Summary
在这里，我们描述了用于表征各种细胞类型的细胞表面蛋白质组的蛋白质组的蛋白质组学工作流程。该工作流程包括细胞表面蛋白富集、后续样品制备、使用 LC-MS/MS 平台进行分析以及使用专用软件进行数据处理。
Abstract
在过去的十年中，基于质谱的蛋白质组学能够在广泛的应用中对生物系统进行深入表征。人类疾病中的细胞表面蛋白质组（“表面组”）具有重要意义，因为质膜蛋白是大多数临床批准的治疗方法的主要靶标，也是诊断区分患病细胞和健康组织的关键特征。然而，细胞膜和表面蛋白的集中表征仍然具有挑战性，主要是由于细胞裂解物的复杂性，其被其他高丰度蛋白掩盖了感兴趣的蛋白质。为了克服这一技术障碍并使用质谱蛋白质组学准确定义各种细胞类型的细胞表面蛋白质组，有必要在质谱仪上分析之前富集细胞表面蛋白的细胞裂解物。本文介绍了从癌细胞标记细胞表面蛋白、将这些蛋白质富集出细胞裂解物以及随后用于质谱分析的样品制备的详细工作流程。
Introduction
蛋白质是执行大多数细胞功能的基本单位。表征相关蛋白质的结构和功能是了解生物过程的重要步骤。在过去的十年中，质谱技术、分析软件和数据库的进步使得能够在蛋白质组范围内准确检测和测量蛋白质1。基于质谱的蛋白质组学可用于多种应用，从生化途径的基础科学分析，到在转化环境中识别新药靶点，再到临床疾病的诊断和监测2。在筛选新型药物靶点时，细胞表面蛋白质组的表征尤为重要，目前批准的人类药物中有65%以上靶向细胞表面蛋白3。癌症免疫治疗领域也完全依靠癌症特异性细胞表面抗原来靶向并特异性消除肿瘤细胞4。因此，基于质谱的蛋白质组学可以作为识别新的细胞表面蛋白以进行治疗干预的有前途的工具。
然而，当利用传统的蛋白质组学方法研究肿瘤细胞的新型细胞表面蛋白靶标时，存在一些局限性。主要问题是表面蛋白占细胞中总蛋白质分子的很小一部分。因此，在对全细胞裂解物进行质谱分析时，这些蛋白质的片段被高丰度的细胞内蛋白质掩盖5。这种限制使得使用传统的蛋白质组学工作流程准确表征细胞表面蛋白质组变得具有挑战性。为了应对这一挑战，有必要在质谱仪上进行分析之前，开发从全细胞裂解物中富集细胞表面蛋白的方法。其中一种方法涉及完整细胞中糖基化细胞表面蛋白的氧化和生物素标记，随后通过中性粒细胞素下拉从裂解物中富集这些生物素化蛋白质，这一过程被称为“细胞表面捕获”6。由于~85%的哺乳动物细胞表面蛋白被认为是糖基化的7，因此这是从整个细胞裂解物中富集细胞表面蛋白质组的有效方法。本文描述了一个完整的工作流程，从培养细胞开始，细胞表面生物素标记，以及随后用于质谱分析的样品制备（图1）。通过多次重复，该方法提供了对特定样品的细胞表面蛋白质组的可靠覆盖。利用该方法表征肿瘤和健康细胞的细胞表面蛋白质组可以促进发现新的细胞表面抗原，以确定潜在的免疫治疗靶点8。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意：AMO1浆细胞瘤细胞用于该细胞表面蛋白质组实验。相同的方案也可用于其他细胞类型，包括各种悬浮和贴壁细胞系9，以及各种类型的原样10。然而，细胞数量（实验的起始材料）通常必须优化以达到等效的蛋白质组覆盖率。有关材料和设备的详细信息，请参阅 材料表。缓冲液和试剂溶液及其组成详见 表1。
1. 用生物素标记细胞表面
- 通过离心（在500×g，24°C下5分钟）计数培养的细胞并沉淀约3.5×107活细胞。
注意：AMO1浆细胞瘤细胞在收获前每3天用新鲜培养基传代一次。 - 吸出上清液并通过加入 1 mL 冷 （4 °C） Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （D-PBS）（无钙，无镁）并轻轻上下移液来重悬沉淀。
- 再次沉淀细胞（如步骤1.1）并再次重复洗涤步骤（步骤1.2）（总共两次洗涤）。
- 第二次洗涤后，沉淀细胞（如步骤1.1所示），并通过轻轻移液将其重悬于990μL冷D-PBS中。
- 事先准备160mM偏高碘酸钠（NaIO4）的储备溶液。分成 50 μL 等分试样，在 -20 °C 下储存长达 6 个月。在步骤1.4中向细胞悬液中加入10μL的160mM偏高碘酸钠溶液，充分混合，并在4°C下在端到端转子上孵育20分钟。
- 孵育完成后，沉淀细胞（如步骤1.1所示），倒出上清液，并重悬于1mL冷D-PBS中。重复此洗涤步骤两次（总共三次洗涤）。第三次洗涤后，将细胞重悬于 989 μL D-PBS 中。
- 事先准备100mM生物细胞素酰肼的储备溶液。分成50μL等分试样，并在-20°C下储存长达6个月。在步骤1.6中向细胞悬液中加入1μL苯胺和10μL100mM生物胞素酰肼，充分混合，并在4°C下在端到端转子上孵育60分钟。
- 孵育完成后，沉淀细胞（如步骤1.1所示），倒出上清液，并重悬于1mL冷D-PBS中。重复此洗涤步骤两次（总共三次洗涤）。
- 第三次洗涤后，用移液管小心吸出上清液，并将管置于液体N2中快速冷冻细胞沉淀。将冷冻沉淀置于-80°C，直到准备好进行裂解和下拉。
2. 细胞裂解和生物素下拉
- 将冷冻细胞沉淀在冰上解冻。
- 向沉淀中加入 500 μL 2x 裂解缓冲液，充分混合，涡旋 30 秒。
注意：可能需要剧烈移液和涡旋才能完全裂解沉淀。一些不溶性碎片（即DNA）是可以接受的，因为它在随后的超声处理步骤中被去除。 - 在冰上超声处理细胞裂解物（三次爆发，每次20秒，60%占空比）。
- 离心裂解物以沉淀任何剩余的碎片（在4°C下以17，200× g 下10分钟）。
- 在裂解物离心时，向过滤柱中加入 100 μL 中性粒蛋白琼脂糖树脂珠。将色谱柱连接到真空歧管上，施加温和的真空，并通过将 3 mL 洗涤缓冲液 1 流过珠子来洗涤珠子。
- 从真空歧管中取出过滤柱，盖上底部，然后将澄清的细胞裂解物加入带有珠子的柱中。盖上柱子的顶部，并将裂解物与珠子在4°C下在端到端转子上孵育120分钟。
注意：盖上色谱柱顶部时，请牢固地将底盖固定到位，否则可能会脱落，并且在孵育过程中细胞裂解物可能会泄漏。 - 制备洗涤缓冲液 1、2 和 3（每个样品每个洗涤缓冲液约 5 mL，参见 表 1），并将它们置于 42 °C 水浴中
- 裂解液孵育完成后，将过滤柱放回真空歧管上，施加温和的真空，并通过将 5 mL 洗涤缓冲液 1 流过珠子来洗涤珠子。
注意：可以使用超过 5 mL 的洗涤缓冲液进行洗涤;额外的洗涤可能会减少背景，非特异性结合到珠子上。 - 用 5 mL 洗涤缓冲液 2 重复洗涤步骤。
- 用 5 mL 洗涤缓冲液 3 重复洗涤步骤。
- 一旦最终洗涤缓冲液完全流过珠子，从歧管中取出色谱柱。向磁珠中加入 100 μL “裂解”溶液，并用移液管将其转移到 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。短暂旋转试管以沉淀珠子，并在不干扰沉淀珠子的情况下去除 50 μL 溶液。
注意：此步骤和所有后续步骤中的试剂均使用市售蛋白质组学样品制备试剂盒。该试剂盒提供优化、简化的样品制备工作流程。然而，这些步骤也可以独立于试剂盒执行，使用Verma等人9中所述的传统蛋白质组学工作流程。如果珠子仍然粘在柱子的侧面或底部，让已转移到管中的珠子沉降，并在管中使用额外的“裂解”溶液转移剩余的珠子。 - 将管子放在65°C的加热块/振动台上，并以1，000rpm摇动10分钟。
注意：此步骤对于消化前半胱氨酸残基的还原和烷基化是必需的。
3. 蛋白质消化
- 通过加入210μL“重悬”溶液重悬干燥胰蛋白酶（试剂盒中的“消化”管，储存在-20°C）。上下移液几次，以确保所有干燥的胰蛋白酶都重新悬浮。
- 孵育完成后，向磁珠中加入 50 μL 重悬的胰蛋白酶溶液。将管在37°C孵育，以500rpm振荡至少90分钟以消化蛋白质。
- 消化完成后，将含有珠子的溶液转移到离心柱中，并将柱插入 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。在室温[RT]下旋转管（500× g5 分钟）以将消化的肽溶液与珠子分离。
注意：在此阶段，一旦珠子与肽溶液分离，就可以对珠子进行PNGase处理，以从链霉亲和素珠中洗脱生物素化的肽片段。然后，该肽样品可以作为单独的二级肽样品在工作流程的其余部分进行，可以进行分析并与珠上胰蛋白酶消化的主要样品进行比较。PNGase方法可能为珠上胰蛋白酶消化提供补充数据，因为基于MS可检测侧链修饰12捕获的N-糖基化天冬酰胺具有额外的特异性。然而，这种顺序洗脱方法的缺点是每次样品分析需要两倍的质谱仪仪器时间。 - 加入 100 μL “停止”溶液以停止消化反应并使肽溶液酸化。
4. 肽脱盐
- 使用管适配器，将脱盐柱置于 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。将整个酸化肽溶液加入色谱柱中。旋转色谱柱（3，800 × g 3分钟），使溶液流过色谱柱。肽现在与色谱柱结合;丢弃流出。
- 向色谱柱中加入 200 μL “Wash 1”溶液并离心（3，800 × g 3 分钟，室温）。丢弃流出物。
- 向色谱柱中加入 200 μL “Wash 2”溶液并离心（3，800 × g 3 分钟，室温）。丢弃流出物。
- 将色谱柱转移到新的标记 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。向色谱柱中加入 100 μL “洗脱”溶液并离心（3，800 × g 3 分钟，室温）。向色谱柱中再加入 100 μL “洗脱”溶液并旋转（3，800 × g 3 分钟，室温）。肽现在从色谱柱上洗脱到管中。
- 将肽溶液放入真空离心机中，使其干燥过夜。将干燥的肽置于-80°C直至准备好定量，并在质谱仪上进行分析。
5. 肽重悬和定量
- 将干燥的肽重悬于 20 μL 溶剂 A（0.1% 甲酸，2% 乙腈）中。
- 离心重悬的肽（17，200× g10 分钟）以沉淀任何不溶性碎片。
- 制备用于比色肽定量测定的肽标准品。
- 将 5 μL 1，000 mg/mL 肽储备溶液置于 96 孔板的一个孔中。
- 用去离子（DI）水在板中进行七步连续稀释，如下所示，每孔用5 μL每种标准品：1，000 mg/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL和15.625 mg/mL。将 5 μL 去离子水放入第八孔中用于空白。
- 将 4 μL 去离子水放入 96 孔板的三个独立孔中。向每个孔中加入 1 μL 重悬的肽溶液，总体积为 5 μL。
注意：移液肽溶液进行定量时，请小心地从溶液顶部移液，以防止干扰任何沉淀的碎片。 - 计算需要多少工作试剂（每孔需要 45 μL）。制备所需体积的比色测定工作试剂;涡旋工作试剂以确保组分正确混合。
- 向每个标准孔和样品孔中加入 45 μL 工作试剂。
注意：将标准品一式两份，并使用多通道移液管确保将试剂添加到孔中的时间差异最小。 - 用铝箔覆盖板并在37°C下孵育15分钟。
- 在自动酶标仪上分析板。使用为标准样品记录的吸光度值生成线性标准曲线。确定标准曲线和 R2 值的方程。如果R2 值合理（≥0.95），则使用标准曲线确定重悬肽的浓度，说明比色测定板中的五倍稀释度。
6. 消化肽的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析
- 通过添加溶剂 A 将肽样品的浓度调节至 0.2 μg/μL，并将 10 μL 转移到 0.6 mL 低蛋白结合管中。
- 将试管放入LC自动进样器中。
- 根据图2和图3设置LC和MS/MS参数。
- 将 5 μL （1 μg） 肽样品注入 LC-MS/MS 设置中进行分析。
注：此处显示的LC-MS/MS设置仅代表图示。根据LC和MS仪器的可用性，用户可以修改LC梯度和MS/MS参数的设置，以获得深度蛋白质组覆盖。本文使用MaxQuant https://www.maxquant.org/ 进行MS数据分析，使用Perseus https://maxquant.net/perseus/ 进行二次数据分析，使用 https://reactome.org/ 进行通路分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
对于该实验，我们通过用生物素标记完整细胞的N-糖基化膜蛋白来表征肿瘤细胞系的细胞表面蛋白质组，并用中性粒细胞素下拉从整个细胞裂解物中富集这些标记的蛋白质（图1）。此外，我们使用LC-MS / MS进行了蛋白质组分析，以表征富集的细胞表面蛋白。与全细胞蛋白质组分析不同，这里的目标是仅表征细胞表面蛋白。因此，我们从3.5×107 AMO-1浆细胞瘤细胞的样品输入开始。我们根据比色肽定量测定获得了~630 ng / μL的最终肽浓度，总产量为~12.6 μg肽（20 μL）（图2A）。然后，我们将1 μg肽样品进样LC-MS/MS系统，并重复进样3次进行技术重复。所使用的LC和MS参数是根据先前的实验优化的（图2C和图3A）。我们利用4小时的长LC梯度来确保最大覆盖率。
使用MaxQuant分析LC-MS/MS数据;在所有三个重复中，我们能够鉴定出具有至少一种独特肽的2，221种蛋白质，以及具有至少两种独特肽的1，764种蛋白质。总共鉴定了12，307种独特的肽。我们利用Python脚本（我们使用的确切脚本可以在 补充图S1中找到）确定了样品中的细胞表面蛋白富集，该脚本将从MaxQuant获得的结果与几个已建立的细胞表面蛋白数据集进行比较。这些数据集包括先前报道的 “计算机表面组”3 和由UniProt13 中注释为膜定位的蛋白质建立的数据集（数据集可在 补充表S1中找到）。该分析在我们的样品中产生了601种表面蛋白（约占所有鉴定蛋白的27%）（图4A）。进行了基因本体注释（http://geneontology.org/），表明大约30%的蛋白质典型定位于质膜。反应组途径分析（https://reactome.org/）也表明参与跨膜转运和细胞表面相互作用的膜蛋白相对富集（图5 和 补充表S2）。
图 1：用于质谱分析的细胞表面标记和后续样品制备的工作流程。 首先，用生物素标记所需细胞样品表面的蛋白质。然后裂解这些细胞，然后与结合生物素标记蛋白的中性粒蛋白珠一起孵育。然后反复洗涤磁珠以去除细胞内蛋白质和其他污染物。然后，蛋白质样品通过加入胰蛋白酶进行珠子消化。然后将所得肽片段样品进行脱盐，以去除洗涤和消化步骤中的污染物。然后将最终的肽样品干燥并准备进行质谱分析。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：比色肽定量标准曲线和液相色谱梯度。 （A）比色肽定量测定法生成的八点标准曲线，用于确定处理样品中的肽浓度。（B） 用于处理样品的LC-MS/MS系统的图示。（C）用于将样品注入质谱仪的液相色谱梯度和流速。缩写：LC-MS/MS = 液相色谱-串联质谱。请点击此处查看此图的大图。
图3：质谱参数和代表性色谱图。 （A）使用Orbitrap质谱仪进行本实验的参数。（B）按照“细胞表面捕获”方案进行4小时梯度的质谱分析生成的代表性色谱图。请点击此处查看此图的大图。
图4：细胞表面蛋白富集分析和技术重复比较。这些数据集包括先前报道的 “计算机表面组”3 和由UniProt13中注释为膜定位的蛋白质建立的数据集。（A）去除污染物后，以不同的截止值鉴定的蛋白质和肽的数量，逆转蛋白质，q值>0.05。（B）该图表示已鉴定蛋白质的分布和仙女座评分14。（C） 散点图说明了样本与样本之间的相关性。斯皮尔曼秩相关性衡量两个秩变量之间的关联强度和方向。（D） 描述运行间变化的箱形图。（E）表示重复数据质量的样本分布图。缩写：LFQ = 无标记定量。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：通路分析。 使用Reactome版本8222进行通路分析。血管壁上细胞表面相互作用的说明性描述，展示了细胞表面蛋白质组的富集，用于血小板和白细胞与内皮相互作用的关键相互作用。 请点击此处查看此图的大图。
| 试剂名称 | 组成 | 存储 | |||||
| 100 mM生物细胞素酰肼 | 粉末形式 生物细胞素酰肼溶解在DMSO中 | 分成 50 μL 等分试样，在 -20 °C 下储存长达 6 个月。 | |||||
| 160 mM 偏高碘酸钠 （NaIO4） | 溶解在去离子水中的固体NaIO4 | 分成 50 μL 等分试样，在 -20 °C 下储存长达 6 个月。 | |||||
| 2x RIPA 裂解缓冲液 | 2x RIPA 裂解缓冲液、1.25 mM EDTA、一次性蛋白酶抑制剂混合物 | 每次在使用 10x RIPA 裂解缓冲液之前准备新鲜的。 | |||||
| 肽比色测定工作试剂 | 50% 试剂 A， 48% 试剂 B， 2% 试剂 C | 每次使用前都要准备新鲜的。将组件储存在4°C。 | |||||
| 溶剂A | 0.1%甲酸，2%乙腈 | 可提前准备并在室温下储存 | |||||
| 洗涤缓冲液 1 | 1x RIPA 裂解缓冲液，1 mM EDTA | 可事先准备大批量并在室温下储存 | |||||
| 洗涤缓冲液 2 | 1x PBS， 1 M 氯化钠 | 可事先准备大批量并在室温下储存 | |||||
| 洗涤缓冲液 3 | 2 M 尿素，50 mM 碳酸氢铵 | 每次准备新鲜的尿素，因为尿素会随着时间的推移迅速降解。 | |||||
表1：本协议中使用的缓冲液和试剂溶液。
补充图S1：Python脚本，用于将从MaxQuant获得的结果与几个已建立的细胞表面蛋白数据集进行比较。请点击此处下载此文件。
补充表S1：细胞表面蛋白数据集。 这些数据集包括先前报道的 “计算机表面组”3 和由UniProt13中注释为膜定位的蛋白质建立的数据集。 请点击此处下载此文件。
补充表S2：这里列出了10种最相关的途径（按 p 值排序）。 缩写：FDR = 错误发现率;SLC = 溶质载体;TCR = T细胞受体。 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
基于质谱的蛋白质组学是一种强大的工具，能够以前所未有的规模对数千种未知蛋白质进行无偏见的表征。这种方法使我们能够识别和量化蛋白质，并通过表征特定样品中存在的各种蛋白质来收集有关细胞和组织结构和信号传导能力的一系列见解。除了样品中的全局蛋白质分析之外，质谱法还使我们能够表征这些蛋白质的各种翻译后修饰（PTM），从而更深入地了解在DNA或RNA水平1分析时无法获得的信号通路和蛋白质动力学阶段。为了开发新型癌症疗法，基于质谱的蛋白质组学使我们能够比较恶性肿瘤细胞与健康组织的蛋白质谱，以确定潜在的可成药靶标。
快速增长的癌症免疫治疗领域依赖于恶性细胞表面表达的抗原来识别和选择性地破坏肿瘤。由于新型癌症免疫疗法的开发受到缺乏健康组织中不存在的独特癌症特异性抗原的限制，因此鉴定更多针对肿瘤细胞的新型抗原至关重要15。肿瘤特异性抗原不一定是肿瘤细胞特有的全蛋白，但也可以是健康组织中不存在的特异性蛋白构象或PTMs16，17。对肿瘤和健康细胞上的细胞表面蛋白进行蛋白质组学分析可以产生新的癌症特异性抗原靶标。细胞表面蛋白质组学需要在质谱分析之前富集来自全细胞裂解物的表面蛋白，以降低样品的复杂性并避免高表达的细胞内蛋白对所需膜蛋白（通常低丰度）的离子抑制18。虽然这里采用的细胞表面捕获策略是细胞表面蛋白质组学最常用的富集方法之一，但还有其他细胞表面蛋白富集方法已与质谱工作流程集成，包括细胞膜的选择性超速离心、表面赖氨酸的 NHS-生物素标记以及细胞表面蛋白的酶介导生物素化19，20.头对头比较表明，细胞表面捕获方法提供了易于使用和成功、相对无偏的细胞表面蛋白富集与细胞内蛋白最低背景标记的最佳平衡20。
通过将细胞表面标记和下拉程序与优化的蛋白质组学样品制备工作流程相结合，本文为细胞表面蛋白质组学工作流程提供了一种有效且省时的方案（图1）。从收获培养细胞到在质谱仪上进行分析的整个过程可以在3天内完成。为了获得表面蛋白质组的最稳定覆盖率，可能需要根据所使用的细胞类型优化细胞的初始输入。建议使用不同的细胞输入进行试点实验，范围从几百万个细胞到5000万个细胞，以确保最大覆盖率。此外，如果观察到大量高表达的细胞内蛋白，则在与裂解物孵育后增加中性粒蛋白珠的洗涤可以最大限度地减少蛋白质与磁珠的非特异性结合。
我们建议每个条件至少进行三个生物学重复和三个技术重复的实验，以增强所鉴定的细胞表面标志物确实存在于大多数细胞上的信心。此外，在对新样品类型执行细胞表面捕获工作流程时，使用传统的鸟枪法蛋白质组学方法21分析全细胞裂解物可能会有所帮助，以便与细胞表面捕获结果进行比较。原始质谱数据的分析可以通过各种数据库搜索和软件包进行 - 在这里，我们使用MaxQuant-产生鉴定蛋白质列表22，23。该列表可以根据各种已知数据库3，24的表面蛋白进行过滤，以建立单个实验中鉴定的细胞表面蛋白列表。一旦建立了细胞表面蛋白列表，就可以进一步分析它们在相关生化途径25或药物靶标候选物26中的作用。该工作流程可应用于多种细胞类型，包括悬浮细胞和贴壁细胞系（对于贴壁细胞，我们建议在样品制备前不使用胰蛋白酶提取细胞，以避免细胞表面蛋白裂解）以及原样。
使用该工作流程，我们能够自信地表征特定细胞系的细胞表面蛋白质组。通过将肿瘤细胞系的表面蛋白质组与健康细胞进行比较，并与正常组织的RNA测序数据库进行交叉引用，可以建立潜在的免疫治疗靶点列表8，13。该方法的局限性在于，尽管与标准的全细胞裂解物实验相比，细胞表面蛋白显着富集，但该工作流程中通过质谱分析鉴定的大多数蛋白质仍被注释为细胞内。根据所用表面蛋白数据库的严格程度，大约25%-30%的鉴定蛋白来自细胞表面。我们预计非表面背景的很大一部分可能来自与磁珠非特异性结合的背景蛋白（例如，如CRAPome27 分析所表征的那样），而其他部分代表标记试剂的细胞渗透与内质网，高尔基体或其他细胞内区室中的 N-糖基化蛋白反应。
虽然替代肽洗脱方法（如PNGase处理）在分析的总肽中导致 N-糖位点的富集程度更高，但这种方法仅允许鉴定单个甘糖基化肽，并且会丢失下拉蛋白序列12的非糖基化剩余部分的宝贵信息。这种珠上胰蛋白酶消化方法可以捕获这些额外的信息，尽管潜在的代价是质谱仪中分析的 N-糖基化蛋白质的特异性降低。此外，即使PNGase洗脱也不能克服标记细胞内糖基化蛋白的挑战，并且PNGase洗脱通常导致每种蛋白质只有一个肽;根据我们实验室的经验，这导致蛋白质鉴定存在显着差异，而此处描述的珠子消化导致每个捕获的蛋白质具有多种肽。因此，根据实验的目的，人们可以选择不同的策略来采用细胞表面捕获策略。这些策略包括小样品输入28 的细胞表面捕获方案的小型化和自动化，并根据应用利用不同结合能力的链霉亲和素微球29 。此处所示的方法和工作流程可作为细胞表面蛋白富集的稳定、易于执行的一般策略。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢Kamal Mandal博士（UCSF检验医学系）帮助建立LC-MS / MS运行，Deeptarup Biswas（BSBE，IIT Bombay）在数据分析方面的帮助，以及Audrey Reeves博士（UCSF实验室医学系）在数据分析方面的帮助。APW实验室的相关工作得到了NIH R01 CA226851和Chan Zuckerberg Biohub的支持。图 1 和 图2B 是使用 BioRender.com 制作的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Bausch-Fluck, D., et al.
- Takahashi, Y., et al. Research advance in tumor specific antigens: A narrative review. AME Medical Journal. 6, 35 (2021).
- Li, Y., Qin, H., Ye, M. An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling. Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).
- Chandler, K. B., Costello, C. C. Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities. Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).
- Ferguson, I. D., et al. The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance. Nature Communications. 13 (1), 4121 (2022).
- Karcini, A., Lazar, I. M. The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications. Scientific Reports. 12 (1), 10847 (2022).
- Köhnke, T., et al. Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML. Biomarker Research. 10 (1), 43 (2022).
- Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (177), e61786 (2021).
- Leung, K. K., et al. Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).
- Nix, M. A., et al. Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL. Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Hosen, N., et al. The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).
- Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery. Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).
- Itzhak, D. N., et al. A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons. Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).
- Kirkemo, L. L., et al. Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells. eLife. 11, 73982 (2022).
- Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows. Current Protocols. 1 (3), 85 (2021).
- Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One. 10 (3), 0121314 (2015).
- Griss, J., et al. ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).
- Waas, M., et al. SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates. Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- van Oostrum, M., et al. Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps. Nature Communications. 10 (1), 5734 (2019).
- Berg Luecke, L., Gundry, R. L. Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies. Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).
