Summary
Qui, descriviamo un flusso di lavoro di proteomica per la caratterizzazione del proteoma della superficie cellulare di vari tipi di cellule. Questo flusso di lavoro include l'arricchimento delle proteine della superficie cellulare, la successiva preparazione del campione, l'analisi utilizzando una piattaforma LC-MS/MS e l'elaborazione dei dati con software specializzato.
Abstract
Negli ultimi dieci anni, la proteomica basata sulla spettrometria di massa ha consentito una caratterizzazione approfondita dei sistemi biologici in una vasta gamma di applicazioni. Il proteoma della superficie cellulare ("surfaceome") nelle malattie umane è di interesse significativo, poiché le proteine della membrana plasmatica sono l'obiettivo primario della maggior parte delle terapie clinicamente approvate, nonché una caratteristica chiave con cui distinguere diagnosticamente le cellule malate dai tessuti sani. Tuttavia, la caratterizzazione mirata delle proteine di membrana e di superficie della cellula è rimasta impegnativa, principalmente a causa della complessità dei lisati cellulari, che mascherano le proteine di interesse da altre proteine ad alta abbondanza. Per superare questa barriera tecnica e definire con precisione il proteoma della superficie cellulare di vari tipi cellulari utilizzando la proteomica della spettrometria di massa, è necessario arricchire il lisato cellulare per le proteine della superficie cellulare prima dell'analisi sullo spettrometro di massa. Questo documento presenta un flusso di lavoro dettagliato per la marcatura delle proteine della superficie cellulare dalle cellule tumorali, l'arricchimento di queste proteine dal lisato cellulare e la successiva preparazione del campione per l'analisi della spettrometria di massa.
Introduction
Le proteine servono come unità fondamentali con cui viene svolta la maggior parte delle funzioni cellulari. Caratterizzare la struttura e la funzione delle proteine rilevanti è un passo essenziale per comprendere i processi biologici. Negli ultimi dieci anni, i progressi nella tecnologia della spettrometria di massa, nel software di analisi e nei database hanno consentito il rilevamento e la misurazione accurati delle proteine su scala1. La proteomica basata sulla spettrometria di massa può essere utilizzata in una vasta gamma di applicazioni, dall'analisi scientifica di base dei percorsi biochimici, all'identificazione di nuovi bersagli farmacologici in un ambiente traslazionale, alla diagnosi e al monitoraggio delle malattie nella clinica2. Durante lo screening di nuovi bersagli farmacologici, la caratterizzazione del proteoma della superficie cellulare è particolarmente importante, con oltre il 65% dei farmaci umani attualmente approvati che prendono di mira le proteine della superficie cellulare3. Il campo dell'immunoterapia del cancro si basa anche interamente su antigeni di superficie cellulare specifici del cancro per colpire ed eliminare specificamente le cellule tumorali4. La proteomica basata sulla spettrometria di massa può quindi servire come uno strumento promettente per identificare nuove proteine della superficie cellulare verso interventi terapeutici.
Tuttavia, ci sono diverse limitazioni quando si utilizzano metodi di proteomica convenzionali per esaminare le cellule tumorali per nuovi bersagli proteici di superficie cellulare. Una preoccupazione primaria è che le proteine di superficie costituiscono una frazione molto piccola delle molecole proteiche totali in una cellula. Pertanto, frammenti di queste proteine sono mascherati da un'elevata abbondanza di proteine intracellulari quando si esegue l'analisi dispettrometria di massa del lisato 5 dell'intera cellula. Questa limitazione rende difficile caratterizzare accuratamente il proteoma della superficie cellulare con un flusso di lavoro di proteomica tradizionale. Per affrontare questa sfida, è necessario sviluppare modi per arricchire le proteine della superficie cellulare dal lisato dell'intera cellula, prima dell'analisi sullo spettrometro di massa. Uno di questi metodi prevede l'ossidazione e la marcatura della biotina delle proteine della superficie cellulare glicosilata nelle cellule intatte e il successivo arricchimento di queste proteine biotinilate dal lisato con un pulldown di neutravidina, un processo che è stato definito "cattura della superficie cellulare"6. Poiché si ritiene che ~ 85% delle proteine della superficie cellulare di mammifero siano glicosilate7, questo serve come metodo efficace per arricchire il proteoma della superficie cellulare dall'intero lisato cellulare. Questo documento descrive un flusso di lavoro completo, a partire dalle cellule coltivate, della marcatura della biotina della superficie cellulare e della successiva preparazione del campione per l'analisi della spettrometria di massa (Figura 1). Su diverse repliche, questo metodo fornisce una copertura robusta del proteoma della superficie cellulare di un particolare campione. L'utilizzo di questo metodo per caratterizzare il proteoma della superficie cellulare sia del tumore che delle cellule sane può facilitare la scoperta di nuovi antigeni di superficie cellulare per identificare potenziali bersagli immunoterapeutici8.
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Protocol
NOTA: Le cellule di plasmacitoma AMO1 sono state utilizzate per questo esperimento sul proteoma della superficie cellulare. Lo stesso protocollo potrebbe essere utilizzato anche per altri tipi di cellule, tra cui una vasta gamma di sospensioni e linee cellulari aderenti9, nonché vari tipi di campioni primari10. Tuttavia, il numero di cellule (materiale di partenza per l'esperimento) in genere deve essere ottimizzato per una copertura proteoma equivalente. Per i dettagli relativi ai materiali e alle attrezzature, vedere la tabella dei materiali. Per i dettagli relativi ai tamponi e alle soluzioni di reagenti e alla loro composizione, vedere la Tabella 1.
1. Etichettatura della superficie cellulare con biotina
- Contare le cellule coltivate e pellet circa 3,5 × 107 cellule vive mediante centrifugazione (5 min a 500 × g, 24 °C).
NOTA: Le cellule di plasmacitoma AMO1 sono state fatte passare con terreni freschi ogni 3 giorni prima della raccolta. - Aspirare il surnatante e risospendere il pellet aggiungendo 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco fredda (4 °C) (senza calcio, senza magnesio) e facendo delicatamente pipettare su e giù.
- Pellettare nuovamente le celle (come al punto 1.1) e ripetere la fase di lavaggio (fase 1.2) ancora una volta (due lavaggi in totale).
- Dopo il secondo lavaggio, pellettare le cellule (come al punto 1.1) e risospenderle in 990 μL di D-PBS freddo mediante pipettaggio delicato.
- Preparare preventivamente una soluzione madre di metaperiodato di sodio 160 mM (NaIO4). Suddividere in aliquote da 50 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Aggiungere 10 μL di soluzione di metaperiodato di sodio 160 mM alla sospensione cellulare nella fase 1.4, mescolare accuratamente e incubare su un rotore end-to-end per 20 minuti a 4 °C.
- Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule (come al punto 1.1), decantare il surnatante e risospendere in 1 ml di D-PBS freddo. Ripetere questa fase di lavaggio due volte (tre lavaggi in totale). Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in 989 μL di D-PBS.
- Preparare preventivamente una soluzione madre di 100 mM di biocitina idrazide. Suddividere in aliquote da 50 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Aggiungere 1 μL di anilina e 10 μL di 100 mM di biocitina idrazide alla sospensione cellulare nella fase 1.6, mescolare accuratamente e incubare su un rotore end-to-end per 60 minuti a 4 °C.
- Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule (come al punto 1.1), decantare il surnatante e risospendere in 1 ml di D-PBS freddo. Ripetere questa fase di lavaggio due volte (tre lavaggi in totale).
- Dopo il terzo lavaggio, aspirare con cura il surnatante con un pipet e congelare a scatto il pellet cellulare posizionando il tubo nel liquido N2. Porre il pellet congelato a -80 °C, fino al momento di procedere con la lisi e il pulldown.
2. Lisi cellulare e pulldown della biotina
- Scongelare il pellet cellulare congelato sul ghiaccio.
- Aggiungere 500 μL di tampone di lisi 2x al pellet, mescolare accuratamente e vortice per 30 s.
NOTA: Per lisare completamente il pellet può essere necessario un vigoroso pipettaggio e vortexing. Alcuni detriti insolubili (cioè il DNA) sono accettabili, poiché vengono rimossi nella successiva fase di sonicazione. - Sonicare il lisato cellulare sul ghiaccio (tre raffiche, 20 s ciascuna, ciclo di lavoro del 60%).
- Centrifugare il lisato per pellettare eventuali residui (10 min a 17.200 × g a 4 °C).
- Durante la centrifugazione del lisato, aggiungere 100 μL di resina di agarosio di neutravidina a una colonna di filtrazione. Fissare la colonna a un collettore a vuoto, applicare un vuoto delicato e lavare le perle facendo scorrere 3 ml di tampone di lavaggio 1 su di esse.
- Rimuovere la colonna di filtrazione dal collettore del vuoto, tappare il fondo e aggiungere il lisato di cella chiarificato alla colonna con le perle. Tappare la parte superiore della colonna e incubare il lisato con le perle su un rotore end-to-end per 120 minuti a 4 °C.
