Summary
In diesem Artikel wird ein Open-Source-Algorithmus zur digitalen Bildkorrelationsalgorithmus zur Messung lokaler 2D-Gewebestämme in Sehnenexplantaten beschrieben. Die Genauigkeit der Technik wurde mit mehreren Techniken validiert und steht der Öffentlichkeit zur Verfügung.
Abstract
Es besteht ein erhebliches wissenschaftliches Interesse daran, die Stämme zu verstehen, denen Sehnenzellen in situ ausgesetzt sind, und wie diese Stämme den Gewebeumbau beeinflussen. Basierend auf diesem Interesse wurden verschiedene Analysetechniken entwickelt, um lokale Gewebestämme innerhalb von Sehnenexplantaten während der Belastung zu messen. In mehreren Fällen wurde jedoch nicht über die Genauigkeit und Empfindlichkeit dieser Techniken berichtet, und keiner der Algorithmen ist öffentlich verfügbar. Dies hat die breitere Messung lokaler Gewebestämme in Sehnenexplantaten erschwert. Ziel dieser Arbeit war es daher, ein validiertes Analysewerkzeug zur Messung lokaler Gewebestämme in Sehnenexplantaten zu entwickeln, das leicht verfügbar und einfach zu bedienen ist. Insbesondere wurde ein öffentlich zugänglicher ALDIC-Algorithmus (Augmented-Lagrangeian Digital Image Correlation) für die Messung von 2D-Dehnungen angepasst, indem die Verschiebungen von Zellkernen innerhalb der Achillessehnen der Maus unter einachsiger Spannung verfolgt wurden. Zusätzlich wurde die Genauigkeit der berechneten Dehnungen durch die Analyse digital transformierter Bilder sowie durch den Vergleich der Dehnungen mit Werten validiert, die mit einer unabhängigen Technik (d.h. photogebleichten Linien) bestimmt wurden. Schließlich wurde eine Technik in den Algorithmus integriert, um das Referenzbild unter Verwendung des berechneten Verschiebungsfeldes zu rekonstruieren, mit dem die Genauigkeit des Algorithmus in Abwesenheit bekannter Dehnungswerte oder einer sekundären Messtechnik beurteilt werden kann. Der Algorithmus ist in der Lage, Dehnungen bis zu 0,1 mit einer Genauigkeit von 0,00015 zu messen. Die Technik zum Vergleich eines rekonstruierten Referenzbildes mit dem tatsächlichen Referenzbild identifizierte erfolgreich Proben, die fehlerhafte Daten enthielten, und zeigte an, dass in Proben mit guten Daten etwa 85% des Verschiebungsfeldes genau waren. Schließlich stimmten die in den Achillessehnen der Maus gemessenen Stämme mit der bisherigen Literatur überein. Daher ist dieser Algorithmus ein sehr nützliches und anpassungsfähiges Werkzeug zur genauen Messung lokaler Gewebebelastungen in Sehnen.
Introduction
Sehnen sind mechanoempfindliche Gewebe, die sich als Reaktion auf mechanische Belastungen anpassen und degenerieren 1,2,3,4. Aufgrund der Rolle, die mechanische Reize in der Sehnenzellbiologie spielen, besteht ein großes Interesse daran, die Belastungen zu verstehen, denen Sehnenzellen in der nativen Gewebeumgebung während der Belastung ausgesetzt sind. Es wurden verschiedene experimentelle und analytische Techniken entwickelt, um lokale Gewebebelastungen in Sehnen zu messen. Dazu gehören 2D/3D-Analysen der digitalen Bildkorrelation (DIC) von Oberflächendehnungen unter Verwendung von Speckle-Mustern oder photogebleichten Linien (PBLs)5,6,7,8, die Messung der Änderungen des Schwerpunkt-zu-Schwerpunkt-Abstands einzelner Kerne innerhalb des Gewebes9,10 und eine neuere Vollfeld-3D-DIC-Methode, die Bewegungen außerhalb der Ebene und 3D-Verformungen berücksichtigt 11 . Die Genauigkeit und Empfindlichkeit dieser Techniken wurde jedoch nur in wenigen Fällen berichtet, und keine dieser Techniken wurde öffentlich zugänglich gemacht, was die weit verbreitete Einführung und Nutzung dieser Techniken erschwert.
Ziel dieser Arbeit war es, ein validiertes Analysewerkzeug zur Messung lokaler Gewebestämme in Sehnenexplantaten zu schaffen, das leicht verfügbar und einfach zu bedienen ist. Die gewählte Methode basiert auf einem öffentlich zugänglichen ALDIC-Algorithmus (Augmented-Lagrangeian Digital Image Correlation), der in MATLAB geschrieben wurde und von Yang und Bhattacharya12 entwickelt wurde. Dieser Algorithmus wurde für die Analyse von Sehnenproben angepasst und validiert, indem er auf digital transformierte Bilder angewendet und die in tatsächlichen Sehnenproben gemessenen Dehnungen mit den Ergebnissen aus photogebleichten Linien verglichen wurde. Darüber hinaus wurde eine zusätzliche Funktionalität in den Algorithmus implementiert, um die Genauigkeit des berechneten Verschiebungsfeldes auch ohne bekannte Dehnungswerte oder eine sekundäre Messtechnik zu bestätigen. Daher ist dieser Algorithmus ein sehr nützliches und anpassungsfähiges Werkzeug zur genauen Messung lokaler 2D-Gewebestämme in Sehnen.
