ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
هنا ، نقدم بروتوكول تقييم للقلب المزروع بشكل غير متجانس بعد الحفاظ على الحرارة الطبيعية خارج الموقع في نموذج الفئران.
Abstract
زراعة القلب هي العلاج الأكثر فعالية لفشل القلب في المرحلة النهائية. على الرغم من التحسينات في الأساليب والتدخلات العلاجية ، لا يزال عدد مرضى قصور القلب الذين ينتظرون الزرع في ازدياد. تم إنشاء تقنية الحفظ خارج الموقع الطبيعي الحرارة كطريقة مماثلة لتقنية التخزين البارد الثابت التقليدية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحفاظ على قلوب المتبرعين لمدة تصل إلى 12 ساعة في حالة فسيولوجية. علاوة على ذلك ، تسمح هذه التقنية بإنعاش قلوب المتبرعين بعد موت الدورة الدموية وتطبق التدخلات الدوائية المطلوبة لتحسين وظيفة المتبرع بعد الزرع. تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية لتحسين تقنيات الحفظ خارج الموقع الطبيعي والقضاء على المضاعفات المتعلقة بالحفظ. على الرغم من سهولة التعامل مع النماذج الحيوانية الكبيرة مقارنة بالنماذج الحيوانية الصغيرة ، إلا أنها مكلفة وصعبة. نقدم نموذجا للفئران للحفاظ على قلب المتبرع الطبيعي الحرارة خارج الموقع متبوعا بزراعة البطن غير المتجانسة. هذا النموذج رخيص نسبيا ويمكن تحقيقه بواسطة مجرب واحد.
Introduction
لا يزال زرع القلب هو العلاج الوحيد القابل للتطبيق لفشل القلب المقاومللحرارة 1،2،3،4. على الرغم من الارتفاع المطرد في عدد المرضى الذين يحتاجون إلى زراعة القلب ، لم تلاحظ زيادة نسبية في توافر الأعضاء المانحة5. لمعالجة هذه المشكلة ، تم تطوير مناهج جديدة للحفاظ على قلوب المانحين بهدف تحسين التحديات وزيادة توافر المانحين6،7،8،9.
ظهر نضح القلب خارج الموقع الطبيعي (NESHP) باستخدام آلات نظام العناية بالأعضاء (OCS) كتدخل سريري 1,3. تم اعتبار هذه التقنية بديلا مناسبا لطريقة غرفة التبريد الثابتة التقليدية (SCS) 2,9. يقلل NESHP بشكل فعال من مدة نقص التروية الباردة ، ويقلل من الطلب الأيضي ، ويسهل الإمداد الغذائي الأمثل والأوكسجين أثناء نقل الأعضاء المانحة10,11. على الرغم من الإمكانات الواضحة لهذه الطريقة لتحسين الحفاظ على أعضاء المتبرعين ، إلا أن تطبيقها السريري والمزيد من التحقيق قد تم تقييده بسبب ارتفاع التكاليف. لذلك ، تعد النماذج الحيوانية قبل السريرية ل NESHP ضرورية لتحديد التحديات التقنية الرئيسية المرتبطة بهذه التقنية12،13. الخنازير والجرذان هي النماذج الحيوانية المفضلة للدراسات قبل السريرية بسبب تحملها الإقفاري9. على الرغم من أن نموذج الخنازير مثالي للبحث الأساسي والانتقالي ، إلا أنه محدود بسبب تكلفته العالية والعمالة المكثفة المطلوبة للرعاية والصيانة. في المقابل ، نماذج الفئران أقل تكلفة وأسهل في التعامل معها14.
في هذه الدراسة ، نقدم نموذجا مبسطا للفئران من NESHP ، متبوعا بزراعة القلب غير المتجانس ، لتقييم تأثير تقنية الحفظ على حالة الكسب غير المشروع بعد الزرع. هذا النموذج واضح وفعال من حيث التكلفة ويمكن تنفيذه بواسطة مجرب واحد. يوضح الشكل 1 مخططات الإجراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
اللجنة الأخلاقية لمركز أبحاث المختبر في مستشفى جامعة تشونام الوطنية (الموافقة رقم. CNU IACUC - H - 2022-36) وافق على جميع التجارب على الحيوانات. تلقى ذكور فئران Sprague-Dawley (350-450 جم) ، المستخدمة في هذه الدراسة ، الرعاية وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر. تم إيواء الفئران في غرف يتم التحكم في درجة حرارتها مع دورة 12 ساعة من الضوء والظلام ، مع توفر الطعام والماء القياسيين.
1. التحضير
ملاحظة: يمكن لمجرب واحد إجراء جميع الإجراءات التجريبية.
- قم بتجميع جهاز Langendorff ، بما في ذلك الأكسجين والمضخة وخطوط التروية ، قبل الجراحة (الشكل 2). املأ دائرة التروية ب 20 مل من المحلول الملحي وقم بتدويرها حتى يتم تحضيرها بالدم الذاتي.
ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو تدفئة الدائرة خارج الجسم. - قم بتوصيل خط شلل القلب بالدائرة عبر المحبس المتصل بالقنية الأبهرية وقم بإعداد مضخة المحقنة للتسريب النهائي لشلل القلب.
ملاحظة: تأكد من إزالة أي فقاعات هواء من دائرة التروية وخط شلل القلب. - ضع مستشعر درجة الحرارة داخل الخزان حيث سيتم تخزين قلب المتبرع ، مع الحفاظ على درجة حرارة الدائرة عند 37 درجة مئوية.
- الاستعدادات الجراحية
- قم بإعداد مجموعة منفصلة من الأدوات والمواد الدقيقة المعقمة لكل متبرع وفأر متلقي.
- تحضير المجموعة الجراحية للمتبرع: زوج من المقصات الجراحية ، زوج من الملقط الدقيق ، ملقط البعوض الحاد ، 5-0 خيوط الحرير ، مسحات القطن ، حقنة 50 مل ، خط التروية لمحلول شلل القلب (CPS) ، مضخة حقنة ، قسطرة وعائية 18 G ، مجموعة واحدة من 5 Fr. قسطرة الفخذ ، وشاش معقم.
- قم بإعداد المجموعة الجراحية للمتلقي: مقص جراحي مجهري ، مبعدة للجرح ، زوج من الملقط الدقيق ، ملقط البعوض ، مشابك الأوعية الدموية الدقيقة ، حقنة 1 مل ، خيوط بولي بروبيلين واحدة 5-0 و 9-0 ، خيوط حرير 5-0 ، مسحات قطنية ، وشاش معقم.
- قم بإعداد مجموعة منفصلة من الأدوات والمواد الدقيقة المعقمة لكل متبرع وفأر متلقي.
2. الحفاظ على قلب المتبرع وجمع الدم
- حث التخدير في الفئران المانحة مع إيزوفلوران (5 ٪) في غرفة التخدير وتسجيل وزن الفئران قبل وضعه على طاولة الجراحة.
- ضع الجرذ في وضع الاستلقاء على الطاولة الجراحية وقم بتطبيق التخدير المستمر عن طريق توصيل 2٪ -2.5٪ إيزوفلوران مع 90٪ أكسجين من خلال مخروط الأنف.
- تحقق من عمق التخدير عن طريق التحقق من عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم وتكرار التنفس ، والذي يجب أن يكون بين 50-60 في الدقيقة.
ملاحظة: مستوى مناسب من التخدير أمر بالغ الأهمية لتجنب الإجهاد والألم غير الضروريين للفأر المتبرع. - ضع مادة تشحيم للعين وحلق منطقة العانة على الترقوة ، حيث سيتم إجراء الجراحة. نظف المنطقة باستخدام مقشر يحتوي على اليود وكحول بنسبة 70٪.
- القسطرة
- قم بعمل شق في منتصف البطن بطول 7 سم وشقوق ثنائية بقياس 3 سم من عملية الخنجري إلى منتصف الترقوة. إزالة القشرة من المنطقة الصدرية.
- باستخدام مسحات القطن ، قم بتعبئة أعضاء البطن إلى الجانب الأيسر من البطن. عزل الشريان الأورطي البطني عن اللفافة خلف الصفاق والأنسجة الدهنية.
- حقن 1000 وحدة دولية من الهيبارين المذاب في 0.3 مل من محلول ملحي متساوي التوتر من خلال الوريد الأجوف السفلي (IVC) باستخدام حقنة 1 مل. أوقف أي نزيف من فتحة الإبرة عن طريق الضغط برفق باستخدام قطعة قطن.
ملاحظة: كن حذرا من انسداد الهواء أثناء الحقن ، لأنه يمكن أن يؤدي إلى السكتة القلبية. - أدخل قسطرة الفخذ 5 Fr. في الشريان الأورطي البطني (Abd. A). تأكد من وصول طرف القسطرة إلى قوس الأبهر. تأكد من موقع القسطرة من خلال تقييم الطول التقريبي للجزء المدخل من القسطرة.
- جمع الدم
- اجمع حوالي 10 مل من الدم عن طريق القسطرة التي تم إدخالها في عبد. أ.
- في وقت لاحق ، تمييع الدم فتيلة مع محلول ملحي متساوي التوتر حتى يصل الحجم الكلي إلى 12 مل. أضف 5 ملغ من سيفازولين المذاب في 0.3 مل من المياه المالحة والأنسولين (20 وحدة دولية).
- السكتة القلبية
- قم بتوصيل خط نضح CPS المعد مسبقا بالقسطرة البطنية وابدأ في إدارة CPS بمضخة المحقنة بمعدل 800 مل / ساعة.
- افتح التجويف الصدري من الحجاب الحاجز واقطع IVC بالقرب من الحجاب الحاجز لمنع انتفاخ البطين. قطع الأضلاع بشكل ثنائي على طول العمود الفقري الصدري حتى مدخل الصدر. تعكس جدار الصدر البطني المتحرك بشكل متفوق مع ملقط البعوض.
