Summary
تصف هذه الورقة خوارزمية ارتباط الصور الرقمية مفتوحة المصدر لقياس سلالات الأنسجة 2D المحلية داخل نباتات الأوتار. تم التحقق من دقة التقنية باستخدام تقنيات متعددة ، وهي متاحة للاستخدام العام.
Abstract
هناك اهتمام علمي كبير بفهم السلالات التي تواجهها خلايا الأوتار في الموقع وكيف تؤثر هذه السلالات على إعادة تشكيل الأنسجة. بناء على هذا الاهتمام ، تم تطوير العديد من التقنيات التحليلية لقياس سلالات الأنسجة المحلية داخل نباتات الأوتار أثناء التحميل. ومع ذلك ، في العديد من الحالات ، لم يتم الإبلاغ عن دقة وحساسية هذه التقنيات ، ولا تتوفر أي من الخوارزميات للجمهور. وقد جعل هذا من الصعب قياس سلالات الأنسجة المحلية على نطاق واسع في زراعة الأوتار. لذلك ، كان الهدف من هذه الورقة هو إنشاء أداة تحليل تم التحقق من صحتها لقياس سلالات الأنسجة المحلية في نباتات الأوتار المتاحة بسهولة وسهلة الاستخدام. على وجه التحديد ، تم تكييف خوارزمية ارتباط الصور الرقمية المعززة (ALDIC) المتاحة للجمهور لقياس سلالات 2D من خلال تتبع إزاحة نوى الخلية داخل أوتار أخيل الفأر تحت التوتر أحادي المحور. بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقق من دقة السلالات المحسوبة من خلال تحليل الصور المحولة رقميا ، وكذلك من خلال مقارنة السلالات بالقيم المحددة من تقنية مستقلة (أي الخطوط المبيضة ضوئيا). أخيرا ، تم دمج تقنية في الخوارزمية لإعادة بناء الصورة المرجعية باستخدام حقل الإزاحة المحسوب ، والذي يمكن استخدامه لتقييم دقة الخوارزمية في حالة عدم وجود قيم إجهاد معروفة أو تقنية قياس ثانوية. الخوارزمية قادرة على قياس سلالات تصل إلى 0.1 بدقة 0.00015. نجحت تقنية مقارنة صورة مرجعية أعيد بناؤها مع الصورة المرجعية الفعلية في تحديد العينات التي تحتوي على بيانات خاطئة وأشارت إلى أنه في العينات ذات البيانات الجيدة ، كان ما يقرب من 85٪ من مجال الإزاحة دقيقا. أخيرا ، كانت السلالات المقاسة في أوتار أخيل الفأر متسقة مع الأدبيات السابقة. لذلك ، تعد هذه الخوارزمية أداة مفيدة للغاية وقابلة للتكيف لقياس سلالات الأنسجة المحلية في الأوتار بدقة.
Introduction
الأوتار هي أنسجة حساسة ميكانيكيا تتكيف وتتدهور استجابة للتحميل الميكانيكي1،2،3،4. نظرا للدور الذي تلعبه المحفزات الميكانيكية في بيولوجيا خلايا الأوتار ، هناك اهتمام كبير بفهم السلالات التي تواجهها خلايا الأوتار في بيئة الأنسجة الأصلية أثناء التحميل. تم تطوير العديد من التقنيات التجريبية والتحليلية لقياس سلالات الأنسجة المحلية في الأوتار. وتشمل هذه تحليلات ارتباط الصورة الرقمية 2D / 3D (DIC) للإجهادات السطحية باستخدام أنماط البقع أو الخطوط المبيضة ضوئيا (PBLs) 5،6،7،8 ، وقياس التغيرات في المسافة من النقط الوسطى إلى النوى الفردية داخل الأنسجة9،10 ، وطريقة حديثة ثلاثية الأبعاد ثلاثية الأبعاد كاملة المجال تأخذ في الاعتبار الحركة خارج المستوى والتشوهات ثلاثية الأبعاد11 . ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ عن دقة وحساسية هذه التقنيات إلا في حالات قليلة، ولم يتم إتاحة أي من هذه التقنيات للجمهور، مما يجعل اعتماد هذه التقنيات واستخدامها على نطاق واسع أمرا صعبا.
كان الهدف من هذا العمل هو إنشاء أداة تحليل تم التحقق من صحتها لقياس سلالات الأنسجة المحلية في نباتات الأوتار المتاحة بسهولة وسهلة الاستخدام. تعتمد الطريقة المختارة على خوارزمية ارتباط الصور الرقمية المعززة (ALDIC) المتاحة للجمهور والمكتوبة في MATLAB والتي تم تطويرها بواسطة Yang و Bhattacharya12. تم تكييف هذه الخوارزمية لتحليل عينات الأوتار والتحقق من صحتها من خلال تطبيقها على الصور المحولة رقميا ومقارنة السلالات المقاسة في عينات الأوتار الفعلية بالنتائج التي تم الحصول عليها من الخطوط المبيضة ضوئيا. علاوة على ذلك ، تم تنفيذ وظائف إضافية في الخوارزمية لتأكيد دقة حقل الإزاحة المحسوب حتى في حالة عدم وجود قيم إجهاد معروفة أو تقنية قياس ثانوية. لذلك ، هذه الخوارزمية هي أداة مفيدة للغاية وقابلة للتكيف لقياس سلالات الأنسجة 2D المحلية بدقة في الأوتار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ولاية بنسلفانيا.
1. إعداد الأنسجة
- بالنسبة لهذا البروتوكول ، احصد أوتار العرقوب من ذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 2-4 أشهر.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام أوتار أو أربطة مختلفة من الفئران أو الحيوانات الصغيرة الأخرى.- قم بعمل شق في الجلد السطحي لوتر العرقوب لكشف وتر أخمصي والنسيج الضام المحيط. ثم قم بإزالتها باستخدام شفرة جراحية.
- افصل عضلات النعل وعضلات الساق المكشوفة عن الطرف الخلفي ، وكشطها بعناية من وتر العرقوب بالشفرة الجراحية
- افصل العقبي عن بقية القدم باستخدام ملحق عجلة القطع على أداة دوارة.
- قم بتلطيخ الأنسجة في 1.5 مل من محلول 5 ميكروغرام / مل من 5- (4،6-ثنائي كلورو تريازينيل) أمينوفلوريسئين (DTAF) و 0.1 متر من بيكربونات الصوديوم العازلة لمدة 20 دقيقة على خلاط دوار في درجة حرارة الغرفة. يلطخ هذا المحلول البروتينات (على سبيل المثال ، مصفوفة خارج الخلية) في الأنسجة.
ملاحظة: خلال فترة ال 20 دقيقة هذه، يجب إكمال الخطوة 1.3. - قم بإعداد محلول 1: 1000 من DRAQ5 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لتلطيخ النوى. استخدم خلاط دوامة لتجانس المحلول.
- بعد فترة الحضانة البالغة 20 دقيقة في الخطوة 1.2 ، انقل الأنسجة من محلول DTAF إلى محلول DRAQ5 ، واحتضانها في مكان مظلم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. تحميل الأوتار والحصول على الصور
ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول جهاز شد يمكن تركيبه أعلى مجهر متحد البؤر. لهذه الدراسة ، تم استخدام جهاز microtensile الذي وصفه Peterson و Szczesny13 .
- ضع الوتر في قبضة جهاز تحميل الشد. قبل تركيب المقابض في جهاز التحميل ، استخدم الفرجار الرقمي لقياس المسافة بين ملحق العقبي والمقبض المقابل. هذه المسافة هي طول مقياس الوتر.
- بدلا من ذلك ، قم بتركيب المقابض في جهاز التحميل قبل إدخال الوتر ، وادفع إلى التلامس لتحديد موضع المحرك صفر الإزاحة. يمكن أن يوفر إزاحة المحركات بعد إدخال الوتر طول مقياس قبضة إلى قبضة أكثر دقة.
- قم بتركيب المقابض في جهاز التحميل ، والذي يحتوي على برنامج تلفزيوني للحفاظ على ترطيب الأنسجة. قم بمحاذاة الوتر على أفضل وجه ممكن مع المحور x أو المحور y لصور المجهر بحيث تتوافق مخرجات الإجهاد x و y للخوارزمية مع محاور الأوتار.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم محاذاة الأوتار مع المحور السيني. إذا لم يكن من الممكن محاذاة الوتر تماما مع محاور الصورة ، فيمكن تحويل مخرجات السلالة السينية وسلالة y للخوارزمية لتتماشى مع المحاور الطولية / العمودية للوتر باستخدام معادلات تحويل الإجهاد القياسية14. - قم بتحميل الوتر مسبقا ب 1 جم من التوتر ، وإذا رغبت في ذلك ، قم بتطبيق التحميل الدوري لتهيئة العينة مسبقا. في هذا البروتوكول ، لم يتم استخدام أي شرط مسبق لأن هدف الدراسة كان التحقق من صحة سلالات الأنسجة المحلية المقاسة بدلا من قياس خصائص مادة الأنسجة. إذا كان هناك اهتمام بقياس خصائص المواد الكبيرة ، والتي تعتمد على تاريخ التحميل ، فمن المستحسن التهيئة المسبقة. بعد التكييف المسبق والتعافي ، أعد تطبيق التحميل المسبق 1 جم.
- إذا رغبت في ذلك ، قم بالتبييض الضوئي لمجموعة من أربعة خطوط متباعدة بمقدار 80 ميكرومتر في المنطقة الوسطى من الأنسجة (انظر Peterson و Szczesny13 لمزيد من التفاصيل).
ملاحظة: تم استخدام الخطوط المبيضة ضوئيا للتحقق من صحة قياسات خوارزمية ALDIC وليست ضرورية لأداء ALDIC نفسها. يمكن تعديل عدد الخطوط وتباعدها ، ويجب اختيار موقع الخطوط لتجنب أي قطع أثرية في العينة من شأنها أن تقلل من وضوح الخط. - كرر إجراء التبييض الضوئي على الأطراف اليسرى واليمنى من الأنسجة بالقرب من المقابض.
- باستخدام المجهر متحد البؤر ، احصل على صور حجمية (x ، y: 1.25 μm / pixel ، z: 2.5 μm / pixel) لفلورة DTAF و DRAQ5 عند 1 جم من التحميل المسبق.
- أداء منحدر الإجهاد عند 0.5٪ / ثانية إلى 2٪ إجهاد. لاحظ أنه يمكن تعديل معدل الإجهاد وحجم الإجهاد المتزايد.
- اسمح للمنديل بالضغط على الاسترخاء لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: يجب اختيار مدة استرخاء الإجهاد بحيث تكون العينة تحت حمل شبه ثابت تقريبا أثناء التقاط الصورة. لتحديد ما إذا كانت مدة استرخاء الإجهاد مقبولة ، حدد ميل منحنى وقت القوة خلال الدقيقة الأخيرة من استرخاء الإجهاد (الشكل التكميلي 1) ، واضرب هذا الميل في إجمالي مدة التصوير. في هذه الدراسة ، لم تتغير القوة المطبقة عند أكبر زيادة إجهاد بأكثر من 5٪. - التقط صورة حجمية أخرى للأنسجة بعد التشوه.
- كرر الخطوات 2.7-2.9 حتى يتم الوصول إلى السلالة النهائية المطلوبة. في هذه الورقة ، تم اختيار قيمة سلالة نهائية بنسبة 12٪.
3. معالجة الصور
- استخدم ImageJ أو Fiji لإنشاء أقصى إسقاطات z لكل صورة حجمية لقناة DRAQ5 (النووية). سيكون هذا بمثابة الصور المرقطة 2D ل ALDIC.
- احفظ إسقاطات z ذات الكثافة القصوى كملفات .tiff ، وقم بتسميتها وفقا لاصطلاح التسمية التالي.
- استخدم رقما كحرف أول من اسم الصورة.
- اجعل الرقم يتوافق مع الترتيب الذي سيتم به النظر في الصور أثناء تحليل الإجهاد. على سبيل المثال ، يجب أن تبدأ الصورة الأولى بواحد ، ويجب أن تبدأ الصورة الثانية باثنين. يمكن اختيار أرقام مختلفة ، ولكن يجب أن تزيد بالتتابع. مثال على اصطلاح التسمية هو كما يلي: "0_Experiment1_MaxZProjection".
- احفظ جميع إسقاطات z ذات الكثافة القصوى التي تمت إعادة تسميتها في مجلد.
4. تركيب وتطبيق كود تحليل الخط المبيض ضوئيا
ملاحظة: هذه الخطوات ضرورية فقط إذا كان من المرغوب فيه تأكيد دقة خوارزمية ALDIC باستخدام خطوط مبيضة ضوئيا. يحسب الرمز سلالة الأنسجة المحلية على أنها متوسط التغير الطبيعي في المسافة بين كل خط مبيض ضوئيا داخل مجموعة الخطوط المبيضة ضوئيا. في هذه الدراسة ، تم بعد ذلك حساب متوسط القيم المحلية عبر جميع مجموعات الخطوط المبيضة ضوئيا (أي في المركز والأطراف اليسرى / اليمنى) لتحديد متوسط قيمة سلالة الأنسجة المحلية لكل عينة. ثم تم استخدام هذه القيمة لتقدير دقة خوارزمية ALDIC.
- قم بتنزيل مجلد "رمز PBL" من GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) ، وانقل جميع المحتويات إلى دليل العمل في MATLAB.
- افتح البرنامج النصي MATLAB "Micro_Mech_Template.m".
- اضغط على تشغيل، وحدد أحد ملفات الصور التي تحتوي على الصور الحجمية. يمكن أن تكون الصور الحجمية أيا من أنواع الملفات التالية: .lsm و .tiff و .nd2.
- سيقوم البرنامج تلقائيا بتحميل جميع الصور الموجودة في المجلد وعرض صورة مسقطة للصورة الحجمية المرجعية. عند المطالبة ، انقر بزر الماوس الأيسر لإنشاء خطوط متعددة النقاط تتعقب الطرفين الأيسر والأيمن للعينة. انقر بزر الماوس الأيمن لإنهاء سطر. بمجرد معالجة الإدخال ، إذا كانت الحواف صحيحة ، فاضغط على موافق لقبول النتيجة.
- ارسم خطا قطريا عشوائيا عبر العينة كخط مرجعي عندما يطلب منك ذلك.
- أدخل عدد الخطوط المبيضة ضوئيا التي تم إنشاؤها، وتتبع الخطوط المبيضة ضوئيا بخطوط متعددة النقاط.
- إذا كانت النتيجة مقبولة ، فاقبلها. إذا كانت النتيجة خاطئة ، فاضبطها وأعد معالجتها.
- كرر الخطوة 4.2 لكافة الصور، وانقل كافة صور الخطوط التي تم تتبعها إلى مجلد واحد.
- افتح البرنامج النصي "Micro_Mech_Strain.m".
- اضغط على تشغيل لتنفيذ التعليمات البرمجية ، وحدد إحدى الصور المحفوظة حيث يتم تتبع الخطوط المبيضة ضوئيا.
- تأكد من صحة الصور المصاحبة المحددة بمجرد تحديد الصورة بالضغط على موافق.
5. إنشاء صور محولة رقميا
ملاحظة: هذه الخطوات ضرورية فقط إذا كان من المطلوب تأكيد دقة خوارزمية ALDIC باستخدام الصور المحولة رقميا. تحاكي هذه الصور حقول سلالة 2D متجانسة ذات حجم معروف عن طريق تحويل الصورة المرجعية بشكل مصطنع.
- قم بتنزيل الكود "Digital_strain.m" من GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc).
- افتح الكود وقم بتشغيله.
- عند المطالبة ، أدخل القيم المطلوبة للحد الأقصى للإجهاد المطبق ، وزيادة الإجهاد المطبقة ، ونسبة بواسون. اضغط على موافق.
ملاحظة: بالنسبة لهذه التجربة ، كان الحد الأقصى للإجهاد المطبق 0.1 (10٪) ، وكانت زيادة الإجهاد المطبقة 0.02 (2٪) ، وتم استخدام نسبة بواسون 1 ، والتي تتوافق مع البيانات التجريبية لاختبار شد الأوتار15,16. يستخدم الكود وظيفة MATLAB المضمنة imwarp وقيم الإدخال (على سبيل المثال ، زيادات الإجهاد ، نسبة Poisson) لإنشاء الصور المحولة رقميا. - عند المطالبة، حدد الصورة المرجعية غير المشوهة.
- لكل زيادة إجهاد ، يتم عرض تراكب للصورة المرجعية والصورة المحولة. سيتم حفظ الصورة المحولة في الدليل تحت عنوان "DigitallyTransformedX٪ Strain" ، حيث X هي زيادة الإجهاد.
6. حساب الإجهاد وتثبيت رمز التحقق من الصحة والتطبيق
- قم بتنزيل مجلد "حساب الإجهاد ورمز التحقق من الصحة" من GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) ، وانقل جميع المحتويات إلى دليل عمل MATLAB
- قم بتثبيت مترجم mex C / C ++ وفقا ليانغ وبهاتاشاريا12. يتم تلخيص الخطوات أدناه.
- تحقق من MATLAB لمعرفة ما إذا كان قد تم تثبيت برنامج التحويل البرمجي mex C / C ++ عن طريق كتابة "mex -setup" في نافذة أوامر MATLAB والضغط على Enter.
- إذا ظهر خطأ يشير إلى أن برنامج التحويل البرمجي غير مدعوم أو موجود ، فانتقل إلى الخطوة 6.3 والخطوة 6.4.
- في حالة عدم وجود خطأ، انتقل إلى الخطوة 6.5
- لتنزيل برنامج التحويل البرمجي mex C / C ++ ، انتقل إلى "https: / tdm-gcc.tdragon.net/" ، واختر برنامج التحويل البرمجي TDM-gcc.
- قم بتثبيت المترجم الذي تم تنزيله إلى موقع معروف.
- ارجع إلى نافذة أوامر MATLAB ، واكتب: "setenv ("MW_MINGW64_LOC" ، "[اكتب مسار التثبيت الخاص بك هنا]")". على سبيل المثال ، يمكن أن يكون هذا "setenv ("MW_MINGW64_LOC" ، "C: \ TDM-GCC-64")". إذا تم تنفيذ هذا الأمر بنجاح ، يتم تثبيت برنامج التحويل البرمجي mex بشكل صحيح.
- أدخل البرنامج النصي للدالة "main_aldic.m" ، وقم بتغيير السطر 22 لمطابقة الأمر الذي تم تنفيذه في الخطوة 6.5.
- افتح البرنامج النصي "Strain_calc_and_validate.m".
- اضغط على تشغيل لبدء تحليل الصورة.
- عند المطالبة ، قم بتغيير قيم معلمات ALDIC حسب الرغبة.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم النافذة 0.25 إلى 1 ضعف حجم المجموعة الفرعية. لمزيد من المعلومات حول اختيارات المعلمات، راجع دليل المستخدم عبر الإنترنت: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
_Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).- تم استخدام القيم التالية في هذه الدراسة:
حجم المجموعة الفرعية (بكسل): 20
حجم النافذة (بكسل): 10
طريقة لحل ALDIC: الفرق المحدود (1)
لم يتم استخدام الحوسبة المتوازية (1)
طريقة حساب التخمين الأولي: بحث متعدد الشبكات يعتمد على هرم الصورة (0)
- تم استخدام القيم التالية في هذه الدراسة:
- عند المطالبة ، حدد مربع الاختيار "نعم" لجعل الخوارزمية تحفظ تلقائيا القيمة المتوسطة والانحراف المعياري وخرائط 2D للمجموعة المطلوبة من المتغيرات (على سبيل المثال ، سلالة x ، سلالة y ، إجهاد القص ، المناطق السيئة ، إلخ). حدد المتغيرات التي يجب حفظها، واضغط على موافق.
- عند المطالبة ، قم بتغيير المعلمات حسب الرغبة.
- تم استخدام القيم التالية في هذه التجربة:
النقاط المحيطة لحساب الإجهاد (خدر): 12
معامل الارتباط لتحديد المنطقة السيئة (corr_threshold): 0.5
حجم المنطقة الفرعية (بكسل) لتحليل المنطقة السيئة (الحجم الفرعي): 32
- تم استخدام القيم التالية في هذه التجربة:
- عند المطالبة، حدد المجلد الذي يحتوي على إسقاطات z ذات الكثافة القصوى المعاد تسميتها. لاحظ أن البرنامج يقوم تلقائيا بإجراء ALDIC تزايدي لتحديد حقول الإجهاد للصور المشوهة. أي أن كل صورة مشوهة تعمل كصورة "مرجعية" جديدة للصورة المشوهة التالية. هذا يحسن دقة النتائج (الشكل التكميلي 2) مقارنة بأداء ALDIC التراكمي ، حيث تتم مقارنة كل صورة مشوهة مرة أخرى بالصورة المرجعية الأصلية (سلالة 0٪). لإجراء تحليل تراكمي ، قم بتحميل الصور ولكن حدد فقط الصورة المرجعية الأصلية والصورة المشوهة موضع الاهتمام.
ملاحظة: يتم حساب الإجهاد الطبيعي على أنه λ - 1 ، حيث λ هو تمدد الأنسجة. يتم حساب تمدد الأنسجة وفقا ل
، حيث N = [1 0] T أو [0 1] T للاتجاه x والاتجاه y ، على التوالي ، و C = F T F ، حيث F هو تدرج التشوه المحسوب باستخدام نقاط "numP" المحيطة بكل ناتج نقطة بيانات بواسطة خوارزمية ALDIC. يتم حساب إجهاد القص ك 
، حيث 
. - عند المطالبة ، انقر بزر الماوس الأيسر لإنشاء مضلع من أربع نقاط لتحديد منطقة الاهتمام لقياس السلالات. ابدأ بالنقطة في الزاوية العلوية اليسرى ، وقم بتعيين النقاط اللاحقة بطريقة في اتجاه عقارب الساعة.
ملاحظة: يحتوي المتغير "التخزين" المحفوظ في مساحة عمل MATLAB على جميع القيم الخاصة بمتوسط السلالة x ، والانحراف المعياري للإجهاد x ، ومتوسط سلالة y ، والانحراف المعياري للإجهاد y ، ومتوسط إجهاد القص ، والانحراف المعياري لإجهاد القص ، والنسبة المئوية للمناطق التالفة. يتم تعريف المناطق السيئة وفقا لتحليل معامل الارتباط داخل منطقة الاهتمام المحددة في الخطوة 6.13. يخزن المجلد "NuclearTrackingResults" (الذي يمكن إعادة تسميته عن طريق ضبط الخطين 555 و 556) جميع المؤامرات المحددة في الخطوة 6.10. يحتوي هذا المجلد أيضا على ملف جدول بيانات باسم "النتائج" ، والذي يخزن جميع الوسائل والانحرافات المعيارية المحددة في الخطوة 6.10.
، حيث N = [1 0] T أو [0 1] T للاتجاه x والاتجاه y ، على التوالي ، و C = F T F ، حيث F هو تدرج التشوه المحسوب باستخدام نقاط "numP" المحيطة بكل ناتج نقطة بيانات بواسطة خوارزمية ALDIC. يتم حساب إجهاد القص ك 
، حيث 
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل تحليل حقول الإجهاد في عينات الأنسجة الفعلية ، تم التحقق من صحة بروتوكول ALDIC لأول مرة باستخدام صور متوترة / محولة رقميا للنوى داخل أوتار أخيل الفأر. على وجه التحديد ، تم تحويل الصور لإنتاج سلالات موحدة رقميا في الاتجاه x بنسبة 2٪ و 4٪ و 6٪ و 8٪ و 10٪ مع نسبة محاكاة بواسون 115,16. ثم تم تقييم دقة خوارزمية ALDIC من خلال مقارنة متوسط قيم الإجهاد المحسوبة مع السلالات الرقمية المعروفة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم الانحراف المعياري لقيم الإجهاد لتحديد عدم تجانس مجال الإجهاد. يظهر الفرق بين السلالات المحسوبة بواسطة ALDIC (باستخدام التحليل التزايدي) والسلالات الفعلية المطبقة على الصور المحولة رقميا في الشكل 1. كان متوسط الانفعال في الاتجاه x المحسوب بواسطة برنامج ALDIC دائما أقل من تقدير الإجهاد المطبق الحقيقي (الشكل 1 أ) ، وزاد حجم الخطأ مع زيادة الضغط المطبق. ومع ذلك ، كان الحجم دائما أقل من 0.00015 لجميع زيادات الإجهاد. كان هناك تقليل طفيف من تقدير الإجهاد في الاتجاه y أيضا (الشكل 1C). كما زاد الانحراف المعياري للسلالات المحسوبة داخل المنطقة الكاملة محل الاهتمام للسلالة السينية والسلالة y مع زيادة السلالات المطبقة ، ولكن الحجم كان أيضا صغيرا جدا (<0.002) (الشكل 1B ، D). كانت هذه الأخطاء أكبر بكثير عند استخدام التحليل التراكمي (الشكل التكميلي 2).
الشكل 1: مقارنة الخوارزمية والتحقق من صحتها مع الصور المجهدة رقميا . (أ) كانت بيانات سلالة ALDIC المقاسة في الاتجاه x أقل باستمرار من الإجهاد الفعلي المنصوص عليه في التحولات الرقمية ، وزاد الخطأ تدريجيا مع زيادة الإجهاد المطبق. (ب) زاد الانحراف المعياري لقيم الانفعال في الاتجاه x أيضا مع زيادة السلالات الرقمية المطبقة. (ج) كانت بيانات سلالة ALDIC المقاسة في الاتجاه y أقل باستمرار من الإجهاد الفعلي المنصوص عليه في التحولات الرقمية. (د) زاد الانحراف المعياري لقيم الانفعال في الاتجاه y مع زيادة الإجهاد المطبق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
عند إجراء تحليل الإجهاد على عينات الأنسجة الفعلية ، لا يمكن تقييم دقة خوارزمية ALDIC مباشرة. ومع ذلك ، تم تطوير تقنية لتقدير دقة مجال الإزاحة. على وجه التحديد ، تم تشويه الصورة المشوهة مرة أخرى إلى تنبؤ بالصورة المرجعية بناء على حقل الإزاحة المحسوب. ثم تم استخدام معامل الارتباط المتبادل الموحد لتحديد مدى تطابق الصورة المرجعية المشوهة / المعاد بناؤها مع الصورة المرجعية الحقيقية. أي مناطق فرعية (32 بكسل × 32 بكسل) كانت فيها قيمة الارتباط المتبادل الموحدة أقل من 0.5 اعتبرت "منطقة سيئة" من المحتمل أن يكون فيها حقل الإزاحة غير دقيق. حدد هذا التحليل أن هناك فرقا كبيرا بين أداء تقنيات التحليل التدريجي والتراكمي. على وجه التحديد ، بدأ عدد المناطق السيئة في الارتفاع بالطريقة التراكمية بعد السلالة المطبقة بنسبة 6٪ (الشكل 2 أ) ، في حين لوحظ عدد قليل جدا (1٪) من المناطق السيئة في أي من المناطق المحولة رقميا للتحليل التدريجي. عند تطبيق تقنية تقييم الدقة هذه على أوتار أخيل الفأر الأربعة التي تم اختبارها (الشكل التكميلي 3) ، تم تحديد أنه بالنسبة لثلاث عينات ، كان متوسط عدد المناطق السيئة أقل من 25٪ من الصورة. ومع ذلك ، في واحدة من العينات الأربع (التجربة 2) ، تم تحديد ما يقرب من نصف الصورة على أنها سيئة عند زيادة الإجهاد القصوى (الشكل 2B). اختلف عدد المناطق السيئة التي كانت موجودة في التجربة 2 عن متوسط العينات الثلاث الأخرى بأكثر من أربعة انحرافات معيارية. وقد مكن ذلك من تحديد أن بيانات ALDIC من التجربة 2 تمثل قيمة شاذة ، وبالتالي تم استبعاد هذه البيانات من التحليل الإضافي للنتائج.
الشكل 2: التحديد الناجح للمناطق ذات حسابات الإجهاد غير الصالحة عن طريق تحليل المنطقة السيئة . (أ) زادت كمية المناطق السيئة في الصور المحولة رقميا التي تم تحليلها باستخدام الطريقة التراكمية باستمرار بعد 6٪ من الإجهاد المطبق ، بينما ظلت الكمية الإضافية عند 1٪. (ب) زادت كمية المناطق السيئة لجميع عينات الأوتار بشكل مطرد بزيادات إجهاد أكبر. اعتبرت التجربة 2 قيمة شاذة ، وبالتالي ، لم يتم تضمينها في أشرطة المتوسط والانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس سلالات الشد المحلية في أوتار أخيل الفأر المختبرة باستخدام خطوط مبيضة ضوئيا (PBLs) كطريقة ثانية لتحديد دقة خوارزمية ALDIC. تميل سلالات الاتجاه x المحسوبة بواسطة ALDIC إلى أن تكون أكبر من تلك المحددة من PBLs ، لكن الفرق كان بشكل عام ضمن سلالة 0.005 (الشكل 3A). كان حجم الخطأ هذا مشابها للانحراف المعياري الذي لوحظ عبر PBLs المختلفة داخل عينة معينة (الشكل 3B).
الشكل 3: التحقق من صحة حسابات سلالة ALDIC بالمقارنة مع بيانات الخط المبيض ضوئيا . (أ) ظل الفرق بين قيم سلالة ALDIC وقيم سلالة PBL ثابتا نسبيا لجميع زيادات الإجهاد ، حول قيمة 0.005. (ب) ظل متوسط الانحراف المعياري لبيانات PBL عبر جميع العينات ثابتا نسبيا عند 0.005 تقريبا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد تقييم دقة خوارزمية ALDIC ، تم تحديد المقادير والتوزيعات المكانية للسلالات المحلية في أوتار أخيل الفأر تحت حمل الشد (الشكل 4 والشكل 5 والشكل 6). لاحظ أن السلالات لا تتضمن بيانات الإزاحة من "المناطق السيئة" داخل كل عينة. كانت سلالات الشد ذات الاتجاه x متسقة عبر جميع العينات الثلاث وكانت أقل بكثير من سلالات الأنسجة المطبقة (الشكل 4 أ). بالإضافة إلى ذلك ، كان إجهاد الاتجاه x غير متجانس نسبيا ، بالنظر إلى أن الانحراف المعياري عبر صورة 2D كان دائما أكبر من متوسط قيمة الإجهاد. في المقابل ، كان هناك تناقض كبير بين العينات الثلاث لسلالات الاتجاه y ، حيث أظهرت عينة واحدة قيما متوسطة موجبة ، وعينة واحدة أظهرت قيما وسطية سالبة ، وعينة واحدة تظهر إجهاد صفري في الاتجاه y (الشكل 4B). بالإضافة إلى ذلك ، كان الانحراف المعياري لسلالات الاتجاه y داخل عينة معينة أكبر من الانحراف المعياري لسلالات الاتجاه x. أخيرا ، كان إجهاد القص منخفضا نسبيا عبر جميع زيادات الإجهاد (الشكل 4C).
الشكل 4: السلالات المجهرية لأوتار أخيل الفأر . (أ) ظل متوسط الانفعال في الاتجاه x أقل من إجهاد الأنسجة المطبق، لكنه زاد مع كل زيادة إجهاد. (ب) كان متوسط الانفعال في الاتجاه y صفرا تقريبا لجميع الزيادات، لكن الانحراف المعياري كان مرتفعا. (ج) زاد إجهاد القص المتوسط بشكل مطرد خلال زيادات الإجهاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التوزيع المكاني للسلالات السينية والسلالات y وسلالات القص. خرائط تمثيلية لسلالات (A) x و (B) سلالات y و (C) سلالات القص في جميع أنحاء منطقة الأوتار محل الاهتمام يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: التوزيعات المكانية لأقصى إجهادات قص رئيسية ودنيا وقصا قصا. خرائط تمثيلية ل (أ) السلالات الرئيسية القصوى ، (ب) السلالات الرئيسية الدنيا ، و (ج) سلالات القص القصوى في جميع أنحاء منطقة الوتر محل الاهتمام. تشير الخطوط البيضاء إلى اتجاهات الحد الأقصى والحد الأدنى من الضغوط الرئيسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: تحديد الحالة شبه الساكنة أثناء التصوير. يمكن استخدام منحنى وقت القوة خلال الدقيقة الأخيرة من فترة استرخاء الإجهاد (الخط الأحمر) لتقريب التغير الكلي في القوة أثناء التصوير. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: مقارنة بين تقنيات التحليل التدريجي والتراكمي. (أ) كان الفرق بين إجهاد الاتجاه x المقاس والفعلي في الصور المحولة رقميا أكبر بكثير مع الطريقة التراكمية مقارنة بالطريقة الإضافية فوق سلالة 4٪. (ب) كان الانحراف المعياري لقيم السلالة السينية أكبر بكثير مع الطريقة التراكمية فوق سلالة 4٪. (ج) كان الفرق بين سلالات y المقاسة والفعلية في الصور المحولة رقميا أكبر بكثير مع الطريقة التراكمية فوق 8٪ إجهاد. (د) كان الانحراف المعياري لقيم السلالة y أكبر بكثير مع الطريقة التراكمية فوق سلالة 4٪. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: تصور المنطقة السيئة والقياس الكمي لكل تجربة. تم تعريف المناطق السيئة على أنها مناطق محلية داخل الصورة المرجعية المعاد بناؤها والتي لم تتطابق (أقل من معامل الارتباط 0.5) مع نفس المنطقة من الصورة المرجعية الفعلية. يتم تمييز كل منطقة سيئة يتم تحديدها داخل منطقة الاهتمام (الموضحة باللون الأبيض) بمربع أزرق. يشار إلى النسبة المئوية للمناطق السيئة داخل منطقة الاهتمام فوق كل صورة بين قوسين. لاحظ أن هذه الصور أعيد بناؤها من الصورة المشوهة عند 12٪ من الإجهاد المطبق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان الهدف من هذه الورقة هو توفير طريقة مفتوحة المصدر ومعتمدة لقياس حقول إجهاد 2D في الأوتار تحت حمل الشد. استند أساس البرنامج إلى خوارزمية ALDIC المتاحة للجمهور12. تم تضمين هذه الخوارزمية في رمز MATLAB أكبر مع الوظيفة المضافة لتحليل الإجهاد التدريجي (مقابل التراكمي). ثم تم تطبيق هذه الخوارزمية المعدلة على اختبار شد الأوتار ، وتم تقييم دقتها من خلال تقنيتين مختلفتين (أي الصور المحولة رقميا وقياس الإجهاد باستخدام خطوط مبيضة ضوئيا). بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة قدرة لتقييم دقة قياسات ALDIC على أي عينة دون الحاجة إلى معرفة قيم الإجهاد الحقيقية.
أظهر تحليل الصور المحولة رقميا أن الخوارزمية يمكنها قياس السلالات بدقة تصل إلى 10٪ مع القليل من الخطأ ، والذي لا يمكن تقييمه من اختبار الشد لأوتار أخيل الفأر الفعلية بسبب انخفاض أحجام السلالات في عينات الأوتار. ومع ذلك ، فإن مقارنة السلالات المحسوبة في أوتار أخيل الفأر بواسطة ALDIC بالسلالات المقاسة باستخدام خطوط مبيضة ضوئيا أظهرت أن خطأ تقنية ALDIC كان ضمن تباين القياس للخطوط المبيضة ضوئيا نفسها. كتحقق نهائي ، تم تقييم دقة حقول الإزاحة 2D الكاملة المحسوبة بواسطة خوارزمية ALDIC من خلال إعادة بناء الصورة المرجعية من الصورة المشوهة ومقارنة إعادة البناء بالصورة المرجعية الفعلية. في الصور المحولة رقميا ، كانت هناك زيادة في عدد المناطق السيئة وخطأ الإجهاد مع سلالات مطبقة أكبر ، خاصة بالنسبة لتحليل ALDIC التراكمي (الشكل 2 والشكل التكميلي 2). كان هذا متوقعا لأن التقنية المتزايدة تعيد تعريف الصورة المرجعية مع كل صورة وسيطة لتقليل اختلافات الإزاحة بين أزواج الصور. كان عدد المناطق السيئة أعلى في عينات الأوتار الفعلية لأن بنية وتحميل أنسجة الأوتار لم تكن متجانسة (على عكس الصور المحولة رقميا). ومع ذلك ، في المتوسط ، لم يتطابق سوى حوالي 15٪ من الصورة المعاد بناؤها مع الصورة المرجعية الفعلية. ومع ذلك ، فإن عينة واحدة (التجربة 2) لديها عدد كبير من المناطق الخاطئة (~ 45٪). في حين أنه من غير الواضح سبب عدم إمكانية معالجة هذه العينة بشكل صحيح ، إلا أن هذا التحليل للصورة المرجعية المعاد بناؤها كان قيما لأنه مكن من التعرف على أن البيانات من هذه العينة لم تكن موثوقة. إجمالا ، توضح هذه التجارب أنه يمكن استخدام هذه الخوارزمية مفتوحة المصدر بثقة لقياس سلالات الأنسجة بدقة داخل زراعة الأوتار.
قدمت هذه التجارب أيضا معلومات قيمة فيما يتعلق بالسلوك الميكانيكي لأوتار أخيل الفأر. على وجه التحديد ، عند سلالة الأنسجة المطبقة بنسبة 12٪ ، كان متوسط السلالة الطولية (الاتجاه x) داخل عينة الأنسجة 2٪ فقط. يرجع جزء من توهين الإجهاد هذا إلى حقيقة أن سلالات الأنسجة الكبيرة تم حسابها من التغيرات في طول القبضة إلى القبضة للأنسجة ، والتي من المحتمل أن تتضمن تركيزات إجهاد كبيرة عند واجهة قبضة الوصلة العضلية. ومع ذلك ، فإن هذا يتوافق مع دراسات أخرى للسلالات المجهرية في الأوتار10،17،18. علاوة على ذلك ، فإن سلالة 12٪ تتوافق مع حوالي 5 ميجا باسكال من التحميل ، والتي من المحتمل أن تكون مماثلة للأحمال الفسيولوجية القصوى في الجسم الحي19. هذا يشير إلى أن الخلايا داخل أوتار أخيل الفأر لا تعاني من سلالات الشد فوق 2٪. كانت الانفعال المستعرض (الاتجاه y) أكثر تغيرا عبر العينات ، مع قيم موجبة وسالبة. يشير هذا إلى أن عينات الأوتار أظهرت نسب بواسون إيجابية وسلبية ، وهو ما يتوافق مع الاختبار السابق لأوتار العرقوب20. كما هو متوقع للتوتر أحادي المحور ، كان حجم إجهاد القص منخفضا بشكل عام (<4 درجة في المتوسط). ومع ذلك ، بالنسبة لجميع سلالات الشد والقص ، كان الانحراف المعياري عبر المنطقة المعنية دائما أكبر من متوسط قيمة الإجهاد ، مما يدل على وجود درجة كبيرة من عدم تجانس الإجهاد. علاوة على ذلك ، زاد عدم التجانس هذا مع زيادة السلالات المطبقة ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى عدم تجانس بنية الأنسجة بالإضافة إلى زيادة الخطأ في حسابات ALDIC الناتجة عن الإزاحة الأكبر وحقول الإزاحة. هذا يشير إلى أن السلالات التي تعاني منها خلايا الأوتار الفردية متغيرة للغاية داخل الأنسجة.
على الرغم من التحقق الناجح من خوارزمية ALDIC ، إلا أن هناك بعض القيود في استخدامها لتحليل السلالات داخل نباتات الأوتار. القيد الأساسي هو حقيقة أن الخوارزمية يمكنها فقط إجراء تحليل 2D لكائن 3D. قد يكون النهج الأكثر صرامة هو إجراء ارتباط حجم رقمي كامل (DVC) ، والذي تم إجراؤه على الصور المحولة رقميا للأوتار11. ومع ذلك ، يصعب إجراء ذلك بشكل عام على عينات الأوتار الفعلية لأن الصور تحتوي على نوى قابلة للحل على عمق 100 ميكرومتر فقط. هذا يعني أن الحجم الداخلي للعينات لا يحتوي على نسيج داخل الصور الحجمية ، مما يجعل DVC غير موثوق. لذلك ، تم طي الصور في هذه الدراسة إلى أقصى إسقاطات 2D ، والتي تجبر جميع النوى بشكل مصطنع في مستوى صورة واحد. في حين أن هذا قد ينتج بعض الأخطاء في تحليل الإجهاد ويمنع قياس الإزاحة خارج المستوى ، فإن نتائج التحقق تشير إلى أن التقنية لا تزال دقيقة. هناك قيد إضافي هو أن السلالات تم حسابها في نهاية فترة استرخاء الإجهاد ولا يمكن حسابها أثناء التحميل الدوري الديناميكي. كانت هذه المشكلة لا مفر منها نظرا لوجود وقت تصوير محدود للحصول على الصور الحجمية المستخدمة في تحليل الإجهاد. على الرغم من هذه القيود ، كان نجاح التحليل قويا نسبيا ، بالنظر إلى أن ثلاث من عينات الأوتار الأربعة أنتجت بيانات سلالة دقيقة. لذلك ، ستكون هذه الخوارزمية أداة مفيدة للباحثين المهتمين بقياس حقول الإجهاد داخل زراعة الأوتار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R21 AR079095) والمؤسسة الوطنية للعلوم (2142627).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer | ThermoFisher | D16 | |
| Calipers | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R HD | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Coning | 6775 | |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher | 62554 | |
| MATLAB | MathWorks | R2022b | |
| Tensile Loading Device | N/A | N/A | Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13) |
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher | 88881001 |
References
- Devkota, A. C. Distributing a fixed amount of cyclic loading to tendon explants over longer periods induces greater cellular and mechanical responses. Journal of Orthopaedic Research. 11 (4), 1609-1612 (2007).
- Sun, H. B., et al. Cycle-dependent matrix remodeling gene expression response in fatigue-loaded rat patellar tendons. Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1380-1386 (2010).
- Shepherd, J. H., Screen, H. R. C.
- Paschall, L., Pedaprolu, K., Carrozzi, S., Dhawan, A., Szczesny, S. Mechanical stimulation as both the cause and the cure of tendon and ligament injuries. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , Springer. Cham, Switzerland. 359-386 (2022).
- Andarawis-Puri, N., Ricchetti, E. T., Soslowsky, L. J. Rotator cuff tendon strain correlates with tear propagation. Journal of Biomechanics. 42 (2), 158-163 (2009).
- Cheng, V. W. T., Screen, H. R. C.
- Luyckx, T., et al. Digital image correlation as a tool for three-dimensional strain analysis in human tendon tissue. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 7 (2014).
- Duncan, N. A., Bruehlmann, S. B., Hunter, C. J., Shao, X., Kelly, E. J. In situ cell-matrix mechanics in tendon fascicles and seeded collagen gels: Implications for the multiscale design of biomaterials. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering. 17 (1), 39-47 (2014).
- Arnoczky, S. P., Lavagnino, M., Whallon, J. H., Hoonjan, A. In situ cell nucleus deformation in tendons under tensile load; A morphological analysis using confocal laser microscopy. Journal of Orthopaedic Research. 20 (1), 29-35 (2002).
- Screen, H. R. C., Bader, D. L., Lee, D. A., Shelton, J. C.
- Fung, A. K., Paredes, J. J., Andarawis-Puri, N. Novel image analysis methods for quantification of in situ 3-D tendon cell and matrix strain. Journal of Biomechanics. 67, 184-189 (2018).
- Yang, J., Bhattacharya, K. Augmented Lagrangian digital image correlation. Experimental Mechanics. 59 (2), 187-205 (2019).
- Peterson, B. E., Szczesny, S. E. Dependence of tendon multiscale mechanics on sample gauge length is consistent with discontinuous collagen fibrils. Acta Biomaterialia. 117, 302-309 (2020).
- Humphrey, J. D., O'Rourke, S. L. An Introduction to Biomechanics. , Springer. New York, NY. (2015).
- Reese, S. P., Weiss, J. A. Tendon fascicles exhibit a linear correlation between Poisson's ratio and force during uniaxial stress relaxation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (3), 34501 (2013).
- Ahmadzadeh, H., Freedman, B. R., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J., Shenoy, V. B. Micromechanical poroelastic finite element and shear-lag models of tendon predict large strain dependent Poisson's ratios and fluid expulsion under tensile loading. Acta Biomaterialia. 22, 83-91 (2015).
- Szczesny, S. E., Elliott, D. M. Interfibrillar shear stress is the loading mechanism of collagen fibrils in tendon. Acta Biomaterialia. 10 (6), 2582-2590 (2014).
- Han, W. M., et al. Macro- to microscale strain transfer in fibrous tissues is heterogeneous and tissue-specific. Biophysical Journal. 105 (3), 807-817 (2013).
- Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A novel, open-source, low-cost bioreactor for load-controlled cyclic loading of tendon explants. Journal of Biomechanical Engineering. 144 (8), 084505 (2022).
- Gatt, R., et al. Negative Poisson's ratios in tendons: An unexpected mechanical response. Acta Biomaterialia. 24, 201-208 (2015).