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Protocol
Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Pennsylvania State University genehmigt.
1. Gewebevorbereitung
- Für dieses Protokoll werden die Achillessehnen von 2-4 Monate alten männlichen C57BL/6-Mäusen entnommen.
HINWEIS: Es können auch verschiedene Sehnen oder Bänder von Mäusen oder anderen Kleintieren verwendet werden.- Machen Sie einen Schnitt in der Haut oberflächlich zur Achillessehne, um die Plantarissehne und das umgebende Bindegewebe freizulegen. Entfernen Sie sie dann mit einer chirurgischen Klinge.
- Trennen Sie den freiliegenden Musculus soleus und den Musculus gastrocnemius vom Hinterbein und kratzen Sie sie vorsichtig mit der chirurgischen Klinge von der Achillessehne ab
- Trennen Sie das Fersenbein vom Rest des Fußes mit einem Schneidradaufsatz an einem Rotationswerkzeug.
- Färben Sie das Gewebe in 1,5 ml einer 5 μg/ml-Lösung von 5-(4,6-Dichlortriazinyl)aminofluorescein (DTAF) und 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer für 20 Minuten auf einem rotierenden Mischer bei Raumtemperatur. Diese Lösung färbt Proteine (z. B. extrazelluläre Matrix) im Gewebe ein.
HINWEIS: Während dieses Zeitraums von 20 Minuten sollte Schritt 1.3 abgeschlossen sein. - Bereiten Sie eine 1:1.000-Lösung von DRAQ5 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor, um die Kerne zu färben. Verwenden Sie einen Wirbelmischer, um die Lösung zu homogenisieren.
- Nach der 20-minütigen Inkubationszeit in Schritt 1.2 wird das Gewebe aus der DTAF-Lösung in die DRAQ5-Lösung überführt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum inkubiert.
2. Sehnenbelastung und Bildaufnahme
HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert eine Zugvorrichtung, die auf einem konfokalen Mikroskop montiert werden kann. Für diese Studie wurde die von Peterson und Szczesny13 beschriebene Mikrozugvorrichtung verwendet.
- Legen Sie die Sehne in die Griffe der Zugbelastungsvorrichtung. Messen Sie vor der Montage der Griffe in der Ladevorrichtung mit digitalen Messschiebern den Abstand zwischen dem Fersenbeinaufsatz und dem gegenüberliegenden Griff. Dieser Abstand ist die Spanngliedlänge.
- Alternativ können Sie die Griffe vor dem Einführen der Sehne in die Ladevorrichtung montieren und in Kontakt drücken, um die Position des Nullhubmotors zu definieren. Die Verschiebung der Motoren nach dem Einsetzen der Sehne könnte zu einer potenziell genaueren Griff-zu-Griff-Messlänge führen.
- Montieren Sie die Griffe in der Ladevorrichtung, die PBS enthält, um die Gewebehydratation aufrechtzuerhalten. Richten Sie die Sehne so gut wie möglich an der x-Achse oder der y-Achse der Mikroskopbilder aus, so dass die x-Dehnungs- und y-Dehnungsausgänge des Algorithmus mit den Sehnenachsen übereinstimmen.
HINWEIS: In dieser Studie wurden die Sehnen auf die x-Achse ausgerichtet. Wenn es nicht möglich ist, die Sehne perfekt mit den Bildachsen auszurichten, können die x-Dehnungs- und y-Dehnungsausgänge des Algorithmus unter Verwendung der Standard-Dehnungstransformationsgleichungen14 so transformiert werden, dass sie sich an den Längs-/Senkrechtachsen der Sehne ausrichten. - Spannglied mit 1 g Spannung vorspannen und, falls gewünscht, zyklisch belastet werden, um die Probe vorzukonditionieren. In diesem Protokoll wurde keine Vorkonditionierung verwendet, da das Studienziel darin bestand, die gemessenen lokalen Gewebestämme zu validieren, anstatt die Gewebematerialeigenschaften zu messen. Wenn Interesse an der Messung der makroskaligen Materialeigenschaften besteht, die von der Belastungshistorie abhängig sind, wird eine Vorkonditionierung empfohlen. Tragen Sie nach der Vorkonditionierung und Erholung erneut eine Vorspannung von 1 g auf.
- Falls gewünscht, photobleichen Sie einen Satz von vier Linien im Abstand von 80 μm im mittleren Bereich des Gewebes (siehe Peterson und Szczesny13 für weitere Details).
HINWEIS: Die photogebleichten Linien wurden verwendet, um die Messungen des ALDIC-Algorithmus zu validieren, und sind für die Durchführung des ALDIC selbst nicht erforderlich. Die Anzahl und der Abstand der Linien können angepasst werden, und die Position der Linien sollte so gewählt werden, dass Artefakte in der Stichprobe vermieden werden, die die Klarheit der Linie verringern würden. - Wiederholen Sie den Photobleaching-Vorgang am linken und rechten Ende des Gewebes in der Nähe der Griffe.
- Nehmen Sie mit dem konfokalen Mikroskop volumetrische Bilder (x,y: 1,25 μm/Pixel, z: 2,5 μm/Pixel) der DTAF- und DRAQ5-Fluoreszenz bei 1 g Vorspannung auf.
- Führen Sie eine Dehnungsrampe mit einer Dehnung von 0,5 %/s bis 2 % durch. Beachten Sie, dass die Dehnungsrate und die inkrementelle Dehnungsgröße angepasst werden können.
- Lassen Sie das Gewebe 10 Minuten lang entspannen.
HINWEIS: Die Dauer der Spannungsrelaxation sollte so gewählt werden, dass die Probe während der Bildaufnahme einer annähernd quasistatischen Belastung ausgesetzt ist. Um zu bestimmen, ob die Dauer der Spannungsrelaxation akzeptabel ist, bestimmen Sie die Steigung der Kraft-Zeit-Kurve während der letzten Minute der Spannungsentspannung (ergänzende Abbildung 1) und multiplizieren Sie diese Steigung mit der gesamten Bilddauer. In dieser Studie änderte sich die Kraft, die bei der größten Dehnungserhöhung ausgeübt wurde, nie um mehr als 5%. - Machen Sie ein weiteres volumetrisches Bild des Gewebes nach der Verformung.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.7-2.9, bis die gewünschte Enddehnung erreicht ist. In dieser Arbeit wurde ein endgültiger Dehnungswert von 12% gewählt.
3. Bildverarbeitung
- Verwenden Sie ImageJ oder Fiji, um maximale Z-Projektionen für jedes volumetrische Bild des DRAQ5-Kanals (Kernkanal) zu erstellen. Dies dient als 2D-gesprenkelte Bilder für das ALDIC.
- Speichern Sie die Z-Projektionen mit maximaler Intensität als .tiff-Dateien, und benennen Sie sie gemäß der folgenden Namenskonvention.
- Verwenden Sie eine Zahl als erstes Zeichen des Bildnamens.
- Die Nummer muss der Reihenfolge entsprechen, in der die Bilder bei der Dehnungsanalyse berücksichtigt werden. Beispielsweise sollte das erste Bild mit eins und das zweite Bild mit zwei beginnen. Es können verschiedene Zahlen gewählt werden, die jedoch nacheinander ansteigen müssen. Ein Beispiel für eine Namenskonvention lautet wie folgt: "0_Experiment1_MaxZProjection".
- Speichern Sie alle umbenannten Z-Projektionen mit maximaler Intensität in einem Ordner.
4. Installation und Anwendung des Codes für die Photobleich-Linienanalyse
HINWEIS: Diese Schritte sind nur erforderlich, wenn die Genauigkeit des ALDIC-Algorithmus mithilfe von photogebleichten Linien bestätigt werden soll. Der Code berechnet die lokale Gewebebelastung als die durchschnittliche normalisierte Änderung des Abstands zwischen den einzelnen photogebleichten Linien innerhalb des photogebleichten Liniensatzes. In dieser Studie wurden dann die durchschnittlichen lokalen Werte über alle photogebleichten Liniensätze (d. h. in der Mitte und am linken/rechten Ende) gemittelt, um einen einzigen durchschnittlichen lokalen Gewebedehnungswert für jede Probe zu bestimmen. Dieser Wert wurde dann verwendet, um die Genauigkeit des ALDIC-Algorithmus abzuschätzen.
- Laden Sie den Ordner "PBL Code" von GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) herunter und verschieben Sie den gesamten Inhalt in das Arbeitsverzeichnis in MATLAB.
- Öffnen Sie das MATLAB-Skript "Micro_Mech_Template.m".
- Drücken Sie auf Ausführen und wählen Sie eine der Bilddateien aus, die die volumetrischen Bilder enthalten. Bei den volumetrischen Bildern kann es sich um einen der folgenden Dateitypen handeln: .lsm, .tiff, .nd2.
- Die Software lädt automatisch alle Bilder in den Ordner und zeigt ein projiziertes Bild des volumetrischen Referenzbildes an. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie mit der linken Maustaste , um Mehrpunktlinien zu erstellen, die das linke und rechte Ende der Probe nachzeichnen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste , um eine Zeile zu beenden. Wenn die Eingabe verarbeitet wurde und die Kanten korrekt sind, drücken Sie OK , um das Ergebnis zu übernehmen.
- Zeichnen Sie eine zufällige diagonale Linie als Referenzlinie über die Stichprobe, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
- Geben Sie die Anzahl der erzeugten photogebleichten Linien ein, und verfolgen Sie die photogebleichten Linien mit mehrpunktigen Linien.
- Wenn das Ergebnis akzeptabel ist, akzeptieren Sie es. Wenn das Ergebnis fehlerhaft ist, passen Sie es an und verarbeiten Sie es erneut.
- Wiederholen Sie Schritt 4.2 für alle Bilder und verschieben Sie alle Bilder der nachgezeichneten Linien in einen einzigen Ordner.
- Öffnen Sie das Skript "Micro_Mech_Strain.m".
- Drücken Sie Ausführen , um den Code auszuführen, und wählen Sie eines der gespeicherten Bilder aus, auf denen die photogebleichten Linien nachgezeichnet sind.
- Vergewissern Sie sich, dass die ausgewählten Begleitbilder korrekt sind, sobald das Bild ausgewählt wurde, indem Sie auf OK klicken.
5. Digital transformierte Bilder erstellen
HINWEIS: Diese Schritte sind nur erforderlich, wenn die Genauigkeit des ALDIC-Algorithmus mithilfe digital transformierter Bilder bestätigt werden soll. Diese Bilder simulieren homogene 2D-Dehnungsfelder bekannter Größe, indem sie das Referenzbild künstlich transformieren.
- Laden Sie den Code "Digital_strain.m" von GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) herunter.
- Öffnen Sie den Code, und führen Sie ihn aus.
- Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie die gewünschten Werte für die maximal angelegte Dehnung, das angewendete Dehnungsinkrement und das Poisson-Verhältnis ein. Drücken Sie OK.
ANMERKUNG: Für dieses Experiment betrug die maximal angewandte Dehnung 0,1 (10 %), das angewandte Dehnungsinkrement 0,02 (2 %) und es wurde ein Poisson-Verhältnis von 1 verwendet, das mit den experimentellen Daten des Sehnenzugversuchs15,16 übereinstimmt. Der Code verwendet die eingebettete MATLAB-Funktion imwarp und die Eingabewerte (z. B. Dehnungsinkremente, Poisson-Verhältnis), um die digital transformierten Bilder zu erstellen. - Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie das unverformte Referenzbild aus.
- Für jedes Dehnungsinkrement wird eine Überlagerung des Referenzbildes und des transformierten Bildes angezeigt. Das transformierte Bild wird im Verzeichnis unter dem Titel "DigitallyTransformedX%Strain" gespeichert, wobei X das Dehnungsinkrement ist.
6. Installation und Anwendung des Dehnungsberechnungs- und Validierungscodes
- Laden Sie den Ordner "Strain Calculation and Validation Code" von GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) herunter und verschieben Sie den gesamten Inhalt in das MATLAB-Arbeitsverzeichnis
- Installieren Sie einen mex C/C++ Compiler nach Yang und Bhattacharya12. Die Schritte sind im Folgenden zusammengefasst.
- Überprüfen Sie MATLAB, um festzustellen, ob ein mex C/C++-Compiler installiert wurde, indem Sie "mex -setup" in das MATLAB-Befehlsfenster eingeben und die Eingabetaste drücken.
- Wenn ein Fehler angezeigt wird, der darauf hinweist, dass ein Compiler nicht unterstützt wird oder nicht vorhanden ist, fahren Sie mit Schritt 6.3 und Schritt 6.4 fort.
- Wenn kein Fehler vorliegt, fahren Sie mit Schritt 6.5 fort
- Um einen mex C/C++-Compiler herunterzuladen, gehen Sie zu "https:/tdm-gcc.tdragon.net/" und wählen Sie den TDM-gcc-Compiler aus.
- Installieren Sie den heruntergeladenen Compiler an einem bekannten Speicherort.
- Kehren Sie zum MATLAB-Befehlsfenster zurück und geben Sie Folgendes ein: "setenv("MW_MINGW64_LOC","[Geben Sie hier Ihren Installationspfad ein]")". Dies könnte z.B. "setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")". Wenn dieser Befehl erfolgreich ausgeführt wird, ist der mex-Compiler ordnungsgemäß installiert.
- Geben Sie das Funktionsskript "main_aldic.m" ein und ändern Sie Zeile 22 so, dass sie mit dem in Schritt 6.5 ausgeführten Befehl übereinstimmt.
- Öffnen Sie das Skript "Strain_calc_and_validate.m".
- Drücken Sie Ausführen , um die Bildanalyse zu starten.
- Wenn Sie dazu aufgefordert werden, ändern Sie die Werte für die ALDIC-Parameter wie gewünscht.
HINWEIS: Die Fenstergröße sollte das 0,25- bis 1-fache der Teilmengengröße betragen. Weitere Informationen zur Parameterauswahl finden Sie im Online-Benutzerhandbuch: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
_Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).- Die folgenden Werte wurden in dieser Studie verwendet:
Größe der Teilmenge (Pixel): 20
Fenstergröße (Pixel): 10
Methode zur Lösung von ALDIC: Finite Differenz (1)
Paralleles Rechnen wurde nicht verwendet (1)
Methode zur Berechnung der anfänglichen Schätzung: Multigrid-Suche basierend auf der Bildpyramide (0)
- Die folgenden Werte wurden in dieser Studie verwendet:
- Wenn Sie dazu aufgefordert werden, aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Ja", damit der Algorithmus automatisch den Mittelwert, die Standardabweichung und die 2D-Karten für die gewünschte Sammlung von Variablen (z. B. x-Dehnung, y-Dehnung, Schubdehnung, fehlerhafte Bereiche usw.) speichert. Wählen Sie aus, welche Variablen gespeichert werden sollen, und drücken Sie OK.
- Wenn Sie dazu aufgefordert werden, ändern Sie die Parameter wie gewünscht.
- Die folgenden Werte wurden in diesem Experiment verwendet:
Umgebungspunkte zur Berechnung der Dehnung (numP): 12
Korrelationskoeffizient für die Identifizierung schlechter Regionen (corr_threshold): 0,5
Größe des Subbereichs (Pixel) für die Analyse fehlerhafter Bereiche (Subsize): 32
- Die folgenden Werte wurden in diesem Experiment verwendet:
- Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie den Ordner aus, der die umbenannten Z-Projektionen mit maximaler Intensität enthält. Beachten Sie, dass die Software automatisch inkrementelles ALDIC durchführt, um die Dehnungsfelder der verformten Bilder zu bestimmen. Das heißt, jedes deformierte Bild dient als neues "Referenz"-Bild für das nächste deformierte Bild. Dies verbessert die Genauigkeit der Ergebnisse (ergänzende Abbildung 2) im Vergleich zur Durchführung von kumulativem ALDIC, bei dem jedes deformierte Bild mit dem ursprünglichen Referenzbild (0% Dehnung) verglichen wird. Um eine kumulative Analyse durchzuführen, laden Sie die Bilder, wählen Sie jedoch nur das ursprüngliche Referenzbild und das deformierte Bild aus, das Sie interessieren.
HINWEIS: Die normale Dehnung wird als λ - 1 berechnet, wobei λ die Gewebedehnung ist. Die Gewebedehnung wird nach
berechnet, wobei N = [1 0]T oder [0 1]T für die x-Richtung bzw. y-Richtung und C = F T F ist, wobei F der Verformungsgradient ist, der unter Verwendung von "numP"-Punkten berechnet wird, die jeden vom ALDIC-Algorithmus ausgegebenen Datenpunkt umgeben. Die Schubdehnung wird berechnet als 
, wobei 
. - Wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie mit der linken Maustaste, um ein Vier-Punkt-Polygon zu erstellen, um den Bereich zu definieren, der für die Messung der Dehnungen von Interesse ist. Beginnen Sie mit dem Punkt in der oberen linken Ecke, und weisen Sie die nachfolgenden Punkte im Uhrzeigersinn zu.
HINWEIS: Die im MATLAB-Arbeitsbereich gespeicherte Variable "Storage" enthält alle Werte für die durchschnittliche x-Dehnung, die x-Dehnungsstandardabweichung, die durchschnittliche y-Dehnung, die y-Dehnungsstandardabweichung, die durchschnittliche Scherdehnung, die Scherdehnungsstandardabweichung und den Prozentsatz der fehlerhaften Bereiche. Die schlechten Regionen werden gemäß der Korrelationskoeffizientenanalyse innerhalb der in Schritt 6.13 ausgewählten Region von Interesse definiert. Der Ordner "NuclearTrackingResults" (der durch Anpassen der Zeilen 555 und 556 umbenannt werden kann) speichert alle in Schritt 6.10 angegebenen Plots. Dieser Ordner enthält auch eine Tabellenkalkulationsdatei mit dem Namen "Ergebnisse", in der alle in Schritt 6.10 angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen gespeichert sind.
berechnet, wobei N = [1 0]T oder [0 1]T für die x-Richtung bzw. y-Richtung und C = F T F ist, wobei F der Verformungsgradient ist, der unter Verwendung von "numP"-Punkten berechnet wird, die jeden vom ALDIC-Algorithmus ausgegebenen Datenpunkt umgeben. Die Schubdehnung wird berechnet als 
, wobei 
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Representative Results
Vor der Analyse der Dehnungsfelder in realen Gewebeproben wurde das ALDIC-Protokoll zunächst anhand von digital gespannten/transformierten Bildern von Kernen in den Achillessehnen der Maus validiert. Insbesondere wurden die Bilder transformiert, um digitale gleichmäßige Dehnungen in x-Richtung von 2 %, 4 %, 6 %, 8 % und 10 % Dehnung mit einem simulierten Poisson-Verhältnis von 115,16 zu erzeugen. Die Genauigkeit des ALDIC-Algorithmus wurde dann bewertet, indem die mittleren berechneten Dehnungswerte mit den bekannten digitalen Dehnungswerten verglichen wurden. Zusätzlich wurde die Standardabweichung der Dehnungswerte bewertet, um die Heterogenität des Dehnungsfeldes zu bestimmen. Die Differenz zwischen den von ALDIC berechneten Dehnungen (unter Verwendung der inkrementellen Analyse) und den tatsächlichen Dehnungen, die auf die digital transformierten Bilder angewendet werden, ist in Abbildung 1 dargestellt. Die mittlere Dehnung in x-Richtung, die von der ALDIC-Software berechnet wurde, war durchweg eine Unterschätzung der tatsächlichen angewandten Dehnung (Abbildung 1A), und das Ausmaß des Fehlers nahm mit zunehmender angelegter Dehnung zu. Die Magnitude war jedoch immer kleiner als 0,00015 für alle Dehnungsschritte. Auch in y-Richtung wurde die Dehnung leicht unterschätzt (Abbildung 1C). Die Standardabweichung der berechneten Dehnungen innerhalb des gesamten interessierenden Bereichs für die x-Dehnung und die y-Dehnung nahm ebenfalls mit größeren angelegten Dehnungen zu, aber die Größe war auch sehr gering (<0,002) (Abbildung 1B, D). Diese Fehler waren bei Verwendung der kumulativen Analyse wesentlich größer (ergänzende Abbildung 2).
Abbildung 1: Algorithmusvergleich und -validierung mit digital belasteten Bildern . (A) Die gemessenen ALDIC-Dehnungsdaten in x-Richtung waren durchweg niedriger als die tatsächliche Dehnung, die durch die digitalen Transformationen vorgeschrieben wurde, und der Fehler nahm mit zunehmender angewandter Dehnung progressiv zu. (B) Die Standardabweichung der Dehnungswerte in x-Richtung nahm ebenfalls mit größeren angelegten digitalen Dehnungen zu. (C) Die gemessenen ALDIC-Dehnungsdaten in y-Richtung waren durchweg niedriger als die tatsächliche Dehnung, die durch die digitalen Transformationen vorgeschrieben wurde. (D) Die Standardabweichung der Dehnungswerte in y-Richtung nahm mit zunehmender aufgebrachter Dehnung zu. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Bei der Durchführung von Dehnungsanalysen an tatsächlichen Gewebeproben ist es nicht möglich, die Genauigkeit des ALDIC-Algorithmus direkt zu beurteilen. Dennoch wurde eine Technik entwickelt, um die Genauigkeit des Verschiebungsfeldes abzuschätzen. Konkret wurde das deformierte Bild zu einer Vorhersage des Referenzbildes auf Basis des berechneten Verschiebungsfeldes zurückgekrümmt. Ein normalisierter Kreuzkorrelationskoeffizient wurde dann verwendet, um zu bestimmen, wie gut das verzerrte/rekonstruierte Referenzbild mit dem wahren Referenzbild übereinstimmte. Alle Teilbereiche (32 Pixel x 32 Pixel), in denen der normalisierte Kreuzkorrelationswert weniger als 0,5 betrug, wurden als "schlechter Bereich" betrachtet, in dem das Verschiebungsfeld wahrscheinlich ungenau war. Diese Analyse ergab, dass es einen signifikanten Unterschied zwischen der Leistung der inkrementellen und der kumulativen Analysetechniken gab. Insbesondere begann die Anzahl der fehlerhaften Regionen mit der kumulativen Methode nach der angewendeten Dehnung von 6 % zu steigen (Abbildung 2A), während in einer der digital transformierten Regionen für die inkrementelle Analyse nur sehr wenige (1 %) schlechte Regionen beobachtet wurden. Bei der Anwendung dieser Genauigkeitsbewertungstechnik auf die vier getesteten Achillessehnen der Maus (Ergänzende Abbildung 3) wurde festgestellt, dass bei drei Proben die durchschnittliche Anzahl schlechter Regionen weniger als 25% des Bildes betrug. In einer der vier Proben (Experiment 2) wurde jedoch fast die Hälfte des Bildes bei maximaler Dehnungserhöhung als schlecht identifiziert (Abbildung 2B). Die Anzahl der fehlerhaften Regionen, die in Experiment 2 vorhanden waren, variierte um mehr als vier Standardabweichungen vom Mittelwert der anderen drei Proben. Dies ermöglichte die Feststellung, dass die ALDIC-Daten aus Experiment 2 einen Ausreißer darstellten, und diese Daten wurden daher aus der weiteren Analyse der Ergebnisse eliminiert.
Abbildung 2: Erfolgreiche Identifizierung von Bereichen mit ungültigen Dehnungsberechnungen durch Bad-Region-Analyse . (A) Die Anzahl der fehlerhaften Bereiche in den digital transformierten Bildern, die mit der kumulativen Methode analysiert wurden, stieg nach 6% der angelegten Dehnung konsistent an, während die inkrementelle Menge bei 1% blieb. (B) Die Anzahl der schlechten Regionen für alle Sehnenproben nahm bei größeren Dehnungsschritten stetig zu. Experiment 2 wurde als Ausreißer betrachtet und ist daher nicht in den Mittelwert- und Standardabweichungsbalken enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Zusätzlich wurden die lokalen Zugdehnungen in den getesteten Achillessehnen der Maus unter Verwendung von photogebleichten Linien (PBLs) als zweite Methode zur Bestimmung der Genauigkeit des ALDIC-Algorithmus gemessen. Die von ALDIC berechneten x-Richtungs-Dehnungen waren tendenziell größer als die aus den PBLs bestimmten, aber die Differenz lag im Allgemeinen innerhalb von 0,005 Dehnungen (Abbildung 3A). Diese Fehlergröße entsprach der Standardabweichung, die bei den verschiedenen PBLs innerhalb einer bestimmten Stichprobe beobachtet wurde (Abbildung 3B).
Abbildung 3: Validierung der ALDIC-Dehnungsberechnungen durch Vergleich mit photogebleichten Liniendaten . (A) Die Differenz zwischen den ALDIC-Dehnungswerten und den PBL-Dehnungswerten blieb für alle Dehnungsstufen relativ konstant und lag bei einem Wert von 0,005. (B) Die Standardabweichung für die PBL-Daten, gemittelt über alle Stichproben, blieb relativ konstant bei etwa 0,005. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Nach der Bewertung der Genauigkeit des ALDIC-Algorithmus wurden die Größen und räumlichen Verteilungen der lokalen Dehnungen in den Achillessehnen der Maus unter Zugbelastung bestimmt (Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6). Beachten Sie, dass die Stämme nicht die Verdrängungsdaten aus den "schlechten Regionen" in jeder Probe enthalten. Die x-Richtungs-Zugstämme waren in allen drei Proben konsistent und wesentlich niedriger als die verwendeten Gewebestämme (Abbildung 4A). Darüber hinaus war die x-Richtungsdehnung relativ heterogen, da die Standardabweichung im 2D-Bild immer größer als der durchschnittliche Dehnungswert war. Im Gegensatz dazu gab es eine signifikante Inkonsistenz zwischen den drei Stichproben für die Dehnungen in y-Richtung, wobei eine Probe positive Mittelwerte, eine Probe negative Mittelwerte und eine Probe keine Dehnung in y-Richtung aufwies (Abbildung 4B). Darüber hinaus war die Standardabweichung der y-Richtungsdehnungen innerhalb einer gegebenen Probe größer als die Standardabweichung der x-Richtungsdehnungen. Schließlich war die Schubdehnung über alle Dehnungsstufen hinweg relativ gering (Abbildung 4C).
Abbildung 4: Mikroskalige Stämme der Achillessehnen der Maus . (A) Die mittlere Dehnung in x-Richtung blieb unter der angewandten Gewebedehnung, nahm aber mit jedem Dehnungszuwachs zu. (B) Die mittlere Dehnung in y-Richtung war für alle Inkremente ungefähr Null, aber die Standardabweichung war hoch. (C) Die mittlere Scherdehnung nahm während der Dehnungsschritte stetig zu. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Räumliche Verteilung von x-Dehnungen, y-Dehnungen und Schubdehnungen. Repräsentative Karten der (A) x-Dehnungen, (B) y-Dehnungen und (C) Scherdehnungen in der gesamten interessierenden Sehnenregion Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Räumliche Verteilungen der maximalen Haupt-, Minimal- und maximalen Schubdehnungen. Repräsentative Karten der (A) maximalen Hauptdehnungen, (B) minimalen Hauptdehnungen und (C) maximalen Scherdehnungen in der gesamten interessierenden Sehnenregion. Die weißen Linien zeigen die Richtungen der maximalen und minimalen Hauptspannungen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Identifizierung des quasistatischen Zustands während der Bildgebung. Die Steigung der Kraft-Zeit-Kurve während der letzten Minute der Spannungsrelaxationsperiode (rote Linie) kann verwendet werden, um die Gesamtkraftänderung während der Bildgebung zu approximieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Vergleich von inkrementellen und kumulativen Analysetechniken. (A) Der Unterschied zwischen den gemessenen und den tatsächlichen x-Richtungs-Dehnungen in den digital transformierten Bildern war bei der kumulativen Methode signifikant größer als bei der inkrementellen Methode über 4% Dehnung. (B) Die Standardabweichung der x-Dehnungswerte war bei der kumulativen Methode ebenfalls signifikant größer als bei einer Dehnung von über 4 %. (C) Der Unterschied zwischen den gemessenen und den tatsächlichen y-Dehnungen in den digital transformierten Bildern war bei der kumulativen Methode über 8% Dehnung wesentlich größer. (D) Die Standardabweichung der y-Dehnungswerte war bei der kumulativen Methode über 4 % Dehnung signifikant größer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Visualisierung und Quantifizierung fehlerhafter Regionen für jedes Experiment. Fehlerhafte Regionen wurden als lokale Bereiche innerhalb des rekonstruierten Referenzbildes definiert, die nicht mit demselben Bereich des tatsächlichen Referenzbildes übereinstimmten (unterhalb des Korrelationskoeffizienten von 0,5). Jede fehlerhafte Region, die innerhalb einer Region von Interesse identifiziert wurde (weiß umrandet), ist durch ein blaues Kästchen gekennzeichnet. Der Prozentsatz der fehlerhaften Regionen innerhalb der interessierenden Region ist über jedem Bild in Klammern angegeben. Beachten Sie, dass diese Bilder aus dem deformierten Bild bei 12% angelegter Dehnung rekonstruiert werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das Ziel dieser Arbeit war es, eine quelloffene, validierte Methode zur Messung der 2D-Dehnungsfelder in Spanngliedern unter Zugbelastung bereitzustellen. Das Fundament der Software basierte auf einem öffentlich zugänglichen ALDIC-Algorithmus12. Dieser Algorithmus wurde in einen größeren MATLAB-Code eingebettet, der die Funktionalität einer inkrementellen (im Vergleich zur kumulativen) Dehnungsanalyse umfasste. Dieser angepasste Algorithmus wurde dann auf den Zugversuch von Spanngliedern angewendet, und seine Genauigkeit wurde mit zwei verschiedenen Techniken bewertet (d. h. digital transformierte Bilder und Dehnungsmessung mit photogebleichten Linien). Darüber hinaus wurde die Möglichkeit hinzugefügt, die Genauigkeit der ALDIC-Messungen an jeder Probe zu bewerten, ohne dass die tatsächlichen Dehnungswerte bekannt sein müssen.
Die Analyse der digital transformierten Bilder zeigte, dass der Algorithmus Dehnungen bis zu 10% mit sehr geringem Fehler genau messen konnte, was aufgrund der geringen Größen der Dehnungen in den Sehnenproben nicht aus dem Zugversuch der tatsächlichen Achillessehnen der Maus beurteilt werden konnte. Nichtsdestotrotz zeigte der Vergleich der von ALDIC in den Achillessehnen der Maus berechneten Dehnungen mit den Dehnungen, die mit photogebleichten Linien gemessen wurden, dass der Fehler der ALDIC-Technik in der Messvariation der photogebleichten Linien selbst lag. Als abschließende Validierung wurde die Genauigkeit der vom ALDIC-Algorithmus berechneten vollständigen 2D-Verschiebungsfelder bewertet, indem das Referenzbild aus dem deformierten Bild rekonstruiert und die Rekonstruktion mit dem tatsächlichen Referenzbild verglichen wurde. In den digital transformierten Bildern gab es eine Zunahme der Anzahl schlechter Regionen und Dehnungsfehler mit größeren angewandten Dehnungen, insbesondere für die kumulative ALDIC-Analyse (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 2). Dies war zu erwarten, da die inkrementelle Technik das Referenzbild mit jedem Zwischenbild neu definiert, um die Verschiebungsunterschiede zwischen den Bildpaaren zu minimieren. Die Anzahl der schlechten Regionen war in den eigentlichen Sehnenproben sogar noch höher, da die Struktur und Belastung des Sehnengewebes (im Gegensatz zu den digital transformierten Bildern) nicht homogen waren. Dennoch stimmten im Durchschnitt nur etwa 15% des rekonstruierten Bildes nicht mit dem tatsächlichen Referenzbild überein. Eine Stichprobe (Experiment 2) wies jedoch eine große Anzahl fehlerhafter Regionen auf (~45%). Es ist zwar unklar, warum diese Probe nicht richtig verarbeitet werden konnte, aber diese Analyse des rekonstruierten Referenzbildes war wertvoll, weil sie es ermöglichte, zu erkennen, dass die Daten aus dieser Probe nicht zuverlässig waren. Insgesamt zeigen diese Experimente, dass dieser Open-Source-Algorithmus sicher verwendet werden kann, um Gewebebelastungen in Sehnenexplantaten genau zu messen.
