Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Samtidig bedömning av släktskap, divisionsnummer och fenotyp via flödescytometri för hematopoetiska stam- och stamceller

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64918
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 1, 2, 1
1Quantitative Immuno-hematology, CNRS UMR168, Institut Curie, 2Hamilton Institute, Maynooth University, 3Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3348, Orsay, 4Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, CNRS UMR 3348, Orsay

Summary

Här presenteras en flödescytometribaserad teknik som möjliggör samtidig mätning av antalet celldelningar, ytcellsfenotyp och cellulärt släktskap. Dessa egenskaper kan testas statistiskt med hjälp av ett permutationsbaserat ramverk.

Abstract

Få tekniker kan bedöma fenotyp och öde för samma cell samtidigt. De flesta av de nuvarande protokollen som används för att karakterisera fenotyp, även om de kan generera stora dataset, kräver förstörelse av cellen av intresse, vilket gör det omöjligt att bedöma dess funktionella öde. Heterogena biologiska differentieringssystem som hematopoes är därför svåra att beskriva. Baserat på celldelningsspårningsfärgämnen utvecklade vi vidare ett protokoll för att samtidigt bestämma släktskap, divisionsnummer och differentieringsstatus för många enskilda hematopoetiska förfäder. Detta protokoll möjliggör bedömning av ex vivo-differentieringspotentialen hos murina och humana hematopoetiska stamfäder, isolerade från olika biologiska källor. Dessutom, eftersom det är baserat på flödescytometri och ett begränsat antal reagens, kan det snabbt generera en stor mängd data, på encellsnivå, på ett relativt billigt sätt. Vi tillhandahåller också den analytiska pipelinen för encellsanalys, kombinerat med ett robust statistiskt ramverk. Eftersom detta protokoll tillåter länkning av celldelning och differentiering på encellsnivå kan det användas för att kvantitativt bedöma symmetriskt och asymmetriskt ödesåtagande, balansen mellan självförnyelse och differentiering och antalet divisioner för ett givet engagemangsöde. Sammantaget kan detta protokoll användas i experimentella mönster som syftar till att avslöja de biologiska skillnaderna mellan hematopoetiska förfäder, ur ett encellsperspektiv.

Introduction

Det senaste decenniet präglades av den globala spridningen av encelliga metoder för cell- och molekylärbiologi. I stegen med encellsgenomik1,2 är det numera möjligt att studera många komponenter i en enda cell (t.ex. DNA, RNA, proteiner), med nya encells-omics-tekniker som växer fram varje år. Dessa tekniker har belyst gamla och nya frågor för områdena immunologi, neurobiologi, onkologi och andra, både med hjälp av mänskliga och modellorganismceller3. Genom att belysa skillnaderna mellan enskilda celler ledde single cell -omics till definitionen av en ny modell av hematopoies, centrerad på heterogeniteten hos hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) och rörde sig bort från den klassiska modellen av diskreta homogena populationer 4,5.

En av de få nackdelarna med alla -omics-tekniker är förstörelsen av cellen av intresse, vilket utesluter möjligheten att bedöma dess funktionalitet. Omvänt ger andra encellsmetoder, såsom encellstransplantationsanalys och härstamningsspårningsteknik, en avläsning av förfadercellens funktionalitet genom att bedöma ödet för enskilda celler in vivo 6,7. Släktspårningsteknik innebär att märka cellen av intresse med en ärftlig genetisk7 eller en fluorescerande etikett8,9, vilket gör att ödet för flera enskilda celler kan följas samtidigt. Karakteriseringen av utgångscellerna är emellertid typiskt begränsad till ett begränsat antal parametrar, såsom uttrycket av några ytproteiner bedömda med flödescytometri10. Dessutom kräver spårningsteknik för encellslinjer mödosam detektion av den cellulära etiketten, vanligtvis via DNA / RNA-sekvensering eller avbildning. Denna sista punkt begränsar särskilt antalet förhållanden som kan testas i ett enda experiment.

En annan klass av metoder som används för att studera funktionaliteten hos enskilda celler är ex vivo-cellodlingssystem för enskilda HSPC. Lätt att utföra, dessa guldstandardanalyser involverar sortering av enskilda celler i 96-brunnar cellodlingskärl och efter odling karakteriserar cellprogens fenotyp, vanligtvis genom flödescytometri eller morfologisk analys. Dessa analyser har mestadels använts för att karakterisera den långsiktiga differentieringen av HSPC i mogna celler, vanligtvis efter 2-3 veckors odling11,12. Alternativt har de använts för att försöka upprätthålla och expandera ex vivo HSPC 13,14,15,16,17,18, med löfte om medicinsk nytta för mänsklig stamcellstransplantation 19. Slutligen har de använts för att studera HSPC: s tidiga engagemang med korttidskultur20, med det låga antalet celler som genereras i denna kultur som den viktigaste begränsande faktorn. En nackdel med dessa olika typer av ex vivo-analyser är att de endast delvis återspeglar in vivo-komplexiteten; ändå är de ett av de sällsynta sätten att studera mänsklig HSPC-differentiering.

En saknad information från befintliga encellsmetoder (single cell-omics, härstamningsspårning och ex vivo-kultur) är noggrann detektion av celldelningar, en viktig parameter att tänka på när man studerar HSPC-dynamik21. Ett enkelt sätt att bedöma antalet divisioner via flödescytometri är användningen av lösliga "proteinfärgämnen", som 5-(och 6)-karboxifluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE)22. Dessa delningsfärgämnen diffunderar inuti cytoplasman hos de färgade cellerna och späds med hälften och överförs till de två dottercellerna vid varje celldelning, vilket möjliggör uppräkning upp till 10 divisioner. Genom att kombinera flera delningsfärgämnen är det möjligt att fröa flera enskilda föregångare i samma brunn, eftersom varje enskilt färgämne möjliggör separation av de olika efterkommande. Detta är principen bakom användningen av cellfärgämnen för multiplex klonal och delningsspårning som först introducerades för murina lymfocyter23,24.

Här presenterar vi utvecklingen av MultiGen-analysen för användning med murina och humana HSPC. Det möjliggör testning av många enskilda celler samtidigt för deras egenskaper differentiering, delning och släktskap ex vivo. Denna höga genomströmning, lätt att utföra och billig analys gör det möjligt att mäta den cellulära fenotypen, antalet utförda divisioner och cellkinskapet och klonalförhållandet med de andra cellerna i brunnen, allt samtidigt. Den kan användas för att kvantitativt bedöma symmetriskt och asymmetriskt ödesåtagande, balansen mellan självförnyelse och differentiering och antalet uppdelningar som är nödvändiga för ett givet åtagandeöde. Protokollet kräver en fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS) och en flödescytometer med en plattläsare, plus den utrustning som krävs för att utföra cellodling. Förutom det tekniska protokollet för utförande av analysen på humana HSPC, tillhandahåller vi också den detaljerade analysramen, inklusive den statistiska testning som krävs för att bedöma cellulära egenskaper relaterade till begreppet cellfamilj25. Detta protokoll har redan använts framgångsrikt för att beskriva murina HSPC-fack26,27.

Följande protokoll använder magnetiskt anrikade CD34 + -celler som utgångsmaterial28. På detta sätt är det möjligt att effektivt färga och isolera de mänskliga HSPC: erna från olika blodkällor (t.ex. navelsträngsblod, benmärg, perifert blod). Det är viktigt att inte kassera CD34-fraktionen, eftersom den kommer att användas som en del av protokollet för att ställa in olika typer av experimentella kontroller. De nämnda cellmängderna och volymerna kan skalas upp eller ner, beroende på experimentellt arbetsflöde och nödvändigheter. På samma sätt kan protokollet anpassas till studier av olika typer av förfäder, helt enkelt genom att modifiera antikropparna som används för cellsorterings- och flödescytometristegen.

