Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Измерение локальных деформаций тканей в сухожилиях с помощью корреляции цифровых изображений с открытым исходным кодом

Published: January 27, 2023 doi: 10.3791/64921
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Biomedical Engineering, Amirkabir University of Technology, 3Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Pennsylvania State University

Summary

В этой статье описывается алгоритм корреляции цифровых изображений с открытым исходным кодом для измерения локальных 2D-деформаций тканей в эксплантатах сухожилий. Точность метода была подтверждена с использованием нескольких методов, и она доступна для публичного использования.

Abstract

Существует значительный научный интерес к пониманию штаммов, которые испытывают сухожильные клетки in situ , и того, как эти штаммы влияют на ремоделирование тканей. Основываясь на этом интересе, было разработано несколько аналитических методов для измерения локальных деформаций тканей в сухожильных эксплантатах во время нагрузки. Однако в нескольких случаях о точности и чувствительности этих методов не сообщалось, и ни один из алгоритмов не является общедоступным. Это затруднило более широкое измерение локальных деформаций тканей в эксплантатах сухожилий. Таким образом, цель этой статьи состояла в том, чтобы создать валидированный инструмент анализа для измерения локальных тканевых деформаций в сухожильных эксплантатах, который был бы легко доступен и прост в использовании. В частности, общедоступный алгоритм дополненной лагранжевой корреляции цифровых изображений (ALDIC) был адаптирован для измерения 2D-деформаций путем отслеживания смещений ядер клеток в ахилловых сухожилиях мыши при одноосном напряжении. Кроме того, точность рассчитанных деформаций была подтверждена путем анализа изображений с цифровым преобразованием, а также путем сравнения деформаций со значениями, определенными независимым методом (т.е. фотообесцвеченными линиями). Наконец, в алгоритм был включен метод реконструкции эталонного изображения с использованием рассчитанного поля смещения, который может быть использован для оценки точности алгоритма в отсутствие известных значений деформации или вторичного метода измерения. Алгоритм способен измерять деформации до 0,1 с точностью до 0,00015. Метод сравнения реконструированного эталонного изображения с фактическим эталонным изображением успешно идентифицировал образцы, которые имели ошибочные данные, и показал, что в образцах с хорошими данными примерно 85% поля смещения было точным. Наконец, штаммы, измеренные в ахилловых сухожилиях мыши, соответствовали предыдущей литературе. Таким образом, этот алгоритм является очень полезным и адаптируемым инструментом для точного измерения локальных деформаций тканей в сухожилиях.

Introduction

Сухожилия представляют собой механочувствительные ткани, которые адаптируются и дегенерируют в ответ на механическую нагрузку 1,2,3,4. Из-за роли, которую механические стимулы играют в биологии сухожильных клеток, существует большой интерес к пониманию деформаций, которые сухожильные клетки испытывают в нативной тканевой среде во время нагрузки. Было разработано несколько экспериментальных и аналитических методов для измерения локальных деформаций тканей в сухожилиях. К ним относятся 2D/3D цифровой корреляционный анализ изображений (DIC) поверхностных деформаций с использованием либо спекл-узоров, либо фотообесцвеченных линий (PBL)5,6,7,8, измерение изменений расстояния между центроидами и центроидами отдельных ядер в ткани9,10 и недавний полнопольный метод 3D DIC, который учитывает движение вне плоскости и 3D-деформации 11 . Однако о точности и чувствительности этих методов сообщалось лишь в нескольких случаях, и ни один из этих методов не был обнародован, что затрудняет широкое внедрение и использование этих методов.

Цель этой работы состояла в том, чтобы создать валидированный инструмент анализа для измерения локальных деформаций тканей в эксплантатах сухожилий, который был бы легко доступен и прост в использовании. Выбранный метод основан на общедоступном алгоритме дополненной лагранжевой корреляции цифровых изображений (ALDIC), написанном в MATLAB, который был разработан Янгом и Бхаттачарьей12. Этот алгоритм был адаптирован для анализа образцов сухожилий и проверен путем применения его к изображениям с цифровым преобразованием и сравнения штаммов, измеренных в реальных образцах сухожилий, с результатами, полученными из фотообесцвеченных линий. Кроме того, в алгоритме был реализован дополнительный функционал для подтверждения точности рассчитанного поля смещения даже при отсутствии известных значений деформации или вторичной методики измерения. Таким образом, этот алгоритм является очень полезным и адаптируемым инструментом для точного измерения локальных 2D-деформаций тканей в сухожилиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Это исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета штата Пенсильвания.

