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Summary
यहां, हम चूहे के मॉडल में नॉर्मोथर्मिक पूर्व सीटू संरक्षण के बाद एक हेटरोटॉपिक रूप से प्रत्यारोपित दिल का एक मूल्यांकन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
हृदय प्रत्यारोपण अंतिम चरण के दिल की विफलता के लिए सबसे प्रभावी चिकित्सा है। चिकित्सीय दृष्टिकोण और हस्तक्षेप में सुधार के बावजूद, प्रत्यारोपण के लिए इंतजार कर रहे दिल की विफलता के रोगियों की संख्या अभी भी बढ़ रही है। नॉर्मोथर्मिक एक्स सीटू संरक्षण तकनीक को पारंपरिक स्थैतिक कोल्ड स्टोरेज तकनीक के लिए एक तुलनीय विधि के रूप में स्थापित किया गया है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि दाता दिलों को शारीरिक स्थिति में 12 घंटे तक संरक्षित किया जा सकता है। इसके अलावा, यह तकनीक परिसंचरण मृत्यु के बाद दाता के दिलों के पुनर्जीवन की अनुमति देती है और आरोपण के बाद दाता समारोह में सुधार के लिए आवश्यक फार्माकोलॉजिकल हस्तक्षेप लागू करती है। नॉर्मोथर्मिक पूर्व सीटू संरक्षण तकनीकों में सुधार और संरक्षण से संबंधित जटिलताओं को खत्म करने के लिए कई पशु मॉडल स्थापित किए गए हैं। हालांकि छोटे पशु मॉडल की तुलना में बड़े पशु मॉडल को संभालना आसान है, यह महंगा और चुनौतीपूर्ण है। हम हेटरोटोपिक पेट प्रत्यारोपण के बाद नॉर्मोथर्मिक एक्स सीटू डोनर हार्ट प्रिजर्वेशन का एक चूहा मॉडल प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल अपेक्षाकृत सस्ता है और एक ही प्रयोगकर्ता द्वारा पूरा किया जा सकता है।
Introduction
हृदय प्रत्यारोपण दुर्दम्य दिल की विफलता के लिए एकमात्र व्यवहार्य चिकित्सा बनी हुईहै 1,2,3,4. हृदय प्रत्यारोपण की आवश्यकता वाले रोगियों की संख्या में लगातार वृद्धि के बावजूद, दाता अंगों की उपलब्धता में आनुपातिक वृद्धिनहीं देखी गई है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, चुनौतियों में सुधार और दाताओं की उपलब्धता 6,7,8,9 बढ़ाने के लक्ष्य के साथ दाता दिलों को संरक्षित करने के लिए नए दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं।
ऑर्गन केयर सिस्टम (ओसीएस) मशीनों का उपयोग करते हुए नॉर्मोथर्मिक एक्स सीटू हार्ट परफ्यूजन (एनईईएसपी) एक नैदानिक हस्तक्षेपके रूप में उभरा है। इस तकनीक को पारंपरिक स्थैतिक कोल्ड स्टोरेज (एससीएस) विधि 2,9 के लिए एक उपयुक्त विकल्प माना गया है। एनईएसएचपी प्रभावी रूप से कोल्ड इस्किमिया की अवधि को कम करता है, चयापचय की मांग को कम करता है, और दाता अंगों के परिवहन के दौरान इष्टतम पोषण आपूर्ति और ऑक्सीकरण की सुविधा प्रदान करता है। दाता अंग संरक्षण में सुधार के लिए इस पद्धति की स्पष्ट क्षमता के बावजूद, इसके नैदानिक अनुप्रयोग और आगे की जांच उच्च लागत से बाधित हुई है। इसलिए, एनईएसएचपी के प्रीक्लिनिकल पशु मॉडलइस तकनीक से जुड़ी प्रमुख तकनीकी चुनौतियों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सूअर और चूहे अपने इस्केमिकसहिष्णुता के कारण प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए पसंदीदा पशु मॉडल हैं। यद्यपि पोर्सिन मॉडल बुनियादी और अनुवाद अनुसंधान के लिए आदर्श है, यह इसकी उच्च लागत और देखभाल और रखरखाव के लिए आवश्यक गहन श्रम से सीमित है। इसके विपरीत, चूहे के मॉडल कम महंगे होते हैं और14 को संभालना आसान होता है।
इस अध्ययन में, हम एनईएसपी के एक सरलीकृत चूहे के मॉडल को पेश करते हैं, जिसके बाद हेटरोटोपिक हृदय प्रत्यारोपण, प्रत्यारोपण के बाद ग्राफ्ट स्थिति पर संरक्षण तकनीक के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए। यह मॉडल सीधा, लागत प्रभावी है, और एक ही प्रयोगकर्ता द्वारा निष्पादित किया जा सकता है। चित्रा 1 प्रक्रिया के योजनाबद्धता को दर्शाता है।
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Protocol
चोन्नम नेशनल यूनिवर्सिटी अस्पताल के प्रयोगशाला पशु अनुसंधान केंद्र की नैतिक समिति (अनुमोदन सं। सीएनयू आईएसीयूसी - एच - 2022-36) ने सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दी। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले नर स्प्राग-डॉवले चूहों (350-450 ग्राम) को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुपालन में देखभाल मिली। चूहों को 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्र के साथ तापमान-नियंत्रित कमरों में रखा गया था, जिसमें मानक भोजन और पानी उपलब्ध था।