Diese Experimente lieferten auch wertvolle Informationen über das mechanische Verhalten von Achillessehnen der Maus. Konkret betrug bei einer applizierten Gewebebelastung von 12 % die durchschnittliche longitudinale (x-Richtung) Dehnung innerhalb der Gewebeprobe nur 2 %. Ein Teil dieser Dehnungsdämpfung war auf die Tatsache zurückzuführen, dass die makroskaligen Gewebestämme aus Änderungen der Griff-zu-Griff-Länge des Gewebes berechnet wurden, was wahrscheinlich signifikante Dehnungskonzentrationen an der Griffschnittstelle des myotendinösen Übergangs beinhaltete. Dies steht jedoch im Einklang mit anderen Studien zu mikroskaligen Dehnungen in Sehnen10,17,18. Darüber hinaus entsprach der Stamm von 12 % einer Belastung von etwa 5 MPa, was wahrscheinlich mit den maximalen physiologischen Belastungen in vivo19 vergleichbar ist. Dies deutet darauf hin, dass Zellen in den Achillessehnen der Maus keine Zugbelastungen über 2% erfahren. Die transversale (y-Richtung) Dehnung war über die Proben hinweg variabler, sowohl mit positiven als auch mit negativen Werten. Dies deutet darauf hin, dass die Sehnenproben positive und negative Poisson-Verhältnisse aufwiesen, was mit früheren Tests der Achillessehnen20 übereinstimmt. Wie für die einachsige Spannung zu erwarten, war das Ausmaß der Schubdehnung im Allgemeinen gering (<4° im Durchschnitt). Bei allen Zug- und Schubdehnungen war die Standardabweichung im interessierenden Bereich jedoch immer größer als der durchschnittliche Dehnungswert, was zeigt, dass ein hohes Maß an Dehnungsheterogenität vorlag. Darüber hinaus nahm diese Heterogenität mit zunehmender Anwendung zu, was wahrscheinlich auf die Heterogenität der Gewebestruktur sowie auf den erhöhten Fehler innerhalb der ALDIC-Berechnungen zurückzuführen ist, der sich aus den größeren Verschiebungen und Verschiebungsfeldern ergibt. Dies deutet darauf hin, dass die Belastungen, denen einzelne Sehnenzellen ausgesetzt sind, innerhalb des Gewebes sehr unterschiedlich sind.
Trotz der erfolgreichen Validierung des ALDIC-Algorithmus gibt es einige Einschränkungen bei der Analyse von Dehnungen innerhalb von Sehnenexplantaten. Die primäre Einschränkung ist die Tatsache, dass der Algorithmus nur eine 2D-Analyse eines 3D-Objekts durchführen kann. Ein strengerer Ansatz wäre die Durchführung einer vollständigen digitalen Volumenkorrelation (DVC), die an digital transformierten Bildern von Sehnen durchgeführt wurde11. Dies ist jedoch in der Regel schwierig an tatsächlichen Sehnenproben durchzuführen, da die Bilder auflösbare Kerne bis zu einer Tiefe von nur 100 μm enthalten. Dies bedeutet, dass das Innenvolumen der Proben keine Textur innerhalb der volumetrischen Bilder aufweist, was den DVC unzuverlässig macht. Daher wurden die Bilder in dieser Studie auf 2D-Maximalprojektionen reduziert, wodurch alle Kerne künstlich in eine einzige Bildebene gezwungen werden. Dies kann zwar zu Fehlern bei der Dehnungsanalyse führen und die Messung von Verschiebungen außerhalb der Ebene verhindern, aber die Validierungsergebnisse deuten darauf hin, dass die Technik immer noch genau ist. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass die Dehnungen am Ende einer Spannungsrelaxationsperiode berechnet wurden und bei dynamischer zyklischer Belastung nicht berechnet werden konnten. Dieses Problem war unvermeidlich, da es eine begrenzte Bildgebungszeit gab, um die für die Dehnungsanalyse verwendeten volumetrischen Bilder zu erfassen. Trotz dieser Einschränkungen war der Erfolg der Analyse relativ robust, da drei der vier Sehnenproben genaue Dehnungsdaten lieferten. Daher wird dieser Algorithmus ein nützliches Werkzeug für Forscher sein, die an der Messung von Dehnungsfeldern in Sehnenexplantaten interessiert sind.
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Disclosures
Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R21 AR079095) und der National Science Foundation (2142627) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer | ThermoFisher | D16 | |
| Calipers | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R HD | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Coning | 6775 | |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher | 62554 | |
| MATLAB | MathWorks | R2022b | |
| Tensile Loading Device | N/A | N/A | Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13) |
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher | 88881001 |
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