1. Подготовка тканей

  1. Для этого протокола собирают ахилловы сухожилия у 2-4-месячных самцов мышей C57BL/6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно использовать различные сухожилия или связки мышей или других мелких животных.
    1. Сделайте надрез на коже поверхностно по отношению к ахиллову сухожилию, чтобы обнажить подошвенное сухожилие и окружающую соединительную ткань. Затем удалите их с помощью хирургического лезвия.
    2. Отделите открытую камбаловидную мышцу и икроножную мышцу от задней конечности и осторожно соскребите их с ахиллова сухожилия хирургическим лезвием
    3. Отделите пяточную кость от остальной части стопы с помощью насадки-отрезного круга на вращающемся инструменте.
  2. Окрашивают ткань в 1,5 мл 5 мкг/мл раствора 5-(4,6-дихлортриазинил)аминофлуоресцеина (ДТАФ) и 0,1 М буфера бикарбоната натрия в течение 20 мин на вращающемся смесителе при комнатной температуре. Этот раствор окрашивает белки (например, внеклеточный матрикс) в ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого 20-минутного периода необходимо выполнить шаг 1.3.
  3. Приготовьте раствор DRAQ5 в солевом буфере 1:1,000 в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) для окрашивания ядер. Используйте вихревой смеситель для гомогенизации раствора.
  4. После 20-минутного инкубационного периода на шаге 1.2 перенесите ткань из раствора DTAF в раствор DRAQ5 и инкубируйте в темном помещении в течение 10 минут при комнатной температуре.

2. Нагрузка на сухожилия и получение изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола требуется растягивающее устройство, которое может быть установлено поверх конфокального микроскопа. Для этого исследования использовалось микрорастяжимое устройство, описанное Петерсоном и Щесны13 .

  1. Поместите сухожилие в захваты растягивающего нагрузочного устройства. Перед установкой захватов в загрузочное устройство с помощью цифровых штангенциркулей измерьте расстояние между насадкой пяточной кости и противоположной рукояткой. Это расстояние является длиной сухожилия.
    1. В качестве альтернативы установите захваты в загрузочное устройство перед вставкой сухожилия и вступите в контакт, чтобы определить положение двигателя с нулевым рабочим объемом. Смещение двигателей после введения сухожилия может обеспечить потенциально более точную длину калибра от захвата до захвата.
  2. Установите захваты в загрузочное устройство, которое содержит PBS для поддержания увлажнения тканей. Выровняйте сухожилие как можно лучше по оси X или Y изображений микроскопа так, чтобы выходы алгоритма x-деформации и y-деформации соответствовали осям сухожилий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании сухожилия были выровнены по оси x. Если невозможно идеально выровнять сухожилие с осями изображения, то выходы алгоритма x-деформации и y-деформации могут быть преобразованы для выравнивания с продольными/перпендикулярными осями сухожилия с использованием стандартных уравнений преобразования деформации14.
  3. Предварительно нагружите сухожилие 1 г натяжения и, при желании, примените циклическую нагрузку для предварительного кондиционирования образца. В этом протоколе предварительное кондиционирование не использовалось, поскольку цель исследования состояла в том, чтобы проверить измеренные местные штаммы тканей, а не измерить свойства тканевого материала. Если есть интерес к измерению макромасштабных свойств материала, которые зависят от истории загрузки, рекомендуется предварительное кондиционирование. После предварительного кондиционирования и восстановления повторно нанесите 1 г предварительной нагрузки.
  4. При желании фотоотбеливают набор из четырех линий, расположенных на расстоянии 80 мкм друг от друга в центральной области ткани (подробнее см. Peterson and Szczesny13 ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фотообесцвеченные линии использовались для проверки измерений алгоритма ALDIC и не являются необходимыми для выполнения самого ALDIC. Количество и расстояние между линиями можно регулировать, а расположение линий следует выбирать таким образом, чтобы избежать каких-либо артефактов в образце, которые могли бы снизить четкость линии.
  5. Повторите процедуру фотообесцвечивания на левом и правом краях ткани возле захватов.
  6. С помощью конфокального микроскопа можно получить объемные изображения (x,y: 1,25 мкм/пиксель, z: 2,5 мкм/пиксель) флуоресценции DTAF и DRAQ5 при 1 г предварительной нагрузки.
  7. Выполните увеличение деформации при деформации от 0,5% до 2%. Обратите внимание, что скорость деформации и величина дополнительной деформации можно регулировать.
  8. Дайте тканям расслабиться в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность релаксации напряжения должна быть выбрана таким образом, чтобы образец находился под приблизительно квазистатической нагрузкой во время получения изображения. Чтобы определить, является ли продолжительность релаксации напряжения приемлемой, определите наклон кривой силы-времени в течение последней минуты релаксации напряжения (дополнительный рисунок 1) и умножьте этот наклон на общую продолжительность изображения. В этом исследовании сила, приложенная при наибольшем приращении деформации, никогда не изменялась более чем на 5%.
  9. Сделайте еще одно объемное изображение ткани после деформации.
  10. Повторяйте шаги 2.7-2.9 до тех пор, пока не будет достигнута желаемая конечная деформация. В этой работе было выбрано окончательное значение штамма 12%.

3. Обработка изображений

  1. Используйте ImageJ или Fiji для создания максимальных z-проекций каждого объемного изображения канала DRAQ5 (ядерного). Это будет служить 2D-пятнистыми изображениями для ALDIC.
  2. Сохраните z-проекции максимальной интенсивности в виде файлов .tiff и назовите их в соответствии со следующим соглашением об именовании.
    1. Используйте цифру в качестве первого символа имени изображения.
    2. Пусть число соответствует порядку, в котором изображения будут рассматриваться во время анализа деформации. Например, первое изображение должно начинаться с единицы, а второе изображение должно начинаться с двух. Можно выбирать разные числа, но они должны последовательно увеличиваться. Пример соглашения об именах выглядит следующим образом: «0_Experiment1_MaxZProjection».
  3. Сохраните все переименованные z-проекции максимальной интенсивности в папку.

4. Установка и применение кода фотообесцвеченного линейного анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги необходимы только в том случае, если необходимо подтвердить точность алгоритма ALDIC с использованием фотообесцвеченных линий. Код вычисляет локальную деформацию ткани как среднее нормализованное изменение расстояния между каждой фотообесцвеченной линией в наборе фотообесцвеченных линий. В этом исследовании средние локальные значения были затем усреднены по всем наборам фотообесцвеченных линий (т.е. в центре и на левом / правом концах), чтобы определить одно среднее значение локальной деформации ткани для каждого образца. Затем это значение использовалось для оценки точности алгоритма ALDIC.

  1. Загрузите папку «PBL Code» с GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) и переместите все содержимое в рабочий каталог в MATLAB.
  2. Откройте сценарий MATLAB «Micro_Mech_Template.m».
    1. Нажмите кнопку «Выполнить» и выберите один из файлов изображений, содержащих объемные изображения. Объемные образы могут быть любого из следующих типов: .lsm, .tiff, .nd2.
    2. Программа автоматически загрузит все изображения в папку и отобразит проецируемое изображение эталонного объемного изображения. При появлении запроса щелкните левой кнопкой мыши , чтобы создать многоточечные линии, которые обводят левый и правый концы образца. Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы завершить строку. После обработки входных данных, если края верны, нажмите Ok , чтобы принять результат.
    3. Нарисуйте случайную диагональную линию поперек образца в качестве контрольной линии при появлении запроса.
    4. Введите количество созданных фотообесцвеченных линий и обведите фотообесцвеченные линии многоточечными линиями.
    5. Если результат приемлем, примите его. Если результат ошибочный, скорректируйте его и обработайте повторно.
  3. Повторите шаг 4.2 для всех изображений и переместите все изображения с трассированными линиями в одну папку.
  4. Откройте скрипт «Micro_Mech_Strain.m».
    1. Нажмите «Выполнить», чтобы выполнить код, и выберите одно из сохраненных изображений, на котором прослеживаются фотообесцвеченные линии.
    2. После выбора убедитесь в правильности выбранных сопроводительных изображений, нажав кнопку ОК.

5. Создание изображений с цифровым преобразованием

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги необходимы только в том случае, если необходимо подтвердить точность алгоритма ALDIC с использованием изображений с цифровым преобразованием. Эти изображения имитируют однородные 2D-поля деформаций известной величины путем искусственного преобразования эталонного изображения.

  1. Загрузите код «Digital_strain.m» с GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc).
  2. Откройте и запустите код.
  3. При появлении запроса вставьте желаемые значения для максимальной приложенной деформации, приращения приложенной деформации и коэффициента Пуассона. Нажмите ОК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента максимальная приложенная деформация составила 0,1 (10%), приращение приложенной деформации составило 0,02 (2%), и был использован коэффициент Пуассона, равный 1, что согласуется с экспериментальными данными испытания сухожилий на растяжение15,16. Код использует встроенную функцию MATLAB imwarp и входные значения (например, приращения деформации, коэффициент Пуассона) для создания изображений с цифровым преобразованием.
  4. При появлении запроса выберите недеформированный эталонный образ.
  5. Для каждого приращения деформации отображается наложение эталонного изображения и преобразованного изображения. Преобразованное изображение будет сохранено в каталоге под названием «DigitallyTransformedX%Strain», где X — шаг деформации.

6. Расчет деформации и установка и применение кода проверки

  1. Загрузите папку «Strain Calculation and Validation Code» с GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) и переместите все содержимое в рабочий каталог MATLAB
  2. Установите компилятор mex C/C++ в соответствии с Янгом и Бхаттачарьей12. Эти шаги кратко изложены ниже.
    1. Проверьте MATLAB, чтобы узнать, установлен ли компилятор mex C/C++, введя «mex -setup» в командном окне MATLAB и нажав Enter.
    2. Если появляется ошибка, указывающая, что компилятор не поддерживается или не присутствует, перейдите к шагам 6.3 и 6.4.
    3. Если ошибка отсутствует, перейдите к шагу 6.5
  3. Чтобы загрузить компилятор mex C/C++, перейдите по адресу https:/tdm-gcc.tdragon.net/ и выберите компилятор TDM-gcc.
  4. Установите загруженный компилятор в известное расположение.
  5. Вернитесь в командное окно MATLAB и введите: "setenv("MW_MINGW64_LOC","[Введите здесь путь установки]")". Например, это может быть "setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")". Если эта команда выполняется успешно, компилятор mex установлен правильно.
  6. Введите сценарий функции «main_aldic.m» и измените строку 22 в соответствии с командой, выполненной на шаге 6.5.
  7. Откройте скрипт «Strain_calc_and_validate.m».
  8. Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы начать анализ изображения.
  9. При появлении запроса измените значения параметров ALDIC по своему усмотрению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер окна должен быть от 0,25 до 1 раза больше размера подмножества. Дополнительные сведения о выборе параметров см. в онлайн-руководстве пользователя: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
    _Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).
    1. В данном исследовании использовались следующие значения:
      Размер подмножества (пикселей): 20
      Размер окна (пикселей): 10
      Метод решения ALDIC: конечная разность (1)
      Параллельные вычисления не использовались (1)
      Метод вычисления начального предположения: многосеточный поиск на основе пирамиды изображений (0)
  10. При появлении запроса установите флажок «Да», чтобы алгоритм автоматически сохранял среднее значение, стандартное отклонение и 2D-карты для нужного набора переменных (например, x-деформация, y-деформация, деформация сдвига, плохие области и т. д.). Выберите, какие переменные следует сохранить, и нажмите Ok.
  11. При появлении запроса измените параметры по своему усмотрению.
    1. В этом эксперименте использовались следующие значения:
      Окружающие точки для расчета деформации (числоП): 12
      Коэффициент корреляции для идентификации плохого региона (corr_threshold): 0.5
      Размер подобласти (в пикселях) для анализа неверных областей (Subsize): 32
  12. При появлении запроса выберите папку, содержащую переименованные z-проекции максимальной интенсивности. Обратите внимание, что программное обеспечение автоматически выполняет инкрементальный ALDIC для определения напряженных полей деформированных изображений. То есть каждое деформированное изображение служит новым «эталонным» изображением для следующего деформированного изображения. Это повышает точность результатов (дополнительный рисунок 2) по сравнению с выполнением кумулятивного ALDIC, где каждое деформированное изображение сравнивается с исходным эталонным изображением (деформация 0%). Чтобы выполнить кумулятивный анализ, загрузите изображения, но выберите только исходное эталонное изображение и деформированное изображение, которое вас интересует.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальная деформация рассчитывается как λ - 1, где λ - растяжение ткани. Растяжение ткани рассчитывается по формулеEquation 1, где N = [1 0]T или [0 1]T для направления x и направления y, соответственно, и C = F T F, где F — градиент деформации, рассчитанный с использованием точек «numP», окружающих каждую точку данных, выводимую алгоритмом ALDIC. Деформация сдвига вычисляется как Equation 2, где Equation 3.
  13. При появлении запроса щелкните левой кнопкой мыши, чтобы создать четырехточечный многоугольник, чтобы определить область, представляющую интерес для измерения деформаций. Начните с точки в левом верхнем углу и назначьте последующие точки по часовой стрелке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переменная «Хранилище», сохраненная в рабочем пространстве MATLAB, содержит все значения для средней деформации x, стандартного отклонения деформации x, средней деформации y, стандартного отклонения деформации y, средней деформации сдвига, стандартного отклонения деформации сдвига и процента поврежденных областей. Плохие области определяются в соответствии с анализом коэффициентов корреляции в интересующей области, выбранной на шаге 6.13. В папке "NuclearTrackingResults" (которую можно переименовать, скорректировав строки 555 и 556) хранятся все графики, указанные на шаге 6.10. Эта папка также содержит файл электронной таблицы с именем «Результаты», в котором хранятся все средние значения и стандартные отклонения, указанные в шаге 6.10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Перед анализом полей деформации в реальных образцах тканей протокол ALDIC был сначала проверен с использованием цифровых напряженных / преобразованных изображений ядер в ахилловых сухожилиях мыши. В частности, изображения были преобразованы для получения в цифровом виде однородных деформаций в направлении x 2%, 4%, 6%, 8% и 10% с смоделированным соотношением Пуассона 115,16. Затем точность алгоритма ALDIC оценивали путем сравнения средних расчетных значений деформации с известными цифровыми деформациями. Кроме того, оценивали стандартное отклонение значений деформации для определения неоднородности поля деформации. Разница между штаммами, рассчитанными ALDIC (с использованием инкрементального анализа), и фактическими деформациями, примененными к изображениям с цифровым преобразованием, показана на рисунке 1. Средняя деформация в направлении x, рассчитанная программным обеспечением ALDIC, постоянно была недооценкой истинной приложенной деформации (рис. 1A), и величина ошибки увеличивалась с увеличением приложенной деформации. Однако величина всегда была меньше 0,00015 для всех приращений деформации. Также наблюдалась небольшая недооценка деформации в направлении y (рис. 1C). Стандартное отклонение рассчитанных штаммов в пределах полной области интереса для x-штамма и y-штамма также увеличивалось с увеличением применяемых деформаций, но величина также была очень малой (<0,002) (рис. 1B, D). Эти ошибки были значительно больше при использовании кумулятивного анализа (дополнительный рисунок 2).

Figure 1
Рисунок 1: Сравнение и проверка алгоритма с изображениями с цифровой деформацией . (A) Измеренные данные о деформации ALDIC в направлении x были неизменно ниже, чем фактическая деформация, предписанная цифровыми преобразованиями, и погрешность постепенно увеличивалась с увеличением приложенной деформации. (B) Стандартное отклонение значений деформации в направлении x также увеличивалось с увеличением примененных цифровых деформаций. (C) Измеренные данные о деформации ALDIC в направлении y были неизменно ниже, чем фактическая деформация, предписанная цифровыми преобразованиями. (D) Стандартное отклонение значений деформации в направлении y увеличивалось с увеличением приложенной деформации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

При проведении анализа деформации на реальных образцах тканей невозможно напрямую оценить точность алгоритма ALDIC. Тем не менее, была разработана методика оценки точности поля смещения. В частности, деформированное изображение было деформировано обратно в предсказание эталонного изображения на основе рассчитанного поля смещения. Затем был использован нормализованный коэффициент перекрестной корреляции, чтобы определить, насколько хорошо деформированное/реконструированное эталонное изображение совпадает с истинным эталонным изображением. Любые субрегионы (32 пикселя x 32 пикселя), в которых нормализованное значение взаимной корреляции было меньше 0,5, считались «плохой областью», в которой поле смещения, вероятно, было неточным. Этот анализ показал, что существует значительная разница между эффективностью методов инкрементального и кумулятивного анализа. В частности, число плохих областей начало расти с кумулятивным методом после 6% примененной деформации (рис. 2A), тогда как очень мало (1%) плохих областей наблюдалось в любой из областей с цифровой трансформацией для инкрементального анализа. При применении этого метода оценки точности на четырех тестируемых ахилловых сухожилиях мыши (дополнительный рисунок 3) было определено, что для трех образцов среднее количество поврежденных областей составляло менее 25% изображения. Однако в одном из четырех образцов (эксперимент 2) почти половина изображения была идентифицирована как плохая при максимальном приращении деформации (рис. 2B). Количество плохих областей, которые присутствовали в эксперименте 2, отличалось от среднего значения других трех образцов более чем на четыре стандартных отклонения. Это позволило определить, что данные ALDIC из эксперимента 2 представляют собой выброс, и поэтому эти данные были исключены из дальнейшего анализа результатов.

Figure 2
Рисунок 2: Успешная идентификация областей с недопустимыми расчетами деформации с помощью анализа плохих областей. (A) Количество плохих областей на изображениях, проанализированных в цифровом виде с использованием кумулятивного метода, постоянно увеличивалось после 6% приложенной деформации, в то время как добавочное количество оставалось на уровне 1%. (B) Количество поврежденных областей для всех образцов сухожилий неуклонно увеличивалось при больших приращениях деформации. Эксперимент 2 считался выбросом и, таким образом, не включался в среднее значение и стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Кроме того, локальные растягивающие деформации в испытуемых ахилловых сухожилиях мыши были измерены с использованием фотообесцвеченных линий (PBL) в качестве второго метода определения точности алгоритма ALDIC. Штаммы x-направления, рассчитанные с помощью ALDIC, как правило, были больше, чем штаммы, определенные по PBL, но разница обычно составляла в пределах 0,005 деформации (рис. 3A). Эта величина ошибки была аналогична стандартному отклонению, наблюдаемому для различных PBL в данной выборке (рис. 3B).

Figure 3
Рисунок 3: Валидация расчетов деформации ALDIC путем сравнения с данными линии фотообесцвечивания . (A) Разница между значениями деформации ALDIC и значениями деформации PBL оставалась относительно постоянной для всех приращений деформации около значения 0,005. (B) Стандартное отклонение данных PBL, усредненных по всем выборкам, оставалось относительно постоянным и составляло приблизительно 0,005. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

После оценки точности алгоритма ALDIC были определены величины и пространственные распределения локальных деформаций в ахилловых сухожилиях мыши при растягивающей нагрузке (рис. 4, рис . 5 и рис. 6). Обратите внимание, что штаммы не включают данные о смещении из «плохих областей» в каждом образце. Растягивающие деформации в направлении x были одинаковыми во всех трех образцах и были значительно ниже, чем применяемые деформации тканей (рис. 4A). Кроме того, деформация в направлении x была относительно неоднородной, учитывая, что стандартное отклонение на 2D-изображении всегда было больше, чем среднее значение деформации. Напротив, наблюдалось значительное несоответствие между тремя образцами для штаммов в направлении y: один образец демонстрировал положительные средние значения, один образец демонстрировал отрицательные средние значения, а один образец демонстрировал нулевую деформацию в направлении y (рис. 4B). Кроме того, стандартное отклонение штаммов направления y в данном образце было больше, чем стандартное отклонение штаммов направления x. Наконец, деформация сдвига была относительно низкой для всех приращений деформации (рис. 4C).

Figure 4
Рисунок 4: Микромасштабные штаммы ахилловых сухожилий мыши . (A) Среднее напряжение в направлении x оставалось ниже примененного штамма ткани, но увеличивалось с каждым приращением штамма. (B) Средняя деформация в направлении y была приблизительно равна нулю для всех приращений, но стандартное отклонение было высоким. (C) Средняя деформация сдвига неуклонно увеличивалась на протяжении всего приращения деформации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Пространственное распределение x-штаммов, y-штаммов и сдвиговых деформаций. Репрезентативные карты (A) x-штаммов, (B) y-штаммов и (C) сдвиговых деформаций во всей интересующей области сухожилия Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Пространственное распределение максимальных основных, минимальных основных и максимальных сдвиговых деформаций. Репрезентативные карты (A) максимальных основных штаммов, (B) минимальных основных штаммов и (C) максимальных сдвиговых деформаций во всей интересующей области сухожилия. Белыми линиями обозначены направления максимальных и минимальных главных напряжений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Идентификация квазистатического состояния во время визуализации. Наклон кривой силы-времени в течение последней минуты периода релаксации напряжений (красная линия) может быть использован для аппроксимации общего изменения силы во время визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Сравнение методов инкрементального и кумулятивного анализа. (A) Разница между измеренными и фактическими деформациями в направлении x на изображениях, преобразованных в цифровом виде, была значительно больше при кумулятивном методе по сравнению с инкрементальным методом выше 4% деформации. (B) Стандартное отклонение значений x-деформации также было значительно выше при кумулятивном методе выше 4% деформации. (C) Разница между измеренными и фактическими y-деформациями на изображениях, преобразованных в цифровом виде, была значительно больше при кумулятивном методе выше 8% деформации. (D) Стандартное отклонение значений y-деформации было значительно выше при кумулятивном методе выше 4% деформации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Визуализация и количественная оценка плохих областей для каждого эксперимента. Плохие области определялись как локальные области в пределах реконструированного эталонного изображения, которые не соответствовали (ниже коэффициента корреляции 0,5) той же области фактического эталонного изображения. Каждая плохая область, идентифицированная в интересующей области (обведена белым цветом), помечена синим прямоугольником. Процент плохих областей в интересующей области указан над каждым изображением в скобках. Обратите внимание, что эти изображения реконструируются из деформированного изображения при 12% приложенной деформации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Цель этой статьи состояла в том, чтобы предоставить проверенный метод с открытым исходным кодом для измерения 2D-полей деформации в сухожилиях при растягивающей нагрузке. Основа программного обеспечения была основана на общедоступном алгоритме ALDIC12. Этот алгоритм был встроен в более крупный код MATLAB с добавленной функциональностью инкрементального (по сравнению с кумулятивным) анализа деформаций. Затем этот адаптированный алгоритм был применен к испытанию сухожилий на растяжение, и его точность оценивалась двумя различными методами (т. е. изображениями с цифровым преобразованием и измерением деформации с использованием фотообесцвеченных линий). Кроме того, была добавлена возможность оценки точности измерений ALDIC на любом образце, не требуя знания истинных значений деформации.

Анализ изображений, преобразованных в цифровом виде, показал, что алгоритм может точно измерять деформации до 10% с очень небольшой погрешностью, которая не может быть оценена при испытании на растяжение реальных ахилловых сухожилий мыши из-за низких величин деформаций в образцах сухожилий. Тем не менее, сравнение штаммов, рассчитанных в ахилловых сухожилиях мышей с помощью ALDIC, со штаммами, измеренными с использованием фотообесцвеченных линий, показало, что погрешность метода ALDIC находилась в пределах вариации измерения самих фотообесцвеченных линий. В качестве окончательной проверки точность полных полей 2D-смещения, рассчитанных алгоритмом ALDIC, оценивалась путем восстановления эталонного изображения из деформированного изображения и сравнения реконструкции с фактическим эталонным изображением. На изображениях, преобразованных в цифровом виде, наблюдалось увеличение количества плохих областей и ошибки деформации с большими прикладными деформациями, особенно для кумулятивного анализа ALDIC (рис. 2 и дополнительный рис. 2). Это было ожидаемо, поскольку инкрементальный метод переопределяет эталонное изображение с каждым промежуточным изображением, чтобы свести к минимуму различия в смещении между парами изображений. Количество поврежденных областей было еще выше в фактических образцах сухожилий, поскольку структура и нагрузка сухожильной ткани не были однородными (в отличие от изображений, преобразованных в цифровом виде). Тем не менее, в среднем только около 15% реконструированного изображения не соответствовало фактическому эталонному изображению. Тем не менее, одна выборка (эксперимент 2) имела большое количество ошибочных областей (~ 45%). Хотя неясно, почему эта выборка не могла быть должным образом обработана, этот анализ реконструированного эталонного изображения был ценным, поскольку он позволил признать, что данные из этой выборки не были надежными. В целом, эти эксперименты показывают, что этот алгоритм с открытым исходным кодом может быть уверенно использован для точного измерения деформаций тканей в эксплантатах сухожилий.

Эти эксперименты также предоставили ценную информацию о механическом поведении ахилловых сухожилий мыши. В частности, при применяемом тканевом штамме 12% средняя продольная (x-направленная) деформация в образце ткани составляла всего 2%. Частично это ослабление деформации было связано с тем, что макромасштабные деформации тканей были рассчитаны на основе изменений длины ткани от захвата до захвата, которые, вероятно, включали значительные концентрации деформации на границе раздела захвата миотендинозного соединения. Тем не менее, это согласуется с другими исследованиями микроразмерных штаммов в сухожилиях10,17,18. Кроме того, 12%-ная деформация соответствовала примерно 5 МПа нагрузки, что, вероятно, сопоставимо с максимальными физиологическими нагрузками in vivo19. Это говорит о том, что клетки ахилловых сухожилий мыши не испытывают растягивающих деформаций выше 2%. Поперечная (y-направленная) деформация была более изменчивой в разных образцах, как с положительными, так и с отрицательными значениями. Это говорит о том, что образцы сухожилий показали положительные и отрицательные соотношения Пуассона, что согласуется с предыдущим тестированием ахилловых сухожилий20. Как и ожидалось для одноосного растяжения, величина деформации сдвига, как правило, была низкой (в среднем <4°). Однако для всех деформаций при растяжении и сдвиге стандартное отклонение в интересующей области всегда было больше, чем среднее значение деформации, что свидетельствует о значительной степени неоднородности деформации. Кроме того, эта гетерогенность увеличивалась с увеличением применяемых штаммов, вероятно, из-за неоднородности структуры ткани, а также из-за увеличения погрешности в расчетах ALDIC в результате больших смещений и полей смещения. Это говорит о том, что деформации, испытываемые отдельными клетками сухожилий, сильно варьируются в ткани.