1. तैयारी
नोट: एक एकल प्रयोगकर्ता सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का संचालन कर सकता है।
- सर्जरी से पहले ऑक्सीजनेटर, पंप और छिड़काव लाइनों सहित लैंगेंडॉर्फ तंत्र को इकट्ठा करें (चित्रा 2)। छिड़काव सर्किट को 20 एमएल नमकीन घोल से भरें और इसे तब तक प्रसारित करें जब तक कि यह ऑटोलॉगस रक्त से ग्रस्त न हो जाए।
नोट: इस कदम का उद्देश्य एक्स्ट्राकोर्पोरियल सर्किट को गर्म करना है। - महाधमनी प्रवेशनी से जुड़े स्टॉपकॉक के माध्यम से सर्किट में कार्डियोप्लेजिक लाइन संलग्न करें और अंतिम कार्डियोप्लेजिक जलसेक के लिए सिरिंज पंप तैयार करें।
नोट: छिड़काव सर्किट और कार्डियोप्लेजिक लाइन से किसी भी हवा के बुलबुले को हटाना सुनिश्चित करें। - जलाशय के भीतर तापमान सेंसर रखें जहां दाता हृदय संग्रहीत किया जाएगा, सर्किट के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाएगा।
- शल्य चिकित्सा की तैयारी
- प्रत्येक दाता और प्राप्तकर्ता चूहे के लिए बाँझ सूक्ष्म उपकरणों और सामग्रियों का एक अलग सेट तैयार करें।
- दाता के लिए सर्जिकल सेट तैयार करें: सर्जिकल कैंची की जोड़ी, माइक्रो फोर्सप्स की जोड़ी, तेज मच्छर फोर्स, 5-0 सिल्क सीवन, कॉटन स्वैब, 50 एमएल सिरिंज, कार्डियोप्लेजिक सॉल्यूशन (सीपीएस) के लिए छिड़काव लाइन, सिरिंज पंप, 18 ग्राम एंजियोकैथेटर, 5 फादर फेमोरल कैथेटर का एक सेट, और बाँझ धुंध।
- प्राप्तकर्ता के लिए सर्जिकल सेट तैयार करें: माइक्रोसर्जिकल कैंची, घाव को हटाने वाला, माइक्रो फोर्सप्स की जोड़ी, मच्छर बल, संवहनी माइक्रो क्लैंप, 1 एमएल सिरिंज, एक 5-0 और 9-0 पॉलीप्रोपाइलीन सीवन, 5-0 रेशम सीवन, कपास के फाहे और बाँझ धुंध।
- प्रत्येक दाता और प्राप्तकर्ता चूहे के लिए बाँझ सूक्ष्म उपकरणों और सामग्रियों का एक अलग सेट तैयार करें।
2. दाता हृदय संरक्षण और रक्त संग्रह
- एनेस्थीसिया कक्ष में आइसोफ्लुरेन (5%) के साथ दाता चूहे में संज्ञाहरण को प्रेरित करें और सर्जिकल टेबल पर रखने से पहले चूहे के वजन को रिकॉर्ड करें।
- चूहे को सर्जिकल टेबल पर लापरवाह स्थिति में रखें और नाक के माध्यम से 90% ऑक्सीजन के साथ 2% -2.5% आइसोफ्लुरेन वितरित करके निरंतर संज्ञाहरण का प्रशासन करें।
- पैर की अंगुली की चुटकी और सांस आवृत्ति की प्रतिक्रिया की कमी की जांच करके संज्ञाहरण की गहराई को सत्यापित करें, जो प्रति मिनट 50-60 के बीच होना चाहिए।
नोट: दाता चूहे को अनावश्यक तनाव और दर्द से बचने के लिए संज्ञाहरण का पर्याप्त स्तर महत्वपूर्ण है। - आंखों के स्नेहक को लागू करें और क्लैविकुला के लिए क्षेत्र पबिस को शेव करें, जहां सर्जरी की जाएगी। आयोडीन आधारित स्क्रब और 70% अल्कोहल के साथ क्षेत्र को साफ करें।
- कैथीटेराइजेशन
- 7 सेमी मध्य रेखा पेट का चीरा लगाएं और 3 सेमी मापने वाले द्विपक्षीय चीरे को ज़िफॉइड प्रक्रिया से मध्य-क्लैविकल तक मापें। वक्ष क्षेत्र से पत्थर को हटा दें।
- कपास के फाहे का उपयोग करके, पेट के अंगों को पेट के बाईं ओर जुटाएं। रेट्रोपरिटोनियल प्रावरणी और वसा ऊतकों से पेट की महाधमनी को अलग करें।
- 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके अवर वेना कावा (आईवीसी) के माध्यम से 0.3 एमएल आइसोटोनिक खारा में घुलने वाले 1,000 आईयू हेपरिन को इंजेक्ट करें। कपास के फाहे से धीरे से संपीड़ित करके सुई के छेद से किसी भी रक्तस्राव को रोकें।
नोट: इंजेक्शन के दौरान एयर एम्बोलिज्म से सावधान रहें, क्योंकि इससे कार्डियक अरेस्ट हो सकता है। - पेट की महाधमनी (एबीडी ए) में एक 5 एफआर ऊरु कैथेटर डालें। सुनिश्चित करें कि कैथेटर टिप महाधमनी आर्क तक पहुंचता है। कैथेटर के सम्मिलित भाग की अनुमानित लंबाई का आकलन करके कैथेटर स्थान की पुष्टि करें।
- रक्त संग्रह
- एबीडी ए में डाले गए कैथेटर के माध्यम से लगभग 10 एमएल रक्त एकत्र करें।
- बाद में, आइसोटोनिक खारा के साथ प्राइमिंग रक्त को पतला करें जब तक कि कुल मात्रा 12 एमएल तक न पहुंच जाए। 0.3 एमएल खारा और इंसुलिन (20 आईयू) में घुलने वाले 5 मिलीग्राम सेफाज़ोलिन जोड़ें।
- कार्डिएक अरेस्ट