- قم بإزالة الغدة الصعترية بالكامل باستخدام ملقط دقيق لتصور قوس الأبهر. تطبيق ضغط خفيف إذا نزفت الشرايين الغدة الصعترية.
- إستخلاص
- بعد إعطاء جميع CPS ، عزل قوس الأبهر من الأنسجة المحيطة. تشريح بعناية أسفل الشريان تحت الترقوة الأيسر.
- قم بعبور الشرايين السباتية العضدية الرأسية واليسرى في موضع بعيد ، تاركا جذوع أطول من قوس الأبهر لسهولة التعامل معها أثناء قنية الشريان الأورطي. عبور الشريان الرئوي الرئيسي (MPA) أقرب ما يمكن إلى التشعب. كن حذرا حتى لا تتلف الزائدة الأذينية اليسرى.
- اربط بعناية الوريد الأجوف العلوي (SVC) و IVC بخيوط حريرية 5-0 ، مما يمنع انسداد الأذين الأيمن (RA) والجيوب التاجية. قم بتغطية الحواف اليسرى للصدر بشاش مبلل ، ضع القلب عليه واسحب أربطة SVC و IVC برفق لكشف الهيلوم.
- اربط الأوردة الرئوية والأزيجوس مع خياطة حرير 5-0. قطع الأنسجة الظهرية إلى الرباط واستخراج القلب. افحص القلب بحثا عن أي إصابة. أخيرا ، قم بوزن القلب قبل قنية الأبهر.
3. التروية خارج الموقع
- قنية الأبهر والتروية
- قبل قنية الشريان الأورطي ، استبدل الدائرة المحضرة بالمحلول الملحي بفتيلة الدم.
- أدخل القنية الأبهرية في قوس الأبهر وقم بتثبيتها بمشبك دقيق مؤقت. تأكد من وضع طرف القنية عند التقاطع العضدي الرأسي.
- تأكد من الموضع الصحيح للقنية عن طريق إمساك الشريان الأورطي برفق باستخدام ملقط دقيق.
- ابدأ التروية بمعدل تدفق 2-3 مل / دقيقة ، مما يسمح للبيرفوسات بالتسرب من موقع القنية لإزالة أي فقاعات هواء.
- راقب ضغط التروية ودرجة الحرارة من خلال المستشعر المتصل بنظام المراقبة.
- قم بتدليك القلب برفق بإصبعي الإصبع الأول والسبابة حتى يتسرب الدم الوريدي من الشريان الرئوي الرئيسي (MPA).
- قم بتأمين الشريان الأورطي برباط حريري 1-0 وإزالة المشبك بعد التحقق من جميع الإعدادات (دائرة التروية ، ضغط التروية ، درجة الحرارة).
- بمجرد وضع الرباط الدائم ، تأكد من أن القلب يبدأ في الانقباض في غضون ثوان قليلة ويصل إلى الإيقاع الطبيعي في 60 ثانية. يشير متوسط ضغط التروية البالغ 55-65 مم زئبق مع معدل تدفق الشريان التاجي من 3-4 مل عند 37 درجة مئوية إلى التروية الكافية.
- اجمع 0.15 مل من الدم من الخزان وتحقق من تحليل غازات الدم (BGA) في بداية التروية وكل 20 دقيقة بعد ذلك. مراقبة وتسجيل الأس الهيدروجيني ، pCO 2 ، pO2 ، الجلوكوز ، الهيماتوكريت ، البوتاسيوم ، واللاكتات أثناء التروية. بعد 120 دقيقة من التروية، يتم تطبيق 3 مل من الوديعة من خلال مضخة المحقنة بمعدل 250 مل/ساعة لإيقاف القلب.
4. زرع
- إعداد المتلقي
- ابدأ تحضير المتلقي قبل 30 دقيقة من توقف التروية خارج الموقع .
- تخدير الحيوان المتلقي باستخدام نفس الطريقة المذكورة في الخطوة 2.2.
- ضع الجرذ في وضع ضعيف على وسادة التدفئة وأدخل مسبار درجة الحرارة في المستقيم للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية.
- ضع مادة تشحيم للعين ، واحلق العانة على منطقة شرسوفي ، ونظف المنطقة بفرك يحتوي على اليود وكحول بنسبة 70٪.
- الادويه
- حقن 2 مل من المحلول الملحي الدافئ تحت الجلد لتعويض السوائل المفقودة أثناء الجراحة. حقن 200 وحدة دولية من الهيبارين تحت الجلد.
- تطبيق العلاج الوقائي بالمضادات الحيوية عن طريق حقن 10 ملغ/ كغ من سيفازولين المذاب في 0.3 مل من محلول ملحي تحت الجلد أو في العضل.
- يجب تطبيق التحكم في الألم عن طريق حقن 20 ملغ/ كغ من ديكلوفيناك تحت الجلد.
- إجراء بضع البطن منتصف الخط وإدراج ضامد لتوسيع تجويف البطن. قم بتعبئة أعضاء البطن إلى الجانب الأيسر من المتلقي باستخدام مسحات القطن لإفساح المجال للإجراء.
- منع الجفاف عن طريق لف أعضاء البطن بشاش دافئ ورطب. انشر محلول ملحي دافئ بشكل متقطع باستخدام حقنة سعة 50 مل أثناء الجراحة.
- باستخدام مجهر جراحي بتكبير 10x ، قم بتعبئة الاثني عشر والصائم القريب عن طريق التشريح الحاد باستخدام مسحات القطن لفضح Abd. A. و IVC. جهز عبد. A و IVC للمفاغرة وزرع قلب المتبرع بشكل منهجي ، وفقا للشكل 3 أو الطرق الموثقة مسبقا15.
ملاحظة: لا تفصل بين Abd. A. و IVC.- بافتراض مفاغرة الأوعية الدموية ليتم وضعها تحت ، وإعداد جزء كاف من الشريان الأورطي و IVC لتثبيت.
- قم بإجراء تحضير حاد باستخدام مسحات قطنية أو ملقط مسنن حاد لإزالة الدهون واللفافة حول الأوعية.
- ضع 5-0 أربطة حريرية على الفروع المساريقية وكلا الجانبين القحفي والذيلية للأوعية الرئيسية. ارفع الأوعية البطنية وقم بتخثر أو ربط الفروع القطنية بخيوط من الحرير 5-0. تذكر أن تجنيب شرايين وأوردة الخصية ولا تشبكها.
- استخدم الأربطة لرفع الأوعية ووضع المشابك الدقيقة على الفروع المساريقية والجوانب الذيلية والجمجمة للأوعية الرئيسية لوقف تدفق الدم في موقع المفاغرة. أغلق وسادة التدفئة قبل وضع المشابك ، لأن التسخين الزائد يمكن أن يؤدي إلى تفاقم نقص تروية الأطراف. تأكد من تشغيل وسادة التدفئة بعد فك تثبيت الأوعية لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
- ثقب الشريان الأورطي باستخدام إبرة 27 G وإطالة الشق بمقص دقيق بطول يساوي أو أكبر قليلا من فتحة الشريان الأورطي الصاعد للمتبرع (Asc. A) ، وهو ما يقرب من 5 ملم.
- قم بعمل شق طولي على IVC بنفس طريقة بضع الأبهر ، ولكن اجعله أقرب بمقدار 3 مم إلى الجانب الذيلي مقارنة بشق الشريان الأورطي.
- بدء مفاغرة ، ووضع قلب المتبرع على الجانب الأيمن من بطن المتلقي وإرفاق المتبرع Asc. أ إلى عبد المستلم. A مع غرزة واحدة بسيطة متقطعة (9-0 البولي بروبلين) في الزاوية القحفية من شق طولي.
- انقل القلب إلى الجانب الأيسر من بطن المتلقي وقم بإجراء مفاغرة في Asc للمتبرع. أ مع عبد المستلم. أ باستخدام خياطة البولي بروبلين 9-0.
- ثبت الشريان الرئوي المتبرع ب IVC بخيطين متقطعين (9-0 بولي بروبيلين) في الزوايا الذيلية والجمجمة للشق الطولي.
- أداء النصف الأول من مفاغرة الوريدية من الجانب داخل اللمعة من السفينة واستكمال النصف الثاني من الجانب خارج اللمعة من الوعاء. قبل شد العقد ، اغسل الحقل بالمحلول الملحي لمنع انسداد الهواء.
- نزع الهواء وإزالة لقط
- قم بإزالة مشبك الوريد المساريقي أولا بعد الانتهاء من المفاغرة للسماح للجانب الأيمن من القلب بالامتلاء بالدم الوريدي.
- إزالة الهواء في الدائرة التاجية و Asc. A. عن طريق تطبيق التروية التاجية إلى الوراء لعدة ثوان.
- ضع قطعة من الشاش على جانبي الأوعية وأزل المشبك الذيلي ومشبك الجمجمة.
- ضع ضغطا لطيفا بمسحات قطنية لمدة 1-2 دقيقة. بعد التأكد من الإرقاء الكافي ، قم بإزالة المسحات وغسل المفاغرة بمحلول ملحي دافئ.
ملاحظة: يجب أن يبدأ القلب في النبض خلال الدقيقة الأولى من إعادة التروية. إذا كانت درجة حرارة جسم الجرذ المتلقي أقل من 35 درجة مئوية ، فإن إيقاع القلب سوف يعود إلى طبيعته بعد أن تصل درجة الحرارة إلى 36 درجة مئوية.
- استبدل أعضاء البطن بطريقة تشبه التعرج وأغلق طبقات شق البطن باستخدام خيوط البولي بروبلين المستمرة 5-0.
- بعد الجراحة ، ضع الحيوان المخدر على منطقة نظيفة فوق وسادة التدفئة حتى تصل درجة حرارة الجسم إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: لا تبدأ فحوصات ما بعد الجراحة حتى تصل درجة حرارة الجسم إلى 37 درجة مئوية. الحفاظ على التخدير في 2-2.5 ٪ إيزوفلوران حتى نهاية التجارب. - مراقبة تخطيط القلب لقلب المتبرع المزروع لمدة 3 ساعات. ثم ، استئصال القلب تحت التخدير العميق للدراسات النسيجية.
ملاحظة: تأكد من عمق التخدير عن طريق عدم وجود منعكس دواسة قبل استئصال القلب. تستغرق العملية الجراحية ومراقبة تخطيط القلب أقل من 6 ساعات. يتيح ديكلوفيناك ، الذي يتم إعطاؤه حول الجراحة (الخطوة 4.2.3.) ، إدارة الألم طوال مدة هذا الإجراء. يمكن تعديل نظام التسكين وفقا للإرشادات المؤسسية لاستخدام الحيوانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 التصميم التجريبي المستخدم في نموذج حيواني صغير. يعرض الشكل 2 جهاز نضح لانجيندورف المعدل، والذي يتضمن جهاز أكسجين حيواني صغير. يتم عرض ترتيب مفاغرة لزرع البطن غير المتجانس في الشكل 3.
يوضح الشكل 4 المعلمات المستخدمة لتقييم صلاحية القلب أثناء التروية خارج الموقع ، مثل اللاكتات والبوتاسيوم ومتوسط ضغط الأبهر. في هذه الدراسة ، أدى استخدام الحفظ الطبيعي الحرارة خارج الموقع إلى تقليل إجمالي الوقت الإقفاري لست حالات ناجحة إلى 46.2 ± 4.7 دقيقة ، بينما كان إجمالي وقت الخروج من الجسم 166.2 ± 4.7 دقيقة (الشكل 5). يتطلب استخراج القلب من المتبرع والتحضير للتروية خارج الموقع والزرع غير المتجانس 5.8 ± 1.3 دقيقة ، كما هو موضح في الشكل 5. كان معدل النجاح الإجمالي للجراحة 70٪ وكان متوسط وقت المفاغرة للحالات الست الناجحة 38.4 ± 3.4 دقيقة. في جميع التجارب، انخفض معدل ضربات القلب انخفاضا ملحوظا بعد الانغراس مباشرة، لكنه تعافى في النهاية بمرور الوقت، كما هو موضح في الشكل 6. تم الحفاظ على الهيكل الإجمالي لقلوب المتبرعين بشكل جيد بعد الحفظ خارج الموقع والزرع غير المتجانس ، مع عدم اكتشاف أي أضرار مرئية. ومع ذلك ، كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين عن زيادة عدد الخلايا الالتهابية ، ومعظمها من العدلات ، بعد 3 ساعات من الزرع غير المتجانس (الشكل 7).
الشكل 1: التصميم التجريبي لحفظ القلب الطبيعي الحرارة خارج الموقع مع زراعة القلب غير المتجانسة. الاختصارات: BGA = تحليل غازات الدم ، CPS = محلول شلل القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخططات حفظ قلب الحيوانات الصغيرة المعدلة خارج الموقع . الاختصارات: مستشعر ضغط الدم = مستشعر ضغط الدم ، CPS = محلول شلل القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ترتيب المفاغرة في زراعة القلب غير المتجانس. أ: مخططات موضع قلب المتبرع في بطن المتلقي وترتيب المفاغرة. ب: المتبرع الأبهر الصاعد ومفاغرة الشريان الأورطي البطني المتلقي. (ج) الشريان الرئوي المتبرع به والمتلقي مفاغرة IVC. الاختصارات: LV = البطين الأيسر ، RV = البطين الأيمن ، LA = الأذين الأيسر ، MPA = الشريان الرئوي الرئيسي ، IVC = الوريد الأجوف السفلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: بارامترات تقييم الجدوى أثناء التروية خارج الموقع الطبيعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: الجدول الزمني لحفظ القلوب الستة المحفوظة بنجاح. استخراج القلب وتسهيل التروية خارج الموقع: 5.8 ± 1.3 دقيقة. التروية خارج الموقع: 120 دقيقة. الزرع في بطن الجرذ المتلقي: 38.4 ± 3.4 دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: أداء الفيزيولوجيا الكهربية لقلب المتبرع قبل الشراء وبعد الزرع. أ: التغيرات في معدل ضربات القلب. ما قبل الحصاد ، 30 دقيقة ، 60 دقيقة ، 90 دقيقة ، 120 دقيقة ، 150 دقيقة ، 180 دقيقة: الأوقات بعد الزرع. (ب) صور تخطيط كهربية القلب قبل حصاد قلب المتبرع وبعد 3 ساعات من الزرع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: المظهر العياني (A-C) والمجهري (D-F) لقلب المتبرع. (أ، د) قبل الحفظ الطبيعي للحرارة خارج الموقع . (ب، ه) بعد الحفظ الطبيعي خارج الموقع . (ج، و) بعد 2 ساعة من زرع غير متجانسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان تركيزنا في إنشاء هذا النموذج هو تكرار زراعة القلب البشري الطبيعي الحرارة. النماذج غير القاذفة هي التقنية المفضلة بشكل عام للحفاظ على قلب المتبرع في بيئة خارج الموقع 16. بينما توفر نماذج القذف العديد من المزايا في تقييم وظيفة القلب أثناء التروية خارج الموقع 17 ، فهي ليست مناسبة لنماذج الزرع غير المتجانسة. في عملية الزرع غير المتجانسة ، يحتاج قلب المتبرع المزروع إلى التغلب على ضغط الحمل الانقباضي الناتج عن القلب المضيف في الدورة الدموية المتلقي ، مما يؤدي إلى أداء محدود لقلب المتبرع والتقليل من تقديره في التقييم18. لذلك ، تكون النماذج غير المقذوفة أكثر ملاءمة في عملية الزرع غير المتجانسة. في النماذج غير القذفية، يتخلل قلب المتبرع ولكنه لا يدعم الدورة الدموية للمتلقي، مما يحد بشكل كبير من تقييم أداء القلب. يمكن أن تكون التقييمات المورفولوجية والجزيئية، مثل التلوين النسيجي وتحليل النشاف، مفيدة لفحص أمراض قلب المتبرع عندما تكون التقييمات الوظيفية محدودة. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم علامات التمثيل الغذائي باستخدام التقنيات المتقدمة ، مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)19. يمكن أن يكون هذا النموذج مفيدا في اختبار الفعالية طويلة المدى للتدخلات الدوائية والجينية قبل الزرع.
طورت العديد من المجموعات البحثية نموذجا للحفظ خارج الموقع الطبيعي الحرارة ، والذي تم استخدامه بنجاح للحفاظ على قلوب الخنازير لمدة تصل إلى 12 ساعة6. ومع ذلك ، فإن صيانة النماذج الحيوانية الكبيرة يمكن أن تكون باهظة التكلفة بالنسبة للمختبرات الصغيرة ، لأنها تنطوي على نفقات كبيرة وتتطلب عددا كبيرا من الموظفين المدربين. لمعالجة هذه المشكلة ، نقترح طريقة حفظ خارج الموقع أقل تكلفة ومباشرة من الناحية الفنية ، والتي تتضمن استخدام الدم الذاتي متبوعا بزراعة القلب غير المتجانسة. والجدير بالذكر أن تكلفة تجربة واحدة باستخدام نموذجنا تبلغ حوالي 300 دولار. على الرغم من عدم وجود نموذج حيواني صغير مكافئ لمقارنة التكاليف ، إلا أن جهاز التروية خارج الموقع للحيوانات الكبيرة ، عند استخدامه مرة واحدة ، يمكن أن يكلف ما يصل إلى 30000دولار 16.
يوضح البروتوكول المقدم أنه يمكن تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية بطريقة تدريجية بواسطة مجرب واحد (الشكل 3). تعد إمكانية الزرع غير المتجانس بعد الحفظ خارج الموقع ميزة أخرى لهذا النموذج. من خلال تقليب الشريان الأورطي النازل لقلب المتبرع للتروية خارج الموقع ، تمكنا من تجنيب الجزء الصاعد دون التسبب في أي ضرر. علاوة على ذلك ، قمنا بتعديل دائرة Langendorff ، مما قلل من كمية محلول التروية المطلوبة إلى 12 مل من أجل تروية القلب الفعالة. تم الحصول على دم التروية من الفئران المانحة قبل الحصاد ، مما يسمح لنا بالحفاظ على القلب بدمه وتجنب أي تفاعلات مناعية أثناء الحفظ.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
يوصى باستخدام دائرة التروية خارج الموقع للحفاظ على متوسط ضغط الحمل اللاحق في حدود 50-70 مم زئبق. يتم تحديد الضغط من خلال عوامل مختلفة ، بما في ذلك تدفق التروية ، ومقاومة الشريان التاجي ، ولزوجة البيروسات20. مقاومة الشرايين التاجية عرضة للتقلبات بسبب الاختلافات في درجة الحرارة ودرجة الحموضة ، وبالتالي من الضروري الحفاظ على هذه المعلمات ضمن المعدل الطبيعي. يختلف تدفق التروية المطلوب لكل تجربة ويعتمد على التدفق اللازم للحفاظ على ضغط التروية المطلوب. عادة ما يكون تدفق 3-4 مل / دقيقة (أي ما يعادل 5-6 دورة في الدقيقة لمضختنا) كافيا لقلب فأر 350-450 جم. مستوى الهيماتوكريت هو محدد لزوجة البيروسات21. بالنسبة لدائرتنا ، فإن نطاق الهيماتوكريت الأمثل هو 25٪ إلى 30٪. على الرغم من استخدام أصغر جهاز أكسجين تجريبي ، فإن مساحة سطح تبادل الغازات الكبيرة البالغة 0.05 م2 لحجم بيرفوسات يبلغ 12 مل يمكن أن تؤدي إلى التبخر وبالتالي فقدان السوائل بمرور الوقت. يمكن تصحيح فقدان السوائل هذا بإضافة الماء المقطر حسب الحاجة. لا ينصح بإضافة محلول ملحي أو جرس إلى البيرفوسات ، لأنها يمكن أن تسبب فرط صوديوم الدم. يجب الحفاظ على تركيز الجلوكوز المعطوش عند 100-150 مجم / ديسيلتر.
من الأهمية بمكان تجنب عدم انتظام ضربات القلب أثناء التروية لأنه يدل على تدهور واحد أو أكثر من المعلمات الفسيولوجية للبيئة خارج الموقع 10. عادة ما يرتبط عدم انتظام ضربات القلب أو الرجفان البطيني الأيسر بعوامل مختلفة ، مثل عدم التوازن الإلكتروليتي ، وانخفاض الهيماتوكريت ، والحماض / القلاء ، وارتفاع الحرارة ، والحمل اللاحق المفرط. من ناحية أخرى ، يحدث بطء ضربات القلب بشكل رئيسي بسبب انخفاض حرارة الجسم. اللاكتات والبوتاسيوم هي المعلمات الرئيسية في تقييم صلاحية عضلة القلب. تشير مستويات اللاكتات المرتفعة (>5 مليمول / لتر) وفرط بوتاسيوم الدم (>5.0 مجم / ديسيلتر) إلى درجة كبيرة من تلف عضلة القلب22.
المراقبة الدقيقة لجرعة التخدير وأنماط التنفس للفأر المتلقي أمر بالغ الأهمية أثناء العمليات الجراحية. نظرا لعدم تهوية الحيوانات ، فإن الإدارة المستمرة للتخدير المفرط يمكن أن تؤدي إلى نقص التهوية والفشل. يؤدي فتح البطن الكلي واستخراج أعضاء البطن إلى فقدان كبير للحرارة ، مما قد يؤدي إلى مزيد من تدهور حالة المتلقي. لذلك ، فإن استخدام جهاز تحكم في درجة الحرارة مزود بوسادة تدفئة ومسبار درجة الحرارة أمر بالغ الأهمية للتخفيف من تأثير فقدان الحرارة والحفاظ على درجة حرارة ثابتة للجسم.
خطوات حاسمة
تتضمن المراحل الحرجة في الإجراء الجراحي تشريح قوس الأبهر و MPA ، وقنية الأبهر للتروية خارج الموقع ، وإزالة التهوية قبل التروية خارج الموقع ، وإزالة الهواء قبل إزالة المشابك بعد الزرع. هذه الخطوات ضعيفة للغاية وغالبا ما ترتبط بالفشل. ومع ذلك ، فإن مفتاح التغلب على هذه التحديات يكمن في تحديد التقنية المناسبة واكتساب الممارسة الكافية. أثناء عزل الوعاء في المتلقي ، يجب إيلاء اهتمام خاص للحالب الأيمن ، والذي يقع على مقربة من IVC في الفضاء خلف الصفاق وقد يحاكي القناة اللمفاوية. في سياق مفاغرة الوريد ، يوصى أولا بتأمين الطرف الذيلي باستخدام خيوط البقاء متبوعة بنهاية الجمجمة لمنع التمزق والتضيق. هذا مهم بشكل خاص بسبب الطبيعة الهشة نسبيا للأوردة مقارنة بالشريان الأورطي.
القيود
الإجراءات الجراحية التي تنطوي عليها هذه التجربة معقدة إلى حد كبير ، لا سيما عند الحصول على قلب المتبرع وتعطير الدم من نفس الحيوان. التقييمات الوظيفية بعد الزرع محدودة لأننا استخدمنا نموذجا غير مقذف. يعتبر نموذج القذف لتوفير نتائج أكثر تقدما في بيئة خارج الموقع . ومع ذلك ، في عملية الزرع غير المتجانسة ، يتم تقييدها بسبب وجود قلب مضيف داعم في الدورة الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنحة B2021-0991 من معهد البحوث الطبية الحيوية بمستشفى جامعة تشونام الوطنية و NRF-2020R1F1A1073921 من المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AES active evacuation system | Smiths medical | PC-6769-51A | Utilize CO2 and excess isoflurane |
| Anesthesia machine | Smiths medical | PC-8801-01A | Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal |
| B20 patient monitor | GE medical systems | B20 | to observe mean aortic pressure and temperature |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard apparatus | 55-7020 | To monitor and maintain animal's temperature |
| Micro-1 Rat oxygenator | Dongguan Kewei medical instruments | Micro-MO | For gas exchange in the langendorff circuit |
| Micropuncture introducer Set | COOK medical | G48007 | for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta |
| Microscope | Amscope | MU1403 | For zooming surgical field (Recipient) |
| Surgical loupe | SurgiTel | L2S09 | For zooming surgical field (Donor) |
| Syringe pump | AMP all | SP-8800 | To deliver cardioplegic solution |
| Transonic flow sensor | Transonic | ME3PXL-M5 | Perfusion circuit flow sensor |
| Transonic tubing flow module | Transonic | TS410 | flow acquiring system |
| Watson - Marlow pumps | Harvard apparatus | 010.6131.DAO | Peristaltic pump used for recirculate perfusate |
| WBC-1510A | JEIO TECH | E03056D | Heating bath |
| Sprague-Dawley rats | Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea | ||
| Medications | |||
| BioHAnce Gel Eye Drops | SENTRIX Animal care | wet ointments for eye | |
| Cefazolin | JW pharmaceutical | For prophilaxis | |
| Custodiol | DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH | For heart harvesting | |
| Diclofenac | Myungmoon Pharm. Co. Ltd | For pain control | |
| Heparin | JW pharmaceutical | Anticoagulant | |
| Insulin | JW pharmaceutical | hormon therapy | |
| Saline | JW pharmaceutical | For hydration therapy |
References
- Langmuur, S. J. J., et al. Normothermic ex-situ heart perfusion with the organ care system for cardiac transplantation: A meta-analysis. Transplantation. 106 (9), 1745-1753 (2022).
- Ardehali, A., et al. Ex-vivo perfusion of donor hearts for human heart transplantation (PROCEED II): a prospective, open-label, multicentre, randomized non-inferiority trial. Lancet. 385 (9987), 2577-2584 (2015).
- Dang Van, S., et al. Ex vivo perfusion of the donor heart: Preliminary experience in high-risk transplantations. Archives of Cardiovascular Diseases. 114 (11), 715-726 (2021).
- Zhou, P., et al. Donor heart preservation with hypoxic-conditioned medium-derived from bone marrow mesenchymal stem cells improves cardiac function in a heart transplantation model. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 5f6 (2021).
- Messer, S., Large, S. Resuscitating heart transplantation: the donation after circulatory determined death donor.European. Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 49 (1), 1-4 (2016).
- Trahanas, J. M., et al. Achieving 12 hour normothermic ex situ heart perfusion: an experience of 40 porcine hearts. ASAIO Journal. 62 (4), 470-476 (2016).
- Yang, Y., et al. Keeping donor hearts in completely beating status with normothermicblood perfusion for transplants. The Annals of Thoracic Surgery. 95 (6), 2028-2034 (2013).
- Van Caenegem, O., et al. Hypothermic continuous machine perfusion enables preservation of energy charge and functional recovery of heart grafts in an ex vivo model of donation following circulatory death. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 49 (5), 1348-1353 (2016).
- Lu, J., et al. Normothermic ex vivo heart perfusion combined with melatonin enhances myocardial protection in rat donation after circulatory death hearts via inhibiting NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 733183 (2021).
- Pinnelas, R., Kobashigawa, J. A. Ex vivo normothermic perfusion in heart transplantation: a review of the TransMedics Organ Care System. Future Cardiology. 18 (1), 5-15 (2022).
- Fuchs, M., et al. Does the heart transplant have a future. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 55, i38-i48 (2019).
- Pahuja, M., Case, B. C., Molina, E. J., Waksman, R. Overview of the FDA's circulatory system devices panel virtual meeting on the TransMedics Organ Care System (OCS) Heart - portable extracorporeal heart perfusion and monitoring system. American Heart Journal. 247, 90-99 (2022).
- Jawitz, O. K., Devore, A. D., Patel, C. B., Bryner, B. S., Schroder, J. N. Expanding the donor pool: quantifying the potential impact of a portable organ-care system for expanded criteria heart donation. Journal of Cardiac Failure. 27 (12), 1462-1465 (2021).
- van Suylen, V., et al. Ex situ perfusion of hearts donated after euthanasia: a promising contribution to heart transplantation. Transplantation Direct. 7 (3), e676 (2021).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), e0214513 (2019).
- Qin, G., Jernryd, T., Sjoberg, S., Steen, S., Nilsson, J. Machine perfusion for human heart preservation: A systematic review. Transplant International. 35, 10258 (2022).
- Dang Van, S., Brunet, D., Akamkam, A., Decante, B., Guihaire, J. Functional assessment of the donor heart during ex situ perfusion: insights from pressure-volume loops and surface echocardiography. Journal of Visual Experiments. (188), e63945 (2022).
- Fu, X., Segiser, A., Carrel, T. P., Tevaearai Stahel, H. T., Most, H. Rat heterotopic heart transplantation model to investigate unloading-induced myocardial remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 3, 34 (2016).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Qi, X., et al. The evaluation of constant coronary artery flow versus constant coronary perfusion pressure during normothermic ex-situ heart perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 41 (12), 1738-1750 (2022).
- Okahara, S., et al. A novel blood viscosity estimation method based on pressure-flow characteristics of an oxygenator during cardiopulmonary bypass. Artificial Organs. 41 (3), 262-266 (2017).
- Quader, M., Torrado, J. F., Mangino, M. J., Toldo, S. Temperature and flow rate limit the optimal ex-vivo perfusion of the heart - an experimental study. Journal of Cardiothoracic Surgery. 15 (1), 180 (2020).
Tags
الطب، العدد 194،Erratum
Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 08/28/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.
Section 4 of the Protocol was updated from:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
to:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
- After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C.
NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments. - Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