NOTA: Quando si tappa la parte superiore della colonna, tenere saldamente il cappuccio inferiore in posizione, altrimenti potrebbe staccarsi e il lisato cellulare potrebbe fuoriuscire durante l'incubazione. - Preparare i tamponi di lavaggio 1, 2 e 3 (circa 5 ml di ciascun tampone di lavaggio per campione, fare riferimento alla Tabella 1) e metterli a bagnomaria a 42 °C
- Dopo che il lisato ha terminato l'incubazione, riposizionare la colonna di filtrazione sul collettore del vuoto, applicare un vuoto delicato e lavare le perle facendo scorrere 5 ml di tampone di lavaggio 1 su di esse.
NOTA: per il lavaggio è possibile utilizzare più di 5 ml di tamponi di lavaggio; Il lavaggio extra può ridurre lo sfondo, il legame non specifico sulle perline. - Ripetere la fase di lavaggio con 5 ml di tampone di lavaggio 2.
- Ripetere la fase di lavaggio con 5 ml di tampone di lavaggio 3.
- Una volta che il tampone di lavaggio finale è fluito interamente attraverso le perline, rimuovere la colonna dal collettore. Aggiungere 100 μL di soluzione di "Lyse" alle sfere e trasferirle in una provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 1,7 ml con un pipet. Ruotare brevemente il tubo per depositare le perle e rimuovere 50 μL della soluzione senza disturbare le perle depositate.
NOTA: I reagenti in questa fase e in tutte le fasi successive utilizzano un kit di preparazione del campione di proteomica disponibile in commercio. Il kit fornisce un flusso di lavoro di preparazione dei campioni ottimizzato e semplificato. Tuttavia, questi passaggi possono anche essere eseguiti indipendentemente dal kit, utilizzando un flusso di lavoro di proteomica tradizionale come descritto in Verma et al.9. Se le perle rimangono attaccate al lato o al fondo della colonna, lasciare che le perle che sono state trasferite al tubo si depositino e utilizzare una soluzione aggiuntiva di "Lyse" nel tubo per trasferire le perle rimanenti. - Posizionare il tubo su un blocco termico/agitatore a 65 °C e agitare a 1.000 giri/min per 10 minuti.
NOTA: Questo passaggio è necessario per la riduzione e l'alchilazione dei residui di cisteina prima della digestione.
3. Digestione delle proteine
- Risospendere la tripsina essiccata (provetta "Digest" nel kit, conservata a -20 °C) aggiungendo 210 μL della soluzione "Resuspend". Pipet la soluzione su e giù più volte per garantire che tutta la tripsina essiccata sia risospesa.
- Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 μL della soluzione di tripsina risospesa alle perline. Incubare la provetta a 37 °C, agitando a 500 giri/min per almeno 90 minuti per digerire la proteina.
- Una volta completata la digestione, trasferire la soluzione contenente le perle in una colonna di rotazione e inserire la colonna in una provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 1,7 ml. Girare il tubo (500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente [RT]) per separare la soluzione peptidica digerita dalle perle.
NOTA: In questa fase, il trattamento con PNGasi può essere eseguito sulle perle una volta separate dalla soluzione peptidica, per eluire frammenti di peptidi biotinilati dalle perle di streptavidina. Questo campione peptidico può quindi essere portato avanti attraverso il resto del flusso di lavoro come un campione peptidico secondario separato che può essere analizzato e confrontato con il campione primario dalla tripsinizzazione on-bead. È probabile che l'approccio PNGasi fornisca dati complementari alla tripsinizzazione on-bead, data la specificità aggiuntiva per le asparagine N-glicosilate catturate sulla base della modifica della catena laterale rilevabile dalla SM12. Tuttavia, lo svantaggio di questo approccio di eluizione sequenziale è il requisito del doppio del tempo dello strumento dello spettrometro di massa per analisi del campione. - Aggiungere 100 μL della soluzione "Stop" per interrompere la reazione di digestione e acidificare la soluzione peptidica.
4. Desalinizzazione dei peptidi
- Utilizzando un adattatore per tubi, posizionare una colonna di dissalazione in una provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 1,7 ml. Aggiungere l'intera soluzione peptidica acidificata alla colonna. Ruotare la colonna (3.800 × g per 3 minuti) in modo che la soluzione scorra attraverso la colonna. I peptidi sono ora legati alla colonna; Eliminare il flusso through.
- Aggiungere 200 μL di soluzione "Wash 1" alla colonna e centrifugare (3.800 × g per 3 min, RT). Eliminare il flusso continuo.
- Aggiungere 200 μL di soluzione "Wash 2" alla colonna e centrifugare (3.800 × g per 3 min, RT). Eliminare il flusso continuo.
- Trasferire la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 1,7 mL. Aggiungere 100 μL di soluzione "Elute" alla colonna e centrifugare (3.800 × g per 3 minuti, RT). Aggiungere altri 100 μL di soluzione "Elute" alla colonna e centrifugare (3.800 × g per 3 minuti, RT). I peptidi vengono ora eluiti dalla colonna nel tubo.
- Mettere la soluzione peptidica in una centrifuga sottovuoto e lasciarla asciugare per una notte. Posizionare i peptidi essiccati a -80 °C fino al momento di quantificare e analizzare sullo spettrometro di massa.
5. Risospensione e quantificazione dei peptidi
- Risospendere i peptidi essiccati in 20 μL di solvente A (0,1% acido formico, 2% acetonitrile).
- Centrifugare i peptidi risospesi (17.200 × g per 10 minuti) per pellettare eventuali detriti insolubili.
- Preparare gli standard peptidici per il test di quantificazione colorimetrica del peptide.
- Introdurre 5 μL di 1.000 mg/mL di soluzione madre di peptidi in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti.
- Eseguire una diluizione seriale in sette fasi nella piastra con acqua deionizzata (DI), come segue, con 5 μL di ciascun standard per pozzetto: 1.000 mg/ml, 500 mg/ml, 250 mg/ml, 125 mg/ml, 62,5 mg/ml, 31,25 mg/ml e 15,625 mg/ml. Mettere 5 μL di acqua DI in un ottavo pozzetto per il bianco.
- Posizionare 4 μL di acqua DI in tre pozzetti separati della piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 1 μL della soluzione peptidica risospesa a ciascun pozzetto, per un volume totale di 5 μL.
NOTA: Quando si pipetta la soluzione peptidica per la quantificazione, pipettare accuratamente dalla parte superiore della soluzione per evitare di disturbare eventuali detriti depositati. - Calcolare la quantità di reagente di lavoro necessaria (45 μL necessari per pozzetto). Preparare il volume richiesto del reagente di lavoro del saggio colorimetrico; vortice il reagente di lavoro per garantire una corretta miscelazione dei componenti.
- Aggiungere 45 μL del reagente di lavoro a ciascuno dei pozzetti standard e campione.
NOTA: rendere gli standard in duplicato e utilizzare un pipet multicanale per garantire una differenza minima nei tempi di quando il reagente viene aggiunto ai pozzetti. - Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare a 37 °C per 15 min.
- Analizza la piastra su un lettore automatico di piastre. Utilizzare i valori di assorbanza registrati per i campioni standard per generare una curva standard lineare. Determinare l'equazione della curva standard e del valore R2 . Se il valore R2 è ragionevole (≥0,95), utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione di peptidi risospesi, tenendo conto della diluizione quintuplicata nella piastra di analisi colorimetrica.
6. Analisi cromatografica-spettrometria di massa tandem liquida (LC-MS/MS) dei peptidi digeriti
- Regolare la concentrazione dei campioni peptidici a 0,2 μg/μL aggiungendo il solvente A e trasferire 10 μL in una provetta a basso legame proteico da 0,6 ml.
- Posizionare il tubo nell'autocampionatore LC.
- Impostare i parametri LC e MS/MS, in base alle Figure 2 e 3.
- Iniettare 5 μL (1 μg) del campione peptidico nella configurazione LC-MS/MS per l'analisi.
NOTA: le impostazioni LC-MS/MS mostrate qui sono rappresentative solo per le illustrazioni. A seconda della disponibilità dello strumento LC e MS, gli utenti possono modificare le impostazioni per il gradiente LC e i parametri MS/MS per ottenere una copertura profonda del proteoma. Per questo documento, l'analisi dei dati MS è stata eseguita utilizzando MaxQuant https://www.maxquant.org/, l'analisi dei dati secondari è stata eseguita utilizzando Perseus https://maxquant.net/perseus/ e l'analisi del percorso utilizzando https://reactome.org/.
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Representative Results
Per questo esperimento, abbiamo caratterizzato il proteoma della superficie cellulare di una linea cellulare tumorale marcando le proteine di membrana N-glicosilate di cellule intatte con biotina e arricchendo queste proteine marcate dall'intero lisato cellulare con un pulldown di neutravidina (Figura 1). Inoltre, abbiamo eseguito l'analisi del proteoma utilizzando LC-MS / MS per caratterizzare le proteine della superficie cellulare arricchita. A differenza dell'analisi del proteoma dell'intera cellula, qui, l'obiettivo era quello di caratterizzare solo le proteine della superficie cellulare. Quindi, abbiamo iniziato con un input campione di 3,5 × 107 cellule di plasmacitoma AMO-1. Abbiamo ottenuto una concentrazione finale di peptidi di ~ 630 ng / μL basata sul saggio di quantificazione colorimetrica del peptide e la resa totale era ~ 12,6 μg di peptidi (in 20 μL) (Figura 2A). Abbiamo quindi iniettato 1 μg di campione di peptide nel sistema LC-MS / MS e ripetuto l'iniezione tre volte per le repliche tecniche. I parametri LC e MS utilizzati sono stati ottimizzati sulla base di esperimenti precedenti (Figura 2C e Figura 3A). Abbiamo utilizzato una lunga pendenza LC di 4 ore per garantire la massima copertura.
I dati LC-MS/MS sono stati analizzati utilizzando MaxQuant; Siamo stati in grado di identificare 2.221 proteine con almeno un peptide unico e 1.764 proteine con almeno due peptidi unici in tutte e tre le repliche. In totale, sono stati identificati 12.307 peptidi unici. Abbiamo determinato l'arricchimento delle proteine della superficie cellulare nel campione utilizzando uno script Python (lo script esatto che abbiamo usato può essere trovato nella Figura supplementare S1) che confronta i risultati ottenuti da MaxQuant con diversi set di dati stabiliti di proteine della superficie cellulare. Questi set di dati includono il precedentemente riportato "in silico surfaceome"3 e un set di dati stabilito da proteine annotate come localizzate in membrana in UniProt13 (i set di dati sono disponibili nella Tabella supplementare S1). Questa analisi ha prodotto 601 proteine di superficie nel nostro campione (circa il 27% di tutte le proteine identificate) (Figura 4A). È stata eseguita l'annotazione dell'ontologia genica (http://geneontology.org/), che ha indicato circa il 30% delle proteine da localizzare canonicamente nella membrana plasmatica. L'analisi della via del reattoma (https://reactome.org/) ha anche indicato un arricchimento relativo delle proteine di membrana coinvolte nel trasporto trans-membrana e nelle interazioni della superficie cellulare (Figura 5 e Tabella supplementare S2).
Figura 1: Flusso di lavoro per l'etichettatura della superficie cellulare e la successiva preparazione del campione per l'analisi della spettrometria di massa. In primo luogo, le proteine sulla superficie del campione cellulare desiderato sono etichettate con biotina. Queste cellule vengono poi lisate, seguite dall'incubazione con perle di neutravidina che legano le proteine marcate con biotina. Le perle vengono quindi lavate ripetutamente per rimuovere le proteine intracellulari e altri contaminanti. Il campione proteico subisce quindi una digestione on-bead con l'aggiunta di tripsina. Il campione risultante di frammenti peptidici viene quindi sottoposto a desalinizzazione per rimuovere i contaminanti dalle fasi di lavaggio e digestione. Il campione peptidico finale viene quindi essiccato e pronto per essere sottoposto ad analisi di spettrometria di massa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Curva standard di quantificazione colorimetrica dei peptidi e gradiente LC. (A) Curva standard a otto punti generata dal saggio di quantificazione colorimetrica del peptide utilizzato per determinare la concentrazione di peptidi nei campioni trattati. (B) Un'illustrazione del sistema LC-MS/MS utilizzato per trattare i campioni. (C) Gradiente cromatografico liquido e portata utilizzati per l'iniezione di campioni sullo spettrometro di massa. Abbreviazioni: LC-MS/MS = cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Parametri di spettrometria di massa e cromatogramma rappresentativo . (A) Parametri utilizzati per questo esperimento utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap. (B) Cromatogramma rappresentativo generato mediante analisi di spettrometria di massa secondo il protocollo di "cell surface capture" per un gradiente di 4 ore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi dell'arricchimento proteico della superficie cellulare e confronto delle repliche tecniche. Questi set di dati includono il " surfaceome in silico"3 precedentemente riportato e un set di dati stabilito da proteine annotate come localizzate in membrana in UniProt13. (A) Il numero di proteine e peptidi identificati con un cut-off diverso dopo la rimozione di contaminanti, proteine inverse e un valore q > 0,05. (B) Il grafico rappresenta la distribuzione della proteina identificata e il punteggio di Andromeda14. (C) Il grafico a dispersione illustra la correlazione campione-campione. La correlazione di rango di Spearman misura la forza e la direzione dell'associazione tra due variabili classificate. (D) Box plot raffiguranti la variazione run-to-run. (E) Grafico di distribuzione campionario che rappresenta la qualità dei dati delle repliche. Abbreviazione: LFQ = quantificazione label-free. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Analisi del percorso. L'analisi del percorso è stata eseguita utilizzando Reactome versione 8222. Una rappresentazione illustrativa delle interazioni della superficie cellulare sulla parete vascolare, che mostra l'arricchimento del proteoma della superficie cellulare per le interazioni chiave coinvolte nell'interazione piastrinica e leucocitaria con l'endotelio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Nome del reagente | Composizione | Immagazzinamento | |||||
| 100 mM di biocitina idrazide | biocitina idrazide in forma di polvere disciolta in DMSO | Suddividere in aliquote da 50 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi. | |||||
| 160 mM metaperiodato di sodio (NaIO4) | NaIO4 solido disciolto in acqua DI | Suddividere in aliquote da 50 μL e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi. | |||||
| 2x tampone di lisi RIPA | 2x tampone di lisi RIPA, 1,25 mM EDTA, cocktail inibitore della proteasi monouso | Preparare fresco ogni volta prima di utilizzare 10x RIPA Lysis Buffer. | |||||
| Saggio colorimetrico peptidico Reagente di lavoro | 50% Reagente A, 48% Reagente B, 2% Reagente C | Preparare fresco ogni volta prima dell'uso. Conservare i componenti a 4 °C. | |||||
| Solvente A | 0,1% acido formico, 2% acetonitrile | Può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente | |||||
| Tampone di lavaggio 1 | 1x tampone di lisi RIPA, 1 mM EDTA | Può preparare in anticipo grandi lotti e conservare a temperatura ambiente | |||||
| Tampone di lavaggio 2 | 1x PBS, 1 M NaCl | Può preparare in anticipo grandi lotti e conservare a temperatura ambiente | |||||
| Tampone di lavaggio 3 | 2 M Urea, 50 mM Bicarbonato di ammonio | Preparare fresco ogni volta come l'urea si degraderà rapidamente nel tempo. | |||||
Tabella 1: Buffer e soluzioni di reagenti utilizzati in questo protocollo.
Figura supplementare S1: Script Python per confrontare i risultati ottenuti da MaxQuant con diversi set di dati stabiliti di proteine della superficie cellulare. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S1: Set di dati delle proteine della superficie cellulare. Questi set di dati includono il " surfaceome in silico"3 precedentemente riportato e un set di dati stabilito da proteine annotate come localizzate in membrana in UniProt13. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S2: I 10 percorsi più rilevanti (ordinati per valore p ) sono presentati qui. Abbreviazioni: FDR = tasso di scoperta falsa; SLC = trasportatore di soluto; TCR = Recettore delle cellule T. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
La proteomica basata sulla spettrometria di massa è un potente strumento che ha permesso la caratterizzazione imparziale di migliaia di proteine sconosciute su una scala precedentemente impossibile. Questo approccio ci consente di identificare e quantificare le proteine, nonché di raccogliere una serie di intuizioni per le capacità strutturali e di segnalazione di cellule e tessuti, caratterizzando la varietà di proteine presenti in un particolare campione. Andando oltre il profilo proteico globale in un campione, la spettrometria di massa ci consente di caratterizzare varie modifiche post-traduzionali (PTM) su queste proteine, fornendo uno sguardo ancora più profondo sulle fasi delle vie di segnalazione e sulle dinamiche proteiche non disponibili quando si analizzaa livello 1 di DNA o RNA. Verso lo sviluppo di nuove terapie antitumorali, la proteomica basata sulla spettrometria di massa ci consente di confrontare il profilo proteico delle cellule tumorali maligne rispetto ai tessuti sani, per identificare potenziali bersagli farmacologici.
Il campo in rapida crescita dell'immunoterapia del cancro si basa su antigeni espressi sulla superficie delle cellule maligne per identificare e distruggere selettivamente i tumori. Poiché lo sviluppo di nuove immunoterapie antitumorali è limitato dalla mancanza di antigeni specifici del cancro unici, che sono assenti nei tessuti sani, è fondamentale identificare più nuovi antigeni specifici per le cellule tumorali15. Gli antigeni tumore-specifici non devono necessariamente essere proteine intere uniche per la cellula tumorale, ma possono anche essere conformazioni proteiche specifiche o PTM assenti nei tessuti sani16,17. L'analisi proteomica delle proteine della superficie cellulare sia sul tumore che sulle cellule sane può produrre nuovi bersagli antigenici specifici per il cancro. La proteomica della superficie cellulare richiede l'arricchimento di proteine di superficie dal lisato dell'intera cellula prima dell'analisi di spettrometria di massa, per ridurre la complessità del campione ed evitare la soppressione ionica delle proteine di membrana desiderate (spesso a bassa abbondanza) da parte di proteine intracellulari altamente espresse18. Mentre la strategia di cattura della superficie cellulare impiegata qui è uno degli approcci di arricchimento più comunemente usati per la proteomica della superficie cellulare, ci sono altri metodi per l'arricchimento proteico della superficie cellulare che sono stati integrati con un flusso di lavoro di spettrometria di massa, tra cui l'ultracentrifugazione selettiva delle membrane cellulari, l'etichettatura della biotina NHS delle lisine superficiali e la biotinilazione enzimatica delle proteine della superficie cellulare19, 20. I confronti testa a testa suggeriscono che l'approccio di cattura della superficie cellulare fornisce l'equilibrio ottimale tra facilità d'uso e arricchimento efficace e relativamente imparziale delle proteine della superficie cellulare con la più bassa etichettatura di fondo delle proteine intracellulari20.
Questo documento presenta un protocollo efficace ed efficiente in termini di tempo per un flusso di lavoro di proteomica della superficie cellulare integrando la procedura di etichettatura e pulldown della superficie cellulare con un flusso di lavoro ottimizzato per la preparazione dei campioni di proteomica (Figura 1). L'intera procedura, dalla raccolta di cellule in coltura all'analisi sullo spettrometro di massa, potrebbe essere realizzata nel corso di 3 giorni. Per ottenere una copertura più robusta del proteoma di superficie, potrebbe essere necessario ottimizzare l'input iniziale delle cellule in base al tipo di cellula utilizzata. Si consiglia di eseguire un esperimento pilota con input cellulari variabili, che vanno da pochi milioni di cellule fino a 50 milioni di cellule, per garantire la massima copertura. Inoltre, se si osserva una grande quantità di proteine intracellulari altamente esplicite, un maggiore lavaggio delle sfere di neutravidina dopo l'incubazione con il lisato potrebbe ridurre al minimo il legame non specifico delle proteine alle perle.
Si consiglia di eseguire l'esperimento con almeno tre repliche biologiche e tre repliche tecniche per condizione, per aumentare la fiducia che i marcatori di superficie cellulare identificati siano effettivamente presenti sulla maggior parte delle cellule. Inoltre, quando si esegue il flusso di lavoro di acquisizione della superficie cellulare per un nuovo tipo di campione, potrebbe essere utile analizzare un lisato di cellule intere utilizzando un approccio proteomico convenzionale21, da confrontare con i risultati della cattura della superficie cellulare. L'analisi dei dati grezzi della spettrometria di massa può essere eseguita da vari pacchetti di ricerca di database e software - qui, abbiamo usato MaxQuant - per produrre un elenco di proteine identificate22,23. Questa lista può essere filtrata su vari database noti 3,24 di proteine di superficie per stabilire un elenco delle proteine della superficie cellulare identificate in un singolo esperimento. Una volta stabilito un elenco di proteine della superficie cellulare, possono essere ulteriormente analizzate per il loro ruolo nei percorsi biochimici rilevanti25 o candidati bersaglio farmacologico26. Questo flusso di lavoro può essere applicato a un'ampia varietà di tipi di cellule, tra cui la sospensione e le linee cellulari aderenti (per le cellule aderenti, si consiglia di sollevare le cellule senza l'uso di tripsina prima della preparazione del campione, per evitare la scissione delle proteine della superficie cellulare), nonché campioni primari.
Utilizzando questo flusso di lavoro, siamo stati in grado di caratterizzare con sicurezza il proteoma della superficie cellulare di una particolare linea cellulare. Confrontando il proteoma di superficie delle linee cellulari tumorali con le cellule sane e incrociando i riferimenti con un database di sequenziamento dell'RNA per tessuti normali, è stato possibile stabilire un elenco di potenziali bersagli immunoterapeutici 8,13. Una limitazione di questo metodo è che, nonostante il significativo arricchimento delle proteine della superficie cellulare rispetto a un esperimento standard di lisato di cellule intere, la maggior parte delle proteine identificate dall'analisi della spettrometria di massa in questo flusso di lavoro sono ancora annotate come intracellulari. A seconda della rigore del database delle proteine di superficie utilizzato, circa il 25% -30% delle proteine identificate provengono dalla superficie cellulare. Prevediamo che una parte significativa del fondo non superficiale probabilmente emana da proteine di fondo non specificamente legate alle perle (ad esempio, come caratterizzato dall'analisi CRAPome27), mentre altri rappresentano la penetrazione cellulare del reagente marcante per reagire con le proteine N-glicosilate nel reticolo endoplasmatico, Golgi o altri compartimenti intracellulari.
Mentre i metodi alternativi di eluizione dei peptidi come il trattamento con la PNGasi determinano un arricchimento molto maggiore di N-glicositi tra i peptidi totali analizzati, questo approccio consente solo l'identificazione di singoli peptidi gliciosilati e perde informazioni preziose dal resto non glicosilato della sequenza proteica tirata verso il basso12. Queste informazioni aggiuntive possono essere catturate con questo approccio di tripsinizzazione on-bead, anche se al potenziale compromesso di una ridotta specificità per le proteine N-glicosilate analizzate nello spettrometro di massa. Inoltre, anche l'eluizione della PNGasi non supera la sfida di marcare le proteine glicosilate intracellulari e un'eluizione della PNGasi porta tipicamente a un solo peptide per proteina; Ciò porta a una significativa variabilità nell'identificazione delle proteine, secondo l'esperienza del nostro laboratorio, mentre la digestione on-bead qui descritta porta a più peptidi per proteina catturata. Pertanto, a seconda dell'obiettivo dell'esperimento, si potrebbero potenzialmente scegliere diverse strategie per l'impiego della strategia di cattura della superficie cellulare. Queste strategie includono la miniaturizzazione e l'automazione del protocollo di cattura della superficie cellulare per piccoli input di campioni28 e l'utilizzo di perle di streptavidina con capacità di legame variabile29 a seconda dell'applicazione. Il metodo e il flusso di lavoro qui illustrati fungono da strategia generale robusta e facile da eseguire per l'arricchimento proteico della superficie cellulare.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Kamal Mandal (Dept of Laboratory Medicine, UCSF) per l'aiuto nella configurazione della corsa LC-MS / MS, Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) per l'aiuto con l'analisi dei dati e la dott.ssa Audrey Reeves (Dept of Laboratory Medicine, UCSF) per l'aiuto con l'analisi dei dati. Il lavoro correlato nel laboratorio A.P.W. è supportato da NIH R01 CA226851 e dal Chan Zuckerberg Biohub. La Figura 1 e la Figura 2B sono state realizzate utilizzando BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| 96X iST Sample Preparation Kit | PreOmics | P.O.00027 | Proteomics sample preparation kit. Includes reagents for reduction, alkylation, and digestion. Also include desalting columns and reagents. |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo | 23275 | Peptide quantification kit. Includes peptide standards and components of working reagents. |
| Reagents | |||
| Acetonitrile | Fisher | A955-1 | |
| Ammonium bicarbonate | Millipore Sigma | 09830-1KG | |
| Biocytin hydrazide | Biotium | 90060 | |
| D-PBS (w/o Calcium and Magnesium Salts) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003-225B01 | |
| Formic Acid | Honeywell | 94318 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail | Thermo | 1861280 | |
| High Capacity Neutravidin Agarose Resin | Thermo | 29204 | |
| Phosphate Buffered Saline | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL001-22J01 | |
| RIPA Lysis Buffer, 10x | Millipore Sigma | 20-188 | |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium metaperiodate | Alfa Aesar | 13798 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
| Urea (Proteomics Grade) | VWR | M123-1KG | |
| Equipment | |||
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | |
| PrismR Microcentrifuge | Labnet International | C2500-R-230V | |
| Sonicator | VWR | Branson Sonifier 240 | |
| Vacuum Manifold | Promega | Promega Vac-Man | |
| Shaking Heatblock | Eppendorf | Eppendorf Thermomixer C | |
| End-to-End rotator | Labnet | Revolver Adjustable Rotator | |
| LC | Thermo | Ultimate 3000 HPLC and UHPLC | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Microplate Reader | Biotek | Biotek Synergy 2 | |
| Vacuum Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Supplies | |||
| 1.5 mL Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| 1.7 mL Microcentrifuge Tubes | |||
| Filtration Columns | Bio-Rad | 7326008 | |
| Spin Columns | Thermo | 69725 |
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