametre, såsom ekspressionen af nogle få overfladeproteiner vurderet ved flowcytometri10. Derudover kræver enkeltcelle afstamningssporingsteknologier besværlig detektion af den cellulære etiket, typisk via DNA / RNA-sekventering eller billeddannelse. Dette sidste punkt begrænser især antallet af forhold, der kan testes i et enkelt eksperiment.

En anden klasse af metoder, der bruges til at studere funktionaliteten af enkeltceller, er ex vivo-celledyrkningssystemer af enkelte HSPC'er. Disse guldstandardassays er nemme at udføre og involverer sortering af individuelle celler i cellekulturbeholdere med 96 brønde og efter dyrkning karakteriserer celleafkomfænotypen, typisk ved flowcytometri eller morfologisk analyse. Disse analyser er for det meste blevet brugt til at karakterisere den langsigtede differentiering af HSPC'er i modne celler, typisk efter 2-3 ugers dyrkning 11,12. Alternativt er de blevet brugt til at forsøge at opretholde og udvide ex vivo HSPC'er 13,14,15,16,17,18 med løftet om medicinsk fordel ved transplantation af humane stamceller 19. Endelig er de blevet brugt til at studere HSPC'ers tidlige engagement ved hjælp af kortvarig kultur20, hvor det lave antal celler, der genereres i denne kultur, er den vigtigste begrænsende faktor. En ulempe ved disse forskellige former for ex vivo-assays er, at de kun delvist afspejler in vivo-kompleksiteten; Alligevel er de en af de sjældne måder at studere menneskelig HSPC-differentiering på.

Et manglende stykke information fra eksisterende enkeltcellemetoder (enkeltcelle-omics, afstamningssporing og ex vivo-kultur) er den nøjagtige detektion af celledelinger, en vigtig parameter at overveje, når man studerer HSPC-dynamik21. En enkel måde at vurdere antallet af divisioner via flowcytometri er brugen af opløselige "proteinfarvestoffer", som 5-(og 6)-carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE)22. Disse divisionsfarvestoffer diffunderer inde i cytoplasmaet i de farvede celler og fortyndes med halvdelen og overføres til de to datterceller ved hver celledeling, hvilket gør det muligt at opregne op til 10 divisioner. Ved at kombinere flere divisionsfarvestoffer er det muligt at frø flere individuelle forfædre i samme brønd, da hvert enkelt farvestof tillader adskillelse af de forskellige efterkommere. Dette er princippet bag brugen af cellefarvestoffer til multiplex klonal og divisionssporing, der først blev introduceret for murine lymfocytter23,24.

Her præsenterer vi udviklingen af MultiGen-analysen til brug med murin og humane HSPC'er. Det tillader test af mange enkeltceller samtidigt for deres egenskaber ved differentiering, opdeling og slægtskab ex vivo. Denne høje gennemstrømning, let at udføre og billig analyse gør det muligt at måle den cellulære fænotype, antallet af udførte divisioner og celleslægtskabet og klonforholdet med de andre celler i brønden, alt sammen på samme tid. Det kan bruges til kvantitativt at vurdere symmetrisk og asymmetrisk skæbneforpligtelse, balancen mellem selvfornyelse og differentiering og antallet af divisioner, der er nødvendige for en given forpligtelsesskæbne. Protokollen kræver en fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og et flowcytometer med en pladelæser plus det nødvendige udstyr til at udføre cellekultur. Ud over den tekniske protokol til udførelse af analysen på humane HSPC'er leverer vi også den detaljerede analyseramme, herunder den statistiske test, der er nødvendig for at vurdere cellulære egenskaber relateret til begrebet cellefamilie25. Denne protokol er allerede blevet brugt med succes til at beskrive murine HSPC-rummet26,27.

Følgende protokol bruger magnetisk berigede CD34+-celler som udgangsmateriale28. På denne måde er det muligt effektivt at plette og isolere de humane HSPC'er fra forskellige blodkilder (f.eks. Navlestrengsblod, knoglemarv, perifert blod). Det er vigtigt ikke at kassere CD34-fraktionen, da den vil blive brugt som en del af protokollen til at indstille forskellige typer eksperimentelle kontroller. De nævnte cellemængder og volumener kan skaleres op eller ned i henhold til den eksperimentelle arbejdsgang og fornødenheder. På samme måde kan protokollen tilpasses undersøgelsen af forskellige typer forfædre, blot ved at ændre de antistoffer, der anvendes til cellesortering og flowcytometritrin.

Protocol

For den følgende protokol blev afidentificeret navlesnorsblod brugt som HSPC-kilde og indsamlet i overensstemmelse med retningslinjerne defineret af Saint-Louis Hospital navlestrengsblodbiobank (autorisation AC-2016-2759) og med Helsingfors-erklæringen.

BEMÆRK: Før du starter, skal du sikre dig, at alle reagenser og udstyr, der er nødvendigt for denne protokol, er tilgængelige, som anført i materialetabellen og nævnt i protokollen. De relevante reagenser tilberedes friske, og de opbevares ikke, medmindre det udtrykkeligt er nævnt.

1. Farvning af cellefarve

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver farvning med fire kombinationer af CFSE og violet farvestof (CTV) celledelingsfarvestoffer. Behandl alle rørene samtidigt, selvom der ikke tilsættes nogen cellefarveopløsning. Alle trin udføres under sterile forhold for at tillade følgende cellekulturtrin. Tidsforbrug: ca. 100 min.

  1. Behandl navlestrengsblodenheden i henhold til en magnetisk sorteringsprotokol29. Sørg for, at to fraktioner er tilgængelige: en stor CD34- fraktion og en mindre CD34+ fraktion. Drej begge rør i 5 minutter ved 300 x g. Supernatanten suges til uden at forstyrre pelletsen.
  2. For CD34+ fraktionen resuspenderes den i 1 ml af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) uden føtalt bovint serum (FBS). Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer; celletætheden bør ikke være højere end 3 x 106 celler/ml. Hvis dette er tilfældet, skal du tilpasse lydstyrken i overensstemmelse hermed. For CD34-fraktionen skal du resuspendere i DMEM uden FBS og justere lydstyrken til maksimalt 6 x 106 celler/ml.
  3. Alikvote 250 μL af CD34+ fraktionen i fire 15 ml polypropylenrør. Mærk rørene som følger: CD34+/CF (CFSE_only), CD34+/CV (CFSE_high CTV_low), CD34+/VC (CFSE_low CTV_high) og CD34+/VI (CTV_high). Alikvote 250 μL af CD34- fraktionen i yderligere fire 15 ml polypropylenrør. Mærk rørene som følger: CD34-/CF (CFSE_only), CD34-/CV (CFSE_high CTV_low), CD34-/VC (CFSE_low CTV_high) og CD34-/VI (CTV_high). De resterende celler fra CD34-fraktionen kan kasseres.
  4. Forbered to CFSE-løsninger med navnene CFSE_high og CFSE_low. Til CFSE_high (10 μM) blandes 1,1 ml DMEM uden FBS med 2,2 μL CFSE-lager (5 mM). Til CFSE_low (5 μM) blandes 550 μL DMEM uden FBS og 0,55 μL CFSE-lager (5 mM).
  5. Der tilsættes 250 μL af CFSE_high opløsningen til CF- og CV-rørene, 250 μL af den CFSE_low opløsning til VC-rørene og 250 μL DMEM uden FBS til VI-røret. For at sikre en effektiv blanding af cellesuspension og cellefarvestof skal du hælde røret næsten 90 grader og deponere CFSE-opløsningerne på rørvæggen. Hold derefter røret lodret for at blande de to opløsninger, og pipette tre eller fire gange for at sikre en hurtig blanding af CFSE-opløsningerne med de resuspenderede celler. Inkuber ved 37 °C i præcis 8 min.
  6. Efter inkubationen tilsættes 5 ml DMEM + 10% FBS. Opbevar glassene ved 37 °C i 5 min.
  7. Drej rørene i 5 min ved 300 x g. Supernatanten fjernes via aspiration uden at forstyrre pelletsen, og pelletpen vaskes med 5 ml fosfatbufret saltvand 1x/ethylendiamintetraeddikesyre (PBS 1x/EDTA). Spin igen i 5 min ved 300 x g. Supernatanten kasseres uden at forstyrre pelletten, og cellepelletsen resuspenderes i 250 μl 1x PBS/EDTA.
  8. Forbered to CTV-løsninger med navnene CTV_high og CTV_low. For CTV_high (10 μM) blandes 1,1 ml PBS 1x/EDTA og 2,2 μL CTV-lager (5 mM). For CTV_low (5 μM) blandes 550 μL PBS 1x/EDTA med 0,55 μL CTV-materiale (5 mM).
  9. Der tilsættes 250 μL af den CTV_high opløsning til VC- og VI-rørene, 250 μL af den CTV_low opløsning til CV-røret og 250 μL 1x PBS /EDTA til CF-røret. Brug samme teknik som beskrevet i trin 1.5. Inkuber ved 37 °C i præcis 8 min.
  10. Efter inkubationen tilsættes 5 ml DMEM + 10% FBS. Opbevares ved 37 °C i 5 min.
  11. Drej glassene i 5 minutter ved 300 x g, kassér supernatanten uden at forstyrre pillen, og vask derefter pillen med 5 ml 1x PBS/EDTA. Spin igen i 5 min ved 300 x g.
  12. Supernatanten kasseres uden at forstyrre pelletten, og CD34- fraktionerne resuspenderes i 1x PBS/EDTA i en slutkoncentration på 1,5 x 106 celler/ml. Resuspender CD34+ fraktionerne i 40 μL farvningsbuffer, og overfør cellerne til 1,5 ml rør.

2. Antistoffarvning

BEMÆRK: Antistoffarvning kan tilpasses efter de eksperimentelle behov. Kun CD34+ fraktionerne gennemgår antistoffarvning; CD34-fraktionerne bruges som en enkelt farvningskontrol til farvekombinationerne til celledeling (CV-, VC-, CF- og VI-fraktioner ). Følgende panel er skræddersyet til påvisning af fire typer HSPC'er: hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), multipotente stamceller (MPP'er), lymfoidprimede multipotente stamceller (LMPP'er) og hæmatopoietiske stamceller (HPC'er)12. Identifikation af HSC'er og MPP'er præsenteres dog. Påkrævet tid: 75 min.

  1. Forbered enkeltfarvningen til overfladefarvning ved hjælp af kompensationsperler. Bland negative perler og immunglobulin G (IgG) perler i forholdet 1:1 for et samlet volumen svarende til 20 μL x antallet af overflademarkører (f.eks. 120 μL, hvis farvningspanelet indeholder seks antistoffer).
  2. Send 20 μL perler i individuelle 1,5 ml rør for hver markør. Der tilsættes det volumen, der svarer til fortyndingsfaktoren for hvert antistof i det tilsvarende glas (hvis fortyndingsfaktoren f.eks. er 1:20, tilsættes 1 μL).
  3. For at plette CD34+ cellerne skal du forberede en masterblanding af antistoffer12, baseret på tabel 1. Bland antistofferne i et enkelt 0,5 ml rør. Der tilsættes 7 μL fra antistofmasterblandingen til hver af de fire CD34+ betingelser.
  4. Inkuber kompensationsperlerne og CD34+ prøverne ved 4°C i mindst 30 min.
    BEMÆRK: Inkubationstiden skal tilpasses de tekniske detaljer for de antistoffer, der anvendes til farvning.
  5. Under inkubationen forberedes den 96-brønds rundbundede plade, der skal bruges til sortering, idet der tilsættes 100 μL cellekulturmedium til hvert hul ved hjælp af en multikanalpipette.
    BEMÆRK: Lad hulerne H8-H12 være tomme.
  6. Mærk 5 ml polypropylenrør til overfladefarvningskontrollerne (5 ved hjælp af perler), celledelingsfarvestofferne (4 ved hjælp af CD34-fraktionerne) og CD34+ prøverne (4).
  7. Ved afslutningen af inkubationen vaskes cellerne og perlerne med 1 ml farvningsbuffer. Overfør det samlede volumen til 5 ml polypropylenrørene. Centrifuger glassene i 5 minutter ved 300 x g, og sug derefter supernatanten uden at forstyrre pelleten.
  8. Resuspender cellerne i farvningsbuffer ved hjælp af ca. 500 μL hver til perlerne og CD34+ cellerne og 1 ml til CD34- rørene.

Tabel 1: Skabelon til forberedelse af antistofmasterblandingen til et cellesorteringseksperiment. Klik her for at downloade denne tabel.

3. Cellesortering

BEMÆRK: De sorterede cellenumre kan variere afhængigt af det samlede antal tilgængelige celler. I protokollen angives et minimumscellenummer for hver kontrol. Tidsforbrug (for en enkelt plade): 100 min.

  1. Åbn skabeloneksperimentet, eller angiv et nyt eksperiment. Opret en enkelt prøve og flere rør, et pr. Hver tilstand.
  2. Indstil gating-strategien, der er beskrevet i figur 1, og opret seks punktplotdiagrammer. Først skal du visualisere cellerne på et FSC-A / SSC-A prikplot, og dobbeltklik på polygongatingværktøjet for at vælge en population med lav sidespredning (figur 1A). I det følgende prikplot (FSC-A / FSC-H) skal du højreklikke på plottet og vælge porten "Celler" i rullemenuen ved at klikke på den. Brug det samme gatingværktøj til at vælge en tæt population på diagonalen mellem de to akser (figur 1B).
  3. I det tredje prikplot (APC vs. FSH-H) vises populationen "Single Cells" og gate cellerne negativt for ekspressionen af APC Lineage (Lin) (figur 1C). I det fjerde plot (CFSE vs. CTV) skal du vise populationen "Lin-" og oprette fire adskilte porte, en for hver farvekombination (figur 1D).
    BEMÆRK: Disse porte skal være stramme for kun at vælge en lille brøkdel af homogent farvede celler.
  4. Brug det femte og sjette plot (APC-Cy7 vs. BV650 og PE-Cy7 vs. PE) til at identificere forfædrene af interesse. Gate generøst CD34 + CD38- befolkningen og CD34 + CD38 + i det femte plot (figur 1E). Vælg derefter CD34 + CD38- befolkningen i det sjette plot, og tegn tre porte i henhold til figur 1F.
  5. Kør de enkelte farvningsrør, der indeholder kompensationsperlerne, ved at klikke på knappen Anskkaffe . Juster fotomultiplikatorrørets (PMT) spændinger fra rullemenuen Parametre , især for celledelingsfarvestofferne (mellem 104 og 105 på en bieksponentiel skala).
  6. Afgræns kompensationsmatrixen i overensstemmelse hermed til det panel, der bruges til sortering, ved hjælp af fanen Kompensation . Optag mindst 5.000 begivenheder i perleporten ved at klikke på knappen Optag .
  7. Kør CD34-fraktionerne, og kontroller kompensationsmatrixen igen. Optag mindst 10.000 hændelser i enkeltcelleporten.
  8. Kør CD34+ fraktionerne, og optag mindst 5.000 hændelser i enkeltcelleporten. Juster porten for hver farvekombination, og indstil en stram port for at vælge en homogen population (figur 1D). På samme måde skal du justere gatingen til valg af HSC'er og MPP'er.
  9. Når analysen er afsluttet, og alle rør er registreret, indsættes pladen i den relevante holder, når du har udført ARIA-standardkalibreringen til sortering på plader med 96 huller. Det anbefales at afkøle pladen.
  10. Forbered skabelonen til sortering af plader i henhold til skemaet i tabel 2 ved hjælp af layoutet til eksperimentsortering. Brøndene med navnet "CD34-" indeholder 5.000-10.000 celler, sorteret på CF/CV/VC/VI-porten. "Bulk" brøndene indeholder mindst 500 celler, sorteret på porten CD34 + CD38-. Endelig indeholder enkeltcellebrøndene kun én hændelse pr. celledelingsfarvekombination pr. brønd, altså fire hændelser pr. brønd i alt.
    BEMÆRK: "Bulk" populationerne kan tilpasses specifikke forfædres delmængde; Sorter ikke mindre end 500 celler.
  11. Til sorteringen skal du fortsætte i rækkefølge og udfylde hver farvestofkombination, inden du går videre til den næste. Start f.eks. med at sortere CD34-CF i flydespænding . Klik på anskaffelsesknappen og derefter på sorteringsknappen.
  12. I slutningen af CD34-sorteringen skal du indsætte CF CD34+ røret. Erhverv, klik derefter på sorteringsknappen, og sørg for at have markeret 0/16/0 som renhedsgrad. Til sidst skal du sortere cellerne af interesse, en celle pr. Brønd, i enkeltcellerenhed, og sørg for at markere indstillingen Indekssortering.
  13. Gå til følgende farvestofkombination til celledeling, og gentag den samme rækkefølge. Som reference giver tabel 2 et eksempel på en sorteret plade.
    BEMÆRK: Indekssorteringsfunktionen genererer individuelle filer for hver sorteret tilstand.
  14. I slutningen af sorteringen skal du eksportere filerne som .fcs 3.0-filer. Sæt cellerne i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Cellerne dyrkes i flere dage i henhold til det eksperimentelle design i mindst 24 timer26.

Tabel 2: Skabelon til en cellesorteringsplade med 96 brønde baseret på de specifikke krav til den successive flowcytometrianalyse. Klik her for at downloade denne tabel.

4. Analyse af cellesorteringsdata

BEMÆRK: For at validere kvaliteten af cellesortering er FACS-dataanalysen nødvendig, før du går videre. Hovedoutputtet i dette trin er genereringen af et regneark, der indeholder markørintensiteterne for hver sorteret individuel celle.

  1. Upload .fcs 3.0-filerne i analysesoftwaren.
  2. Kontroller den kompensationsindstilling, der bruges under cellesortering, ved hjælp af de enkelte farvningsfiler, der er optaget før den faktiske sortering.
  3. Indstil den reviderede gating-strategi ved hjælp af de filer, der svarer til den forskellige bulk. Kopier og indsæt disse porte på indekssorteringsfilerne.
  4. Kontroller, at indekssorterede celler faldt i den indstillede port. Hvis der er nogle sorterede celler, der var forkert gated, kan de identificeres ved at eksportere de pladekoordinater, der blev registreret under indekssortering, og fjernes senere i analysen.
  5. Eksportér hændelsen fra indekssorteringsfilerne som kompenserede parametre. Eksporter dem som .csv filer, afkryds indstillingerne "skalaværdier" og "kompenserede parametre". Disse filer skal eksporteres i en mappe med navnet "Eksporterede filer".
  6. Kombiner alle filerne i en enkelt .csv fil ved hjælp af scriptet i supplerende fil 1. Indstil den rigtige sti med funktionen "setwd". Outputtet af dette script er et regneark, der indeholder alle de forskelligt lukkede begivenheder og de relative intensiteter for alle parametrene.

5. Efter dyrkning antistoffarvning

BEMÆRK: Udfør denne del af protokollen under sterile forhold; Flere reagenser deles med de tidligere trin og skal forblive sterile. Til flowcytometrianalysen skal du bruge et flowcytometer med en pladelæser. Dette gør det muligt at udføre farvningen direkte i vævskulturpladen, hvilket reducerer celletabet til et minimum ved at begrænse mængden af pipettering og spinding. Forbered overflademarkørens enkeltfarvede farvning ved hjælp af kompensationsperlerne, undtagen hullerne A1-A4, som repræsenterer enkeltfarvningen for CF/CV/VC/VI-farverne og allerede findes i 96-brøndspladen. Bulkpopulationerne sorteret efter cellefarvestoffet hjælper med at indstille gating-strategien for antallet af divisioner og den generelle gating. Påkrævet tid: 120 min.

  1. Før du starter protokollen, skal du markere brøndene, der indeholder mindst en celle, ved at kontrollere pladen under et omvendt mikroskop. Dette trin gør det muligt at optimere mængden af antistof, der anvendes til farvning og fremskynder proceduren.
  2. Forbered antistofmastermixet i henhold til tabel 3. Da der er en betydelig mængde pipettering, tager tabellen højde for den tekniske fejl på grund af pipettering, herunder en ekstra volumen på 5 %. Antistofferne beskrevet i tabellen gør det muligt at karakterisere en række HSPC'er fra humane navlestrengsblodprøver12.
  3. Centrifuger pladen i 5 minutter ved 300 x g. Vend hurtigt pladen på hovedet under hætten og over et køkkenrulle for at fjerne supernatanten.
  4. Der tilsættes 8 μL farvningsbuffer til hul A1-A4. Der tilsættes 8 μL af blandingen til de andre huller.
  5. Bland de negative perler og IgG-kompensationsperler i forholdet 1:1 for et samlet volumen svarende til 120 μL. Send 20 μL i et 1,5 ml rør pr. markør. Der tilsættes det antistofvolumen, der svarer til fortyndingsfaktoren (hvis fortyndingsfaktoren f.eks. er 1:20, tilsættes 1 μL).
    BEMÆRK: Tilpas det samlede volumen til antallet af markører, der bruges til farvningen (f.eks. 100 μL, hvis farvningspanelet indeholder fem antistoffer).
  6. Pladen og enkeltfarvningskompensationskontrollerne inkuberes ved +4 °C i mindst 30 minutter.
    BEMÆRK: Inkubationstiden skal tilpasses de tekniske detaljer for de antistoffer, der anvendes til farvningen.
  7. Vask perlerne med 1 ml farvningsbuffer. Overfør det samlede volumen til de 5 ml polypropylenrør, der tidligere er mærket. Centrifuger glassene i 5 minutter ved 300 x g, og fjern derefter supernatanten via aspiration.
  8. Cellerne i pladen vaskes ved at tilsætte 100 μL farvningsbuffer pr. hul ved hjælp af en flerkanalpipette. Pladen centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter, og derefter vendes pladen hurtigt på hovedet under hætten og over et køkkenrulle for at fjerne supernatanten.
  9. Ophvæs cellerne igen i 85 μL farvningsbuffer ved hjælp af en multikanalpipette.
  10. Start analysen på flowcytometeret (Acquisition mode) ved hjælp af den dedikerede skabelon og klik på brugerdefineret. Denne tilpassede skabelon tager højde for de tekniske egenskaber ved den 96-brønds rundbundede plade, især dimensionerne på hver brønd (diameter, dybde og tykkelse). Sonden skal nå bunden af brønden, så sæt den i det nøjagtige centrum af brøndene A1 og H12.
  11. Når du har valgt fluoroforerne af interesse fra listen foreslået af softwaren, skal du indstille pladeopsætningen efter pladeskabelonen i tabel 2, korrigeret for antallet af brønde, der indeholder mindst en celle.
  12. Vælg 100 μL som grænse for anskaffelsesvolumen. Marker omrøringsindstillingen . Indstil anskaffelseshastigheden til maks. 1 μL/s, da lavere hastighed forbedrer den samlede analysede volumen pr. brønd.
  13. Tilsæt passende rengørings- og vaskeopløsninger til brønd H8-H12. Skabelonen i tabel 2 lader specifikt brøndene H8-H12 være tomme, da flowcytometeret skal køre en række vaskebetingelser i slutningen af analysen.
    BEMÆRK: Dette trin er tilpasset specifikationerne for det anvendte flowcytometer.
  14. I afsnittet plots and gates skal du først indstille enkeltcelleporten ved hjælp af FSC-A/SSC-A-scatterplottet og derefter FSC-H/FSC-A-scatterplottet. Opret et histogram for hver markør af interesse.
  15. Når indstillingerne er bekræftet, skal du fortsætte til afsnittet Analyse . Analyser den enkelte farvning først, og registrer ikke mindre end 5.000 hændelser (optimalt interval: 5.000-15.000 hændelser), både for kompensationsperlerne og de CD34-farvede fraktioner. Juster spændingerne, hvis det kræves.
  16. Når de enkelte farvninger alle er registreret, er det muligt at starte den faktiske erhvervelse ved at klikke på erhvervelsesfunktionen .

Tabel 3: Antistofmastermix til et flowcytometrieksperiment, specifikt til identifikation af HSPC'er fra humant navlestrengsblod. Klik her for at downloade denne tabel.

6. Dataanalyse af flowcytometri efter kultur

BEMÆRK: Den beskrevne dataanalyse er specifik for den software, der er nævnt i materialetabellen. Hovedoutputtet er generering af et regneark, der indeholder oplysninger om overflademarkørintensitet, antal divisioner og slægtskab pr. Hver analyseret celle. Inkluderet i denne del af protokollen er et script skrevet i R, der er nødvendigt for denne arbejdsgang for at generere det endelige analyseregneark.

  1. Eksporter filer fra flowcytometeret som .fcs-filer. Upload dem til analysesoftwaren, og gruppér dem sammen som "enkelt farvning", "bulk" og "enkelt celle".
  2. Forbered en kompensationsmatrix ved hjælp af de enkelte farvningsfiler, og anvend den på de to andre grupper ved at trække og slippe.
    BEMÆRK: Hvis der anvendes et automatisk kompensationsværktøj, skal du kontrollere kvaliteten manuelt, før du går videre.
  3. For at have en repræsentativ gating skal du sammenkæde de forskellige bulkbrønde i en enkelt fil. Dette trin fremhæver hurtigt, om to farver overlapper hinanden (typisk CV og VC) eller andre uregelmæssigheder og derfor skal udelukkes. Når du har klikket på indstillingen sammenkædning af populationer , skal du vælge alle ikke-kompenserede parametre i menuen "parametre" og derefter klikke på sammenkædning.
  4. Overfør den sammenkædede fil til arbejdsområdet, og anvend derefter kompensationsmatrixen via træk og slip.
  5. Forbered gating-strategien, der er defineret i figur 2 , ved hjælp af den sammenkædede fil. I enkeltcelleporten skal du vise begivenhederne på et spredningsplot med CFSE og CTV. Opret en første port kaldet Mærket, inklusive alle fire farver og eksklusive mulig autofluorescens (figur 2C). Derefter gate hver farve individuelt.
  6. Celler mærket med CV og VC har brug for en transformeret værdi, i betragtning af at farven er resultatet af CFSE- og CTV-signalerne. De to koordinerede signaler drejes derfor på en logaritmisk skala med 45°, så divisionsfortyndingen kan fortsætte parallelt med x-aksen. Denne transformerede værdi udledes manuelt ved at klikke på Værktøjer og derefter Afledte parameter. Indsæt følgende formel i formelfeltet :
    Equation 1
    BEMÆRK: Ligning26 forudsætter, at CFSE og CTV er parametre 03 og 17.
  7. For korrekt visualisering af denne nye parameter med navnet Afledt parameter skal du indstille en lineær akse på ~3-7, klikke på indstillingen Akseparameter og vælge Tilpas akse.
  8. Anvend gatingen på hver farve individuelt som et histogramplot: For CF og VI skal du indstille CFSE-A og CTV-A på henholdsvis x-aksen . For CV og VC skal du indstille den nyligt afledte parameter på x-aksen. Indstil porte svarende til hver top, som vist i figur 3.
  9. Påfør gatingen på hver enkelt enkeltcellebrønd. Sørg for at tilføje den afledte parameter til hver analyseret brønd. Kontroller manuelt hver farveport for hvert felt for at registrere hændelser, der er forkert tildelt en given top. Eksempler på gating er vist i figur 4.
  10. Når analysen er fuldført, og alle brønde er verificeret, skal du vælge alle CF/CV/VC/VI-porte, der indeholder mindst én celle. Eksporter dem som .csv filer, afkryds indstillingerne "skalaværdier" og "kompenserede parametre". Disse filer eksporteres i en mappe med navnet "Eksporterede filer".
  11. Kombiner alle filerne i et enkelt .csv ved hjælp af R-scriptet i supplerende fil 1. Husk at indstille den rigtige vej med funktionen "setwd". Outputtet af dette script er et regneark, der indeholder alle de forskellige lukkede begivenheder og de relative intensiteter for alle parametrene.
  12. Åbn regnearket, og omdøb kolonnerne for hver parameter, f.eks. ved hjælp af følgende navne: CFSE, CTV, CD90, CD123, CD45RA, CD34, CD38. Disse navne vil blive brugt til at identificere gating-tærsklen for korrekt tildeling til hver celle deres identitet.
  13. Tilføj seks kolonner med navnet "Nå", "Tilstand", "Farve", "Generation", "Original_cell" og "Culture_time". Disse variabler er dem, der er defineret eksperimentelt og udledes af hver række:
    export_A10 CD34 + PBS_CV_Peak 1.csv.1 = A10 (godt), CD34+ (Original_cell), PBS (tilstand), CV (farve), Peak_1 (generation).
  14. Eksporter bulkbrøndene for at identificere tærskelværdierne for gating: eksporter den kompenserede population af interesse (f.eks. CD34 + CD38-) som .csv filer, og marker indstillingerne "skalaværdier" og "kompenserede parametre." Eksporter disse filer i en mappe med navnet "Eksporterede filer".
  15. For at finde tærsklen for CD38 skal du identificere den største numeriske værdi for denne parameter. Omvendt, for at finde tærsklen for CD34, skal du identificere den mindste numeriske værdi for denne parameter. Gentag denne proces for alle parametre af interesse.
    BEMÆRK: Til analysen præsenteret i protokollen bruges markøren CD45RA både til at identificere LMPP'er i CD34+CD38-porten og CMP/GMP i CD34+CD38+-porten. Det betyder, at der skal udtrækkes to forskellige tærskelværdier for denne markør.
  16. Kopier og indsæt tærskelværdierne i en Excel-fil kaldet "gating_matrix". Denne fil er organiseret i henhold til tabel 4 og tillader analyse af flere uafhængige eksperimenter. Det er meget vigtigt at navngive hver kolonne nøjagtigt med dette skema: XXYYMMDD_xxh, hvor XX står for operatørens to initialer, YY de sidste to tal for året, MM for måneden, DD for dagen og xx for analysetidspunktet.

Tabel 4: Gating matrix for celleskæbnetildelingen, før den statistiske analyse. CD45h henviser til intensiteten af CD45RA for HPC-delmængdegating, mens CD45l henviser til intensiteten af CD45RA for CD34+CD38-delmængderne. Klik her for at downloade denne tabel.

7. Statistisk analyse

BEMÆRK: Den statistiske test af de genererede data involverer en skræddersyet analysepipeline, kodet ved hjælp af programmeringssproget Python (supplerende fil 2, supplerende fil 3 og supplerende fil 4). Scriptet er organiseret i tre blokke: den første til behandling af regnearket, den anden blok til generering af varmekortet til datavisualisering og den sidste blok til generering af flere histogrammer til analyse og test af differentierings- og divisionsegenskaber.

  1. Start fra blokken "0_process_data" (supplerende fil 2), og sørg for, at stierne til gating_matrix og dataregnearket er korrekt defineret i scriptet.
  2. Definer ordbogen "cell_cols" for at tildele de relevante celleskæbner til hver celle. I det specifikke tilfælde er skæbnerne HSC'er, MPP'er, LMPP'er, almindelige myeloide stamfædre (CMP'er), granulo-monocytiske stamfædre (GMP'er), megakaryocytiske-erythroid-forfædre (MEP'er) og CD34-.
  3. Brug de tærskelværdier, der er defineret fra bulkbrøndene (trin 6.16), til at definere funktionen "cell_class_exp_time". Det er vigtigt at være konsekvent i kolonnenavngivningen for at definere disse tærskler korrekt ved hjælp af det samme navn, der bruges til at definere hver kolonne i trin 6.12.
  4. Cellefænotyperne defineres i scriptet ved hjælp af en række "if-else" -sætninger baseret på de tærskler, der detekteres under flowcytometrianalysen.
    BEMÆRK: Forskellige fænotyper kan vises ved at ændre disse udsagn for at imødekomme andre markørkombinationer.
  5. Angiv de eksperimentelle specifikke betingelser ved hjælp af funktionen "cond_rule" (f.eks. Forskellige eksperimentelle behandlinger). For det angivne datasæt hedder betingelserne "GT" og "Diff". Beskriv de to forskellige cellekulturmedier, der bruges til at dyrke cellerne. Disse oplysninger vil blive brugt af blokken "1_dot_plot" (supplerende fil 3) til at plotte varmekortet.
  6. I blokken "2_bar_plot" (supplerende fil 4) skal du definere ordbogen "class_dct", herunder de diskrete celleskæbner af interesse. For det angivne datasæt er de celleskæbner, der er interessante, de samme, som er beskrevet for ordbogen "cell_cols".
  7. Definer "conds" (betingelser), "or_cells" (original celle), "sym_labs" (symmetrietiketter) og "gange" (det eksperimentelle tidspunkt). Disse er gentagelse af filtre, der er nødvendige for plotning. "conds" tager betingelserne defineret i "cond_rule" igen, "or_cells" er HSC'er og MPP'er, og "sym_labs" beskriver typen af divisioner.
  8. I blokken "2_bar_plot" er det muligt at plotte celler, der er gået op til division 6.
    BEMÆRK: Det angivne datasæt indeholder kun celler op til division 4, så der vises en fejlmeddelelse, men dette forhindrer ikke scriptet i at fungere.
  9. De tal, der genereres af scriptet, kan hentes i mappen med navnet "figurer" som pdf-filer. Filerne med navnet "Test" repræsenterer de forskellige statistiske tests, der udføres for det tilsvarende histogram.

Representative Results

FACS-sortering
De sorteringsgatingstrategier, der præsenteres i denne protokol, er baseret på bredt accepterede strategier 12,30,31. For gating-strategien, der er præsenteret i figur 1, er udgangsmaterialet navlestrengsblodprogenitorer, der tidligere er renset via CD34+ magnetisk berigelse, hvilket forklarer den ubetydelige procentdel af afstamningspositive celler. Det er vigtigt at bruge tætte porte til de fire intracellulære farvekombinationer (f.eks. CTV i figuren) for at forbedre toppenes opløsning under den følgende analyse og for at gate den korrekte cellepopulation (figur 1D). I det tilfælde, der vises i figuren, vælger portene den største og bedre definerede befolkning. Tilstedeværelsen af flere, tætte populationer for hver farvestofkombination med celledeling er efter vores erfaring ikke repræsentativ for biologiske forskelle. I stedet kunne det indikere a) en ikke-optimal farvningsprocedure eller b) en stor heterogenitet (især i størrelse) i startpuljen af celler. Dette er ikke uventet, når man starter fra navlestrengsblod eller andre komplekse biologiske kilder (f.eks. knoglemarvsaspirationer, perifert blod). Hvis porten ikke er tæt defineret, kan den progressive fortynding af de forskellige farvekombinationer føre til sammensmeltning af de senere toppe, specifikt for betingelserne CV og VC (figur 2D). En anden negativ konsekvens af en suboptimal gating er manglende evne til effektivt at skelne mellem forskellige toppe efter cellekultur, da en heterogen startpopulation kan føre til lavvandede toppe.

Figure 1
Figur 1: Gating strategi for cellesortering. (A) FSC-A versus SSC-A, for at udelukke snavs og forurenende celler. (B) FSC-A versus FSC-H, for at udelukke dubletter og celleklumper. (C) Lin versus FSC-H, for at udelukke celler, der er Lin+. (D) CTV versus CFSE, for entydigt at identificere cellerne farvet med farvestofkombinationerne CF, CV, VC og VI. Portene skal være strenge nok til at omfatte en homogen befolkning. (E) CD34 versus CD38, for at adskille de begrænsede forfædre CD34+CD38+ (også kaldet HPC'er) fra det multipotente rum CD34+CD38-. (F) CD45RA versus CD90, fra CD34+CD38-populationen, for at adskille mellem de mest umodne forfædre beriget i HSC (CD90+CD45RA-), LMPP (CD90midCD45RA+) og den mere engagerede MPP (CD90-CD45RA-). (G) Indekssorterede begivenheder, her repræsenteret for deres farvestofkombinationsfarvning og (H) ekspressionen af overflademarkørerne CD90 og CD45RA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Flowcytometrianalyse efter cellekultur
Dataene i figur 2 er repræsentative for HSC'er i humant navlestrengsblod, der holdes i kultur i 72 timer under tilstedeværelse af flere cytokiner, der er i stand til at understøtte en række myeloide progenitorer og prækursorer. Panelerne 2A til 2D repræsenterer den gating, der er nødvendig for at etablere slægtskabet mellem hver af de enkelte celler, mens panelerne 2E til 2G tillader cellulær fænotypning. Den reducerede tilstedeværelse af MEP'er i figuren er sandsynligvis en konsekvens af de kulturforhold, der blev brugt til dette repræsentative eksperiment (figur 2F). Brug af forskellige cytokiner og dyrkningsbetingelser ændrer den relative procentdel af hver delmængde, på samme måde som at vælge forskellige startceller til eksperimentet.

Figure 2
Figur 2: Gating strategi for flow cytometri analyse. (A) FSC-A versus SSC-A, for at udelukke snavs og kontaminerende celler. (B) FSC-A versus FSC-H, for at udelukke dubletter og celleklumper. (C) CTV versus CFSE, porten mærket giver mulighed for at udelukke enhver autofluorescerende begivenhed, der kan påvirke dataopløsningen. D) CTV versus CFSE. Det er ekstremt vigtigt at strengt gate de fire populationer, baseret på celledeling farvestoffortyndinger. E) CD34 versus CD38 for at skelne mellem forpligtede prækursorer (CD34-), begrænsede forfædre (HPC) (CD34+CD38+) og umodne forfædre (CD34+CD38-). (F) CD45RA versus CD123 for at skelne mellem tre typer betingede forfædre: CMP (CD123+CD45RA-), MEP (CD123-CD45RA-) og GMP (CD123+CD45RA+). (G) CD45RA versus CD90, fra CD34+CD38-, for at identificere HSC'er, LMPP'er og MPP'er. Klik her for at se en større version af denne figur.

Topdefinitionen og tildelingstrinnene (figur 3 og figur 4) er afgørende aspekter af protokollen og kræver definition af strenge porte. For topdefinitionen (figur 3) er mindst 1 000 hændelser nødvendige for en pålidelig identifikation. I denne forstand kan det være en fordel at isolere flere celler under cellesorteringstrinnet for "Bulk" -brøndene. Figur 4 beskriver fire eksempler på enkeltboringer, der indeholder flere familier. Dette tal tydeliggør betydningen af figur 2D og figur 3, især for identifikationen af hver familie og hver top. Figur 4A illustrerer et ligetil eksempel, da alle cellerne i porten CF er meget tæt på hinanden og let kan tildeles en enkelt top. Figur 4C viser et andet eksempel på en familie fordelt entydigt på to godt adskilte toppe, som det tydeligt vises i histogrammet i figur 4D. Figur 4E,G afslører vigtigheden af streng gating baseret på et stort antal begivenheder; De viser begge få begivenheder, der er tætte, men uden for farvekombinationsportene. Disse hændelser kunne fejlagtigt medtages i VI- og CF-gatene udelukkende baseret på analysen af en enkelt brønd. Endelig viser figur 4F,H to forskellige eksempler på familier spredt på flere toppe, med et eksempel på to lignende intensitetstoppe (figur 4F) og et med to ulige intensitetstoppe (figur 4H).

Figure 3
Figur 3: Topdefinition for flowcytometrianalysen. (A-D) Der bør defineres toppe, der registrerer mindst 500 hændelser for at sikre en god repræsentation for hver enkelt top. (A) Histogram for CFSE-A-intensiteten. Flere toppe kan identificeres, hver svarende til en anden population af delende celler. (B,C) Histogrammer for intensiteten af den afledte parameter, der repræsenterer CFSE-CTV-blandingen, henholdsvis CV (B) og VC (C). D) Histogram for farvefjernsynsmodtager-A-intensiteten. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Spidsbelastning . (A,B) Der kan kun påvises én top for denne brønd i CF-porten. (C,D) To toppe med næsten lige stor intensitet kan detekteres i denne brønd i VI-porten. Toppene er godt løst. (E,F) To toppe af sammenlignelig intensitet kan detekteres i denne brønd i VI-porten. Kun begivenhederne i porten er blevet overvejet baseret på den strategi, der er fastsat ved hjælp af bulkbrøndene. (G-H) To toppe af forskellig intensitet kan detekteres i denne brønd, i porten CF. Klik her for at se en større version af denne figur.

Datarepræsentation og statistisk test
Figur 5 viser forskellige typer datarepræsentation af to separate eksperimenter, begge udført efter 72 timers cellekultur. HSC'er og MPP'er er blevet dyrket i to forskellige cellekulturmedier, der formodes at ændre celledelings- og differentieringsegenskaberne. Disse medier kaldes "Diff" (differentiering)32 og "GT"33; den første fremmer myeloid og erythroid differentiering, da den indeholder erythropoietin (EPO) og granulo-monocytisk kolonistimulerende faktor (GM-CSF), mens den anden er udviklet i forbindelse med kliniske forsøg med genterapi med det formål at opretholde og forstærke en høj procentdel af HSPC'er. Figur 5A er et repræsentativt varmekort for tilstanden "Diff", der repræsenterer en række cellefamilier, både i celleskæbner og delinger. I dette varmekort repræsenterer hver række en individuel familie, hver kvadrat en individuel celle, og kolonnerne grupperer alle celler, der er i samme generation (f.eks. celler i generation 2 opdelt mindst to gange). Det er muligt at skelne mellem meget homogene familier, der består af en enkelt celletype og viser det samme antal divisioner (f.eks. Familie #63) og heterogene familier, herunder tre celletyper over to generationer (f.eks. Familie #84). Fordi den cellulære gendannelsesrate for denne analyse er ca. 70%, observeres komplette familier, som defineres ved at få alle deres celler genoprettet i muligvis forskellige generationer (f.eks. En familie af en celle i generation 1 og to celler i generation 2), sjældent (viser et hashtag ved siden af deres ID-nummer i figur 5A). Der er flere forklaringer, der tegner sig for den ufuldstændige detektion, som kan være teknisk (farvningsproblem, celletab på grund af protokollen) eller biologisk (celledød og / eller apoptose). Tekniske begrænsninger kan overvindes ved hjælp af en analysator, der er designet til at reducere det døde volumen, der er forbundet med den enkelte prøve, og ved at udføre cellefarvningen direkte i cellekulturpladen for at reducere volumenpipetteringen. Omvendt kan ortogonale metoder til bestemmelse af mængden af celledød (f.eks. via billeddannelsesforsøg med levende celler) hjælpe med at skelne mellem de tekniske og biologiske faktorer, der resulterer i ufuldstændig detektion.

Figur 5Bi viser, hvordan man visualiserer effekten af dyrkningstilstanden på celletypesammensætningen, som om man havde udført et bulkassay. Her fremmer Diff-tilstanden et større antal skæbner og en højere procentdel af CD34+ celler (defineret som alle celletyper undtagen CD34-). Konfidensintervallerne beregnes i scriptet via grundlæggende bootstrap med 250.000 bootstrapped datasæt34. Det er værd at bemærke, at alle de andre histogrammer i figur 5 viser konfidensintervaller beregnet på samme måde. Tabel 5 opsummerer alle oplysninger om antallet af familier og antallet af celler i hver generation.

Figur 5Bii viser grafisk resultatet af den statistiske test, der er udført i scriptet "2_bar_plot". Der findes en formel beskrivelse af den statistiske ramme26. Kort sagt muliggør denne ramme statistisk hypotesetestning, mens det antages, at celler fra samme familie er afhængige (en antagelse, der i sig selv kan testes), i modsætning til klassisk statistik, der ville kræve uafhængighed mellem alle observerede celler. I det specifikke tilfælde, der præsenteres i figuren, udfordrer den statistiske test hypotesen om, at MPP'ers celleskæbnevalg, målt som frekvenserne af de forskellige celletyper, der er til stede i kulturen, er uafhængige af de anvendte cellekulturbetingelser. For det første bruges G-teststatistikken til at evaluere uoverensstemmelsen mellem celletypefrekvenser fra forskellige cellemedier (for eksemplet i Bii er denne statistik repræsenteret med den røde bjælke). Derefter udføres en randomisering af dataene via permutation, der bytter hele familier af celler mellem de to cellekulturbetingelser. Dette er for at bevare afhængigheden mellem familierelaterede celler, samtidig med at antallet af familier i hvert sæt holdes i overensstemmelse med de originale data. G-teststatistikken beregnes ud fra det randomiserede datasæt. De blå værdier repræsenteret i 5Bii er G-teststatistikken for 250.000 permutationer. Endelig beregnes p-værdien for at vurdere, i hvilket omfang det oprindelige datasæt afviger fra fordelingen af de permuterede. I eksemplet afviger den oprindelige statistik stort set fra fordelingen, hvilket resulterer i en lille p-værdi og dermed afviser hypotesen om, at MPP'ernes celleskæbne er uafhængig af dyrkningsbetingelserne.

Figur 5C repræsenterer procentdelen af cellefamilier pr. maksimal generation for at undersøge, hvordan forskellige forhold ændrer celledeling pr. Cellefamilie. Dette dataplot viser, at cellerne dyrket i Diff-tilstanden ved 72 timer fuldfører et større antal divisioner end celler i GT-tilstanden. Repræsenterede er antallet af maksimale generationer pr. familie, så en familie, der viser celler i generation 1 og 2, betragtes som generation 2. Den samme statistiske ramme, der anvendes til figur 5B , kan bruges til statistisk at teste uafhængigheden mellem cellulær deling og kulturtilstand.

Figur 5D undersøger typen af symmetri/asymmetri i den første division for de forskellige forfadertyper (HSC'er eller MPP'er). For de komplette cellefamilier i generation 1 - den eneste generation, hvor det er muligt definitivt at etablere de to datterceller som søsterceller - kan der defineres fire forskellige typer symmetri/asymmetri: etiketten "Sym Undiff" beskriver familier, hvor begge døtre bevarer oprindelsescellens fænotype. "Sym Diff" betyder, at begge døtre har samme fænotype, og den er forskellig fra oprindelsescellen. "Asym Undiff" betyder, at en datter kun bevarer fænotypen af oprindelsescellen. Endelig beskriver "Asym Diff" familier, hvor begge døtre har forskellige fænotyper, og ingen af dem er de samme som oprindelsescellen. For at få statistisk styrke til at vurdere disse symmetriske/asymmetriske skæbner er det ønskeligt at udføre MultiGen-analysen på tidlige tidspunkter for at observere flere familier, hvis afkom findes i generation 1.

Endelig repræsenterer figur 5E procentdelene af celletyper som en funktion af antallet af divisioner for at få indsigt i differentieringsmønsterprogressionen på tværs af divisioner. For eksempel tyder dataene i figuren på, at celler udvikler sig til CD34-tilstanden, med over 50% af detekterede celler i denne klasse efter kun tre divisioner. Desuden er det muligt at udlede, at MPP'er ikke favoriserer selvfornyelsesopdeling, da en lille procentdel af celler bevarer den oprindelige fænotype. Nogle af disse konklusioner kan derefter testes ved hjælp af den statistiske ramme, der er beskrevet i de foregående tal.

Figure 5
Figur 5: Eksempel på datarepræsentation for et 72 timers eksperiment med HSPC'er til navlestrengsblod. (A) Varmekort for et udvalgt datasæt (HSC, i "Diff" medium, efter 72 timers kultur). Plottene repræsenterer alle individuelle celler (firkanter) i henhold til deres slægtskab (rækker), antal udførte divisioner (kolonner, kaldet generation) og fænotype (farver). (Bi) Histogram, der sammenligner proportioner af celletyperne af celleafkom af HSC'er og MPP'er, mellem tilstanden GT og tilstanden Diff. (Bii) Grafen repræsenterer de statistiske tests, der er udført i "2_bar_plot" -scriptet for MPP'er ved 72 timers kultur, sammenlignet mellem "Diff" og "GT" cytokincocktails. Den eksperimentelle værdi vises med rødt, og værdierne genereres via 250.000 permutationer i blåt. P. -værdien af G-testen er angivet i øverste højre hjørne med antallet af familier, der er brugt til testen. (C) Histogram, der sammenligner procentdelen af familier (314 familier i alt) i hver generation (farvekodet) for HSC'er og MPP'er pr. Kulturtilstand. Konfidensintervallerne beregnes med 250.000 bootstrapped datasæt. (D) Histogram, der repræsenterer typen af symmetri/asymmetri mellem dattercellernes skæbne for familier med to celler i generation 1: Sym Undiff (begge døtre bevarer oprindelsescellens fænotype), Sym Diff (begge døtre har samme fænotype, og den er forskellig fra oprindelsescellen), Asym Undiff (kun en datter bevarer oprindelsescellens fænotype), og Asym Diff (begge døtre har forskellige fænotyper, og ingen af dem ligner oprindelsescellen). E) histogrammer over bidraget fra celletyper klassificeret pr. generation for MPP'er dyrket med "Diff"-cocktailen n = 204 celler og 97 familier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 5: Beskrivelse af antallet af familier og celler analyseret pr. forsøgstilstand (oprindelsescelle og cellekulturmedium). Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

MultiGen-analysen er et højt gennemløb, let at udføre og billigt assay, der har været medvirkende til at studere lymfocyt 23,24,35 og murin hæmatopoietiske celler 26,27. Her præsenterer vi en ny udvikling af tilgangen, der gør det muligt ex vivo at dechiffrere den tidlige fase af menneskelig HSPC-forpligtelse på enkeltcelleniveau ved hjælp af kortvarig kultur (figur 6). Enkeltcelle ex vivo-kultursystemer bruges typisk til at vurdere HSPC'ernes langsigtede skæbne i modne celler, men nogle skæbner forekommer tidligere end andre36, hvilket potentielt fordrejer analysen mod færre skæbner. Derudover savner disse kultursystemer normalt information om opdelinger under skæbneforpligtelse. De første forpligtelsestrin har vist sig at forekomme så tidligt som i starten af kulturen, nogle gange uden division26,37, hvilket gør kortsigtet kultur og sporingsopdeling afgørende for at studere tidlig skæbneforpligtelse. Ved samtidig at følge skæbnen, opdelingen og slægtskabet giver dette assay mulighed for at forstå rollen som den første division og skæbnebeslutningen i humane HSPC'er. Ved hjælp af analysen er det muligt at udlede, efter hvor mange opdelinger forpligtelsesprocessen finder sted, balancen mellem selvfornyelse og differentiering for de tidlige forfædre, og hvordan disse egenskaber arves på tværs af generationer. Så vidt vi ved, er dette det eneste assay, der tillader disse typer målinger for humane HSPC'er ved enkeltcelleopløsning. Derudover øgede vi analysens gennemløb ved hjælp af forskellige kombinationer af celledelingsfarvestoffer, hvilket gør dette assay til et værdifuldt værktøj til hurtigt at generere store datasæt. Farvekombinationerne gør det muligt at følge flere familier i de samme brønde, hvilket øger antallet af celler, der er tilgængelige til analyse i kortvarig kultur. Antallet af kombinationer kan potentielt øges endnu mere ved tilsætning af andre farvestoffer (f.eks. gult farvestof) eller ændring af forholdet mellem CFSE og CTV. Dette reducerer dog antallet af andre parametre, der kan analyseres.

Figure 6
Figur 6: Skematisk gengivelse af protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at udføre analysen med succes er det på grund af det store antal brønde og det reducerede antal celler, der skal analyseres, nødvendigt at køre flowcytometrianalysen på en analysator udstyret med en pladelæser. Den nye generation af bænkanalysatorer er specielt tilpasset dette assay, da de fleste af dem har et mindre dødvolumen for at reducere procentdelen af celletab. Dette garanterer igen en højere effektivitet ved genvinding af hele hver brønd, hvilket giver anledning til en effektivitet, der anslås til 70% -området26. Estimering af celletabet under flowcytometrioptagelsen er afgørende for analysen af hver enkelt familie. For eksempel, forudsat at der ikke er celledød og tæller antallet af divisioner, er det muligt at estimere antallet af celler pr. Hver familie. Ikke desto mindre er det ønskeligt at gennemføre nogle konfirmatoriske forsøg, især i estimering af celledød under de testede dyrkningsbetingelser og måling af genfindingshastigheden eksperimentelt ved hjælp af et defineret antal celler.

Et af de afgørende trin i denne protokol er toptildelingen. Som allerede nævnt er en topfordeling af god kvalitet stærkt afhængig af isoleringen af meget smalle toppe ved cellesortering. Ikke desto mindre er det stadig vanskeligt at tildele det korrekte antal divisioner baseret entydigt på fordelingen. Da cellesortering og flowcytometrianalyse udføres på to forskellige maskiner, er det ikke muligt direkte at sammenligne intensiteten af hvert signal, så det kan være svært at vide, om den første top, der observeres i højre ende af histogrammet, er top 0 eller top 1. I denne henseende er få løsninger mulige; En måde er at udføre et ortogonalt eksperiment for nøjagtigt at måle antallet af divisioner udført af disse celler (f.eks. Levende cellebilleddannelse). En anden mulighed er blot at tælle antallet af celler i brønden under et omvendt brightfield-mikroskop, før flowcytometrianalysen køres. Dette vil udlede et gennemsnitligt antal divisioner (forudsat at der ikke er celledød). Endelig er en post-hoc løsning til spidsbelastning påvisning af et usædvanligt antal "umulige familier"; Disse familier består af et større antal celler end muligt pr. generation (f.eks. fem celler i generation 2 eller to celler i generation 1 og en celle i generation 2). Muligheden for at udelukke umulige familier kodes i det statistiske analysetrin og markerer den umulige familie. Hvis forekomsten af disse fejl er for høj, er det rimeligt at antage, at spidsbelastningstildelingen skal revideres.

I denne protokol inkluderede vi et par eksempler på datarepræsentation og analyse til analysen, da dette er blevet et vigtigt skridt i genereringen og fortolkningen af store datasæt38. Det første eksempel er varmekortet, der viser totaliteten af alle analyserede celler, organiseret pr. Familie. Dette er et effektivt værktøj til at udforske de generelle egenskaber ved dataene og potentielle konklusioner: er familier sammensat af flere celletyper, eller har de tendens til at være homogene i sammensætning? Er familier spredt over flere generationer, eller deler de for det meste det samme antal gange? Denne sonderende analyse skal derefter suppleres med mere specifikke observationsområder og statistiske undersøgelser. Det kan bruges til kvantitativt at vurdere symmetrisk og asymmetrisk skæbneforpligtelse, differentiering uden division, balancen mellem selvfornyelse og differentiering og antallet af divisioner for en given forpligtelsesskæbne. Det er grundlæggende under den eksperimentelle planlægning at indstille cellekulturlængden i overensstemmelse hermed til den type spørgsmål, der stilles; For eksempel for de to første spørgsmål (symmetrisk/asymmetrisk balance og differentiering uden division) tillader planlægning af meget korte kulturtrin isolering af et stort antal familier, der kun har udført en eller ingen opdelinger overhovedet26. Omvendt tillader længere eksperimenter udforskning af antallet af divisioner, der kræves for en bestemt celleforpligtelse, da de prøver familier på forskellige stadier af differentiering. Ikke desto mindre er denne metode ikke designet til langsigtede kulturer (2-3 uger), da cellefarvestoffortynding ikke er i stand til nøjagtigt at spore mere end syv eller otte divisioner22. Som følge heraf er dette værktøj for det meste tilpasset til at studere den tidlige forpligtelse hos hæmatopoietiske forfædre og er ikke designet til at drage robuste konklusioner om disse cellers langsigtede differentieringsegenskaber.

Den statistiske ramme blev udviklet specielt til analyse af denne type data og baseret på begrebet permutationer26. Dette var nødvendigt på grund af observationen af en familiær afhængighed af celletypefordelingen og antallet af udførte divisioner. Med andre ord er celler, der er en del af den samme familie, også mere tilbøjelige til at vise lignende fænotyper og opdele det samme antal gange. Selv om en tilbundsgående analyse ligger uden for rammerne af dette arbejde, bør det leverede sæt statistiske test være tilstrækkeligt til vurdering af forskellige forhold.

Afslutningsvis udgør denne protokol et værdifuldt værktøj til vurdering af den cellulære dynamik i hæmatopoietiske stamceller og stamceller ex vivo på en hurtig og billig måde. På grund af sin fleksibilitet og alsidighed med hensyn til tidspunkt, kulturbetingelser og type analyserede HSPC'er giver det mulighed for at teste en række eksperimentelle forhold. Som et flowcytometribaseret assay kan det implementeres i de fleste laboratorier, og det kræver ikke omfattende forudgående viden, hvilket gør det til en god kandidat til screeninger og pilotforsøg.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt, der er relevant for dette arbejde. Bidragyderne havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og fortolkning eller beslutningen om at indsende værket til offentliggørelse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke medlemmerne af Institut Curie Flow Facility for deres hjælp med at oprette flowcytometrieksperimenterne. Vi vil også gerne anerkende bidragene fra de andre medlemmer af Team Perié under flere diskussioner. Vi takker Dr. Julia Marchingo og Prof. Phil Hodgkin (Walter end Eliza Hall Institute of Medical Research) for at dele deres protokol for multiplexing af celledelingsfarvestoffer på lymfocytter. Vi takker Saint Louis hospitals navlestrengsblodbiobank for at have tilvejebragt de biologiske ressourcer, der er nødvendige for udviklingen af denne protokol. Undersøgelsen blev støttet af et ATIP-Avenir-tilskud fra CNRS og Bettencourt-Schueller Foundation (til LP), tilskud fra Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (til LP og AD), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (til LP), Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, til LP) og ITMO MIIC-tilskuddet (21CM044, til LP). Ud over finansiering fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram ERC StG 758170-Microbar (til LP) blev AD støttet af et stipendium fra Fondation de France.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes vWR 87003-294
15-mL polypropylene tubes vWR 734-0451
50-mL polypropylene tubes vWR 734-0448
96-well U-bottom culture plate  Falcon 353077
Anti-human Lin APC Thermo Fisher 22-7776-72 Dilution 1/40
ARIA III BD Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Life Technologies C34570
Cell Trace Violet (CTV)  Life Technologies C34571
Compensation beads  BD 552843
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies 11320033
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Thermo Scientific J62948-36 Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water
FC block Fc1.3216 BD 564220 Dilution 1/50
Fetal Bovine Serum (FBS) Dutscher S1900-500C Batch S00CH
FlowJo v10.8.1 BD
Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a Biolegend 312216 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3 BD 564195 Dilution 1/15
Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581 Biolegend 343513 Dilution 1/40
Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7 Biolegend 356620 Dilution 1/40
Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100 BD 560673 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100 BD 560675 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10 Biolegend 328110 Dilution 1/20
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Life Technologies 10010001
Python
R
Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes Falcon
ZE5  Biorad Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader
Laboratory prepared
Cell culture media Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 °C until use
DMEM + 10% FBS Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM
PBS 1X + EDTA 0.1% Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X
Staining buffer Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. Single-cell immunology: Past, present, and future. Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).
  2. Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity. Bioessays. 44 (11), 2200084 (2022).
  3. Regev, A., et al. The human cell atlas. Elife. 6, 27041 (2017).
  4. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  5. Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
  6. Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies. Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).
  7. Perié, L., Duffy, K. R. Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods. FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).
  8. Yu, V. W. C., et al. Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells. Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).
  9. Ganuza, M., et al. Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny. Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).
  10. Naik, S. H., Schumacher, T. N., Perié, L. Cellular barcoding: A technical appraisal. Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).
  11. Quek, L., et al. Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 − acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage. The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).
  12. Karamitros, D., et al. Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells. Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).
  13. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  14. Delaney, C., et al. Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).
  15. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  16. Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. Antagonism of PPAR-γ 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis. Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).
  17. Vannini, N., et al. The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
  18. Gupta, R., et al. Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity. Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).
  19. Horwitz, M. E., et al. Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study. Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).
  20. Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation. Science. 367 (6479), 3381 (2020).
  21. Loeffler, D., Schroeder, T. Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification. Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).
  22. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. Journal of Visualized Experiments. (70), e4287 (2012).
  23. Marchingo, J. M., et al. T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate. Nature Communications. 7, 13540 (2016).
  24. Horton, M. B., et al. Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing. Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).
  25. Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. Testing statistical hypotheses. , Springer. New York. 784 (2005).
  26. Tak, T., et al. HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity. Elife. 10, 360624 (2021).
  27. Sommerkamp, P., et al. Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).
  28. Kato, K., Radbruch, A. Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting. Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).
  29. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
  30. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  31. Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
  32. Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
  33. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
  34. Davison, A. C., Hinkley, D. V. Bootstrap Methods and their Application. , Cambridge University Press. (1997).
  35. Horton, M. B., et al. Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable. Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).
  36. Notta, F., et al. Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
  37. Grinenko, T., et al. Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice. Nature Communications. 9 (1), 1898 (2018).
  38. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

Tags

Tilbagetrækning nr. 193
Samtidig vurdering af slægtskab, divisionsnummer og fænotype <em>via</em> flowcytometri for hæmatopoietiske stam- og stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donada, A., Tak, T., Prevedello, G., … More

Donada, A., Tak, T., Prevedello, G., Milo, I., Duffy, K. R., Perié, L. Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64918, doi:10.3791/64918 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter