Summary
Dette papir beskriver en open source digital billedkorrelationsalgoritme til måling af lokale 2D-vævsstammer inden for seneeksplanter. Nøjagtigheden af teknikken er blevet valideret ved hjælp af flere teknikker, og den er tilgængelig til offentlig brug.
Abstract
Der er stor videnskabelig interesse for at forstå de stammer, som seneceller oplever in situ , og hvordan disse stammer påvirker vævsremodellering. Baseret på denne interesse er der udviklet flere analytiske teknikker til måling af lokale vævsstammer i seneeksplanter under belastning. I flere tilfælde er nøjagtigheden og følsomheden af disse teknikker imidlertid ikke blevet rapporteret, og ingen af algoritmerne er offentligt tilgængelige. Dette har gjort det vanskeligt for en mere udbredt måling af lokale vævsstammer i seneeksplanter. Derfor var formålet med dette papir at skabe et valideret analyseværktøj til måling af lokale vævsstammer i seneeksplanter, der er let tilgængeligt og let at bruge. Specifikt blev en offentligt tilgængelig augmented-Lagrangian digital billedkorrelationsalgoritme (ALDIC) tilpasset til måling af 2D-stammer ved at spore forskydningerne af cellekerner i musens akillessener under uniaxial spænding. Derudover blev nøjagtigheden af de beregnede stammer valideret ved at analysere digitalt transformerede billeder samt ved at sammenligne stammerne med værdier bestemt ud fra en uafhængig teknik (dvs. fotoblegede linjer). Endelig blev der indarbejdet en teknik i algoritmen til at rekonstruere referencebilledet ved hjælp af det beregnede forskydningsfelt, som kan bruges til at vurdere algoritmens nøjagtighed i fravær af kendte belastningsværdier eller en sekundær måleteknik. Algoritmen er i stand til at måle stammer op til 0,1 med en nøjagtighed på 0,00015. Teknikken til sammenligning af et rekonstrueret referencebillede med det faktiske referencebillede identificerede med succes prøver, der havde fejlagtige data, og indikerede, at ca. 85% af forskydningsfeltet var nøjagtigt i prøver med gode data. Endelig var de stammer, der blev målt i museakillessener, i overensstemmelse med den tidligere litteratur. Derfor er denne algoritme et meget nyttigt og tilpasningsdygtigt værktøj til nøjagtig måling af lokale vævsstammer i sener.
Introduction
Sener er mekanofølsomme væv, der tilpasser sig og degenererer som reaktion på mekanisk belastning 1,2,3,4. På grund af den rolle, som mekaniske stimuli spiller i senecellebiologi, er der stor interesse for at forstå de stammer, som seneceller oplever i det oprindelige vævsmiljø under belastning. Flere eksperimentelle og analytiske teknikker er blevet udviklet til at måle lokale vævsstammer i sener. Disse omfatter 2D/3D digital billedkorrelation (DIC) analyser af overfladestammer ved hjælp af enten speckle mønstre eller fotobleget linjer (PBL'er)5,6,7,8, måling af ændringerne i centroid-til-centroid afstanden af individuelle kerner i vævet 9,10 og en nylig fuldfelt 3D DIC-metode, der tager højde for bevægelse uden for plan og 3D-deformationer 11 . Imidlertid er nøjagtigheden og følsomheden af disse teknikker kun blevet rapporteret i nogle få tilfælde, og ingen af disse teknikker er blevet gjort offentligt tilgængelige, hvilket gør den udbredte vedtagelse og anvendelse af disse teknikker vanskelig.
Formålet med dette arbejde var at skabe et valideret analyseværktøj til måling af lokale vævsstammer i seneeksplanter, der er let tilgængeligt og let at bruge. Den valgte metode er baseret på en offentligt tilgængelig augmented-Lagrangian digital image correlation (ALDIC) algoritme skrevet i MATLAB, der blev udviklet af Yang og Bhattacharya12. Denne algoritme blev tilpasset til analyse af seneprøver og valideret ved at anvende den på digitalt transformerede billeder og ved at sammenligne de stammer, der blev målt i faktiske seneprøver, med resultaterne opnået fra fotoblegede linjer. Desuden blev yderligere funktionalitet implementeret i algoritmen for at bekræfte nøjagtigheden af det beregnede forskydningsfelt, selv i fravær af kendte belastningsværdier eller en sekundær måleteknik. Derfor er denne algoritme et meget nyttigt og tilpasningsdygtigt værktøj til nøjagtig måling af lokale 2D-vævsstammer i sener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Pennsylvania State University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Vævsforberedelse
- Til denne protokol høstes akillessenerne fra 2-4 måneder gamle C57BL/6-hanmus.
BEMÆRK: Forskellige sener eller ledbånd fra mus eller andre små dyr kan også bruges.- Lav et snit i huden overfladisk til akillessenen for at udsætte plantaris senen og det omgivende bindevæv. Fjern dem derefter ved hjælp af et kirurgisk blad.
- Adskil de udsatte soleus og gastrocnemius muskler fra bagbenet, og skrab dem forsigtigt af akillessenen med det kirurgiske blad
- Adskil calcaneus fra resten af foden med en skærehjulsfastgørelse på et roterende værktøj.
- Plet vævet i 1,5 ml af en 5 μg/ml opløsning af 5-(4,6-dichlortriazinyl) aminofluorescein (DTAF) og 0,1 M natriumbicarbonatbuffer i 20 minutter på en roterende mixer ved stuetemperatur. Denne opløsning pletter proteiner (fx ekstracellulær matrix) i vævet.
BEMÆRK: I løbet af denne periode på 20 minutter skal trin 1.3 fuldføres. - Forbered en 1:1.000 opløsning af DRAQ5 i fosfatbufret saltvand (PBS) for at plette kernerne. Brug en hvirvelblander til at homogenisere opløsningen.
- Efter inkubationsperioden på 20 minutter i trin 1.2 overføres vævet fra DTAF-opløsningen til DRAQ5-opløsningen, og det inkuberes i et mørkt rum i 10 minutter ved stuetemperatur.
2. Senbelastning og billedoptagelse
BEMÆRK: Denne protokol kræver en trækanordning, der kan monteres oven på et konfokalmikroskop. Til denne undersøgelse blev mikrotrækanordningen beskrevet af Peterson og Szczesny13 brugt.
- Placer senen i grebene på trækpåfyldningsanordningen. Før du monterer grebene i lasteenheden, skal du bruge digitale kalibre til at måle afstanden mellem calcaneus-fastgørelsen og det modsatte greb. Denne afstand er senemålerens længde.
- Alternativt kan du montere grebene i lastenheden, inden senen indsættes, og skubbe i kontakt for at definere nulforskydningsmotorens position. Motorernes forskydning efter indsættelse af senen kan give en potentielt mere nøjagtig greb-til-greb-målerlængde.
- Monter grebene i påfyldningsanordningen, som indeholder PBS for at opretholde vævets hydrering. Juster senen bedst muligt med enten x-aksen eller y-aksen på mikroskopbillederne, så algoritmens x-stamme- og y-stammeudgange svarer til seneakserne.
BEMÆRK: I denne undersøgelse var senerne justeret med x-aksen. Hvis det ikke er muligt at justere senen perfekt med billedakserne, kan algoritmens x-stamme- og y-belastningsoutput transformeres, så de flugter med senens længde-/vinkelrette akser ved hjælp af standardbelastningstransformationsligninger14. - Forspænd senen med 1 g spænding, og påfør om ønsket cyklisk belastning for at forkonditionere prøven. I denne protokol blev der ikke anvendt prækonditionering, da undersøgelsens mål var at validere de målte lokale vævsstammer snarere end at måle vævsmaterialets egenskaber. Hvis der er interesse for at måle makroskalamaterialeegenskaberne, som er afhængige af belastningshistorikken, anbefales forkonditionering. Efter forkonditionering og genvinding påføres en 1 g forspænding igen.
- Hvis det ønskes, fotobleges et sæt på fire linjer med en afstand på 80 μm fra hinanden i vævets midterste område (se Peterson og Szczesny13 for flere detaljer).
BEMÆRK: De fotoblegede linjer blev brugt til at validere målingerne af ALDIC-algoritmen og er ikke nødvendige for at udføre selve ALDIC. Linjernes antal og afstand kan justeres, og placeringen af linjerne skal vælges for at undgå artefakter i prøven, der ville mindske linjens klarhed. - Gentag fotoblegningsproceduren på venstre og højre ekstrem af vævet nær grebene.
- Brug det konfokale mikroskop til at erhverve volumetriske billeder (x, y: 1,25 μm / pixel, z: 2,5 μm / pixel) af DTAF og DRAQ5 fluorescens ved 1 g forspænding.
- Udfør en belastningsrampe ved 0,5% / s til 2% belastning. Bemærk, at belastningshastigheden og den trinvise belastningsstørrelse kan justeres.
- Lad vævet stresse, slappe af i 10 min.
BEMÆRK: Varigheden af spændingsafslapning skal vælges således, at prøven er under en omtrent kvasistatisk belastning under billedoptagelse. For at afgøre, om stressafslapningsvarigheden er acceptabel, bestemmes hældningen af krafttidskurven i det sidste minut af spændingslempelsen (supplerende figur 1), og denne hældning ganges med den samlede billeddannelsesvarighed. I denne undersøgelse ændrede den kraft, der blev anvendt ved den største belastningsforøgelse, aldrig med mere end 5%. - Tag et andet volumetrisk billede af vævet efter deformation.
- Gentag trin 2.7-2.9, indtil den ønskede endelige belastning er nået. I dette papir blev der valgt en endelig belastningsværdi på 12%.
3. Billedbehandling
- Brug ImageJ eller Fiji til at oprette maksimale z-projektioner af hvert volumetrisk billede af DRAQ5-kanalen (nuklear). Dette vil fungere som 2D-specklede billeder til ALDIC.
- Gem z-projektionerne med maksimal intensitet som .tiff filer, og navngiv dem i henhold til følgende navngivningskonvention.
- Brug et tal som det første tegn i billednavnet.
- Lad nummeret svare til den rækkefølge, som billederne vil blive overvejet i under stammeanalysen. For eksempel skal det første billede begynde med et, og det andet billede skal begynde med to. Forskellige tal kan vælges, men de skal sekventielt stige. Et eksempel på navngivningskonvention er som følger: "0_Experiment1_MaxZProjection".
- Gem alle de omdøbte z-projektioner med maksimal intensitet i en mappe.
4. Installation og anvendelse af fotobleget linjeanalysekode
BEMÆRK: Disse trin er kun nødvendige, hvis det ønskes at bekræfte nøjagtigheden af ALDIC-algoritmen ved hjælp af fotoblegede linjer. Koden beregner den lokale vævsstamme som den gennemsnitlige normaliserede ændring i afstanden mellem hver fotobleget linje inden for det fotoblegede linjesæt. I denne undersøgelse blev de gennemsnitlige lokale værdier derefter beregnet som gennemsnit på tværs af alle de fotoblegede linjesæt (dvs. i midten og venstre / højre ende) for at bestemme en enkelt gennemsnitlig lokal vævsstammeværdi for hver prøve. Denne værdi blev derefter brugt til at estimere nøjagtigheden af ALDIC-algoritmen.
- Download mappen "PBL-kode" fra GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc), og flyt alt indholdet til arbejdsmappen i MATLAB.
- Åbn MATLAB-scriptet "Micro_Mech_Template.m".
- Tryk på Kør, og vælg en af de billedfiler, der indeholder de volumetriske billeder. De volumetriske billeder kan være en af følgende filtyper: .lsm, .tiff, .nd2.
- Softwaren indlæser automatisk alle billederne i mappen og viser et projiceret billede af referencevolumetrisk billede. Når du bliver bedt om det, skal du venstreklikke for at oprette flerpunktslinjer, der sporer venstre og højre ende af eksemplet. Højreklik for at afslutte en linje. Når inputtet er behandlet, skal du trykke på OK , hvis kanterne er korrekte, for at acceptere resultatet.
- Tegn en tilfældig diagonal linje hen over prøven som referencelinje, når du bliver bedt om det.
- Indtast antallet af fotoblegede linjer, der oprettes, og spor de fotoblegede linjer med flerpunktslinjer.
- Hvis resultatet er acceptabelt, skal du acceptere det. Hvis resultatet er fejlagtigt, skal du justere det og behandle igen.
- Gentag trin 4.2 for alle billederne, og flyt alle billederne af sporede linjer til en enkelt mappe.
- Åbn scriptet "Micro_Mech_Strain.m".
- Tryk på Kør for at udføre koden, og vælg et af de gemte billeder, hvor de fotoblegede linjer spores.
- Bekræft, at de valgte ledsagende billeder er korrekte, når billedet er valgt, ved at trykke på OK.
5. Oprettelse af digitalt transformerede billeder
BEMÆRK: Disse trin er kun nødvendige, hvis det ønskes at bekræfte nøjagtigheden af ALDIC-algoritmen ved hjælp af digitalt transformerede billeder. Disse billeder simulerer homogene 2D-stammefelter af en kendt størrelse ved kunstigt at transformere referencebilledet.
- Download koden "Digital_strain.m" fra GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc).
- Åbn og kør koden.
- Når du bliver bedt om det, skal du indsætte de ønskede værdier for den maksimale anvendte stamme, den anvendte belastningsforøgelse og Poissons forhold. Tryk på OK.
BEMÆRK: Til dette eksperiment var den maksimale påførte belastning 0,1 (10%), den påførte belastningsforøgelse var 0,02 (2%), og et Poissons forhold på 1 blev anvendt, hvilket er i overensstemmelse med eksperimentelle data for senetræktest15,16. Koden bruger den integrerede MATLAB-funktion imwarp og inputværdierne (f.eks. strain increments, Poissons ratio) til at skabe de digitalt transformerede billeder. - Når du bliver bedt om det, skal du vælge det ikke-deformerede referencebillede.
- For hvert belastningstrin vises en overlejring af referencebilledet og det transformerede billede. Det transformerede billede gemmes i mappen under titlen "DigitallyTransformedX%Strain", hvor X er stammeforøgelsen.
6. Installation og anvendelse af belastningsberegning og valideringskode
- Download mappen "Strain Calculation and Validation Code" fra GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc), og flyt alt indholdet til MATLAB-arbejdsmappen
- Installer en mex C / C ++ compiler i henhold til Yang og Bhattacharya12. Trinene er opsummeret nedenfor.
- Kontroller MATLAB for at se, om der er installeret en mex C/C++-compiler ved at skrive "mex -setup" i MATLAB-kommandovinduet og trykke på Enter.
- Hvis der vises en fejl, der angiver, at en compiler ikke understøttes eller findes, skal du fortsætte til trin 6.3 og trin 6.4.
- Hvis der ikke er nogen fejl, skal du fortsætte til trin 6.5
- For at downloade en mex C / C ++ compiler skal du gå til "https: / tdm-gcc.tdragon.net/" og vælge TDM-gcc-compileren.
- Installer den downloadede compiler på en kendt placering.
- Gå tilbage til MATLAB-kommandovinduet, og skriv: "setenv("MW_MINGW64_LOC","[Skriv din installationssti her]")". Det kan f.eks. være "setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")". Hvis denne kommando udføres korrekt, er mex-kompilatoren korrekt installeret.
- Indtast funktionsscriptet "main_aldic.m", og skift linje 22 for at matche den kommando, der blev udført i trin 6.5.
- Åbn scriptet "Strain_calc_and_validate.m".
- Tryk på Kør for at starte billedanalysen.
- Når du bliver bedt om det, skal du ændre værdierne for ALDIC-parametrene efter behov.
BEMÆRK: Vinduesstørrelsen skal være 0,25 til 1 gange delmængdestørrelsen. Du kan finde flere oplysninger om parametervalgene i onlinebrugervejledningen: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
_Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).- Følgende værdier blev anvendt i denne undersøgelse:
Delmængde størrelse (pixels): 20
Vinduesstørrelse (pixels): 10
Metode til løsning af ALDIC: Endelig forskel (1)
Parallel computing blev ikke brugt (1)
Metode til beregning af første gæt: Multigrid-søgning baseret på billedpyramide (0)
- Følgende værdier blev anvendt i denne undersøgelse:
- Når du bliver bedt om det, skal du markere afkrydsningsfeltet "Ja" for at få algoritmen til automatisk at gemme middelværdien, standardafvigelsen og 2D-kortene for den ønskede samling af variabler (f.eks. x-stamme, y-stamme, forskydningsstamme, dårlige regioner osv.). Vælg, hvilke variabler der skal gemmes, og tryk på OK.
- Når du bliver bedt om det, skal du ændre parametrene som ønsket.
- Følgende værdier blev brugt i dette eksperiment:
Omgivende punkter til beregning af belastning (numP): 12
Korrelationskoefficient for identifikation af dårlig region (corr_threshold): 0,5
Subregion størrelse (pixels) til dårlig region analyse (Subsize): 32
- Følgende værdier blev brugt i dette eksperiment:
- Når du bliver bedt om det, skal du vælge den mappe, der indeholder de omdøbte z-projektioner med maksimal intensitet. Bemærk, at softwaren automatisk udfører trinvis ALDIC for at bestemme belastningsfelterne for de deformerede billeder. Det vil sige, at hvert deformeret billede fungerer som det nye "reference" -billede til det næste deformerede billede. Dette forbedrer nøjagtigheden af resultaterne (supplerende figur 2) sammenlignet med udførelse af kumulativ ALDIC, hvor hvert deformeret billede sammenlignes tilbage med det originale referencebillede (0% belastning). For at udføre en kumulativ analyse skal du indlæse billederne, men kun vælge det originale referencebillede og det deformerede billede af interesse.
BEMÆRK: Den normale belastning beregnes som λ - 1, hvor λ er vævsstrækningen. Vævsstrækningen beregnes i henhold til
, hvor N = [1 0]T eller [0 1]T for henholdsvis x-retningen og y-retningen og C = F T F, hvor F er deformationsgradienten beregnet ved hjælp af "numP"-punkter omkring hvert datapunkt, der udsendes af ALDIC-algoritmen. Forskydningsbelastningen beregnes som 
, hvor 
. - Når du bliver bedt om det, skal du venstreklikke for at oprette en firepunktspolygon for at definere interesseområdet for måling af stammerne. Begynd med punktet i øverste venstre hjørne, og tildel de efterfølgende punkter med uret.
BEMÆRK: Variablen "Lager", der er gemt i MATLAB-arbejdsområdet, indeholder alle værdierne for den gennemsnitlige x-stamme, x-stammestandardafvigelse, den gennemsnitlige y-stamme, y-stammestandardafvigelsen, den gennemsnitlige forskydningsstamme, forskydningsbelastningens standardafvigelse og procentdelen af dårlige områder. De dårlige regioner defineres i henhold til korrelationskoefficientanalysen inden for det interesseområde, der er valgt i trin 6.13. Mappen "NuclearTrackingResults" (som kan omdøbes ved at justere linjerne 555 og 556) gemmer alle de plot, der er angivet i trin 6.10. Denne mappe indeholder også en regnearksfil med navnet "Resultater", som gemmer alle de midler og standardafvigelser, der er angivet i trin 6.10.
, hvor N = [1 0]T eller [0 1]T for henholdsvis x-retningen og y-retningen og C = F T F, hvor F er deformationsgradienten beregnet ved hjælp af "numP"-punkter omkring hvert datapunkt, der udsendes af ALDIC-algoritmen. Forskydningsbelastningen beregnes som 
, hvor 
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før analysen af stammefelterne i egentlige vævsprøver blev ALDIC-protokollen først valideret ved hjælp af digitalt anstrengte/transformerede billeder af kerner i museakillessener. Specifikt blev billederne transformeret til digitalt at producere ensartede stammer i x-retningen på 2%, 4%, 6%, 8% og 10% belastning med et simuleret Poissons forhold på 115,16. ALDIC-algoritmens nøjagtighed blev derefter vurderet ved at sammenligne de gennemsnitlige beregnede stammeværdier med de kendte digitale stammer. Derudover blev stammens standardafvigelse vurderet for at bestemme stammefeltets heterogenitet. Forskellen mellem de stammer, der beregnes af ALDIC (ved hjælp af trinanalyse), og de faktiske stammer, der anvendes på de digitalt transformerede billeder, er vist i figur 1. Den gennemsnitlige belastning i x-retningen beregnet af ALDIC-softwaren var konsekvent en undervurdering af den sande anvendte belastning (figur 1A), og fejlens størrelse steg med større anvendt belastning. Størrelsen var dog altid mindre end 0,00015 for alle belastningsstigningerne. Der var også en lille undervurdering af belastningen i y-retningen (figur 1C). Standardafvigelsen for de beregnede stammer inden for det fulde interesseområde for x-stammen og y-stammen steg også med større anvendte stammer, men størrelsen var også meget lille (<0,002) (figur 1B, D). Disse fejl var væsentligt større ved anvendelse af kumulativ analyse (supplerende figur 2).
Figur 1: Algoritmesammenligning og validering med digitalt anstrengte billeder . (A) De målte ALDIC-belastningsdata i x-retningen var konsekvent lavere end den faktiske belastning, der foreskrives af de digitale transformationer, og fejlen steg gradvist med større anvendt belastning. (B) Standardafvigelsen for belastningsværdierne i x-retningen steg også med flere anvendte digitale stammer. C) De målte ALDIC-stammedata i y-retningen var konsekvent lavere end den faktiske belastning, der foreskrives af de digitale transformationer. D) Standardafvigelsen for belastningsværdierne i y-retningen steg med større påført belastning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Ved udførelse af stammeanalyse på faktiske vævsprøver er det ikke muligt direkte at vurdere nøjagtigheden af ALDIC-algoritmen. Alligevel blev der udviklet en teknik til at estimere nøjagtigheden af forskydningsfeltet. Specifikt blev det deformerede billede forvrænget tilbage til en forudsigelse af referencebilledet baseret på det beregnede forskydningsfelt. En normaliseret krydskorrelationskoefficient blev derefter brugt til at bestemme, hvor godt det skæve/rekonstruerede referencebillede matchede det sande referencebillede. Alle underområder (32 pixel x 32 pixel), hvor den normaliserede krydskorrelationsværdi var mindre end 0,5, blev betragtet som et "dårligt område", hvor forskydningsfeltet sandsynligvis var unøjagtig. Denne analyse identificerede, at der var en signifikant forskel mellem resultaterne af de inkrementelle og kumulative analyseteknikker. Specifikt begyndte antallet af dårlige regioner at stige med den kumulative metode efter den anvendte stamme på 6% (figur 2A), mens meget få (1%) dårlige regioner blev observeret i nogen af de digitalt transformerede regioner til den inkrementelle analyse. Ved anvendelse af denne nøjagtighedsvurderingsteknik på de fire museakillessener, der blev testet (supplerende figur 3), blev det fastslået, at for tre prøver var det gennemsnitlige antal dårlige regioner mindre end 25% af billedet. I en af de fire stikprøver (eksperiment 2) blev næsten halvdelen af billedet imidlertid identificeret som dårligt ved den maksimale belastningsforøgelse (figur 2B). Antallet af dårlige regioner, der var til stede i eksperiment 2, varierede fra gennemsnittet af de tre andre prøver med over fire standardafvigelser. Dette gjorde det muligt at fastslå, at ALDIC-dataene fra eksperiment 2 repræsenterede en outlier, og disse data blev derfor elimineret fra den videre analyse af resultaterne.
Figur 2: Vellykket identifikation af områder med ugyldige belastningsberegninger ved analyse af dårlig region. (A) Mængden af dårlige regioner i de digitalt transformerede billeder, der blev analyseret ved hjælp af den kumulative metode, steg konsekvent efter 6% anvendt belastning, mens den inkrementelle mængde forblev på 1%. (B) Mængden af dårlige områder for alle seneprøverne steg støt ved større belastningsforøgelser. Eksperiment 2 blev betragtet som en outlier og er derfor ikke inkluderet i middel- og standardafvigelsesbjælkerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Derudover blev de lokale trækstammer i de testede museakillessener målt ved hjælp af fotoblegede linjer (PBL'er) som en anden metode til bestemmelse af nøjagtigheden af ALDIC-algoritmen. De x-retningsstammer, der blev beregnet af ALDIC, havde tendens til at være større end dem, der blev bestemt ud fra PBL'erne, men forskellen var generelt inden for 0,005-stammen (figur 3A). Denne fejlstørrelse svarede til den standardafvigelse, der blev observeret på tværs af de forskellige PBL'er i en given prøve (figur 3B).
Figur 3: Validering af ALDIC-belastningsberegningerne ved sammenligning med fotoblegede linjedata . (A) Forskellen mellem ALDIC-stammeværdierne og PBL-stammeværdierne forblev relativt konstant for alle belastningsstigningerne, omkring en værdi på 0,005. (B) Standardafvigelsen for PBL-dataene som gennemsnit for alle prøverne forblev forholdsvis konstant på ca. 0,005. Klik her for at se en større version af denne figur.
Efter vurdering af nøjagtigheden af ALDIC-algoritmen blev størrelsen og rumlige fordelinger af de lokale stammer i musens akillessener under trækbelastning bestemt (figur 4, figur 5 og figur 6). Bemærk, at stammerne ikke inkluderer forskydningsdata fra de "dårlige regioner" inden for hver prøve. X-retnings trækstammerne var konsistente på tværs af alle tre prøver og var væsentligt lavere end de påførte vævsstammer (figur 4A). Derudover var x-retningsstammen relativt heterogen, da standardafvigelsen over 2D-billedet altid var større end den gennemsnitlige belastningsværdi. I modsætning hertil var der signifikant inkonsekvens mellem de tre prøver for y-retningsstammerne, idet en prøve udviste positive middelværdier, en prøve udviste negative middelværdier og en prøve udviste nul belastning i y-retningen (figur 4B). Derudover var standardafvigelsen for y-retningsstammerne i en given prøve større end standardafvigelsen for x-retningsstammerne. Endelig var forskydningsbelastningen relativt lav på tværs af alle belastningsstigningerne (figur 4C).
Figur 4: Mikroskalastammer af musens akillessener . (A) Den gennemsnitlige stamme i x-retningen forblev under den påførte vævsstamme, men steg med hver stammeforøgelse. (B) Den gennemsnitlige belastning i y-retningen var ca. nul for alle trin, men standardafvigelsen var høj. (C) Den gennemsnitlige forskydningsbelastning steg støt gennem belastningsforøgelserne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Rumlig fordeling af x-stammer, y-stammer og forskydningsstammer. Repræsentative kort over (A) x-stammer, (B) y-stammer og (C) forskydningsstammer i hele seneområdet af interesse Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Rumlige fordelinger af største hovedstol, mindste hovedstol og maksimale forskydningsstammer. Repræsentative kort over (A) maksimale hovedstammer, (B) mindste hovedstammer og (C) maksimale forskydningsstammer i hele det pågældende seneområde. De hvide linjer angiver retningen for de største og minimale hovedspændinger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Identifikation af kvasistatisk tilstand under billeddannelse. Hældningen af krafttidskurven i det sidste minut af stressafslapningsperioden (rød linje) kan bruges til at tilnærme den samlede ændring i kraft under billeddannelse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Sammenligning af inkrementelle og kumulative analyseteknikker. (A) Forskellen mellem de målte og faktiske x-retningsstammer i de digitalt transformerede billeder var signifikant større med den kumulative metode sammenlignet med den inkrementelle metode over 4% belastning. (B) Standardafvigelsen for x-stammeværdier var også signifikant større med den kumulative metode over 4% stamme. (C) Forskellen mellem de målte og faktiske y-stammer i de digitalt transformerede billeder var væsentligt større, da den kumulative metode var over 8 % belastning. D) Standardafvigelsen for y-stammeværdierne var signifikant større med den kumulative metode over 4 % stamme. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Dårlig regionvisualisering og kvantificering for hvert eksperiment. Dårlige regioner blev defineret som lokale områder inden for det rekonstruerede referencebillede, der ikke matchede (under korrelationskoefficienten på 0,5) det samme område af det faktiske referencebillede. Hver dårlig region, der er identificeret inden for en region af interesse (skitseret med hvidt), er markeret med en blå boks. Procentdelen af dårlige regioner inden for interesseområdet er angivet over hvert billede i parentes. Bemærk, at disse billeder er rekonstrueret ud fra det deformerede billede ved 12% anvendt belastning. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med dette papir var at levere en open source, valideret metode til måling af 2D-belastningsfelterne i sener under trækbelastning. Grundlaget for softwaren var baseret på en offentligt tilgængelig ALDIC-algoritme12. Denne algoritme blev indlejret i en større MATLAB-kode med den tilføjede funktionalitet af trinvis (versus kumulativ) stammeanalyse. Denne tilpassede algoritme blev derefter anvendt til trækprøvning af sener, og dens nøjagtighed blev vurderet ved hjælp af to forskellige teknikker (dvs. digitalt transformerede billeder og belastningsmåling ved hjælp af fotoblegede linjer). Derudover blev der tilføjet en evne til at vurdere nøjagtigheden af ALDIC-målingerne på enhver prøve uden at kræve kendskab til de sande belastningsværdier.
Analysen af de digitalt transformerede billeder viste, at algoritmen præcist kunne måle stammer op til 10% med meget få fejl, hvilket ikke kunne vurderes ud fra trækprøvningen af faktiske museakillessener på grund af de lave størrelser af stammerne i seneprøverne. Ikke desto mindre viste en sammenligning af de stammer, som ALDIC beregnede i museakillessener, med de stammer, der blev målt ved hjælp af fotoblegede linjer, at fejlen i ALDIC-teknikken lå inden for målevariationen af selve de fotoblegede linjer. Som en endelig validering blev nøjagtigheden af de fulde 2D-forskydningsfelter beregnet af ALDIC-algoritmen vurderet ved at rekonstruere referencebilledet fra det deformerede billede og sammenligne rekonstruktionen med det faktiske referencebillede. I de digitalt transformerede billeder var der en stigning i antallet af dårlige regioner og belastningsfejl med større anvendte stammer, især for den kumulative ALDIC-analyse (figur 2 og supplerende figur 2). Dette var forventet, da den inkrementelle teknik omdefinerer referencebilledet med hvert mellemliggende billede for at minimere forskydningsforskellene mellem billedpar. Antallet af dårlige regioner var endnu højere i de faktiske seneprøver, da strukturen og belastningen af senevævet ikke var homogen (i modsætning til de digitalt transformerede billeder). Alligevel var det i gennemsnit kun ca. 15% af det rekonstruerede billede, der ikke matchede det faktiske referencebillede. En stikprøve (eksperiment 2) havde imidlertid et stort antal fejlagtige regioner (~45%). Selvom det er uklart, hvorfor denne prøve ikke kunne behandles korrekt, var denne analyse af det rekonstruerede referencebillede værdifuld, fordi den muliggjorde erkendelsen af, at dataene fra denne prøve ikke var pålidelige. Alt i alt viser disse eksperimenter, at denne open source-algoritme med sikkerhed kan bruges til nøjagtigt at måle vævsstammer inden for seneeksplanter.
Disse eksperimenter gav også værdifuld information om den mekaniske opførsel af musens akillessener. Specifikt ved en påført vævsstamme på 12% var den gennemsnitlige langsgående (x-retning) stamme i vævsprøven kun 2%. En del af denne belastningsdæmpning skyldtes det faktum, at makroskalavævsstammerne blev beregnet ud fra ændringer i vævets greb-til-greb-længde, hvilket sandsynligvis omfattede signifikante belastningskoncentrationer ved grebsgrænsefladen i det myotendinøse kryds. Alligevel er dette i overensstemmelse med andre undersøgelser af mikroskalastammer i sener10,17,18. Desuden svarede 12% stammen til ca. 5 MPa belastning, hvilket sandsynligvis kan sammenlignes med de maksimale fysiologiske belastninger in vivo19. Dette tyder på, at celler i musens akillessener ikke oplever trækstammer over 2%. Den tværgående (y-retning) stamme var mere variabel på tværs af prøver, med både positive og negative værdier. Dette tyder på, at seneprøverne udviste positive og negative Poissons forhold, hvilket er i overensstemmelse med tidligere test af akillessener20. Som forventet for uniaxial spænding var størrelsen af forskydningsstammen generelt lav (<4° i gennemsnit). For alle træk- og forskydningsstammerne var standardafvigelsen på tværs af det pågældende område imidlertid altid større end den gennemsnitlige belastningsværdi, hvilket viser, at der var en høj grad af belastningsheterogenitet. Desuden steg denne heterogenitet med større anvendte stammer, sandsynligvis på grund af vævsstrukturens heterogenitet samt den øgede fejl inden for ALDIC-beregningerne som følge af de større forskydninger og forskydningsfelter. Dette tyder på, at de stammer, der opleves af individuelle seneceller, er meget variable i vævet.
På trods af den vellykkede validering af ALDIC-algoritmen er der nogle begrænsninger i dens anvendelse til analyse af stammer inden for seneeksplanter. Den primære begrænsning er, at algoritmen kun kan udføre en 2D-analyse af et 3D-objekt. En strengere tilgang ville være at udføre en fuld digital volumenkorrelation (DVC), som er blevet udført på digitalt transformerede billeder af sener11. Dette er dog generelt vanskeligt at udføre på egentlige seneprøver, da billederne indeholder opløselige kerner til en dybde på kun 100 μm. Dette betyder, at prøvernes indvendige volumen ikke har nogen tekstur inden for de volumetriske billeder, hvilket gør DVC upålidelig. Derfor blev billederne i denne undersøgelse kollapset til 2D maksimale fremskrivninger, hvilket kunstigt tvinger alle kernerne ind i et enkelt billedplan. Selvom dette kan give nogle fejl i belastningsanalysen og forhindre måling af forskydninger uden for plan, tyder valideringsresultaterne på, at teknikken stadig er nøjagtig. En yderligere begrænsning er, at stammerne blev beregnet ved afslutningen af en stresslempelsesperiode og ikke kunne beregnes under dynamisk cyklisk belastning. Dette problem var uundgåeligt, da der var en begrænset billedbehandlingstid til at erhverve de volumetriske billeder, der blev brugt til stammeanalysen. På trods af disse begrænsninger var analysens succes relativt robust, da tre ud af de fire seneprøver gav nøjagtige stammedata. Derfor vil denne algoritme være et nyttigt værktøj for forskere, der er interesserede i at måle belastningsfelter inden for seneeksplanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (R21 AR079095) og National Science Foundation (2142627).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-DTAF (5-(4,6-Dichlorotriazinyl) Aminofluorescein), single isomer | ThermoFisher | D16 | |
| Calipers | Mitutoyo | 500-196-30 | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R HD | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Coning | 6775 | |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher | 62554 | |
| MATLAB | MathWorks | R2022b | |
| Tensile Loading Device | N/A | N/A | Tensile loading device described in Peterson et al, 2020. (ref 13) |
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher | 88881001 |
References
- Devkota, A. C. Distributing a fixed amount of cyclic loading to tendon explants over longer periods induces greater cellular and mechanical responses. Journal of Orthopaedic Research. 11 (4), 1609-1612 (2007).
- Sun, H. B., et al. Cycle-dependent matrix remodeling gene expression response in fatigue-loaded rat patellar tendons. Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1380-1386 (2010).
- Shepherd, J. H., Screen, H. R. C.
- Paschall, L., Pedaprolu, K., Carrozzi, S., Dhawan, A., Szczesny, S. Mechanical stimulation as both the cause and the cure of tendon and ligament injuries. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , Springer. Cham, Switzerland. 359-386 (2022).
- Andarawis-Puri, N., Ricchetti, E. T., Soslowsky, L. J. Rotator cuff tendon strain correlates with tear propagation. Journal of Biomechanics. 42 (2), 158-163 (2009).
- Cheng, V. W. T., Screen, H. R. C.
- Luyckx, T., et al. Digital image correlation as a tool for three-dimensional strain analysis in human tendon tissue. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 7 (2014).
- Duncan, N. A., Bruehlmann, S. B., Hunter, C. J., Shao, X., Kelly, E. J. In situ cell-matrix mechanics in tendon fascicles and seeded collagen gels: Implications for the multiscale design of biomaterials. Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering. 17 (1), 39-47 (2014).
- Arnoczky, S. P., Lavagnino, M., Whallon, J. H., Hoonjan, A. In situ cell nucleus deformation in tendons under tensile load; A morphological analysis using confocal laser microscopy. Journal of Orthopaedic Research. 20 (1), 29-35 (2002).
- Screen, H. R. C., Bader, D. L., Lee, D. A., Shelton, J. C.
- Fung, A. K., Paredes, J. J., Andarawis-Puri, N. Novel image analysis methods for quantification of in situ 3-D tendon cell and matrix strain. Journal of Biomechanics. 67, 184-189 (2018).
- Yang, J., Bhattacharya, K. Augmented Lagrangian digital image correlation. Experimental Mechanics. 59 (2), 187-205 (2019).
- Peterson, B. E., Szczesny, S. E. Dependence of tendon multiscale mechanics on sample gauge length is consistent with discontinuous collagen fibrils. Acta Biomaterialia. 117, 302-309 (2020).
- Humphrey, J. D., O'Rourke, S. L. An Introduction to Biomechanics. , Springer. New York, NY. (2015).
- Reese, S. P., Weiss, J. A. Tendon fascicles exhibit a linear correlation between Poisson's ratio and force during uniaxial stress relaxation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (3), 34501 (2013).
- Ahmadzadeh, H., Freedman, B. R., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J., Shenoy, V. B. Micromechanical poroelastic finite element and shear-lag models of tendon predict large strain dependent Poisson's ratios and fluid expulsion under tensile loading. Acta Biomaterialia. 22, 83-91 (2015).
- Szczesny, S. E., Elliott, D. M. Interfibrillar shear stress is the loading mechanism of collagen fibrils in tendon. Acta Biomaterialia. 10 (6), 2582-2590 (2014).
- Han, W. M., et al. Macro- to microscale strain transfer in fibrous tissues is heterogeneous and tissue-specific. Biophysical Journal. 105 (3), 807-817 (2013).
- Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A novel, open-source, low-cost bioreactor for load-controlled cyclic loading of tendon explants. Journal of Biomechanical Engineering. 144 (8), 084505 (2022).
- Gatt, R., et al. Negative Poisson's ratios in tendons: An unexpected mechanical response. Acta Biomaterialia. 24, 201-208 (2015).