- पहले से तैयार सीपीएस छिड़काव लाइन को पेट के कैथेटर से कनेक्ट करें और सीरिंज पंप के साथ सीपीएस प्रशासन को 800 एमएल / घंटा की दर से शुरू करें।
- डायाफ्राम से वक्ष गुहा खोलें और वेंट्रिकुलर डिस्टेंशन को रोकने के लिए आईवीसी को डायाफ्राम के करीब काटें। वक्ष यी रीढ़ के साथ पसलियों को वक्ष यी इनलेट तक द्विपक्षीय रूप से काटें। मच्छर ों के बल के साथ संगठित उदर छाती की दीवार को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित करें।
- महाधमनी चाप की कल्पना करने के लिए माइक्रो फोर्सप्स का उपयोग करके थाइमस को पूरी तरह से हटा दें। थाइमिक धमनियों से खून बहने पर हल्का कम्प्रेशन लगाएं।
- कुल
- सभी सीपीएस को प्रशासित करने के बाद, आसपास के ऊतकों से महाधमनी चाप को अलग करें। बाएं सबक्लेवियन धमनी के ठीक नीचे सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें।
- ब्राचियोसेफेलिक और आम कैरोटिड धमनियों को दूर की स्थिति में छोड़ दें, जिससे महाधमनी प्रवेशनी के दौरान महाधमनी चाप के लंबे स्टंप को आसानी से संभाला जा सके। मुख्य फुफ्फुसीय धमनी (एमपीए) को विभाजन के जितना संभव हो उतना करीब रखें। बाएं एट्रियल उपांग को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
- 5-0 रेशम सीवन के साथ बेहतर वेना कावा (एसवीसी) और आईवीसी को सावधानीपूर्वक लिपटें, दाहिने आलिंद (आरए) और कोरोनरी साइनस की रुकावट को रोकें। छाती के बाएं किनारे को गीली धुंध के साथ कवर करें, दिल को उस पर रखें और हिलम को उजागर करने के लिए धीरे से एसवीसी और आईवीसी लिगेचर को वापस ले लें।
- फुफ्फुसीय और एज़िगोस नसों को 5-0 रेशम सीवन के साथ मिलाएं। ऊतक पृष्ठीय को लिगेचर से अलग करें और हृदय को निकालें। किसी भी चोट के लिए दिल की जांच करें। अंत में, महाधमनी प्रवेशनी से पहले दिल का वजन करें।
3. पूर्व सीटू छिड़काव
- महाधमनी प्रवेशनी और छिड़काव
- महाधमनी प्रवेशनी से पहले, खारा-प्राइमेड सर्किट को रक्त प्राइमिंग के साथ बदलें।
- महाधमनी मेहराब में महाधमनी प्रवेशनी डालें और इसे अस्थायी माइक्रो क्लैंप के साथ सुरक्षित करें। सुनिश्चित करें कि कैनुला की नोक ब्राचियोसेफेलिक जंक्शन पर स्थित है।
- सूक्ष्म बल के साथ महाधमनी को धीरे से पकड़कर प्रवेशनी की सही स्थिति की पुष्टि करें।
- 2-3 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर छिड़काव शुरू करें, जिससे किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए परफ्यूसेट को प्रवेशनी स्थल से लीक करने की अनुमति मिलती है।
- निगरानी प्रणाली से जुड़े सेंसर के माध्यम से छिड़काव दबाव और तापमान की निगरानी करें।
- मुख्य फुफ्फुसीय धमनी (एमपीए) से शिरापरक रक्त लीक होने तक पहली और तर्जनी उंगलियों से दिल की धीरे-धीरे मालिश करें।
- महाधमनी को 1-0 रेशम के आवरण के साथ सुरक्षित करें और सभी सेटिंग्स (छिड़काव सर्किट, छिड़काव दबाव, तापमान) को सत्यापित करने के बाद क्लैंप को हटा दें।
- एक बार जब स्थायी लिगेचर रखा जाता है, तो सुनिश्चित करें कि दिल कुछ सेकंड के भीतर सिकुड़ना शुरू कर देता है और 60 सेकंड में सामान्य लय तक पहुंच जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 एमएल की कोरोनरी प्रवाह दर के साथ 55-65 मिमीएचजी का औसत छिड़काव दबाव पर्याप्त छिड़काव को इंगित करता है।
- जलाशय से 0.15 एमएल रक्त एकत्र करें और छिड़काव की शुरुआत में और उसके बाद हर 20 मिनट में रक्त गैस विश्लेषण (बीजीए) की जांच करें। छिड़काव के दौरान पीएच, पीसीओ 2, पीओ2, ग्लूकोज, हेमटोक्रिट, पोटेशियम और लैक्टेट की निगरानी और रिकॉर्ड करें। छिड़काव के 120 मिनट के बाद, दिल को गिरफ्तार करने के लिए 250 एमएल / घंटा की दर से सिरिंज पंप के माध्यम से 3 मिलीलीटर कस्टोडिओल का प्रशासन करें।
4. आरोपण
- प्राप्तकर्ता की तैयारी
- पूर्व सीटू छिड़काव की समाप्ति से 30 मिनट पहले प्राप्तकर्ता की तैयारी शुरू करें।
- चरण 2.2 में उल्लिखित उसी विधि का उपयोग करके प्राप्तकर्ता जानवर को एनेस्थेटाइज करें।
- चूहे को हीटिंग पैड पर लापरवाह स्थिति में रखें और शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए मलाशय में तापमान जांच डालें।
- आंखों के स्नेहक लागू करें, प्यूबिक को एपिगैस्ट्रिक क्षेत्र में शेव करें, और आयोडीन आधारित स्क्रब और 70% अल्कोहल के साथ क्षेत्र को साफ करें।
- दवाओं
- सर्जरी के दौरान खोए गए तरल पदार्थ की भरपाई के लिए 2 मिलीलीटर गर्म खारा इंजेक्शन लगाएं। हेपरिन के 200 आईयू को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
- एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस को 10 मिलीग्राम / किग्रा सेफाज़ोलिन को 0.3 मिलीलीटर खारा में घोलकर चमड़े के नीचे या इंट्रामस्क्युलर रूप से इंजेक्ट करके प्रशासित करें।
- 20 मिलीग्राम / किलोग्राम डाइक्लोफेनाक को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करके दर्द नियंत्रण का प्रबंधन करें।
- मध्य-रेखा लैप्रोटॉमी करें और पेट की गुहा को चौड़ा करने के लिए एक रिमुलेटर डालें। प्रक्रिया के लिए जगह बनाने के लिए कपास के फाहे का उपयोग करके प्राप्तकर्ता के बाईं ओर पेट के अंगों को जुटाएं।
- गर्म और गीली धुंध के साथ पेट के अंगों को लपेटकर निर्जलीकरण को रोकें। सर्जरी के दौरान 50 एमएल सिरिंज के साथ रुक-रुक कर गर्म खारा फैलाएं।
- 10x आवर्धन के साथ एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, एबीडी ए और आईवीसी को उजागर करने के लिए कपास के फाहे के साथ कुंद विच्छेदन द्वारा ग्रहणी और समीपस्थ जेजुनम को जुटाएं। एबीडी तैयार करें। एनास्टोमोसिस के लिए ए और आईवीसी और व्यवस्थित रूप से दाता हृदय को प्रत्यारोपित करना, चित्रा 3 या पहले प्रलेखित विधियों15 के अनुसार।
नोट: Abd. A. और IVC को अलग न करें।- संवहनी एनास्टोमोसिस को इन्फ्रारीनल मानते हुए, क्लैंपिंग के लिए महाधमनी और आईवीसी का पर्याप्त हिस्सा तैयार करें।
- वाहिकाओं के चारों ओर वसा और प्रावरणी को हटाने के लिए कपास के फाहे या तेज-सेरेटेड बल का उपयोग करके कुंद तैयारी करें।
- मेसेंटेरिक शाखाओं और प्रमुख जहाजों के कपाल और पुच्छल दोनों किनारों पर 5-0 रेशम के टुकड़े रखें। पेट की वाहिकाओं को ऊपर उठाएं और 5-0 रेशम सीवन के साथ काठ की शाखाओं को कोलेट या लिगेट करें। वृषण धमनियों और नसों को छोड़ना याद रखें और उन्हें दबाएं नहीं।
- एनास्टोमोसिस साइट पर रक्त प्रवाह को रोकने के लिए वाहिकाओं को उठाने और प्रमुख वाहिकाओं की मेसेंटेरिक शाखाओं, पुच्छल और कपाल पक्षों में माइक्रो-क्लैंप की स्थिति के लिए लिगेचर का उपयोग करें। क्लैंप रखने से पहले हीटिंग पैड को बंद कर दें, क्योंकि अतिरिक्त हीटिंग अंग इस्किमिया को बढ़ा सकती है। हाइपोथर्मिया से बचने के लिए वाहिकाओं को डी-क्लैंप करने के बाद हीटिंग पैड पर स्विच करना सुनिश्चित करें।
- 27 ग्राम सुई का उपयोग करके महाधमनी को पंचर करें और सूक्ष्म कैंची के साथ चीरे को दाता आरोही महाधमनी (एएससी) के उद्घाटन के बराबर या उससे थोड़ा बड़ा लंबाई तक बढ़ाएं। ए), जो लगभग 5 मिमी है।
- आईवीसी पर एक अनुदैर्ध्य चीरा उसी तरह से बनाएं जैसे कि ऑर्टोमी, लेकिन इसे महाधमनी चीरा की तुलना में पुच्छल पक्ष के 3 मिमी करीब बनाएं।
- एनास्टोमोसेस शुरू करते हुए, दाता के दिल को प्राप्तकर्ता के पेट के दाईं ओर रखा और दाता एएससी को संलग्न किया। प्राप्तकर्ता के एबीडी के लिए। अनुदैर्ध्य चीरा के कपाल कोने पर एक साधारण बाधित सिलाई (9-0 पॉलीप्रोपाइलीन) के साथ।
- दिल को प्राप्तकर्ता पेट के बाईं ओर ले जाएं और दाता के एएससी के एनास्टोमोसिस करें। प्राप्तकर्ता के एबीडी के साथ। एक चल रहे 9-0 पॉलीप्रोपाइलीन सीवन का उपयोग करना।
- दाता फुफ्फुसीय धमनी को आईवीसी में दो बाधित सीवन (9-0 पॉलीप्रोपाइलीन) के साथ अनुदैर्ध्य चीरा के पुच्छल और कपाल कोनों पर ठीक करें।
- पोत के इंट्राल्यूमिनल पक्ष से शिरापरक एनास्टोमोसिस का पहला आधा हिस्सा करें और पोत के एक्स्ट्राल्यूमिनल पक्ष से दूसरे आधे हिस्से को पूरा करें। समुद्री मील को कसने से पहले, वायु अन्त: शल्यता को रोकने के लिए खारा के साथ खेत को फ्लश करें।
- डी-एयरिंग और डी-क्लैंपिंग
- एनास्टोमोसिस को पूरा करने के बाद पहले मेसेंटेरिक नस क्लैंप को हटा दें ताकि हृदय के दाहिने हिस्से को शिरापरक रक्त से भरने की अनुमति मिल सके।
- कोरोनरी सर्किट और एएससी में हवा को हटा दें। ए. कई सेकंड के लिए प्रतिगामी कोरोनरी छिड़काव लागू करके।
- जहाजों के दोनों किनारों पर धुंध का एक टुकड़ा रखें और पुच्छल क्लैंप और कपाल क्लैंप को हटा दें।
- 1-2 मिनट के लिए कॉटन स्वैब के साथ कोमल कम्प्रेशन लागू करें। पर्याप्त हेमोस्टेसिस सुनिश्चित करने के बाद, स्वैब को हटा दें और एनास्टोमोसेस को गर्म खारा से धो लें।
नोट: दिल को रीपरफ्यूजन के पहले मिनट के भीतर धड़कना शुरू कर देना चाहिए। यदि प्राप्तकर्ता चूहे के शरीर का तापमान 35 डिग्री सेल्सियस से नीचे है, तो तापमान 36 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के बाद हृदय की लय सामान्य हो जाएगी।
- पेट के अंगों को घुमावदार तरीके से बदलें और लगातार 5-0 पॉलीप्रोपाइलीन सीवन का उपयोग करके पेट के चीरे की परतों को बंद करें।
- सर्जरी के बाद, एनेस्थेटाइज्ड जानवर को हीटिंग पैड पर एक साफ क्षेत्र पर रखें जब तक कि शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस तक न पहुंच जाए।
नोट: जब तक शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस तक नहीं पहुंच जाता तब तक पोस्टऑपरेटिव परीक्षाएं शुरू न करें। प्रयोगों के अंत तक 2-2.5% आइसोफ्लुरेन पर संज्ञाहरण बनाए रखें। - 3 घंटे के लिए प्रत्यारोपित दाता हृदय के ईसीजी की निगरानी करें। फिर, हिस्टोलॉजिकल अध्ययन के लिए गहरी संज्ञाहरण के तहत दिल का उत्पादन करें।
नोट: दिल को बाहर निकालने से पहले पेडल रिफ्लेक्स की कमी के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। सर्जिकल प्रक्रिया और ईसीजी निगरानी में 6 घंटे से भी कम समय लगता है। डिक्लोफेनाक, पेरीओपरेटिव रूप से प्रशासित (चरण 4.2.3.), इस प्रक्रिया की पूरी अवधि के लिए दर्द प्रबंधन को सक्षम बनाता है। एनाल्जेसिया आहार को संस्थागत पशु उपयोग दिशानिर्देशों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
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Representative Results
चित्रा 1 एक छोटे पशु मॉडल में उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक डिजाइन को दर्शाता है। चित्रा 2 संशोधित लैंगेंडॉर्फ छिड़काव उपकरण प्रदर्शित करता है, जिसमें एक छोटा पशु ऑक्सीजनेटर शामिल है। हेटरोटोपिक पेट के आरोपण के लिए एनास्टोमोसिस का क्रम चित्रा 3 में प्रस्तुत किया गया है।
चित्रा 4 पूर्व सीटू छिड़काव के दौरान हृदय की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों को दर्शाता है, जैसे लैक्टेट, पोटेशियम, और औसत महाधमनी दबाव। इस अध्ययन में, नॉर्मोथर्मिक एक्स सीटू संरक्षण के उपयोग ने छह सफल मामलों के कुल इस्केमिक समय को 46.2 ± 4.7 मिनट तक कम कर दिया, जबकि कुल आउट-ऑफ-बॉडी समय 166.2 ± 4.7 मिनट था (चित्रा 5)। दाता से हृदय का निष्कर्षण और पूर्व सीटू छिड़काव और हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण की तैयारी के लिए 5.8 ± 1.3 मिनट की आवश्यकता होती है, जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है। सर्जरी की समग्र सफलता दर 70% थी और छह सफल मामलों का औसत एनास्टोमोसिस समय 38.4 ± 3.4 मिनट था। सभी प्रयोगों में, आरोपण के तुरंत बाद हृदय गति में काफी कमी आई, लेकिन यह अंततः समय के साथ ठीक हो गया, जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है। दाता के दिल की सकल संरचना को पूर्व सीटू संरक्षण और हेटरोटोपिक आरोपण के बाद अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था, जिसमें कोई दिखाई देने वाले नुकसान का पता नहीं चला था। हालांकि, हेमेटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधला होने से हेटेरोटोपिक आरोपण के 3 घंटे के बाद भड़काऊ कोशिकाओं, ज्यादातर न्यूट्रोफिल की संख्या में वृद्धि हुई (चित्रा 7)।
चित्रा 1: हेटरोटोपिक हृदय प्रत्यारोपण के साथ नॉर्मोथर्मिक एक्स सीटू हृदय संरक्षण का प्रायोगिक डिजाइन। संक्षेप: बीजीए = रक्त गैस विश्लेषण, सीपीएस = कार्डियोप्लेजिक समाधान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: संशोधित छोटे जानवर पूर्व सीटू हृदय संरक्षण के योजनाबद्ध। संक्षेप: बीपी सेंसर = रक्तचाप सेंसर, सीपीएस = कार्डियोप्लेजिक समाधान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: हेटेरोटोपिक हृदय प्रत्यारोपण में एनास्टोमोसिस का क्रम। (ए) प्राप्तकर्ता पेट में दाता हृदय की स्थिति और एनास्टोमोसिस के क्रम की योजना। (बी) दाता आरोही महाधमनी और प्राप्तकर्ता पेट की महाधमनी एनास्टोमोसिस। (सी) दाता फुफ्फुसीय धमनी और प्राप्तकर्ता आईवीसी एनास्टोमोसिस। संक्षेप: एलवी = बाएं वेंट्रिकल, आरवी = दाएं वेंट्रिकल, एलए = बाएं एट्रियम, एमपीए = मुख्य फुफ्फुसीय धमनी, आईवीसी = अवर वेना कावा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: पूर्व सीटू छिड़काव के दौरान व्यवहार्यता मूल्यांकन के लिए पैरामीटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: छह सफलतापूर्वक संरक्षित दिलों की संरक्षण समयरेखा। हृदय निष्कर्षण और पूर्व सीटू छिड़काव सुविधा: 5.8 ± 1.3 मिनट। प्राप्तकर्ता चूहे के पेट में आरोपण: 38.4 ± 3.4 मिनट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: खरीद से पहले और प्रत्यारोपण के बाद दाता हृदय का इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रदर्शन । (ए) हृदय गति में परिवर्तन। कटाई से पहले, 30 मिनट, 60 मिनट, 90 मिनट, 120 मिनट, 150 मिनट, 180 मिनट: आरोपण के बाद का समय। (बी) दाता हृदय संचयन से पहले और प्रत्यारोपण के 3 घंटे बाद इलेक्ट्रोकार्डियोग्राफी छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: दाता हृदय की मैक्रोस्कोपिक (ए-सी) और सूक्ष्म (डी-एफ) उपस्थिति। (ए, डी) नॉर्मोथर्मिक पूर्व सीटू संरक्षण से पहले। (B, E) नॉर्मोथर्मिक पूर्व सीटू संरक्षण के बाद। (C, F) हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण के 2 घंटे के बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस मॉडल को स्थापित करने में हमारा ध्यान नॉर्मोथर्मिक मानव हृदय प्रत्यारोपण को दोहराने के लिए था। गैर-इजेक्टिंग मॉडल एक पूर्व सीटू वातावरण में दाता हृदय को संरक्षित करने के लिए आमतौर पर पसंदीदा तकनीक है। जबकि इजेक्टिंग मॉडल एक्स सीटू छिड़काव17 के दौरान हृदय समारोह का आकलन करने में कई फायदे प्रदान करते हैं, वे हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण मॉडल के लिए उपयुक्त नहीं हैं। हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण में, प्रत्यारोपित दाता हृदय को प्राप्तकर्ता परिसंचरण प्रणाली में मेजबान हृदय द्वारा बनाए गए सिस्टोलिक आफ्टरलोड दबाव को दूर करने की आवश्यकता होती है, जिससे सीमित दाता हृदय प्रदर्शन होता है और मूल्यांकन18 में कम आंका जाता है। इसलिए, हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण में गैर-इजेक्टिंग मॉडल अधिक अनुकूल हैं। गैर-इजेक्टिंग मॉडल में, दाता हृदय संक्रमित होता है लेकिन प्राप्तकर्ता के परिसंचरण का समर्थन नहीं करता है, जिससे हृदय के प्रदर्शन मूल्यांकन को काफी सीमित कर दिया जाता है। रूपात्मक और आणविक मूल्यांकन, जैसे कि हिस्टोलॉजिकल धुंधला और ब्लॉटिंग विश्लेषण, दाता हृदय स्थितियों की जांच के लिए फायदेमंद हो सकता है जब कार्यात्मक आकलन सीमित होते हैं। इसके अलावा, चयापचय मार्करों का मूल्यांकन उन्नत तकनीकों का उपयोग करके किया जा सकता है, जैसे कि पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)19। यह मॉडल आरोपण से पहले फार्माकोलॉजिकल और आनुवंशिक हस्तक्षेप की दीर्घकालिक प्रभावशीलता का परीक्षण करने में उपयोगी हो सकता है।
कई शोध समूहों ने एक नॉर्मोथर्मिक एक्स सीटू संरक्षण मॉडल विकसित किया है, जिसे 12 घंटे6 तक पोर्सिन दिलों को संरक्षित करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। हालांकि, बड़े पशु मॉडल का रखरखाव छोटी प्रयोगशालाओं के लिए लागत-निषेधात्मक हो सकता है, क्योंकि इसमें पर्याप्त खर्च शामिल हैं और काफी संख्या में प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, हम एक कम खर्चीली और तकनीकी रूप से सरल पूर्व सीटू संरक्षण विधि का प्रस्ताव करते हैं, जिसमें हेटरोटोपिक हृदय प्रत्यारोपण के बाद ऑटोलॉगस रक्त का उपयोग शामिल है। विशेष रूप से, हमारे मॉडल का उपयोग करके एक प्रयोग की लागत लगभग $ 300 है। यद्यपि लागतों की तुलना करने के लिए कोई समकक्ष छोटा पशु मॉडल नहीं है, बड़े जानवरों के लिए पूर्व सीटू छिड़काव उपकरण, जब एक बार उपयोग किया जाता है, तो $ 30,00016 तक खर्च हो सकता है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल दर्शाता है कि सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को एक ही प्रयोगकर्ता (चित्रा 3) द्वारा चरणबद्ध तरीके से किया जा सकता है। पूर्व सीटू संरक्षण के बाद हेटरोटोपिक आरोपण की संभावना इस मॉडल का एक और लाभ है। पूर्व सीटू छिड़काव के लिए दाता हृदय की अवरोही महाधमनी को प्रवेशनी करके, हम बिना किसी नुकसान के आरोही भाग को छोड़ने में सक्षम थे। इसके अलावा, हमने लैंगेंडॉर्फ सर्किट को संशोधित किया, प्रभावी हृदय छिड़काव के लिए आवश्यक छिड़काव समाधान की मात्रा को 12 एमएल तक कम कर दिया। कटाई से पहले दाता चूहे से छिड़काव रक्त प्राप्त किया गया था, जिससे हमें अपने रक्त के साथ दिल को संरक्षित करने और संरक्षण के दौरान किसी भी प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाओं से बचने की अनुमति मिलती है।
संशोधन और समस्या निवारण
50-70 मिमीएचजी की सीमा के भीतर औसत आफ्टरलोड दबाव बनाए रखने के लिए एक्स सीटू छिड़काव सर्किट की सिफारिश की जाती है। दबाव विभिन्न कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है, जिसमें छिड़काव प्रवाह, कोरोनरी धमनी प्रतिरोध और पर्फ्यूसेट चिपचिपाहट20 शामिल हैं। तापमान और पीएच में भिन्नता के कारण कोरोनरी धमनी प्रतिरोध उतार-चढ़ाव के लिए अतिसंवेदनशील होता है, इस प्रकार इन मापदंडों को सामान्य सीमा के भीतर बनाए रखना महत्वपूर्ण है। आवश्यक छिड़काव प्रवाह प्रत्येक प्रयोग के लिए भिन्न होता है और वांछित छिड़काव दबाव को बनाए रखने के लिए आवश्यक प्रवाह पर निर्भर होता है। आमतौर पर, 3-4 एमएल / मिनट (हमारे पंप के लिए 5-6 आरपीएम के बराबर) का प्रवाह 350-450 ग्राम चूहे के दिल के लिए पर्याप्त है। हेमटोक्रिट स्तर पर्फ्यूसेट चिपचिपाहट21 का एक निर्धारक है। हमारे सर्किट के लिए, इष्टतम हेमटोक्रिट रेंज 25% से 30% है। सबसे छोटे प्रयोगात्मक ऑक्सीजनेटर के उपयोग के बावजूद, 12 एमएल की परफ्यूसेट मात्रा के लिए 0.05 मीटर2 का बड़ा गैस विनिमय सतह क्षेत्र समय के साथ वाष्पीकरण और परिणामस्वरूप तरल पदार्थ की हानि का कारण बन सकता है। इस द्रव हानि को आवश्यकतानुसार आसुत जल के अतिरिक्त ठीक किया जा सकता है। परफ्यूसेट में खारा या रिंगर समाधान जोड़ने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि वे हाइपरनेट्रेमिया का कारण बन सकते हैं। परफ्यूसेट ग्लूकोज एकाग्रता को 100-150 मिलीग्राम / डीएल पर बनाए रखा जाना चाहिए।
छिड़काव के दौरान अतालता से बचना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह पूर्व सीटू पर्यावरण के एक या अधिक शारीरिक मापदंडों की गिरावट को दर्शाता है। टैचीएरिथमिया या बाएं वेंट्रिकुलर फाइब्रिलेशन आमतौर पर विभिन्न कारकों से जुड़े होते हैं, जैसे इलेक्ट्रोलाइटिक असंतुलन, कम हेमटोक्रिट, एसिडोसिस / अल्कलोसिस, हाइपरथर्मिया और अत्यधिक आफ्टरलोड। दूसरी ओर, ब्रैडीएरिथमिया मुख्य रूप से हाइपोथर्मिया के कारण होता है। मायोकार्डियल व्यवहार्यता का आकलन करने में लैक्टेट और पोटेशियम प्रमुख पैरामीटर हैं। ऊंचा लैक्टेट स्तर (>5 mmol / L) और हाइपरकेलेमिया (> 5.0 मिलीग्राम / डीएल) मायोकार्डियलक्षति की पर्याप्त डिग्री का संकेत देते हैं।
सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान प्राप्तकर्ता चूहे के संज्ञाहरण खुराक और श्वास पैटर्न की सावधानीपूर्वक निगरानी महत्वपूर्ण है। चूंकि जानवर हवादार नहीं होते हैं, इसलिए अत्यधिक संज्ञाहरण के निरंतर प्रशासन से हाइपोवेंटिलेशन और विफलता हो सकती है। पेट के अंगों के कुल लैप्रोटॉमी और निष्कर्षण के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण गर्मी की हानि होती है, जो प्राप्तकर्ता की स्थिति को और खराब कर सकती है। इसलिए, हीटिंग पैड और तापमान जांच से लैस तापमान नियंत्रक का उपयोग गर्मी के नुकसान के प्रभाव को कम करने और शरीर के स्थिर तापमान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
महत्वपूर्ण कदम
शल्य चिकित्सा प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों में महाधमनी चाप और एमपीए का विच्छेदन, पूर्व सीटू छिड़काव के लिए महाधमनी प्रवेशनी, पूर्व सीटू छिड़काव से पहले डी-एयरिंग और प्रत्यारोपण के बाद क्लैंप को हटाने से पहले डी-एयरिंग शामिल है। ये कदम अत्यधिक कमजोर हैं और अक्सर विफलता से जुड़े होते हैं। हालांकि, इन चुनौतियों पर काबू पाने की कुंजी उपयुक्त तकनीक की पहचान करने और पर्याप्त अभ्यास प्राप्त करने में निहित है। प्राप्तकर्ता में पोत अलगाव के दौरान, दाहिने मूत्रवाहिनी पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए, जो रेट्रोपरिटोनियल स्पेस में आईवीसी के करीब निकटता में स्थित है और लसीका वाहिनी की नकल कर सकता है। नस एनास्टोमोसिस के संदर्भ में, पहले फाड़ और स्टेनोसिस को रोकने के लिए कपाल के अंत के बाद स्टे सीवन का उपयोग करके पुच्छल छोर को सुरक्षित करने की सिफारिश की जाती है। महाधमनी की तुलना में नसों की अपेक्षाकृत नाजुक प्रकृति के कारण यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
सीमाओं
इस प्रयोग में शामिल शल्य चिकित्सा प्रक्रियाएं काफी जटिल हैं, खासकर जब दाता हृदय प्राप्त करते हैं और एक ही जानवर से रक्त प्राप्त करते हैं। प्रत्यारोपण के बाद कार्यात्मक आकलन सीमित हैं क्योंकि हमने एक गैर-इजेक्टिंग मॉडल का उपयोग किया है। एक इजेक्टिंग मॉडल को एक पूर्व सीटू वातावरण में अधिक उन्नत परिणाम प्रदान करने के लिए माना जाता है। हालांकि, हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण में, यह संचार प्रणाली में एक सहायक मेजबान हृदय की उपस्थिति के कारण बाधित होता है।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चोन्नम नेशनल यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल बायोमेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट से अनुदान बी 2021-0991 और कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन से एनआरएफ -2020 आर 1 एफ 1 ए 1073921 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AES active evacuation system | Smiths medical | PC-6769-51A | Utilize CO2 and excess isoflurane |
| Anesthesia machine | Smiths medical | PC-8801-01A | Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal |
| B20 patient monitor | GE medical systems | B20 | to observe mean aortic pressure and temperature |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard apparatus | 55-7020 | To monitor and maintain animal's temperature |
| Micro-1 Rat oxygenator | Dongguan Kewei medical instruments | Micro-MO | For gas exchange in the langendorff circuit |
| Micropuncture introducer Set | COOK medical | G48007 | for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta |
| Microscope | Amscope | MU1403 | For zooming surgical field (Recipient) |
| Surgical loupe | SurgiTel | L2S09 | For zooming surgical field (Donor) |
| Syringe pump | AMP all | SP-8800 | To deliver cardioplegic solution |
| Transonic flow sensor | Transonic | ME3PXL-M5 | Perfusion circuit flow sensor |
| Transonic tubing flow module | Transonic | TS410 | flow acquiring system |
| Watson - Marlow pumps | Harvard apparatus | 010.6131.DAO | Peristaltic pump used for recirculate perfusate |
| WBC-1510A | JEIO TECH | E03056D | Heating bath |
| Sprague-Dawley rats | Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea | ||
| Medications | |||
| BioHAnce Gel Eye Drops | SENTRIX Animal care | wet ointments for eye | |
| Cefazolin | JW pharmaceutical | For prophilaxis | |
| Custodiol | DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH | For heart harvesting | |
| Diclofenac | Myungmoon Pharm. Co. Ltd | For pain control | |
| Heparin | JW pharmaceutical | Anticoagulant | |
| Insulin | JW pharmaceutical | hormon therapy | |
| Saline | JW pharmaceutical | For hydration therapy |
References
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चिकित्सा अंक 194Erratum
Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 08/28/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.
Section 4 of the Protocol was updated from:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
to:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
- After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C.
NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments. - Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