Несмотря на успешную валидацию алгоритма ALDIC, существуют некоторые ограничения в его использовании для анализа деформаций в эксплантатах сухожилий. Основным ограничением является тот факт, что алгоритм может выполнять только 2D-анализ 3D-объекта. Более строгим подходом было бы выполнение полной цифровой объемной корреляции (DVC), которая была выполнена на цифровых трансформированных изображениях сухожилий11. Однако, как правило, это трудно выполнить на реальных образцах сухожилий, поскольку изображения содержат разрешимые ядра на глубине всего 100 мкм. Это означает, что внутренний объем образцов не имеет текстуры в объемных изображениях, что делает DVC ненадежным. Поэтому изображения в этом исследовании были свернуты до максимальных 2D-проекций, что искусственно заставляет все ядра находиться в одной плоскости изображения. Хотя это может привести к некоторым ошибкам в анализе деформаций и помешать измерению смещений вне плоскости, результаты проверки показывают, что метод по-прежнему точен. Дополнительным ограничением является то, что деформации были рассчитаны в конце периода релаксации напряжений и не могли быть рассчитаны во время динамической циклической нагрузки. Эта проблема была неизбежна, поскольку для получения объемных изображений, используемых для анализа деформаций, требовалось конечное время получения изображений. Несмотря на эти ограничения, успех анализа был относительно надежным, учитывая, что три из четырех образцов сухожилий дали точные данные о деформации. Таким образом, этот алгоритм будет полезным инструментом для исследователей, заинтересованных в измерении полей деформаций в эксплантатах сухожилий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У всех авторов нет конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения (R21 AR079095) и Национальным научным фондом (2142627).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer ThermoFisher D16
Calipers Mitutoyo 500-196-30
Confocal Microscope Nikon A1R HD
Corning LSE Vortex Mixer Coning 6775
DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) ThermoFisher 62554
MATLAB MathWorks R2022b
Tensile Loading Device N/A N/A Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13) 
Tube Revolver Rotator ThermoFisher 88881001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devkota, A. C. Distributing a fixed amount of cyclic loading to tendon explants over longer periods induces greater cellular and mechanical responses. Journal of Orthopaedic Research. 11 (4), 1609-1612 (2007).
  2. Sun, H. B., et al. Cycle-dependent matrix remodeling gene expression response in fatigue-loaded rat patellar tendons. Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1380-1386 (2010).
  3. Shepherd, J. H., Screen, H. R. C. Fatigue loading of tendon. International Journal of Experimental Pathology. 94 (4), 260-270 (2013).
  4. Paschall, L., Pedaprolu, K., Carrozzi, S., Dhawan, A., Szczesny, S. Mechanical stimulation as both the cause and the cure of tendon and ligament injuries. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , Springer. Cham, Switzerland. 359-386 (2022).
  5. Andarawis-Puri, N., Ricchetti, E. T., Soslowsky, L. J. Rotator cuff tendon strain correlates with tear propagation. Journal of Biomechanics. 42 (2), 158-163 (2009).
  6. Cheng, V. W. T., Screen, H. R. C. The micro-structural strain response of tendon. Journal of Materials Science. 42 (21), 8957-8965 (2007).
  7. Luyckx, T., et al. Digital image correlation as a tool for three-dimensional strain analysis in human tendon tissue. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 7 (2014).
  8. Duncan, N. A., Bruehlmann, S. B., Hunter, C. J., Shao, X., Kelly, E. J. In situ cell-matrix mechanics in tendon fascicles and seeded collagen gels: Implications for the multiscale design of biomaterials. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering. 17 (1), 39-47 (2014).
  9. Arnoczky, S. P., Lavagnino, M., Whallon, J. H., Hoonjan, A. In situ cell nucleus deformation in tendons under tensile load; A morphological analysis using confocal laser microscopy. Journal of Orthopaedic Research. 20 (1), 29-35 (2002).
  10. Screen, H. R. C., Bader, D. L., Lee, D. A., Shelton, J. C. Local strain measurement within tendon. Strain. 40 (4), 157-163 (2004).
  11. Fung, A. K., Paredes, J. J., Andarawis-Puri, N. Novel image analysis methods for quantification of in situ 3-D tendon cell and matrix strain. Journal of Biomechanics. 67, 184-189 (2018).
  12. Yang, J., Bhattacharya, K. Augmented Lagrangian digital image correlation. Experimental Mechanics. 59 (2), 187-205 (2019).
  13. Peterson, B. E., Szczesny, S. E. Dependence of tendon multiscale mechanics on sample gauge length is consistent with discontinuous collagen fibrils. Acta Biomaterialia. 117, 302-309 (2020).
  14. Humphrey, J. D., O'Rourke, S. L. An Introduction to Biomechanics. , Springer. New York, NY. (2015).
  15. Reese, S. P., Weiss, J. A. Tendon fascicles exhibit a linear correlation between Poisson's ratio and force during uniaxial stress relaxation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (3), 34501 (2013).
  16. Ahmadzadeh, H., Freedman, B. R., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J., Shenoy, V. B. Micromechanical poroelastic finite element and shear-lag models of tendon predict large strain dependent Poisson's ratios and fluid expulsion under tensile loading. Acta Biomaterialia. 22, 83-91 (2015).
  17. Szczesny, S. E., Elliott, D. M. Interfibrillar shear stress is the loading mechanism of collagen fibrils in tendon. Acta Biomaterialia. 10 (6), 2582-2590 (2014).
  18. Han, W. M., et al. Macro- to microscale strain transfer in fibrous tissues is heterogeneous and tissue-specific. Biophysical Journal. 105 (3), 807-817 (2013).
  19. Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A novel, open-source, low-cost bioreactor for load-controlled cyclic loading of tendon explants. Journal of Biomechanical Engineering. 144 (8), 084505 (2022).
  20. Gatt, R., et al. Negative Poisson's ratios in tendons: An unexpected mechanical response. Acta Biomaterialia. 24, 201-208 (2015).

Tags

Машиностроение выпуск 191
Измерение локальных деформаций тканей в сухожилиях с помощью корреляции цифровых изображений <em>с</em> открытым исходным кодом
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Godshall, S., Pedaprolu, K., Vasti,… More

Godshall, S., Pedaprolu, K., Vasti, E., Eskandari, F., Szczesny, S. E. Measuring Local Tissue Strains in Tendons via Open-Source Digital Image Correlation. J. Vis. Exp. (191), e64921, doi:10.3791/64921 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter