Summary
Hier beschrijven we een proteomics-workflow voor de karakterisering van het celoppervlakproteoom van verschillende celtypen. Deze workflow omvat eiwitverrijking van het celoppervlak, daaropvolgende monstervoorbereiding, analyse met behulp van een LC-MS / MS-platform en gegevensverwerking met gespecialiseerde software.
Abstract
In het afgelopen decennium heeft op massaspectrometrie gebaseerde proteomica een diepgaande karakterisering van biologische systemen in een breed scala aan toepassingen mogelijk gemaakt. Het celoppervlakproteoom ("surfaceoom") bij menselijke ziekten is van groot belang, omdat plasmamembraaneiwitten het primaire doelwit zijn van de meeste klinisch goedgekeurde therapieën, evenals een belangrijk kenmerk om ziektecellen diagnostisch te onderscheiden van gezonde weefsels. Gerichte karakterisering van membraan- en oppervlakte-eiwitten van de cel is echter een uitdaging gebleven, voornamelijk vanwege de complexiteit van cellulaire lysaten, die eiwitten maskeren die van belang zijn voor andere eiwitten met een hoge abundantie. Om deze technische barrière te overwinnen en het celoppervlakproteoom van verschillende celtypen nauwkeurig te definiëren met behulp van massaspectrometrieproteomica, is het noodzakelijk om het cellysaat te verrijken voor celoppervlakeiwitten voorafgaand aan analyse op de massaspectrometer. Dit artikel presenteert een gedetailleerde workflow voor het labelen van celoppervlakeiwitten uit kankercellen, het verrijken van deze eiwitten uit het cellysaat en de daaropvolgende monstervoorbereiding voor massaspectrometrie-analyse.
Introduction
Eiwitten dienen als de fundamentele eenheden waarmee de meeste cellulaire functies worden uitgevoerd. Het karakteriseren van de structuur en functie van relevante eiwitten is een essentiële stap om biologische processen te begrijpen. In het afgelopen decennium hebben de ontwikkelingen in massaspectrometrietechnologie, analysesoftware en databases de nauwkeurige detectie en meting van eiwitten op proteoombrede schaalmogelijk gemaakt 1. Op massaspectrometrie gebaseerde proteomica kan worden gebruikt in een breed scala aan toepassingen, van fundamentele wetenschappelijke analyse van biochemische routes, tot identificatie van nieuwe medicijndoelen in een translationele omgeving, tot diagnose en monitoring van ziekten in de kliniek2. Bij het screenen op nieuwe geneesmiddeldoelen is karakterisering van het celoppervlakproteoom bijzonder belangrijk, met meer dan 65% van de momenteel goedgekeurde menselijke geneesmiddelen gericht op celoppervlakeiwitten3. Het gebied van kankerimmunotherapie is ook volledig afhankelijk van kankerspecifieke celoppervlakantigenen om tumorcellen te richten en specifiek te elimineren4. Op massaspectrometrie gebaseerde proteomica kan dus dienen als een veelbelovend hulpmiddel om nieuwe celoppervlakeiwitten te identificeren in de richting van therapeutische interventies.
Er zijn echter verschillende beperkingen bij het gebruik van conventionele proteomics-methoden om tumorcellen te onderzoeken op nieuwe celoppervlakeiwitdoelen. Een primaire zorg is dat oppervlakte-eiwitten een zeer klein deel uitmaken van de totale eiwitmoleculen in een cel. Daarom worden fragmenten van deze eiwitten gemaskeerd door een hoge overvloed aan intracellulaire eiwitten bij het uitvoeren van massaspectrometrie-analyse van het hele cellysaat5. Deze beperking maakt het een uitdaging om het proteoom van het celoppervlak nauwkeurig te karakteriseren met een traditionele proteomics-workflow. Om deze uitdaging aan te gaan, is het noodzakelijk om manieren te ontwikkelen om celoppervlakeiwitten uit het hele cellysaat te verrijken, voorafgaand aan analyse op de massaspectrometer. Een dergelijke methode omvat de oxidatie en biotine-etikettering van geglycosyleerde celoppervlakeiwitten in de intacte cellen en de daaropvolgende verrijking van deze gebiotinyleerde eiwitten uit het lysaat met een neutravidine-pulldown, een proces dat "celoppervlakvangst" wordt genoemd6. Aangezien ~ 85% van de celoppervlakeiwitten van zoogdieren wordt verondersteld geglycosyleerd te zijn 7, dient dit als een effectieve methode om het proteoom van het celoppervlak uit het hele cellysaatte verrijken. Dit artikel beschrijft een complete workflow, te beginnen met gekweekte cellen, van celoppervlakbiotine-etikettering en daaropvolgende monstervoorbereiding voor massaspectrometrie-analyse (figuur 1). Over verschillende replicaties biedt deze methode een robuuste dekking van het proteoom van het celoppervlak van een bepaald monster. Het gebruik van deze methode om het celoppervlakproteoom van zowel tumor- als gezonde cellen te karakteriseren, kan de ontdekking van nieuwe celoppervlakantigenen vergemakkelijken om potentiële immunotherapeutische doelen te identificeren8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: AMO1 plasmacytoomcellen werden gebruikt voor dit proteoomexperiment met celoppervlakken. Hetzelfde protocol kan ook worden gebruikt voor andere celtypen, waaronder een breed scala aan suspensie- en adherente cellijnen9, evenals verschillende soorten primaire monsters10. Celaantallen (uitgangsmateriaal voor het experiment) moeten echter meestal worden geoptimaliseerd voor gelijkwaardige proteoomdekking. Voor meer informatie over materialen en apparatuur, zie de Tabel met materialen. Voor details met betrekking tot buffers en reagensoplossingen en hun samenstelling, zie tabel 1.
1. Celoppervlaketikettering met biotine
- Tel de gekweekte cellen en pellet ongeveer 3,5 × 107 levende cellen door centrifugeren (5 min bij 500 × g, 24 °C).
OPMERKING: De AMO1 plasmacytoomcellen werden om de 3 dagen voorafgaand aan de oogst met verse media gepasseerd. - Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet door 1 ml koude (4 °C) Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS) (geen calcium, geen magnesium) toe te voegen en zachtjes op en neer te pipetteren.
- Pellet de cellen opnieuw (zoals in stap 1.1) en herhaal de wasstap (stap 1.2) nogmaals (twee wasbeurten in totaal).
- Pellet de cellen na de tweede wasbeurt (zoals in stap 1.1) en resuspensie in 990 μL koude D-PBS door voorzichtig te pipetteren.
- Bereid vooraf een stockoplossing van 160 mM natriummetacostaat (NaIO4). Gesplitst in aliquots van 50 μL en bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Voeg 10 μL natriummetaperiodaatoplossing van 160 mM toe aan de celsuspensie in stap 1.4, meng grondig en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C op een end-to-end rotor.
- Nadat de incubatie is voltooid, pelleteert u de cellen (zoals in stap 1.1), decanteert u het supernatant en resuspenseert u in 1 ml koude D-PBS. Herhaal deze wasstap twee keer (drie wasbeurten in totaal). Na de derde wasbeurt, resuspendeerde de cellen in 989 μL D-PBS.
- Bereid vooraf een stamoplossing van 100 mM biocytinehydrazide. Gesplitst in aliquots van 50 μL en maximaal 6 maanden bewaren bij -20 °C. Voeg in stap 1.6 1 μL aniline en 10 μL 100 mM biocytinehydrazide toe aan de celsuspensie, meng grondig en incubeer gedurende 60 minuten bij 4 °C op een end-to-end rotor.
- Nadat de incubatie is voltooid, pelleteert u de cellen (zoals in stap 1.1), decanteert u het supernatant en resuspenseert u in 1 ml koude D-PBS. Herhaal deze wasstap twee keer (drie wasbeurten in totaal).
- Na de derde wasbeurt, zuig het supernatant voorzichtig op met een pipet en vries de celpellet in door de buis in vloeistof N2 te plaatsen. Plaats de bevroren pellet op -80 °C, totdat u klaar bent om verder te gaan met lysis en pulldown.
2. Cellyse en biotine pulldown
- Ontdooi de bevroren celkorrel op ijs.
- Voeg 500 μL 2x lysisbuffer toe aan de pellet, meng grondig en vortex gedurende 30 s.
OPMERKING: Krachtig pipetteren en vortexen kunnen nodig zijn om de pellet volledig te lyseren. Sommige onoplosbare brokstukken (d.w.z. DNA) zijn acceptabel, omdat het wordt verwijderd in de volgende ultrasoonapparaatstap. - Soniceer het cellysaat op ijs (drie uitbarstingen, elk 20 s, 60% duty cycle).
- Centrifugeer het lysaat om eventueel achtergebleven vuil te pelleteren (10 min bij 17.200 × g bij 4 °C).
- Terwijl het lysaat centrifugeert, voegt u 100 μL neutravidine agarose harsparels toe aan een filtratiekolom. Bevestig de kolom aan een vacuümspruitstuk, breng een zacht vacuüm aan en was de kralen door er 3 ml wasbuffer 1 overheen te laten stromen.
- Verwijder de filtratiekolom uit het vacuümspruitstuk, sluit de bodem af en voeg het geklaarde cellysaat toe aan de kolom met de kralen. Sluit de bovenkant van de kolom af en incubeer het lysaat met de kralen op een end-to-end rotor gedurende 120 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Houd bij het afdekken van de bovenkant van de kolom de onderste dop stevig op zijn plaats, anders kan deze losraken en kan het cellysaat lekken tijdens de incubatie. - Bereid wasbuffers 1, 2 en 3 (ongeveer 5 ml van elke wasbuffer per monster, zie tabel 1) en plaats ze in een waterbad van 42 °C
- Nadat het lysaat klaar is met incuberen, plaatst u de filterkolom terug op het vacuümspruitstuk, brengt u een zacht vacuüm aan en wast u de kralen door er 5 ml wasbuffer 1 overheen te laten stromen.
OPMERKING: Meer dan 5 ml van de wasbuffers kan worden gebruikt voor het wassen; Extra wassen kan de achtergrond verminderen, niet-specifieke binding aan de kralen. - Herhaal de wasstap met 5 ml wasbuffer 2.
- Herhaal de wasstap met 5 ml wasbuffer 3.
- Zodra de laatste wasbuffer volledig door de kralen is gestroomd, verwijdert u de kolom uit het spruitstuk. Voeg 100 μL "Lyse" -oplossing toe aan de kralen en breng ze over in een 1,7 ml eiwitarme microcentrifugebuis met een pipet. Draai kort aan de buis om de kralen te laten bezinken en verwijder 50 μL van de oplossing zonder de bezonken kralen te verstoren.
OPMERKING: De reagentia in deze stap en alle volgende stappen maken gebruik van een in de handel verkrijgbare proteomics monstervoorbereidingskit. De kit biedt een geoptimaliseerde, vereenvoudigde workflow voor monstervoorbereiding. Deze stappen kunnen echter ook onafhankelijk van de kit worden uitgevoerd, met behulp van een traditionele proteomics-workflow zoals beschreven in Verma et al.9. Als de kralen aan de zijkant of onderkant van de kolom blijven zitten, laat dan de kralen die naar de buis zijn overgebracht bezinken en gebruik extra "Lyse" -oplossing in de buis om de resterende kralen over te brengen. - Plaats de buis op een warmteblok/schudder bij 65 °C en schud gedurende 10 minuten bij 1.000 tpm.
OPMERKING: Deze stap is vereist voor de reductie en alkylering van cysteïneresiduen voorafgaand aan de spijsvertering.
3. Eiwitvertering
- Resuspendeerde de gedroogde trypsine ("Digest"-buis in de kit, bewaard bij -20 °C) door toevoeging van 210 μL van de "Resuspend"-oplossing. Pipetteer de oplossing meerdere keren op en neer om ervoor te zorgen dat alle gedroogde trypsine wordt geresuspendeerd.
- Nadat de incubatie is voltooid, voegt u 50 μL van de geresuspendeerde trypsine-oplossing toe aan de kralen. Incubeer de buis bij 37 °C en schud bij 500 tpm gedurende ten minste 90 minuten om het eiwit te verteren.
- Zodra de vertering is voltooid, brengt u de oplossing met de kralen over in een spinkolom en plaatst u de kolom in een 1,7 ml eiwitarme microcentrifugebuis. Draai de buis (500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur [RT]) om de verteerde peptideoplossing van de kralen te scheiden.
OPMERKING: In dit stadium kan PNGase-behandeling worden uitgevoerd op de kralen zodra ze zijn gescheiden van de peptideoplossing, om gebiotinyleerde peptidefragmenten uit de streptavidinekorrels te elueren. Dit peptidemonster kan vervolgens door de rest van de workflow worden gedragen als een afzonderlijk, secundair peptidemonster dat kan worden geanalyseerd en vergeleken met het primaire monster van trypsinisatie op de kraal. De PNGase-benadering zal waarschijnlijk aanvullende gegevens opleveren voor trypsinisatie op de kraal, gezien de aanvullende specificiteit voor gevangen N-geglycosyleerde asparaginen op basis van MS-detecteerbare zijketenmodificatie12. Het nadeel van deze sequentiële elutiebenadering is echter de vereiste van tweemaal de massaspectrometerinstrumenttijd per monsteranalyse. - Voeg 100 μL van de "Stop" -oplossing toe om de verteringsreactie te stoppen en de peptideoplossing te verzuren.
4. Peptide ontzouting
- Plaats met behulp van een buisadapter een ontzoutingskolom in een 1,7 ml eiwitarme microcentrifugebuis. Voeg de volledige aangezuurde peptide-oplossing toe aan de kolom. Draai de kolom (3.800 × g gedurende 3 minuten) zodat de oplossing door de kolom stroomt. De peptiden zijn nu gebonden aan de kolom; Gooi de doorstroming weg.
- Voeg 200 μL "Wash 1"-oplossing toe aan de kolom en draai (3.800 × g gedurende 3 minuten, RT). Gooi de doorstroming weg.
- Voeg 200 μL "Wash 2"-oplossing toe aan de kolom en draai (3.800 × g gedurende 3 minuten, RT). Gooi de doorstroming weg.
- Breng de kolom over in een nieuwe, gelabelde 1,7 ml eiwitarme microcentrifugebuis. Voeg 100 μL "Elute"-oplossing toe aan de kolom en draai (3.800 × g gedurende 3 min, RT). Voeg nog eens 100 μL "Elute" -oplossing toe aan de kolom en draai (3.800 × g gedurende 3 minuten, RT). De peptiden worden nu van de kolom in de buis geëlueerd.
- Plaats de peptideoplossing in een vacuümcentrifuge en laat deze een nacht drogen. Plaats de uitgedroogde peptiden op -80 °C totdat ze klaar zijn om te kwantificeren en analyseer ze op de massaspectrometer.
5. Peptide resuspensie en kwantificering
- Resuspendeer de gedroogde peptiden in 20 μL oplosmiddel A (0,1% mierenzuur, 2% acetonitril).
- Centrifugeer de geresuspendeerde peptiden (17.200 × g gedurende 10 minuten) om onoplosbaar vuil te pelleteren.
- Bereid peptidestandaarden voor de colorimetrische peptidekwantificeringstest voor.
- Plaats 5 μL van 1.000 mg/ml peptide-stockoplossing in één put van een plaat met 96 putten.
- Voer een seriële verdunning in zeven stappen uit in de plaat met gedeïoniseerd (DI) water, als volgt, met 5 μL van elke standaard per put: 1.000 mg / ml, 500 mg / ml, 250 mg / ml, 125 mg / ml, 62, 5 mg / ml, 31,25 mg / ml en 15,625 mg / ml. Doe 5 μL DI-water in een achtste put voor de blanco.
- Plaats 4 μL DI-water in drie afzonderlijke putten van de 96-putplaat. Voeg 1 μL van de geresuspendeerde peptideoplossing toe aan elke put, voor een totaal volume van 5 μL.
OPMERKING: Bij het pipetteren van de peptide-oplossing voor kwantificering, pipet voorzichtig vanaf de bovenkant van de oplossing om te voorkomen dat bezonken vuil wordt verstoord. - Bereken hoeveel werkend reagens nodig is (45 μL nodig per put). Bereid het vereiste volume van het colorimetrische testreagens voor; vortex het werkende reagens om een goede menging van de componenten te garanderen.
- Voeg 45 μL van het werkende reagens toe aan elk van de standaard- en monsterputten.
OPMERKING: Maak de standaarden in tweevoud en gebruik een meerkanaals pipet om een minimaal verschil te garanderen in de timing van wanneer het reagens aan de putten wordt toegevoegd. - Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Analyseer de plaat op een geautomatiseerde plaatlezer. Gebruik de absorptiewaarden die zijn geregistreerd voor de standaardmonsters om een lineaire standaardcurve te genereren. Bepaal de vergelijking van de standaardcurve en de R2-waarde . Als de R2-waarde redelijk is (≥0,95), gebruikt u de standaardcurve om de concentratie van geresuspendeerde peptiden te bepalen, rekening houdend met de vijfvoudige verdunning in de colorimetrische testplaat.
6. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) analyse van de verteerde peptiden
- Pas de concentratie van de peptidemonsters aan op 0,2 μg/μl door oplosmiddel A toe te voegen en breng 10 μl over in een 0,6 ml laag-eiwitbindende buis.
- Plaats de buis in de LC autosampler.
- Stel de LC- en MS/MS-parameters in volgens figuur 2 en figuur 3.
- Injecteer 5 μL (1 μg) van het peptidemonster in de LC-MS/MS-opstelling voor analyse.
OPMERKING: De hier getoonde LC-MS/MS-instellingen zijn alleen representatief voor de illustraties. Afhankelijk van de beschikbaarheid van het LC- en MS-instrument kunnen gebruikers de instellingen voor de LC-gradiënt en MS/MS-parameters wijzigen om diepe proteoomdekking te verkrijgen. Voor dit artikel werd de MS-gegevensanalyse uitgevoerd met behulp van MaxQuant https://www.maxquant.org/, secundaire gegevensanalyse werd uitgevoerd met Perseus https://maxquant.net/perseus/ en pathway-analyse met behulp van https://reactome.org/.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor dit experiment karakteriseerden we het celoppervlakproteoom van een tumorcellijn door N-geglycosyleerde membraaneiwitten van intacte cellen te labelen met biotine en deze gelabelde eiwitten uit het hele cellysaat te verrijken met een neutravidine-pulldown (figuur 1). Verder voerden we proteoomanalyse uit met behulp van LC-MS / MS om verrijkte celoppervlakeiwitten te karakteriseren. In tegenstelling tot de analyse van hele cellenproteoom, was het doel hier om alleen celoppervlakeiwitten te karakteriseren. Daarom zijn we begonnen met een monsterinvoer van 3,5 × 107 AMO-1 plasmacytoomcellen. We verkregen een uiteindelijke peptideconcentratie van ~630 ng/μL op basis van de colorimetrische peptidekwantificeringstest en de totale opbrengst was ~12,6 μg peptiden (in 20 μL) (Figuur 2A). Vervolgens injecteerden we 1 μg peptidemonster in het LC-MS/MS-systeem en herhaalden we de injectie drie keer voor technische replicaties. De gebruikte LC- en MS-parameters werden geoptimaliseerd op basis van eerdere experimenten (figuur 2C en figuur 3A). We gebruikten een lange LC-helling van 4 uur om een maximale dekking te garanderen.
LC-MS/MS-gegevens werden geanalyseerd met MaxQuant; We waren in staat om 2.221 eiwitten te identificeren met ten minste één uniek peptide en 1.764 eiwitten met ten minste twee unieke peptiden in alle drie de replicaten. In totaal werden er 12.307 unieke peptiden geïdentificeerd. We bepaalden de eiwitverrijking van het celoppervlak in het monster door gebruik te maken van een Python-script (het exacte script dat we gebruikten is te vinden in aanvullende figuur S1) dat de resultaten van MaxQuant vergelijkt met verschillende gevestigde datasets van celoppervlakeiwitten. Deze datasets omvatten de eerder gerapporteerde "in silico surfaceome"3 en een dataset die is vastgesteld op basis van eiwitten die zijn geannoteerd als membraan-gelokaliseerd in UniProt13 (datasets zijn beschikbaar in aanvullende tabel S1). Deze analyse leverde 601 oppervlakte-eiwitten op in ons monster (ongeveer 27% van alle geïdentificeerde eiwitten) (figuur 4A). Genontologie-annotatie (http://geneontology.org/) werd uitgevoerd, wat aangaf dat ongeveer 30% van de eiwitten canoniek gelokaliseerd was in het plasmamembraan. Reactome pathway analyse (https://reactome.org/) wees ook op relatieve verrijking van de membraaneiwitten die betrokken zijn bij transmembraantransport en celoppervlakinteracties (figuur 5 en aanvullende tabel S2).
Figuur 1: Workflow voor celoppervlaketikettering en daaropvolgende monstervoorbereiding voor massaspectrometrie-analyse. Eerst worden eiwitten aan het oppervlak van het gewenste cellulaire monster gelabeld met biotine. Deze cellen worden vervolgens gelyseerd, gevolgd door incubatie met neutravidineparels die biotine-gelabelde eiwitten binden. De kralen worden vervolgens herhaaldelijk gewassen om intracellulaire eiwitten en andere verontreinigingen te verwijderen. Het eiwitmonster ondergaat vervolgens een vertering op de kraal met toevoeging van trypsine. Het resulterende monster van peptidefragmenten ondergaat vervolgens ontzouting om verontreinigingen uit de was- en verteringsstappen te verwijderen. Het uiteindelijke peptidemonster wordt vervolgens gedroogd en klaar om massaspectrometrie-analyse te ondergaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Colorimetrische peptidekwantificeringsstandaardcurve en LC-gradiënt . (A) Achtpunts standaardcurve gegenereerd door colorimetrische peptidekwantificeringstest die wordt gebruikt om de peptideconcentratie in verwerkte monsters te bepalen. B) Een illustratie van het LC-MS/MS-systeem dat wordt gebruikt voor de verwerking van monsters. (C) Vloeistofchromatografiegradiënt en stroomsnelheid gebruikt voor injectie van monsters op de massaspectrometer. Afkortingen: LC-MS/MS = vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Massaspectrometrieparameters en representatief chromatogram . (A) Parameters die voor dit experiment zijn gebruikt met behulp van een Orbitrap-massaspectrometer. (B) Representatief chromatogram gegenereerd door massaspectrometrie-analyse volgens het "cell surface capture"-protocol voor een gradiënt van 4 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Analyse van eiwitverrijking aan het celoppervlak en vergelijking van technische replicaties. Deze datasets omvatten de eerder gerapporteerde "in silico surfaceome"3 en een dataset die is vastgesteld op basis van eiwitten die zijn geannoteerd als membraan-gelokaliseerd in UniProt13. (A) Het aantal eiwitten en peptiden geïdentificeerd met een andere cut-off na het verwijderen van verontreinigingen, omgekeerde eiwitten en een q-waarde > 0,05. (B) De grafiek vertegenwoordigt de verdeling van het geïdentificeerde eiwit en de Andromeda-score14. (C) De spreidingsgrafiek illustreert de correlatie tussen monsters en monsters. De rangcorrelatie van de Spearman meet de sterkte en richting van associatie tussen twee gerangschikte variabelen. (D) Boxplots die de run-to-run-variatie weergeven. (E) Steekproefsgewijze verdelingsgrafiek die de gegevenskwaliteit van replicaten weergeeft. Afkorting: LFQ = labelvrije kwantificering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Routeanalyse. Pathway-analyse werd uitgevoerd met Reactome versie 8222. Een illustratieve weergave van celoppervlakinteracties aan de vaatwand, met de verrijking van celoppervlakproteoom voor belangrijke interacties die betrokken zijn bij de bloedplaatjes- en leukocyteninteractie met het endotheel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Naam van reagens | Compositie | Opslag | |||||
| 100 mM biocytinehydrazide | poedervorm biocytinehydrazide opgelost in DMSO | Gesplitst in aliquots van 50 μL en bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. | |||||
| 160 mM natriummetachadaat (NaIO4) | vaste NaIO4 opgelost in DI water | Gesplitst in aliquots van 50 μL en bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. | |||||
| 2x RIPA Lysis Buffer | 2x RIPA Lysis Buffer, 1,25 mM EDTA, Proteaseremmercocktail voor eenmalig gebruik | Bereid elke keer vers voordat u 10x RIPA Lysis Buffer gebruikt. | |||||
| Peptide Colorimetrische Assay Working Reagens | 50% Reagens A, 48% Reagens B, 2% Reagens C | Bereid elke keer vers voor gebruik. Bewaar componenten bij 4 °C. | |||||
| Oplosmiddel A | 0,1% mierenzuur, 2% acetonitril | Kan van tevoren voorbereiden en bij kamertemperatuur bewaren | |||||
| Wasbuffer 1 | 1x RIPA Lysis Buffer, 1 mM EDTA | Kan grote partijen van tevoren bereiden en bij kamertemperatuur bewaren | |||||
| Wasbuffer 2 | 1x PBS, 1 m NaCl | Kan grote partijen van tevoren bereiden en bij kamertemperatuur bewaren | |||||
| Wasbuffer 3 | 2 M Ureum, 50 mM Ammoniumbicarbonaat | Bereid elke keer vers, omdat ureum na verloop van tijd snel zal afbreken. | |||||
Tabel 1: Buffers en reagensoplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
Aanvullende figuur S1: Python-script voor het vergelijken van resultaten verkregen van MaxQuant met verschillende gevestigde datasets van celoppervlakeiwitten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Datasets van celoppervlakeiwitten. Deze datasets omvatten de eerder gerapporteerde "in silico surfaceome"3 en een dataset die is vastgesteld op basis van eiwitten die zijn geannoteerd als membraan-gelokaliseerd in UniProt13. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S2: De 10 meest relevante trajecten (gesorteerd op p-waarde ) worden hier weergegeven. Afkortingen: FDR = false discovery rate; SLC = drager van opgeloste stoffen; TCR = T-celreceptor. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Op massaspectrometrie gebaseerde proteomics is een krachtig hulpmiddel dat onbevooroordeelde karakterisering van duizenden onbekende eiwitten op een voorheen onmogelijke schaal mogelijk heeft gemaakt. Deze aanpak stelt ons in staat om de eiwitten te identificeren en te kwantificeren, evenals een reeks inzichten te verzamelen voor de structurele en signalerende capaciteiten van cellen en weefsels, door de verscheidenheid aan eiwitten in een bepaald monster te karakteriseren. Massaspectrometrie gaat verder dan globale eiwitprofilering in een monster en stelt ons in staat om verschillende posttranslationele modificaties (PTM's) op deze eiwitten te karakteriseren, waardoor een nog diepere blik wordt geboden op de stadia van signaalroutes en eiwitdynamica die niet beschikbaar zijn bij het analyseren op DNA- of RNA-niveau1. In de richting van de ontwikkeling van nieuwe kankertherapieën stelt op massaspectrometrie gebaseerde proteomica ons in staat om het eiwitprofiel van kwaadaardige tumorcellen te vergelijken met gezonde weefsels, om potentiële druggable doelen te identificeren.
Het snel groeiende veld van kankerimmunotherapie vertrouwt op antigenen die tot expressie komen op het oppervlak van kwaadaardige cellen om tumoren te identificeren en selectief te vernietigen. Aangezien de ontwikkeling van nieuwe kankerimmunotherapieën wordt beperkt door het gebrek aan unieke kankerspecifieke antigenen, die afwezig zijn in gezonde weefsels, is het van cruciaal belang om meer nieuwe antigenen te identificeren die specifiek zijn voor tumorcellen15. Tumorspecifieke antigenen hoeven geen hele eiwitten te zijn die uniek zijn voor de tumorcel, maar kunnen ook specifieke eiwitconformaties of PTM's zijn die afwezig zijn in gezonde weefsels16,17. Proteomische analyse van celoppervlakeiwitten op zowel tumor- als gezonde cellen kan nieuwe kankerspecifieke antigeendoelen opleveren. Celoppervlakproteomica vereist de verrijking van oppervlakte-eiwitten uit het hele cellysaat voorafgaand aan massaspectrometrie-analyse, om de complexiteit van het monster te verminderen en ionenonderdrukking van de gewenste membraaneiwitten (vaak lage abundantie) door sterk tot expressie gebrachte intracellulaire eiwittente voorkomen 18. Hoewel de hier gebruikte strategie voor het vastleggen van celoppervlakken een van de meest gebruikte verrijkingsbenaderingen is voor proteomica van het celoppervlak, zijn er andere methoden voor eiwitverrijking van het celoppervlak die zijn geïntegreerd met een massaspectrometrieworkflow, waaronder selectieve ultracentrifugatie van celmembranen, NHS-biotine-etikettering van oppervlaktelysines en enzymgemedieerde biotinylering van celoppervlakeiwitten19, 20. Head-to-head vergelijkingen suggereren dat de benadering van het vastleggen van celoppervlakken de optimale balans biedt tussen gebruiksgemak en succesvolle, relatief onbevooroordeelde verrijking van celoppervlakeiwitten met de laagste achtergrondlabeling van intracellulaire eiwitten20.
Dit artikel presenteert een effectief en tijdsefficiënt protocol voor een proteomics-workflow voor celoppervlakken door de labeling en pulldown-procedure van het celoppervlak te integreren met een geoptimaliseerde workflow voor proteomics-monstervoorbereiding (figuur 1). De hele procedure, van het oogsten van gekweekte cellen tot analyse op de massaspectrometer, kon in de loop van 3 dagen worden bereikt. Om de meest robuuste dekking van het oppervlakteproteoom te verkrijgen, moet de initiële invoer van cellen mogelijk worden geoptimaliseerd op basis van het gebruikte celtype. Het uitvoeren van een proefexperiment met variërende celinvoer, variërend van een paar miljoen cellen tot 50 miljoen cellen, wordt aanbevolen om een maximale dekking te garanderen. Bovendien, als een grote hoeveelheid sterk tot expressie brengende intracellulaire eiwitten wordt waargenomen, kan een verhoogd wassen van de neutravidineparels na incubatie met het lysaat de niet-specifieke binding van eiwitten aan de kralen minimaliseren.
We raden aan om het experiment uit te voeren met ten minste drie biologische replicaties en drie technische replicaties per aandoening, om het vertrouwen te vergroten dat de geïdentificeerde celoppervlakmarkers inderdaad aanwezig zijn op de meerderheid van de cellen. Bovendien kan het bij het uitvoeren van de workflow voor het vastleggen van het celoppervlak voor een nieuw monstertype nuttig zijn om een lysaat van de hele cel te analyseren met behulp van een conventionele shotgun proteomics-benadering21, om te vergelijken met de resultaten van het vastleggen van het celoppervlak. Analyse van de ruwe massaspectrometriegegevens kan worden uitgevoerd door verschillende databasezoek- en softwarepakketten - hier hebben we MaxQuant gebruikt - om een lijst met geïdentificeerde eiwitten22,23 op te leveren. Deze lijst kan worden gefilterd tegen verschillende bekende databases 3,24 van oppervlakte-eiwitten om een lijst op te stellen van de celoppervlakeiwitten die in een enkel experiment zijn geïdentificeerd. Zodra een lijst van celoppervlakeiwitten is opgesteld, kunnen ze verder worden geanalyseerd op hun rol in relevante biochemische routes25 of kandidaat-geneesmiddeldoelkandidaten26. Deze workflow kan worden toegepast op een breed scala aan celtypen, waaronder suspensie en aanhangende cellijnen (voor aanhangende cellen raden we aan cellen op te heffen zonder het gebruik van trypsine voorafgaand aan de monstervoorbereiding, om splitsing van de celoppervlakeiwitten te voorkomen), evenals primaire monsters.
Met behulp van deze workflow konden we met vertrouwen het celoppervlakproteoom van een bepaalde cellijn karakteriseren. Door het oppervlakteproteoom van tumorcellijnen te vergelijken met gezonde cellen en kruisverwijzingen met een RNA-sequencingdatabase voor normale weefsels, kon een lijst van potentiële immunotherapeutische doelen worden vastgesteld 8,13. Een beperking van deze methode is dat, ondanks de significante verrijking van celoppervlakeiwitten ten opzichte van een standaard lysaatexperiment met hele cellen, de meerderheid van de eiwitten die door massaspectrometrie-analyse in deze workflow zijn geïdentificeerd, nog steeds worden geannoteerd als intracellulair. Afhankelijk van de strengheid van de gebruikte oppervlakte-eiwitdatabase, is ongeveer 25% -30% van de geïdentificeerde eiwitten afkomstig van het celoppervlak. We verwachten dat een aanzienlijk deel van de niet-oppervlakteachtergrond waarschijnlijk afkomstig is van achtergrondeiwit dat niet specifiek gebonden is aan kralen (bijvoorbeeld zoals gekarakteriseerd door CRAPome27-analyse), terwijl andere celpenetratie van het etiketteringsreagens vertegenwoordigen om te reageren met N-geglycosyleerde eiwitten in het endoplasmatisch reticulum, Golgi of andere intracellulaire compartimenten.
Terwijl alternatieve peptide-elutiemethoden zoals PNGase-behandeling resulteren in een veel grotere verrijking van N-glycosieten onder de totale geanalyseerde peptiden, maakt deze benadering alleen de identificatie van individuele geglycysyleerde peptiden mogelijk en verliest waardevolle informatie van de niet-geglycosyleerde rest van de getrokken eiwitsequentie12. Deze extra informatie kan worden vastgelegd met deze trypsinisatiebenadering op de kraal, hoewel met de potentiële afweging van verminderde specificiteit voor N-geglycosyleerde eiwitten geanalyseerd in de massaspectrometer. Bovendien overwint zelfs PNGase-elutie de uitdaging van het labelen van intracellulaire geglycosyleerde eiwitten niet, en een PNGase-elutie leidt meestal tot slechts één peptide per eiwit; Dit leidt tot aanzienlijke variabiliteit in eiwitidentificatie, volgens de ervaring van ons laboratorium, terwijl de hier beschreven vertering op de kralen leidt tot meerdere peptiden per gevangen eiwit. Daarom zou men, afhankelijk van het doel van het experiment, mogelijk verschillende strategieën kunnen kiezen voor het gebruik van de strategie voor het vastleggen van celoppervlak. Deze strategieën omvatten miniaturisatie en automatisering van het celoppervlakopnameprotocol voor kleine monsterinvoer28 en het gebruik van streptavidin-kralen met verschillende bindingscapaciteit29, afhankelijk van de toepassing. De hier geïllustreerde methode en workflow dienen als een robuuste, eenvoudig uit te voeren algemene strategie voor eiwitverrijking op het celoppervlak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Dr. Kamal Mandal (Dept of Laboratory Medicine, UCSF) voor hulp bij het opzetten van de LC-MS/MS run, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) voor hulp bij data-analyse en Dr. Audrey Reeves (Dept of Laboratory Medicine, UCSF) voor hulp bij data-analyse. Gerelateerd werk in het A.P.W. lab wordt ondersteund door NIH R01 CA226851 en de Chan Zuckerberg Biohub. Figuur 1 en figuur 2B zijn gemaakt met behulp van BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
- Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Bausch-Fluck, D., et al.
- Takahashi, Y., et al. Research advance in tumor specific antigens: A narrative review. AME Medical Journal. 6, 35 (2021).
- Li, Y., Qin, H., Ye, M. An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling. Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).
- Wollscheid, B., et al. Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).
- Chandler, K. B., Costello, C. C. Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities. Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).
- Ferguson, I. D., et al. The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance. Nature Communications. 13 (1), 4121 (2022).
- Karcini, A., Lazar, I. M. The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications. Scientific Reports. 12 (1), 10847 (2022).
- Köhnke, T., et al. Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML. Biomarker Research. 10 (1), 43 (2022).
- Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (177), e61786 (2021).
- Leung, K. K., et al. Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).
- Nix, M. A., et al. Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL. Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Hosen, N., et al. The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy. Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).
- Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery. Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).
- Itzhak, D. N., et al. A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons. Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).
- Kirkemo, L. L., et al. Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells. eLife. 11, 73982 (2022).
- Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows. Current Protocols. 1 (3), 85 (2021).
- Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation. Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PLoS One. 10 (3), 0121314 (2015).
- Griss, J., et al. ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).
- Waas, M., et al. SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates. Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- van Oostrum, M., et al. Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps. Nature Communications. 10 (1), 5734 (2019).
- Berg Luecke, L., Gundry, R. L. Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies. Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).