Protocol

För följande protokoll användes avidentifierat navelsträngsblod som HSPC-källa och samlades in i enlighet med de riktlinjer som definierats av Saint-Louis Hospital navelsträngsblodbiobank (godkännande AC-2016-2759) och med Helsingforsdeklarationen.

OBS: Innan du börjar, se till att alla reagenser och utrustning som är nödvändiga för detta protokoll är tillgängliga, som anges i materialtabellen och nämns i protokollet. Bered de relevanta reagenserna färska och förvara dem inte, såvida det inte uttryckligen anges.

1. Färgning av cellfärg

OBS: Detta avsnitt beskriver färgning med fyra kombinationer av CFSE och violett färgämne (CTV) celldelningsfärger. Bearbeta alla rör samtidigt, även om ingen cellfärglösning tillsätts. Alla steg utförs under sterila förhållanden för att tillåta följande cellodlingssteg. Tidsåtgång: ca 100 min.

  1. Bearbeta navelsträngsblodenheten enligt ett magnetiskt sorteringsprotokoll29. Se till att två fraktioner finns tillgängliga: en stor CD34-fraktion och en mindre CD34 + -fraktion. Snurra båda rören i 5 minuter vid 300 x g. Aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
  2. För CD34 + -fraktionen, suspendera den igen i 1 ml av Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) utan fetalt bovint serum (FBS). Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer; celldensiteten bör inte vara högre än 3 x 106 celler/ml. Om så är fallet, anpassa volymen därefter. För CD34-fraktionen, suspendera igen i DMEM utan FBS och justera volymen till maximalt 6 x 106 celler/ml.
  3. Alikvot 250 μL av CD34+-fraktionen i fyra 15 ml polypropenrör. Märk rören enligt följande: CD34+/CF (CFSE_only), CD34+/CV (CFSE_high CTV_low), CD34+/VC (CFSE_low CTV_high) och CD34+/VI (CTV_high). Alikvot 250 μL av CD34-fraktionen i ytterligare fyra 15 ml polypropenrör. Märk rören enligt följande: CD34-/CF (CFSE_only), CD34-/CV (CFSE_high CTV_low), CD34-/VC (CFSE_low CTV_high) och CD34-/VI (CTV_high). De återstående cellerna från CD34-fraktionen kan kasseras.
  4. Förbered två CFSE-lösningar, som heter CFSE_high och CFSE_low. För CFSE_high (10 μM), blanda 1,1 ml DMEM utan FBS med 2,2 μL CFSE-lösning (5 mM). För CFSE_low (5 μM), blanda 550 μL DMEM utan FBS och 0,55 μL CFSE-stamlösning (5 mM).
  5. Tillsätt 250 μL av den CFSE_high lösningen till CF- och CV-rören, 250 μL av den CFSE_low lösningen till VC-rören och 250 μL DMEM utan FBS till VI-röret. För att säkerställa en effektiv blandning av cellsuspension och cellfärg, luta röret med nästan 90 grader och deponera CFSE-lösningarna på rörväggen. Håll sedan röret vertikalt för att blanda de två lösningarna och pipettera tre eller fyra gånger för att säkerställa en snabb blandning av CFSE-lösningarna med de återsuspenderade cellerna. Inkubera vid 37 °C i exakt 8 minuter.
  6. Efter inkubationen tillsätt 5 ml DMEM + 10% FBS. Håll rören vid 37 °C i 5 minuter.
  7. Snurra rören i 5 minuter vid 300 x g. Ta bort supernatanten via aspiration utan att störa pelleten och tvätta pelleten med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning 1x / etylendiamintetraättiksyra (PBS 1x / EDTA). Snurra igen i 5 minuter vid 300 x g. Kassera supernatanten utan att störa pelleten och suspendera cellpelleten igen i 250 μL 1x PBS /EDTA.
  8. Förbered två CTV-lösningar, som heter CTV_high och CTV_low. För CTV_high (10 μM), blanda 1,1 ml PBS 1x/EDTA och 2,2 μL CTV-material (5 mM). För CTV_low (5 μM), blanda 550 μL PBS 1x/EDTA med 0,55 μL CTV-stock (5 mM).
  9. Tillsätt 250 μL av den CTV_high lösningen till VC- och VI-rören, 250 μL av den CTV_low lösningen till CV-röret och 250 μL 1x PBS / EDTA till CF-röret. Använd samma teknik som beskrivs i steg 1.5. Inkubera vid 37 °C i exakt 8 minuter.
  10. Efter inkubationen tillsätt 5 ml DMEM + 10% FBS. Förvaras vid 37 °C i 5 min.
  11. Snurra rören i 5 minuter vid 300 x g, kassera supernatanten utan att störa pelleten och tvätta sedan pelleten med 5 ml 1x PBS / EDTA. Snurra igen i 5 minuter vid 300 x g.
  12. Kassera supernatanten utan att störa pelleten och suspendera CD34-fraktionerna i 1x PBS / EDTA för en slutlig koncentration av 1,5 x 106 celler / ml. Resuspendera CD34 + -fraktionerna i 40 μL färgningsbuffert och överför cellerna till 1,5 ml rör.

2. Färgning av antikroppar

OBS: Antikroppsfärgning kan anpassas efter experimentella behov. Endast CD34 + -fraktionerna genomgår antikroppsfärgning; CD34-fraktionerna används som en enda färgningskontroll för celldelningsfärgkombinationerna (CV-, VC-, CF- och VI-fraktioner). Följande panel är skräddarsydd för detektion av fyra typer av HSPC: hematopoetiska stamceller (HSC), multipotenta stamceller (MPP), lymfoidgrundade multipotenta stamceller (LMPP) och hematopoetiska stamceller (HPC)12. Identifiering av HSC och MPP presenteras dock. Tidsåtgång: 75 min.

  1. Förbered den enda färgningen för ytfärgning med kompensationspärlor. Blanda negativa pärlor och Immunoglobulin G (IgG) pärlor i förhållandet 1:1 för en total volym motsvarande 20 μL x antalet ytmarkörer (t.ex. 120 μL om färgningspanelen innehåller sex antikroppar).
  2. Skicka 20 μL pärlor till individuella 1,5 ml rör för varje markör. Tillsätt den volym som motsvarar utspädningsfaktorn för varje antikropp i motsvarande rör (om utspädningsfaktorn t.ex. är 1:20, tillsätt 1 μl).
  3. För att färga CD34 + -cellerna, förbered en masterblandning av antikroppar12, baserat på tabell 1. Blanda antikropparna i ett enda 0,5 ml rör. Tillsätt 7 μL från antikroppsmasterblandningen till vart och ett av de fyra CD34+-förhållandena.
  4. Inkubera kompensationspärlorna och CD34+ -proverna vid 4°C i minst 30 minuter.
    OBS: Inkubationstiden måste anpassas till de tekniska detaljerna för antikropparna som används för färgning.
  5. Bered under inkubationen den rundbottnade platta med 96 brunnar som skall användas för sortering och tillsätt 100 μl cellodlingsmedium till varje brunn med hjälp av en flerkanalig pipett.
    OBS: Lämna brunnarna H8-H12 tomma.
  6. Märk 5 ml polypropenrör för ytfärgningskontrollerna (5, med pärlor), celldelningsfärgkontrollerna (4, med CD34-fraktionerna) och CD34 + -proverna (4).
  7. Vid slutet av inkubationen tvättas cellerna och pärlorna med 1 ml färgningsbuffert. Överför den totala volymen till 5 ml polypropenrör. Centrifugera rören i 5 minuter vid 300 x g och sikta sedan på supernatanten utan att störa pelleten.
  8. Resuspendera cellerna i färgningsbuffert med cirka 500 μL vardera för pärlorna och CD34 + -cellerna och 1 ml för CD34-rören.

Tabell 1: Mall för att förbereda antikroppsmastermixen för ett cellsorteringsexperiment. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

3. Sortering av celler

De sorterade cellnumren kan variera beroende på den totala mängden tillgängliga celler. I protokollet tillhandahålls ett minsta cellnummer för varje kontroll. Tidsåtgång (för en enda platta): 100 min.

  1. Öppna mallexperimentet eller ange ett nytt experiment. Skapa ett enda prov och flera rör, ett per varje villkor.
  2. Ställ in grindstrategin som beskrivs i figur 1 och skapa sex punktdiagram. Visualisera först cellerna i ett FSC-A / SSC-A-punktdiagram och dubbelklicka på polygongrindverktyget för att välja en population med låg sidospridning (figur 1A). I följande punktdiagram (FSC-A / FSC-H) högerklickar du på diagrammet och väljer porten "Celler" i rullgardinsmenyn genom att klicka på den. Använd samma grindverktyg för att välja en tät population på diagonalen mellan de två axlarna (figur 1B).
  3. I det tredje punktdiagrammet (APC vs. FSH-H), visa populationen "Single Cells" och grinda cellerna negativa för uttryck av APC Lineage (Lin) (Figur 1C). I det fjärde diagrammet (CFSE vs. CTV), visa populationen "Lin-" och skapa fyra separerade grindar, en för varje färgämneskombination (figur 1D).
    OBS: Dessa grindar måste vara täta för att endast välja en liten del av homogent färgade celler.
  4. Använd det femte och sjätte diagrammet (APC-Cy7 vs. BV650 och PE-Cy7 vs. PE) för att identifiera förfäderna av intresse. Gates generöst CD34 + CD38- befolkningen och CD34 + CD38 + i det femte diagrammet (figur 1E). Välj sedan CD34 + CD38- befolkningen i det sjätte diagrammet och rita tre grindar, enligt figur 1F.
  5. Kör de enkla färgningsrören som innehåller kompensationspärlorna och klicka på knappen Förvärva . Justera fotomultiplikatorrörets (PMT) spänningar från rullgardinsmenyn Parametrar , särskilt för celldelningsfärgämnen (mellan 104 och 105 på en biexponentiell skala).
  6. Förfina kompensationsmatrisen i enlighet med panelen som används för sortering med hjälp av fliken Kompensation . Spela in minst 5 000 händelser i pärlporten genom att klicka på inspelningsknappen .
  7. Kör CD34-fraktionerna och kontrollera kompensationsmatrisen igen. Registrera minst 10 000 händelser i encellsgrinden.
  8. Kör CD34+ -fraktionerna och registrera minst 5 000 händelser i encellsgrinden. Justera grinden för varje färgkombination, ställ in en tät grind för att välja en homogen population (figur 1D). På samma sätt justerar du grinden för att välja HSC och MPP.
  9. När analysen är klar och alla rör har registrerats, sätt in plattan i lämplig hållare efter att ha utfört standard Aria-kalibreringen för sortering på 96-brunnsplattor. Kylning av plattan rekommenderas.
  10. Förbered plattsorteringsmallen enligt schemat som presenteras i tabell 2 med hjälp av experimentsorteringslayouten. Brunnarna med namnet "CD34-" innehåller 5 000-10 000 celler, sorterade på CF / CV / VC / VI-grinden. "Bulk" -brunnarna innehåller minst 500 celler, sorterade på grinden CD34 + CD38-. Slutligen innehåller encellsbrunnarna endast en händelse per celldelningsfärgkombination per brunn, så totalt fyra händelser per brunn.
    OBS: "Bulk" -populationerna kan anpassas till specifika förfäders delmängd; Sortera inte mindre än 500 celler.
  11. För sorteringen, fortsätt i ordning, slutför varje celldelningsfärgkombination innan du flyttar till nästa. Börja till exempel med att sortera CD34-CF, i renhetsläge. Klicka på förvärvsknappen och sedan på sorteringsknappen.
  12. I slutet av CD34-sorteringen sätter du in CF CD34+-röret. Förvärva, klicka sedan på sorteringsknappen och se till att ha markerat 0/16/0 som renhetsgrad. Slutligen sortera cellerna av intresse, en cell per brunn, i encellsrenhet, se till att kryssa i alternativet Indexsortering.
  13. Flytta till följande färgdelningsfärgkombination, upprepa samma ordning. Som referens ger tabell 2 ett exempel på en sorterad platta.
    Indexsorteringsfunktionen genererar enskilda filer för varje sorterat villkor.
  14. I slutet av sorteringen exporterar du filerna som .fcs 3.0-filer. Placera cellerna i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Cellerna odlas i flera dagar, enligt experimentell design, i minst 24 h26.

Tabell 2: Mall för en cellsorterande 96-brunnsplatta, baserat på de specifika kraven för successiv flödescytometrianalys. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

4. Analys av cellsorteringsdata

OBS: För att validera kvaliteten på cellsorteringen är FACS-dataanalysen nödvändig innan man går vidare. Huvudresultatet av detta steg är genereringen av ett kalkylblad som innehåller markörintensiteterna för varje sorterad enskild cell.

  1. Ladda upp .fcs 3.0 filerna i analysprogrammet.
  2. Kontrollera kompensationsinställningen som används vid cellsortering med hjälp av de enskilda färgningsfiler som registrerats före den faktiska sorteringen.
  3. Ställ in den reviderade grindstrategin med hjälp av filerna som motsvarar den olika bulken. Kopiera och klistra in dessa grindar i indexsorteringsfilerna.
  4. Kontrollera att indexsorterade celler föll i den inställda grinden. Om det finns några sorterade celler som var felaktigt gated, kan de identifieras genom att exportera plattkoordinaterna som registrerats under indexsorteringen och tas bort senare i analysen.
  5. Exportera händelsen från indexsorteringsfilerna som kompenserade parametrar. Exportera dem som .csv filer, markera alternativen "skalvärden" och "kompenserade parametrar". Dessa filer ska exporteras i en mapp med namnet "Exporterade filer".
  6. Kombinera alla filer i en enda .csv fil med skriptet i tilläggsfil 1. Ställ in rätt väg med funktionen "setwd". Utdata från det här skriptet är ett kalkylblad som innehåller alla olika gated händelser och de relativa intensiteterna för alla parametrar.

5. Färgning av antikroppar efter odling

OBS: Utför denna del av protokollet under sterila förhållanden; Flera reagenser delas med de tidigare stegen och måste förbli sterila. För flödescytometrianalys, använd en flödescytometer med en plattläsare. Detta gör det möjligt att utföra färgningen direkt i vävnadsodlingsplattan, vilket minskar cellförlusten till ett minimum genom att begränsa mängden pipettering och spinning. Förbered ytmarkörens enfärgsfärgning med kompensationspärlorna, förutom brunnarna A1-A4, som representerar den enda färgningen för CF / CV / VC / VI-färgerna och redan finns i 96-brunnsplattan. Bulkpopulationerna sorterade efter cellfärgen hjälper till att ställa in grindstrategin för antalet divisioner och den allmänna grinden. Tidsåtgång: 120 min.

  1. Innan du börjar protokollet, markera brunnarna som innehåller minst en cell genom att kontrollera plattan under ett inverterat mikroskop. Detta steg gör det möjligt att optimera mängden antikropp som används för färgning och påskyndar proceduren.
  2. Bered antikroppsmastermixen enligt tabell 3. Eftersom det finns en betydande mängd pipettering tar tabellen hänsyn till det tekniska felet på grund av pipettering, inklusive en extra volym på 5%. Antikropparna som beskrivs i tabellen gör det möjligt att karakterisera en rad HSPC från humana navelsträngsblodprover12.
  3. Centrifugera plattan i 5 minuter vid 300 x g. Vänd snabbt plattan under huven och över en pappershandduk för att ta bort supernatanten.
  4. Tillsätt 8 μL färgningsbuffert till brunnarna A1-A4. Tillsätt 8 μL av blandningen till de andra brunnarna.
  5. Blanda de negativa pärlorna och IgG-kompensationspärlorna i förhållandet 1: 1 för en total volym motsvarande 120 μL. Sänd 20 μL i ett 1,5 ml rör per markör. Tillsätt den antikroppsvolym som motsvarar utspädningsfaktorn (tillsätt t.ex. 1 μl om utspädningsfaktorn är 1:20).
    OBS: Anpassa den totala volymen till antalet markörer som används för färgningen (t.ex. 100 μL om färgningspanelen innehåller fem antikroppar).
  6. Inkubera plattan och kompensationskontrollerna för enkel färgning vid +4 °C i minst 30 minuter.
    OBS: Inkubationstiden måste anpassas till de tekniska detaljerna för antikropparna som används för färgningen.
  7. Tvätta pärlorna med 1 ml färgningsbuffert. Överför den totala volymen till de 5 ml polypropenrör som tidigare märkts. Centrifugera rören i 5 minuter vid 300 x g och avlägsna sedan supernatanten via aspiration.
  8. Tvätta cellerna i plattan genom att tillsätta 100 μL färgningsbuffert per brunn med en flerkanalig pipett. Centrifugera plattan vid 300 x g i 5 minuter, vänd sedan snabbt plattan under huven och över en pappershandduk för att ta bort supernatanten.
  9. Återsuspendera cellerna i 85 μL färgningsbuffert med hjälp av en flerkanalig pipett.
  10. Starta analysen på flödescytometern (förvärvsläge) med hjälp av den dedikerade mallen och klicka på anpassad. Denna anpassade mall tar hänsyn till de tekniska egenskaperna hos den runda bottenplattan med 96 brunnar, särskilt dimensionerna för varje brunn (diameter, djup och tjocklek). Sonden måste nå botten av brunnen, så ställ den i exakt centrum av brunnarna A1 och H12.
  11. Efter att ha valt fluoroforer av intresse från listan som föreslås av programvaran, ställ in plattinställningen enligt plattmallen i tabell 2, korrigerad för antalet brunnar som innehåller minst en cell.
  12. Välj 100 μL som gräns för anskaffningsvolym. Markera omrörningsalternativet . Ställ in förvärvshastigheten på max 1 μl/s, eftersom lägre hastighet förbättrar den totala analyserade volymen per brunn.
  13. Tillsätt lämpliga rengörings- och tvättlösningar till brunnarna H8-H12. Mallen i tabell 2 lämnar specifikt brunnarna H8-H12 tomma, eftersom flödescytometern måste köra en rad tvättförhållanden i slutet av analysen.
    OBS: Detta steg är anpassat till specifikationerna för den använda flödescytometern.
  14. I avsnittet plottar och grindar ställer du först in encellsgrinden med hjälp av FSC-A/SSC-A-spridningsdiagrammet och sedan FSC-H/FSC-A-spridningsdiagrammet. Skapa ett histogram för varje markör av intresse.
  15. När inställningarna har bekräftats fortsätter du till avsnittet Analys . Analysera den enskilda färgningen först och registrera inte mindre än 5 000 händelser (optimalt intervall: 5 000-15 000 händelser), både för kompensationspärlorna och de CD34-färgade fraktionerna. Justera spänningarna vid behov.
  16. När alla enstaka färgningar har registrerats är det möjligt att starta det faktiska förvärvet genom att klicka på förvärvsfunktionen .

Tabell 3: Antikroppsmastermix för ett flödescytometriexperiment, specifikt för identifiering av HSPC från humant navelsträngsblod. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

6. Dataanalys av flödescytometri efter odling

Den beskrivna dataanalysen är specifik för den programvara som nämns i materialförteckningen. Huvudresultatet är genereringen av ett kalkylblad som innehåller information om ytmarkörintensitet, antal divisioner och släktskap per analyserad cell. I den här delen av protokollet ingår ett skript skrivet i R, vilket krävs för det här arbetsflödet för att generera det slutliga analyskalkylbladet.

  1. Exportera filer från flödescytometern som FCS-filer. Ladda upp dem till analysprogramvaran, gruppera dem tillsammans som "single staining", "bulk" och "single cell".
  2. Förbered en kompensationsmatris med hjälp av de enskilda färgningsfilerna och tillämpa den på de andra två grupperna genom att dra och släppa.
    OBS: Om ett automatiskt kompensationsverktyg används, kontrollera kvaliteten för hand innan du fortsätter.
  3. Om du vill ha en representativ grind sammanfogar du de olika bulkbrunnarna i en enda fil. Det här steget markerar snabbt om två färger överlappar varandra (vanligtvis CV och VC) eller andra avvikelser och därför måste uteslutas. När du har klickat på alternativet sammanfoga populationer väljer du alla okompenserade parametrar från menyn "parametrar" och klickar sedan på sammanfoga.
  4. Ladda upp den sammanfogade filen till arbetsytan och tillämpa sedan kompensationsmatrisen via dra och släpp.
  5. Förbered grindstrategin som definieras i bild 2 med hjälp av den sammanfogade filen. I encellsgrinden visar du händelserna i ett spridningsdiagram med CFSE och CTV. Skapa en första grind som heter Märkt, inklusive alla fyra färgerna och exklusive eventuell autofluorescens (figur 2C). Porta sedan varje färg individuellt.
  6. Celler märkta med CV och VC behöver ett transformerat värde, med tanke på att färgen är resultatet av CFSE- och CTV-signalerna. De två koordinerade signalerna roteras därför på en logaritmisk skala med 45° så att delningsutspädningen kan fortsätta parallellt med x-axeln. Detta transformerade värde härleds manuellt, klickar på Verktyg och sedan Härled parameter. Klistra in följande formel i formelrutan :
    Equation 1
    OBS: Ekvation26 förutsätter att CFSE och CTV är parametrarna 03 och 17.
  7. För att korrekt visualisera den här nya parametern med namnet Härledd parameter anger du en linjär axel som sträcker sig ~3–7, klickar på alternativet Axelparameter och väljer Anpassa axel.
  8. Använd grinden på varje färg individuellt som ett histogramdiagram: för CF och VI ställer du in CFSE-A respektive CTV-A på x-axeln. För CV och VC anger du den nyligen härledda parametern på x-axeln. Ställ in grindar som motsvarar varje topp, som visas i figur 3.
  9. Applicera grinden på varje enskild encellsbrunn. Se till att lägga till den härledda parametern i varje analyserad brunn. Kontrollera manuellt varje färggrind för varje brunn för att identifiera händelser som felaktigt tilldelats en viss topp. Exempel på grindar visas i figur 4.
  10. När analysen är klar och alla brunnar har verifierats väljer du alla CF/CV/VC/VI-grindar som innehåller minst en cell. Exportera dem som .csv filer, markera alternativen "skalvärden" och "kompenserade parametrar". Dessa filer exporteras i en mapp med namnet "Exporterade filer".
  11. Kombinera alla filer i ett enda .csv med R-skriptet i tilläggsfil 1. Kom ihåg att ställa in rätt väg med funktionen "setwd". Utdata från det här skriptet är ett kalkylblad som innehåller alla olika gated events och de relativa intensiteterna för alla parametrar.
  12. Öppna kalkylbladet och byt namn på kolumnerna för varje parameter, till exempel med följande namn: CFSE, CTV, CD90, CD123, CD45RA, CD34, CD38. Dessa namn kommer att användas för att identifiera grindtröskeln för att korrekt tilldela varje cell deras identitet.
  13. Lägg till sex kolumner med namnen "Well", "Condition", "Color", "Generation", "Original_cell" och "Culture_time". Dessa variabler är de som definieras experimentellt och härleds från varje rad:
    export_A10 CD34 + PBS_CV_Peak 1.csv.1 = A10 (brunn), CD34 + (Original_cell), PBS (skick), CV (färg), Peak_1 (generation).
  14. Exportera bulkbrunnarna för att identifiera tröskelvärdena för grind: exportera den kompenserade populationen av intresse (t.ex. CD34 + CD38-) som .csv filer, markera alternativen "skalvärden" och "kompenserade parametrar". Exportera dessa filer i en mapp med namnet "Exporterade filer".
  15. För att hitta tröskelvärdet för CD38, identifiera det största numeriska värdet för den här parametern. Omvänt, för att hitta tröskeln för CD34, identifiera det minsta numeriska värdet för denna parameter. Upprepa denna process för alla parametrar av intresse.
    OBS: För analysen som presenteras i protokollet används markören CD45RA både för att identifiera LMPP i CD34 + CD38- grinden och CMP / GMP i CD34 + CD38 + grinden. Detta innebär att två olika tröskelvärden måste extraheras för denna markör.
  16. Kopiera och klistra in tröskelvärdena i en Excel-fil som heter "gating_matrix". Denna fil är organiserad enligt tabell 4 och möjliggör analys av flera oberoende experiment. Det är mycket viktigt att namnge varje kolumn exakt med detta schema: XXYYMMDD_xxh, där XX står för operatörens två initialer, YY de två sista siffrorna för året, MM för månaden, DD för dagen och xx för analysens tidpunkt.

Tabell 4: Gating matris för cellens ödestilldelning, före den statistiska analysen. CD45h avser intensiteten hos CD45RA för HPC-undergruppen, medan CD45l avser intensiteten hos CD45RA för CD34+CD38-delmängderna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

7. Statistisk analys

Den statistiska testningen av de data som genereras innefattar en skräddarsydd analyspipeline, kodad med programmeringsspråket Python (Supplemental File 2, Supplemental File 3 och Supplemental File 4). Skriptet är organiserat i tre block: det första för bearbetning av kalkylbladet, det andra blocket för att generera värmekartan för datavisualisering och det sista blocket för att generera flera histogram för att analysera och testa differentierings- och delningsegenskaper.

  1. Börja från blocket "0_process_data" (kompletterande fil 2), se till att gating_matrix- och datakalkylarksvägarna är korrekt definierade i skriptet.
  2. Definiera "cell_cols" -ordlistan för att tilldela relevanta cellöden till varje cell. I det specifika fallet är ödet HSC, MPP, LMPP, vanliga myeloida förfäder (CMP), granulomonocytiska föregångare (GMP), megakaryocytiska-erytroida förfäder (MEP) och CD34-.
  3. Använd de tröskelvärden som definieras från bulkbrunnarna (steg 6.16) och definiera funktionen "cell_class_exp_time". Det är viktigt att vara konsekvent i kolumnnamngivningen, för att korrekt definiera dessa tröskelvärden, med samma namn som används för att definiera varje kolumn i steg 6.12.
  4. Cellfenotyperna definieras i skriptet med hjälp av en serie "if-else" -satser, baserat på tröskelvärdena som detekteras under flödescytometrianalysen.
    OBS: Olika fenotyper kan visas genom att modifiera dessa satser för att rymma andra markörkombinationer.
  5. Ange de experimentella specifika förhållandena med funktionen "cond_rule" (t.ex. olika experimentella behandlingar). För den datauppsättning som tillhandahålls heter villkoren "GT" och "Diff". Beskriv de två olika cellodlingsmedier som används för att odla cellerna. Denna information kommer att användas av blocket "1_dot_plot" (kompletterande fil 3) för att plotta värmekartan.
  6. I blocket "2_bar_plot" (kompletterande fil 4) definierar du ordlistan "class_dct", inklusive de diskreta cellöden av intresse. För den datauppsättning som tillhandahålls är cellöden av intresse desamma som beskrivs för ordlistan "cell_cols".
  7. Definiera "conds" (villkor), "or_cells" (originalcell), "sym_labs" (symmetrietiketter) och "times" (experimentell tidpunkt). Dessa är upprepade filter som är nödvändiga för plottning. "conds" tar villkoren som definieras i "cond_rule" igen, "or_cells" är HSC och MPP, och "sym_labs" beskriver typen av divisioner.
  8. I blocket "2_bar_plot" är det möjligt att plotta celler som har utvecklats upp till division 6.
    OBS: Den angivna datauppsättningen innehåller endast celler upp till division 4, så ett felmeddelande dyker upp, men det hindrar inte skriptet från att fungera.
  9. Figurerna som genereras av skriptet kan hämtas i mappen med namnet "figurer" som pdf-filer. Filerna med namnet "Test" representerar de olika statistiska testerna som utförts för motsvarande histogram.

Representative Results

FACS-sortering
De sorteringsgrindstrategier som presenteras i detta protokoll är baserade på allmänt accepterade strategier 12,30,31. För grindstrategin som presenteras i figur 1 är utgångsmaterialet stamfader som tidigare renats via CD34 + magnetisk anrikning, vilket förklarar den försumbara andelen Lineage-positiva celler. Det är viktigt att använda täta grindar för de fyra intracellulära färgkombinationerna (t.ex. CTV i figuren), för att förbättra topparnas upplösning under följande analys och för att grinda rätt cellpopulation (figur 1D). I det fall som visas i figuren väljer grindarna för den största och bättre definierade befolkningen. Förekomsten av flera, nära populationer för varje celldelningsfärgkombination är enligt vår erfarenhet inte representativ för biologiska skillnader. Istället kan det indikera a) en icke-optimal färgningsprocedur, eller b) en stor heterogenitet (särskilt i storlek) i startpoolen av celler. Detta är inte oväntat när man börjar från navelsträngsblod eller andra komplexa biologiska källor (t.ex. benmärgsaspirering, perifert blod). Om grinden inte är tätt definierad kan den progressiva utspädningen av de olika färgkombinationerna leda till sammanslagning av de senare topparna, speciellt för förhållandena CV och VC (figur 2D). En annan negativ konsekvens av en suboptimal grind är oförmågan att effektivt urskilja olika toppar efter cellodling, eftersom en heterogen startpopulation kan leda till grunda toppar.

Figure 1
Figur 1: Gating-strategi för cellsortering. (A) FSC-A kontra SSC-A, för att utesluta skräp och kontaminerande celler. (B) FSC-A kontra FSC-H, för att utesluta dubbletter och cellklumpar. (C) Lin jämfört med FSC-H, för att utesluta celler som är Lin+. (D) CTV kontra CFSE, för att entydigt identifiera cellerna färgade med färgämneskombinationerna CF, CV, VC och VI. Portarna bör vara tillräckligt strikta för att inkludera en homogen befolkning. (E) CD34 kontra CD38, för att separera de begränsade förfäderna CD34 + CD38 + (även kallad HPC) från det multipotenta facket CD34 + CD38-. (F) CD45RA kontra CD90, från CD34+CD38-populationen, för att skilja mellan de mest omogna stamfäderna anrikade i HSC (CD90+CD45RA-), LMPP (CD90midCD45RA+) och den mer engagerade MPP (CD90-CD45RA-). (G) Indexsorterade händelser, representerade här för deras cellfärgningskombinationsfärgning och (H) uttrycket av ytmarkörerna CD90 och CD45RA. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Flödescytometrianalys efter cellodling
Data i figur 2 är representativa för HSC för humant navelsträngsblod, som hålls i odling i 72 timmar, i närvaro av flera cytokiner som kan stödja en rad myeloida stamfäder och prekursorer. Panelerna 2A till 2D representerar den grind som krävs för att fastställa släktskapet mellan var och en av de enskilda cellerna, medan panelerna 2E till 2G tillåter cellulär fenotypning. Den minskade närvaron av parlamentsledamöter i figuren är förmodligen en följd av de kulturförhållanden som användes för detta representativa experiment (figur 2F). Användning av olika cytokiner och odlingsförhållanden förändrar den relativa procentandelen av varje delmängd, på samma sätt som att välja olika startceller för experimentet.

Figure 2
Figur 2: Gating strategi för flödescytometrianalys. (A) FSC-A kontra SSC-A, för att utesluta skräp och kontaminerande celler. (B) FSC-A kontra FSC-H, för att utesluta dubbletter och cellklumpar. (C) CTV kontra CFSE, grinden märkt gör det möjligt att utesluta alla autofluorescerande händelser som kan påverka dataupplösningen. (D) CTV mot CFSE. Det är extremt viktigt att strikt grinda de fyra populationerna, baserat på celldelningsfärgutspädningarna. (E) CD34 kontra CD38, för att skilja mellan engagerade prekursorer (CD34-), begränsade förfäder (HPC) (CD34 + CD38 +) och omogna förfäder (CD34 + CD38-). (F) CD45RA kontra CD123, för att skilja mellan tre typer av begränsade stamfäder: CMP (CD123+CD45RA-), MEP (CD123-CD45RA-) och GMP (CD123+CD45RA+). (G) CD45RA kontra CD90, från CD34+CD38-, för att identifiera HSC, LMPP och MPP. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Toppdefinitionen och tilldelningsstegen (figur 3 och figur 4) är viktiga aspekter av protokollet och kräver definition av strikta grindar. För toppdefinitionen (figur 3) krävs minst 1 000 händelser för en tillförlitlig identifiering. I den meningen kan det vara fördelaktigt att isolera fler celler under cellsorteringssteget för "Bulk" -brunnarna. Figur 4 beskriver fyra exempel på enskilda brunnar som innehåller flera familjer. Denna figur klargör vikten av Figur 2D och Figur 3 gating, särskilt för identifieringen av varje familj och varje topp. Figur 4A illustrerar ett enkelt exempel, eftersom alla celler i grinden CF är mycket nära varandra och lätt kan tilldelas en enda topp. Figur 4C visar ett annat exempel på en familj som distribueras entydigt på två väl separerade toppar, som det tydligt visas i histogrammet i figur 4D. Figur 4E,G avslöjar vikten av strikt grind baserat på ett stort antal händelser; De visar båda få händelser som är nära, men utanför färgkombinationsportarna. Dessa händelser kan felaktigt inkluderas i VI- och CF-grindarna, uteslutande baserat på analysen av en brunn. Slutligen visar figur 4F,H två olika exempel på familjer spridda på flera toppar, med ett exempel på två liknande intensitetstoppar (figur 4F) och ett med två ojämna intensitetstoppar (figur 4H).

Figure 3
Figur 3: Toppdefinition för flödescytometrianalysen. (AD) Toppar bör definieras som registrerar minst 500 händelser för att säkerställa en god representation för varje enskild topp. a) Histogram för CFSE-A-intensiteten. Flera toppar kan identifieras, var och en motsvarar en annan population av delande celler. (B,C) Histogram för intensiteten hos den härledda parametern, som representerar CFSE-CTV-blandningen, CV (B) respektive VC (C). d) Histogram för CTV-A-intensiteten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Topptilldelning . (A,B) Endast en topp kan detekteras för denna brunn, i CF-grinden. (C,D) Två toppar med nästan samma intensitet kan detekteras i denna brunn, i VI-porten. Topparna är väl upplösta. (E,F) Två toppar av jämförbar intensitet kan detekteras i denna brunn, i VI-porten. Endast händelserna i porten har beaktats, baserat på den strategi som fastställts med hjälp av bulkbrunnarna. (G-H) Två toppar av ojämn intensitet kan detekteras i denna brunn, i grinden CF. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Datarepresentation och statistisk testning
Figur 5 visar olika typer av datarepresentation av två separata experiment, båda utförda efter 72 timmars cellodling. HSC och MPP har odlats i två olika cellodlingsmedier, som ska förändra celldelning och differentieringsegenskaper. Dessa medier heter "Diff" (Differentiation)32 och "GT"33; den första främjar myeloisk och erytroid differentiering, eftersom den innehåller erytropoietin (EPO) och granulomonocytisk kolonistimulerande faktor (GM-CSF), medan den andra har utvecklats i samband med kliniska prövningar av genterapi, med målet att upprätthålla och förstärka en hög andel HSPC. Figur 5A är en representativ värmekarta för tillståndet "Diff", som representerar en mängd olika cellfamiljer, både i cellöden och delningar. I denna värmekarta representerar varje rad en enskild familj, varje kvadrat en enskild cell och kolumnerna grupperar alla celler som är i samma generation (t.ex. celler i generation 2 uppdelade minst två gånger). Det är möjligt att skilja mycket homogena familjer, bestående av en enda celltyp och som visar samma antal divisioner (t.ex. familj # 63) och heterogena familjer, inklusive tre celltyper över två generationer (t.ex. familj # 84). Eftersom den cellulära återvinningsgraden för denna analys är cirka 70%, observeras sällan kompletta familjer, som definieras genom att alla deras celler återvinns i eventuellt olika generationer (t.ex. en familj av en cell i generation 1 och två celler i generation 2) (visar en hashtag bredvid deras ID-nummer i figur 5A). Det finns flera förklaringar som står för den ofullständiga detektionen, som kan vara teknisk (färgningsproblem, cellförlust på grund av protokollet) eller biologisk (celldöd och / eller apoptos). Tekniska begränsningar kan övervinnas med hjälp av en analysator utformad för att minska dödvolymen associerad med det enskilda provet och genom att utföra cellfärgningen direkt i cellodlingsplattan för att minska volympipetteringen. Omvänt kan ortogonala metoder för att bestämma mängden celldöd (t.ex. via levande cellavbildningsexperiment) hjälpa till att skilja de tekniska och biologiska faktorer som resulterar i ofullständig detektion.

Figur 5Bi visar hur man visualiserar effekten av odlingstillståndet på celltypens sammansättning, som om man hade utfört en bulkanalys. Här främjar Diff-tillståndet ett större antal öden och en högre andel CD34 + -celler (definierad som alla celltyper utom CD34-). Konfidensintervallen beräknas i skriptet via grundläggande bootstrap, med 250 000 bootstrapped datauppsättningar34. Det är värt att notera att alla andra histogram i figur 5 visar konfidensintervall beräknade på samma sätt. Tabell 5 sammanfattar all information om antalet familjer och antalet celler i varje generation.

Figur 5Bii visar grafiskt resultatet av den statistiska testning som utförts i skriptet "2_bar_plot". En formell beskrivning av den statistiska ramen finns tillgänglig26. I korthet möjliggör detta ramverk statistisk hypotesprövning samtidigt som man antar att celler från samma familj är beroende (ett antagande som i sig är testbart), i motsats till klassisk statistik som skulle kräva oberoende mellan alla observerade celler. I det specifika fall som presenteras i figuren utmanar det statistiska testet hypotesen att MPP: s cellödesval, mätt som frekvenserna för de olika celltyperna som finns i kulturen, är oberoende av de cellodlingsförhållanden som används. Först används G-teststatistiken för att utvärdera skillnaden mellan celltypsfrekvenser från olika cellmedier (för exemplet i Bii representeras denna statistik med den röda stapeln). Därefter utförs en randomisering av data via permutation, byte av hela familjer av celler mellan de två cellodlingsförhållandena. Detta för att bevara beroendet mellan familjerelaterade celler, samtidigt som antalet familjer i varje uppsättning överensstämmer med originaldata. G-teststatistiken beräknas från den randomiserade datauppsättningen. De blå värdena som representeras i 5Bii är G-teststatistiken för 250 000 permutationer. Slutligen beräknas p-värdet för att bedöma i vilken utsträckning den ursprungliga datauppsättningen avviker från fördelningen av de permuterade. I exemplet avviker den ursprungliga statistiken till stor del från fördelningen, vilket resulterar i ett litet p-värde och därmed avvisar hypotesen att MPP: s cellöde är oberoende av odlingsförhållandena.

Figur 5C representerar procentandelen cellfamiljer per maximal generation, för att undersöka hur olika förhållanden förändrar celldelning per cellfamilj. Detta datadiagram visar att vid 72 timmar fullbordar cellerna odlade i Diff-tillståndet ett större antal delningar än celler i GT-tillståndet. Representerat är antalet maximala generationer per familj, så en familj som visar celler i generation 1 och 2 betraktas som generation 2. Samma statistiska ramverk som används för figur 5B kan användas för att statistiskt testa oberoendet mellan celldelning och odlingstillstånd.

Figur 5D utforskar typen av symmetri/asymmetri för den första divisionen för de olika förfadertyperna (HSC eller MPP). För de fullständiga cellfamiljerna i generation 1 - den enda generationen där det är möjligt att definitivt etablera de två dottercellerna som systerceller - kan fyra olika typer av symmetri / asymmetri definieras: etiketten "Sym Undiff" beskriver familjer där båda döttrarna behåller fenotypen för ursprungscellen. "Sym Diff" betyder att båda döttrarna har samma fenotyp, och det skiljer sig från ursprungscellen. "Asym Undiff" betyder att en dotter bara behåller fenotypen för ursprungscellen. Slutligen beskriver "Asym Diff" familjer där båda döttrarna har olika fenotyper, och ingen av dem är desamma som ursprungscellen. För att få statistisk styrka i bedömningen av dessa symmetriska/asymmetriska öden är det önskvärt att utföra MultiGen-analysen vid tidiga tidpunkter, för att observera fler familjer vars avkomma finns i generation 1.

Slutligen representerar figur 5E procentandelarna av celltyper som en funktion av antalet divisioner, för att få insikter om differentieringsmönstrets progression över divisioner. Till exempel tyder data som visas i figuren på att celler utvecklas till CD34-tillståndet , med över 50% av detekterade celler i denna klass efter bara tre divisioner. Dessutom är det möjligt att dra slutsatsen att MPP inte gynnar självförnyelsedelning, eftersom en liten andel celler behåller den ursprungliga fenotypen. Vissa av dessa slutsatser kan sedan testas med hjälp av den statistiska ram som presenteras i de tidigare figurerna.

Figure 5
Figur 5: Exempel på datarepresentation för ett 72-timmarsexperiment med HSPC:er med navelsträngsblod. (A) Värmekartor för ett valt dataset (HSC, i "Diff"-medium, efter 72 timmars odling). Diagrammen representerar alla enskilda celler (kvadrater) enligt deras släktskap (rader), antal utförda divisioner (kolumner, kallad generation) och fenotyp (färger). (Bi) Histogram som jämför proportionerna av celltyperna hos cellavkommorna till HSC och MPP, mellan tillståndet GT och tillståndet Diff. (Bii) Diagrammet representerar de statistiska tester som utförts i "2_bar_plot" -skriptet för MPP vid 72 timmars kultur, jämfört mellan "Diff" och "GT" cytokincocktails. Det experimentella värdet visas i rött och värdena genereras via 250 000 permutationer i blått. P. värdet för G-testet anges i det övre högra hörnet med antalet familjer som används för testet. (C) Histogram som jämför andelen familjer (totalt 314 familjer) i varje generation (färgkodad), för HSC och MPP per odlingstillstånd. Konfidensintervallen beräknas med 250 000 bootstrapped datauppsättningar. (D) Histogram som representerar typen av symmetri/asymmetri mellan dottercellernas öde för familjerna med två celler i generation 1: Sym Undiff (båda döttrarna behåller ursprungscellens fenotyp), Sym Diff (båda döttrarna har samma fenotyp, och den skiljer sig från ursprungscellen), Asym Undiff (endast en dotter behåller ursprungscellens fenotyp), och Asym Diff (båda döttrarna har olika fenotyper och ingen av dem liknar ursprungscellen). E) Histogram över bidraget från celltyper klassificerade per generation för MPP odlade med "Diff"-cocktail. n = 204 celler och 97 familjer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 5: Beskrivning av antalet analyserade familjer och celler per försöksbetingelse (ursprungscell och cellodlingsmedium). Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande fil 1: Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 3: Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 4: Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

MultiGen-analysen är en high-throughput, lätt att utföra och odyr analys, som har varit avgörande för att studera lymfocyt 23,24,35 och murina hematopoetiska celler 26,27. Här presenterar vi en ny utveckling av tillvägagångssättet som gör det möjligt att dechiffrera ex vivo den tidiga fasen av humant HSPC-engagemang, på encellsnivå med hjälp av kortvarig kultur (figur 6). Encelliga ex vivo-odlingssystem används vanligtvis för att bedöma HSPC: s långsiktiga öde i mogna celler, men vissa öden inträffar tidigare än andra36, vilket potentiellt fördjupar analysen mot färre öden. Dessutom saknar dessa kultursystem vanligtvis information om uppdelningar under ödesåtagandet. De första engagemangsstegen har visat sig inträffa så tidigt som i början av kulturen, ibland utan division26,37, vilket gör kortsiktig kultur och spårning av division avgörande för att studera tidigt ödesengagemang. Genom att samtidigt följa ödet, uppdelningen och släktskapet tillåter denna analys att förstå rollen för den första divisionen och ödesbeslutet i mänskliga HSPC. Med hjälp av analysen är det möjligt att dra slutsatsen efter hur många divisioner engagemangsprocessen sker, balansen mellan självförnyelse och differentiering för de tidiga förfäderna och hur dessa egenskaper ärvs över generationer. Såvitt vi vet är detta den enda analysen som tillåter dessa typer av mätningar för humana HSPC, med encellsupplösning. Dessutom, med hjälp av olika kombinationer av celldelningsfärgämnen, ökade vi genomströmningen av analysen, vilket gjorde denna analys till ett värdefullt verktyg för att snabbt generera stora dataset. Färgkombinationerna gör det möjligt att följa flera familjer i samma brunnar, vilket ökar antalet celler som är tillgängliga för analys i korttidsodling. Antalet kombinationer kan potentiellt ökas ännu mer, genom tillsats av andra färgämnen (t.ex. gult färgämne) eller modifiering av förhållandet mellan CFSE och CTV. Detta minskar dock antalet andra parametrar som kan analyseras.

Figure 6
Figur 6: Schematisk representation av protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För att utföra analysen framgångsrikt, på grund av det stora antalet brunnar och det reducerade antalet celler som ska analyseras, är det nödvändigt att köra flödescytometrianalysen på en analysator utrustad med en plattläsare. Den nya generationen bänkanalysatorer är särskilt anpassade för denna analys, eftersom de flesta av dem har en mindre dödvolym för att minska andelen cellförlust. Detta garanterar i sin tur en högre effektivitet vid återvinning av hela varje brunn, vilket leder till en effektivitet som uppskattas i intervallet70% 26. Att uppskatta cellförlusten under flödescytometriförvärvet är avgörande för analysen av varje enskild familj. Till exempel, förutsatt ingen celldöd och räknar antalet divisioner, är det möjligt att uppskatta antalet celler per varje familj. Det är dock önskvärt att utföra några bekräftande experiment, särskilt vid uppskattning av celldöd under de testade odlingsbetingelserna och mätning av återhämtningshastigheten experimentellt med användning av ett definierat antal celler.

Ett av de avgörande stegen i detta protokoll är topptilldelningen. Som redan nämnts är en toppfördelning av god kvalitet starkt beroende av isolering av mycket smala toppar vid cellsortering. Ändå är det fortfarande svårt att tilldela rätt antal divisioner baserat unikt på fördelningen. Eftersom cellsortering och flödescytometrianalys utförs på två olika maskiner är det inte möjligt att direkt jämföra intensiteten hos varje signal, så det kan vara svårt att veta om den första toppen som observeras i histogrammets högra ände är topp 0 eller topp 1. I detta avseende är få lösningar möjliga; Ett sätt är att utföra ett ortogonalt experiment för att noggrant mäta antalet divisioner som utförs av dessa celler (t.ex. levande cellavbildning). En annan möjlighet är att helt enkelt räkna antalet celler i brunnen under ett inverterat ljusfältmikroskop innan flödescytometrianalysen körs. Detta kommer att härleda ett genomsnittligt antal divisioner (förutsatt ingen celldöd). Slutligen är en post-hoc-lösning för topptilldelning detektering av ett ovanligt antal "omöjliga familjer"; Dessa familjer består av ett större antal celler per generation än möjligt (t.ex. fem celler i generation 2, eller två celler i generation 1 och en cell i generation 2). Möjligheten att exkludera omöjliga familjer kodas i det statistiska analyssteget, och flaggar för den omöjliga familjen. Om förekomsten av dessa fel är för hög är det rimligt att anta att topptilldelningen behöver revideras.

I detta protokoll inkluderade vi några exempel på datarepresentation och analys för analysen, eftersom detta har blivit ett viktigt steg i genereringen och tolkningen av stora dataset38. Det första exemplet är värmekartan som visar totaliteten av alla analyserade celler, organiserade per familj. Detta är ett effektivt verktyg för att utforska de allmänna egenskaperna hos data och potentiella slutsatser: är familjer sammansatta av flera celltyper eller tenderar de att vara homogena i sammansättning? Är familjer spridda över flera generationer, eller delar de oftast lika många gånger? Denna explorativa analys måste sedan kompletteras med mer specifika diagram och statistiska tester. Den kan användas för att kvantitativt bedöma symmetriskt och asymmetriskt ödesengagemang, differentiering utan uppdelning, balansen mellan självförnyelse och differentiering och antalet divisioner för ett givet åtagandeöde. Det är grundläggande, under experimentplaneringen, att ställa in cellodlingslängden i enlighet med den typ av fråga som ställs; Till exempel, för de två första frågorna (symmetrisk/asymmetrisk balans och differentiering utan uppdelning), möjliggör planering av mycket korta kultursteg isolering av ett stort antal familjer som bara har utfört en eller ingen uppdelning alls26. Omvänt tillåter längre experiment utforskning av antalet divisioner som krävs för ett specifikt cellåtagande, eftersom de samplar familjer i olika stadier av differentiering. Ändå är denna metod inte utformad för långsiktiga kulturer (2-3 veckor), eftersom cellfärgutspädning inte kan spåra mer än sju eller åtta divisioner22. Som en konsekvens är detta verktyg mestadels anpassat för att studera det tidiga engagemanget hos hematopoetiska förfäder och är inte utformat för att göra robusta slutsatser om dessa cellers långsiktiga differentieringsegenskaper.

Den statistiska ramen utvecklades specifikt för analys av denna typ av data och baserades på begreppet permutationer26. Detta var nödvändigt på grund av observationen av ett familjärt beroende av celltypfördelningen och antalet utförda divisioner. Med andra ord är celler som ingår i samma familj också mer benägna att visa liknande fenotyper och dela samma antal gånger. Även om en djupgående analys ligger utanför ramen för detta arbete, bör den tillhandahållna uppsättningen statistiska tester vara tillräckliga för att bedöma olika förhållanden.

Sammanfattningsvis utgör detta protokoll ett värdefullt verktyg för att bedöma den cellulära dynamiken hos hematopoetiska stam- och stamceller ex vivo, på ett snabbt och billigt sätt. På grund av dess flexibilitet och mångsidighet när det gäller tidpunkt, odlingsförhållanden och typ av HSPC analyseras, gör det möjligt att testa en mängd olika experimentella förhållanden. Som en flödescytometribaserad analys kan den implementeras i de flesta laboratorier, och den kräver inte omfattande förkunskaper, vilket gör den till en bra kandidat för screenings och pilotexperiment.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt relevant för detta arbete. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och tolkning, eller beslutet att skicka in arbetet för publicering.

Acknowledgments

Vi vill tacka medlemmarna i Institut Curie Flow Facility för deras hjälp med att sätta upp flödescytometriexperimenten. Vi vill också uppmärksamma bidragen från de andra medlemmarna i Team Perié, under flera diskussioner. Vi tackar Dr. Julia Marchingo och Prof. Phil Hodgkin (Walter end Eliza Hall Institute of Medical Research) för att dela sitt protokoll för multiplexering av celldelningsfärgämnen på lymfocyter. Vi tackar biobanken för navelsträngsblod på Saint Louis sjukhus för att ha tillhandahållit de biologiska resurser som är nödvändiga för utvecklingen av detta protokoll. Studien stöddes av ett ATIP-Avenir-bidrag från CNRS och Bettencourt-Schueller Foundation (till LP), bidrag från Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (till LP och AD), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (till LP), Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, till LP) och ITMO MIIC-bidraget (21CM044, till L.P.). Förutom finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) under Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 ERC StG 758170-Microbar (till LP), stöddes A.D. av ett stipendium från Fondation de France.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes vWR 87003-294
15-mL polypropylene tubes vWR 734-0451
50-mL polypropylene tubes vWR 734-0448
96-well U-bottom culture plate  Falcon 353077
Anti-human Lin APC Thermo Fisher 22-7776-72 Dilution 1/40
ARIA III BD Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Life Technologies C34570
Cell Trace Violet (CTV)  Life Technologies C34571
Compensation beads  BD 552843
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies 11320033
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Thermo Scientific J62948-36 Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water
FC block Fc1.3216 BD 564220 Dilution 1/50
Fetal Bovine Serum (FBS) Dutscher S1900-500C Batch S00CH
FlowJo v10.8.1 BD
Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a Biolegend 312216 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3 BD 564195 Dilution 1/15
Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581 Biolegend 343513 Dilution 1/40
Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7 Biolegend 356620 Dilution 1/40
Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100 BD 560673 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100 BD 560675 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10 Biolegend 328110 Dilution 1/20
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Life Technologies 10010001
Python
R
Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes Falcon
ZE5  Biorad Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader
Laboratory prepared
Cell culture media Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 °C until use
DMEM + 10% FBS Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM
PBS 1X + EDTA 0.1% Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X
Staining buffer Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. Single-cell immunology: Past, present, and future. Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).
  2. Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity. Bioessays. 44 (11), 2200084 (2022).
  3. Regev, A., et al. The human cell atlas. Elife. 6, 27041 (2017).
  4. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  5. Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
  6. Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies. Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).
  7. Perié, L., Duffy, K. R. Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods. FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).
  8. Yu, V. W. C., et al. Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells. Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).
  9. Ganuza, M., et al. Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny. Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).
  10. Naik, S. H., Schumacher, T. N., Perié, L. Cellular barcoding: A technical appraisal. Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).
  11. Quek, L., et al. Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 − acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage. The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).
  12. Karamitros, D., et al. Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells. Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).
  13. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  14. Delaney, C., et al. Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).
  15. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  16. Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. Antagonism of PPAR-γ 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis. Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).
  17. Vannini, N., et al. The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
  18. Gupta, R., et al. Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity. Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).
  19. Horwitz, M. E., et al. Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study. Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).
  20. Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation. Science. 367 (6479), 3381 (2020).
  21. Loeffler, D., Schroeder, T. Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification. Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).
  22. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. Journal of Visualized Experiments. (70), e4287 (2012).
  23. Marchingo, J. M., et al. T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate. Nature Communications. 7, 13540 (2016).
  24. Horton, M. B., et al. Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing. Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).
  25. Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. Testing statistical hypotheses. , Springer. New York. 784 (2005).
  26. Tak, T., et al. HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity. Elife. 10, 360624 (2021).
  27. Sommerkamp, P., et al. Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).
  28. Kato, K., Radbruch, A. Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting. Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).
  29. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
  30. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  31. Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
  32. Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
  33. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
  34. Davison, A. C., Hinkley, D. V. Bootstrap Methods and their Application. , Cambridge University Press. (1997).
  35. Horton, M. B., et al. Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable. Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).
  36. Notta, F., et al. Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
  37. Grinenko, T., et al. Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice. Nature Communications. 9 (1), 1898 (2018).
  38. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

Tags

Indragning utgåva 193
Samtidig bedömning av släktskap, divisionsnummer och fenotyp <em>via</em> flödescytometri för hematopoetiska stam- och stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donada, A., Tak, T., Prevedello, G., … More

Donada, A., Tak, T., Prevedello, G., Milo, I., Duffy, K. R., Perié, L. Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64918, doi:10.3791/64918 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter