Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Rottemodell av normoterm ex-situ perfusert heterotopisk hjertetransplantasjon

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64954
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3, 2, 2,3, 4, 5, 3,6
1Department of Medical Science, Chonnam National University Graduate School, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 3Cardiovascular and Respiratory Research Team, Chonnam National University Hospital, 4Department of Internal Medicine, Chonnam National University Hospital and Medical School, 5Departments of Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 6Department of Pediatrics, Chonnam National University Children’s Hospital, and Medical School
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Her presenterer vi en vurderingsprotokoll av et heterotopisk implantert hjerte etter normoterm ex situ konservering i rottemodellen.

Abstract

Hjertetransplantasjon er den mest effektive behandlingen for hjertesvikt i sluttstadiet. Til tross for forbedringer i terapeutiske tilnærminger og intervensjoner, øker antall hjertesviktpasienter som venter på transplantasjon fortsatt. Den normoterme ex situ preserveringsteknikken er etablert som en sammenlignbar metode med den konvensjonelle statiske kjølelagringsteknikken. Den største fordelen med denne teknikken er at donorhjerter kan bevares i opptil 12 timer i fysiologisk tilstand. Videre tillater denne teknikken gjenoppliving av donorhjertene etter sirkulasjonsdød og bruker nødvendige farmakologiske inngrep for å forbedre donorfunksjonen etter implantasjon. Tallrike dyremodeller har blitt etablert for å forbedre normoterm ex situ bevaringsteknikker og eliminere bevaringsrelaterte komplikasjoner. Selv om store dyremodeller er enkle å håndtere sammenlignet med små dyremodeller, er det kostbart og utfordrende. Vi presenterer en rottemodell med normoterm ex situ donorhjertekonservering etterfulgt av heterotopisk abdominaltransplantasjon. Denne modellen er relativt billig og kan oppnås av en enkelt eksperimentør.

Introduction

Hjertetransplantasjon er fortsatt den eneste levedyktige behandlingen for ildfast hjertesvikt 1,2,3,4. Til tross for en jevn økning i antall pasienter med behov for hjertetransplantasjon, er det ikke observert en proporsjonal økning i tilgjengeligheten av donororganer5. For å løse dette problemet har nye tilnærminger for å bevare donorhjerter blitt utviklet med mål om å forbedre utfordringene og øke tilgjengeligheten av givere 6,7,8,9.

Normothermic ex situ heart perfusion (NESHP) ved bruk av organpleiesystem (OCS) maskiner har dukket opp som en klinisk intervensjon 1,3. Denne teknikken har blitt ansett som et egnet alternativ til konvensjonell statisk kjølelager (SCS) metode 2,9. NESHP reduserer effektivt varigheten av kald iskemi, reduserer metabolsk etterspørsel og letter optimal næringstilførsel og oksygenering under transport av donororganer10,11. Til tross for det klare potensialet i denne metoden for å forbedre bevaring av donororganer, har dens kliniske anvendelse og videre undersøkelse blitt begrenset av høye kostnader. Derfor er prekliniske dyremodeller av NESHP avgjørende for å identifisere viktige tekniske utfordringer knyttet til denne teknikken12,13. Griser og rotter er de foretrukne dyremodellene for prekliniske studier på grunn av deres iskemiske toleranse9. Selv om svinemodellen er ideell for grunnleggende og translasjonsforskning, er den begrenset av høye kostnader og intensiv arbeidskraft som kreves for pleie og vedlikehold. Derimot er rottemodeller rimeligere og enklere å håndtere14.

I denne studien introduserer vi en forenklet rottemodell av NESHP, etterfulgt av heterotopisk hjertetransplantasjon, for å evaluere effekten av konserveringsteknikken på transplantattilstand etter implantasjon. Denne modellen er enkel, kostnadseffektiv og kan utføres av en enkelt eksperimentør. Figur 1 viser skjemaene for prosedyren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den etiske komiteen ved Laboratory Animal Research Center ved Chonnam National University Hospital (godkjenning nr. CNU IACUC - H - 2022-36) godkjente alle dyreforsøkene. Mannlige Sprague-Dawley-rotter (350-450 g), brukt i denne studien, fikk omsorg i samsvar med retningslinjene for stell og bruk av forsøksdyrene. Rottene ble plassert i temperaturkontrollerte rom med en 12 timers lys-mørk syklus, med standard mat og vann tilgjengelig.

1. Forberedelse

MERK: En enkelt eksperimentør kan utføre alle eksperimentelle prosedyrer.

  1. Monter Langendorff-apparatet, inkludert oksygenator-, pumpe- og perfusjonsslangene, før kirurgi (figur 2). Fyll perfusjonskretsløpet med 20 ml saltoppløsning og sirkuler det til det er primet med autologt blod.
    MERK: Målet med dette trinnet er å varme den ekstrakorporeale kretsen.
  2. Fest kardioplegisk linje til kretsløpet via stoppekranen festet til aortakanylen og klargjør sprøytepumpen for den endelige kardioplegiske infusjonen.
    MERK: Sørg for at eventuelle luftbobler fjernes fra perfusjonskretsløpet og kardioplegislangen.
  3. Plasser temperatursensoren i reservoaret der donorhjertet skal oppbevares, og hold kretsens temperatur på 37 °C.
  4. Kirurgiske preparater
    1. Forbered et separat sett med sterile mikroinstrumenter og materialer for hver donor og mottakerrotte.
      1. Forbered det kirurgiske settet for giveren: par kirurgiske saks, par mikrotang, skarpe myggtang, 5-0 silkesuturer, bomullspinner, 50 ml sprøyte, perfusjonslinje for kardioplegiær løsning (CPS), sprøytepumpe, 18 G angiokateter, ett sett med 5 Fr. lårbenskatetre og sterile gasbind.
      2. Forbered operasjonssettet for mottakeren: mikrokirurgisk saks, sårretractor, par mikrotang, myggtang, vaskulære mikroklemmer, 1 ml sprøyte, en 5-0 og 9-0 polypropylensuturer, 5-0 silkeuturer, bomullspinner og sterile gasbind.

2. Bevaring av donorhjerte og blodinnsamling

  1. Indusere anestesi hos donorrotten med isofluran (5%) i anestesikammeret og registrer rottens vekt før den legges på operasjonsbordet.
  2. Plasser rotta i liggende stilling på operasjonsbordet og administrer kontinuerlig anestesi ved å levere 2% -2,5% isofluran med 90% oksygen gjennom en nesekjegle.
  3. Bekreft dybden av anestesi ved å sjekke mangelen på respons på tåklemmen og pustefrekvensen, som skal være mellom 50-60 per minutt.
    MERK: Et tilstrekkelig nivå av anestesi er avgjørende for å unngå unødvendig stress og smerte for donorrotten.
  4. Påfør øye smøremiddel og barbere regionen pubis til clavicula, hvor operasjonen skal utføres. Rengjør området med en jodbasert skrubb og 70% alkohol.
  5. Catheterization
    1. Lag et 7 cm midtlinje abdominal snitt og bilaterale snitt som måler 3 cm fra xiphoidprosessen til midtkragebenet. Fjern pelsen fra thoraxområdet.
    2. Bruk bomullspinne, mobiliser bukorganene til venstre side av magen. Isoler abdominal aorta fra retroperitoneal fascia og fettvev.
    3. Injiser 1000 IE heparin oppløst i 0,3 ml isoton saltoppløsning gjennom vena cava inferior (IVC) ved hjelp av en 1 ml sprøyte. Stopp enhver blødning fra nålehullet ved å komprimere forsiktig med en bomullspinne.
      MERK: Vær forsiktig med luftemboli under injeksjon, da det kan føre til hjertestans.
    4. Sett inn et 5 Fr. femoral kateter i abdominal aorta (Abd. A). Sørg for at kateterspissen når aortabuen. Bekreft kateterplasseringen ved å vurdere den omtrentlige lengden på den innsatte delen av kateteret.
  6. Blod samling
    1. Samle rundt 10 ml blod via kateteret satt inn i Abd. A.
    2. Senere fortynnes primingsblodet med isotonisk saltoppløsning til totalvolumet når 12 ml. Tilsett 5 mg cefazolin oppløst i 0,3 ml saltvann og insulin (20 IE).
  7. Hjertestans
    1. Koble den tidligere klargjorte CPS-perfusjonsslangen til abdominalkateteret og start CPS-administrasjonen med sprøytepumpen med en hastighet på 800 ml/t.
    2. Åpne brysthulen fra membranen og kutt IVC nær membranen for å forhindre ventrikulær oppblåsthet. Skjær ribbeina bilateralt langs brystryggen opp til thoraxinnløpet. Reflekter den mobiliserte ventrale brystveggen overlegent med myggtang.
    3. Fjern thymus helt ved hjelp av mikrotang for å visualisere aortabuen. Påfør lett kompresjon hvis tymiske arterier bløder.
  8. Utvinning
    1. Etter administrering av alt CPS, isoler aortabuen fra det omkringliggende vevet. Dissekere forsiktig rett under venstre arteria subclavia.
    2. Transekter brakiocephalic og forlot vanlige carotisarterier i en fjern stilling, slik at de lengre stubbene i aortabuen for enkel håndtering under aorta kanylering. Transekt hovedpulsåren (MPA) så nært bifurkasjonen som mulig. Vær forsiktig så du ikke skader venstre atrievedheng.
    3. Liger forsiktig den overlegne vena cava (SVC) og IVC med 5-0 silkesuturer, og forhindrer obstruksjon av høyre atrium (RA) og koronar sinus. Dekk venstre kanter av thorax med vått gasbind, plasser hjertet, på det og trekk forsiktig SVC- og IVC-ligaturene for å avsløre hilum.
    4. Ligate lunge og azygos årer sammen med en 5-0 silke sutur. Kutt vevet dorsalt til ligaturen og trekk ut hjertet. Undersøk hjertet for eventuelle skader. Til slutt, vei hjertet før aortakanylering.

3. Ex situ perfusjon

  1. Aorta kanylering og perfusjon
    1. Før aorta kanylering, erstatt saltvannsprimet krets med blodpriming.
    2. Sett inn aortakantetylen i aortabuen og fest den med en midlertidig mikroklemme. Sørg for at spissen av kanylen er plassert ved brakiocephalic krysset.
    3. Bekreft riktig posisjon av kanylen ved å ta forsiktig tak i aorta med mikrotang.
    4. Start perfusjonen med en strømningshastighet på 2-3 ml/min, slik at perfusat kan lekke fra kanyleringsstedet for å fjerne eventuelle luftbobler.
    5. Overvåk perfusjonstrykket og temperaturen gjennom sensoren som er koblet til overvåkingssystemet.
    6. Masser hjertet forsiktig med den første og pekefingeren til venøst blod lekker fra hovedpulsåren (MPA).
    7. Fest aorta med en 1-0 silkeligatur og fjern klemmen etter å ha verifisert alle innstillingene (perfusjonskrets, perfusjonstrykk, temperatur).
    8. Når den permanente ligaturen er plassert, sørg for at hjertet begynner å trekke seg sammen innen få sekunder og når normal rytme på 60 s. Et gjennomsnittlig perfusjonstrykk på 55-65 mmHg med en koronar strømningshastighet på 3-4 ml ved 37 °C indikerer adekvat perfusjon.
    9. Samle 0,15 ml blod fra reservoaret og kontroller blodgassanalysen (BGA) i begynnelsen av perfusjonen og deretter hvert 20. minutt. Overvåk og registrer pH, pCO 2, pO2, glukose, hematokrit, kalium og laktat under perfusjon. Etter 120 minutters perfusjon administreres 3 ml Custodiol gjennom sprøytepumpen med en hastighet på 250 ml/t for å arrestere hjertet.

4. Implantasjon

  1. Forberedelse av mottaker
    1. Begynn mottakerforberedelsen 30 minutter før avslutning av ex situ perfusjon.
    2. Bedøve resipientdyret med samme metode som nevnt i trinn 2.2.
    3. Plasser rotta i ryggleie på varmeputen og sett temperatursonden inn i endetarmen for å holde kroppstemperaturen på 37 °C.
    4. Påfør øye smøremiddel, barber skammen til det epigastriske området, og rengjør området med en jodbasert skrubb og 70% alkohol.
  2. Medisiner
    1. Injiser 2 ml varm saltvann subkutant for å kompensere for væsken som går tapt under operasjonen. Injiser 200 IE heparin subkutant.
    2. Administrer antibiotikaprofylakse ved å injisere 10 mg/kg cefazolin oppløst i 0,3 ml saltvann subkutant eller intramuskulært.
    3. Gi smertekontroll ved å injisere 20 mg/kg diklofenak subkutant.
  3. Utfør mid-line laparotomy og sett inn en retractor for å utvide bukhulen. Mobiliser bukorganene til venstre side av mottakeren ved hjelp av bomullspinner for å gi plass til prosedyren.
  4. Forhindre dehydrering ved å pakke bukorganene med varmt og vått gasbind. Periodisk spre varm saltvann med en 50 ml sprøyte under operasjonen.
  5. Ved hjelp av et kirurgisk mikroskop med 10x forstørrelse, mobiliser tolvfingertarmen og proksimal jejunum ved stump disseksjon med bomullspinner for å avsløre Abd. A. og IVC. Forbered Abd. A og IVC for anastomose og systematisk implantering av donorhjertet, i henhold til figur 3 eller tidligere dokumenterte metoder15.
    MERK: Ikke skill Abd. A. og IVC.
    1. Forutsatt at vaskulær anastomose plasseres infrarenal, må du forberede en tilstrekkelig del av aorta og IVC for klemming.
    2. Utfør stump forberedelse ved hjelp av bomullspinne eller skarpe takketang for å fjerne fett og fascia rundt karene.
    3. Plasser 5-0 silke ligaturer til mesenteriske grener og både kraniale og kaudale sider av de store fartøyene. Løft bukkarene og koaguler eller liger lumbale grener med 5-0 silke suturer. Husk å skåne testikkelårene og venene og ikke klemme dem.
    4. Bruk ligaturer til å løfte karene og plassere mikroklemmene til mesenteriske grener, caudale og kraniale sider av de store karene for å stoppe blodstrømmen på anastomosestedet. Slå av varmeputen før du plasserer klemmene, da overflødig oppvarming kan forverre iskemi i lemmer. Sørg for å slå på varmeputen etter at du har klemt karene for å unngå hypotermi.
    5. Punkter aorta med en 27 G nål og forleng snittet med mikrosaks til en lengde som er lik eller litt større enn åpningen av donorens stigende aorta (Asc. A), som er ca. 5 mm.
    6. Lag et langsgående snitt på IVC på samme måte som aortotomien, men gjør det 3 mm nærmere den kaudale siden sammenlignet med aortasnittet.
    7. Ved å starte anastomosene, plasseres donorhjertet på høyre side av mottakerens mage og fester donoren Asc. A til mottakerens Abd. A med ett enkelt avbrutt sting (9-0 polypropylen) i kraniehjørnet av langsgående snitt.
    8. Flytt hjertet til venstre side av mottakerens mage og utfør anastomose av donorens Asc. A med mottakerens Abd. A bruker en løpende 9-0 polypropylen sutur.
    9. Fikser donor lungearterien til IVC med to avbrutte suturer (9-0 polypropylen) ved kaudale og kraniale hjørner av langsgående snitt.
    10. Utfør første halvdel av venøs anastomose fra intraluminal side av fartøyet og fullfør andre halvdel fra ekstraluminal side av fartøyet. Før du strammer knutene, skyll feltet med saltvann for å forhindre luftemboli.
  6. Avlufting og avklemming
    1. Fjern den mesenteriske veneklemmen først etter å ha fullført anastomosen for å la høyre side av hjertet fylles med venøst blod.
    2. Fjern luften i koronarkretsen og Asc. A. ved å påføre retrograd koronar perfusjon i flere sekunder.
    3. Plasser et stykke gasbind på begge sider av karene og fjern kaudalklemmen og kranialklemmen.
    4. Påfør forsiktig kompresjon med bomullspinner i 1-2 min. Etter å ha sikret tilstrekkelig hemostase, fjern vattpinnene og vask anastomosene med varmt saltvann.
      MERK: Hjertet skal begynne å slå i løpet av det første minuttet av reperfusjonen. Hvis mottakerrottens kroppstemperatur er under 35 °C, vil hjerterytmen normaliseres etter at temperaturen når 36 °C.
  7. Bytt bukorganene på en meanderlignende måte og lukk lagene i buksnittet ved hjelp av kontinuerlige 5-0 polypropylensuturer.
  8. Etter operasjonen, plasser det bedøvede dyret på et rent område over en varmepute til kroppstemperaturen når 37 ° C.
    MERK: Ikke start de postoperative undersøkelsene før kroppstemperaturen når 37 °C. Opprettholde anestesi ved 2-2,5% isofluran til slutten av forsøkene.
  9. Overvåk EKG av det transplanterte donorhjertet i 3 timer. Deretter excise hjertet under dyp anestesi for histologiske studier.
    MERK: Bekreft anestesidybden via mangel på pedalrefleks før du ekskluderer hjertet. Den kirurgiske prosedyren og EKG-overvåkingen tar mindre enn 6 timer. Diklofenak, administrert peroperativt (trinn 4.2.3.), muliggjør smertebehandling i hele varigheten av denne prosedyren. Analgesiregimet kan justeres i henhold til institusjonelle retningslinjer for bruk av dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 illustrerer det eksperimentelle designet som ble brukt i en smådyrmodell. Figur 2 viser det modifiserte Langendorff perfusjonsapparatet, som inkluderer en oksygenator for små dyr. Rekkefølgen av anastomose ved heterotopisk abdominalimplantasjon er presentert i figur 3.

Figur 4 viser parametrene som brukes til å vurdere hjertets levedyktighet under ex situ perfusjon, som laktat, kalium og gjennomsnittlig aortatrykk. I denne studien reduserte bruk av normoterm ex situ-konservering den totale iskemiske tiden for seks vellykkede tilfeller til 46,2 ± 4,7 min, mens total ut-av-kroppen-tid var 166,2 ± 4,7 min (figur 5). Ekstraksjon av hjertet fra donor og forberedelse til ex situ perfusjon og heterotoptransplantasjon krevde 5,8 ± 1,3 min, som vist i figur 5. Den totale suksessraten for operasjonen var 70 % og gjennomsnittlig anastomosetid for de seks vellykkede tilfellene var 38,4 ± 3,4 minutter. I alle forsøkene sank hjertefrekvensen signifikant umiddelbart etter implantasjonen, men den kom seg etter hvert over tid, som illustrert i figur 6. Den brutto strukturen til donorhjertene ble godt bevart etter ex situ bevaring og heterotopisk implantasjon, uten synlige skader oppdaget. Imidlertid viste farging av hematoksylin-eosin et økt antall inflammatoriske celler, hovedsakelig nøytrofile celler, etter 3 timer med heterotopisk implantasjon (figur 7).

Figure 1
Figur 1 Eksperimentelt design av normoterm ex situ hjertekonservering med heterotopisk hjertetransplantasjon. Forkortelser: BGA = blodgassanalyse, CPS = kardioplegisk løsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjema over modifisert hjertekonservering på små dyr ex situ . Forkortelser: BP-sensor = blodtrykkssensor, CPS = kardioplegisk løsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Rekkefølgen av anastomose ved heterotopisk hjertetransplantasjon. (A) Skjema over donorens hjerteposisjon i mottakerabdomen og rekkefølge av anastomose. (B) Donor stigende aorta og mottaker abdominal aorta anastomose. (C) Donor lungearterie og mottaker IVC anastomose. Forkortelser: LV = venstre ventrikkel, RV = høyre ventrikkel, LA = venstre atrium, MPA = hovedpulsåren, IVC = vena cava inferior. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Parametere for levedyktighetsvurdering under ex situ perfusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Tidslinje for bevaring av de seks godt bevarte hjertene. Hjerteekstraksjon og ex situ perfusjonsfasilitering: 5,8 ± 1,3 min. Ex situ perfusjon: 120 min. Implantasjon i buken til mottakerrotten: 38,4 ± 3,4 min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Donorhjertets elektrofysiologiske ytelse før anskaffelse og etter implantasjon . (A) Endringer i hjertefrekvensen. Forhøsting, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min: tidene etter implantasjon. (B) Elektrokardiografi bilder før donor hjerte høsting og etter 3 timer med implantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Donorhjertets makroskopiske (A-C) og mikroskopiske (D-F) utseende. (A,D) Før normoterm ex situ bevaring. (B,E) Etter normoterm ex situ bevaring. (C,F) Etter 2 timer med heterotopisk implantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vårt fokus i å etablere denne modellen var å replikere normoterm human hjertetransplantasjon. Ikke-utstøtende modeller er den vanligste foretrukne teknikken for å bevare donorhjertet i et ex situ-miljø 16. Selv om utkastingsmodeller gir mange fordeler ved vurdering av hjertefunksjon under ex situ perfusjon17, er de ikke egnet for heterotopiske transplantasjonsmodeller. Ved heterotopisk transplantasjon må det implanterte donorhjertet overvinne systolisk etterbelastningstrykk skapt av vertshjertet i mottakerens sirkulasjonssystem, noe som fører til begrenset donorhjerteytelse og underestimering i vurderingen18. Derfor er ikke-utstøtende modeller gunstigere i heterotopisk transplantasjon. I ikke-utkastende modeller er donorhjertet perfundert, men støtter ikke mottakerens sirkulasjon, noe som begrenser hjertets ytelsesvurdering betydelig. Morfologiske og molekylære evalueringer, som histologisk farging og blottingsanalyse, kan være fordelaktige for å undersøke donorhjerteforhold når funksjonelle vurderinger er begrenset. Videre kan de metabolske markørene evalueres ved hjelp av avanserte teknologier, for eksempel positronemisjonstomografi (PET) eller magnetisk resonansavbildning (MRI)19. Denne modellen kan være nyttig for å teste den langsiktige effektiviteten av farmakologiske og genetiske inngrep før implantasjon.

Tallrike forskningsgrupper har utviklet en normoterm ex situ bevaringsmodell , som har blitt brukt til å bevare svinehjerter i opptil 12 timer6. Imidlertid kan vedlikehold av store dyremodeller være kostnadsoverkommelig for små laboratorier, da det innebærer betydelige utgifter og krever et betydelig antall utdannet personell. For å løse dette problemet foreslår vi en rimeligere og teknisk enkel ex situ bevaringsmetode , som innebærer bruk av autologt blod etterfulgt av heterotopisk hjertetransplantasjon. Spesielt er kostnaden for et enkelt eksperiment ved hjelp av modellen vår omtrent $ 300. Selv om det ikke finnes noen tilsvarende smådyrmodell for å sammenligne kostnadene, kan ex situ perfusjonsapparatet for store dyr, når det brukes en gang, koste opp til $ 30.00016.

Den presenterte protokollen viser at alle eksperimentelle prosedyrer kan utføres trinnvis av en enkelt eksperimentør (figur 3). Muligheten for heterotopisk implantasjon etter ex situ bevaring er en annen fordel med denne modellen. Ved å kanylere den synkende aorta av donorhjertet for ex situ perfusjon, var vi i stand til å spare den stigende delen uten å forårsake skade. Videre modifiserte vi Langendorff-kretsen, noe som reduserte mengden perfusjonsoppløsning som kreves til 12 ml for effektiv hjerteperfusjon. Perfusjonsblodet ble hentet fra donorrotten før høsting, slik at vi kunne bevare hjertet med sitt eget blod og unngå immunologiske reaksjoner under konservering.

Endringer og feilsøking
Ex situ perfusjonskretsen anbefales for å opprettholde et gjennomsnittlig etterbelastningstrykk innenfor området 50-70 mmHg. Trykket bestemmes av ulike faktorer, inkludert perfusjonsstrøm, koronararteriemotstand og parfysatviskositet20. Koronar arteriell motstand er utsatt for svingninger på grunn av variasjoner i temperatur og pH, og det er derfor avgjørende å opprettholde disse parametrene innenfor normalområdet. Den nødvendige perfusjonsstrømmen varierer for hvert eksperiment og er avhengig av den nødvendige gjennomstrømningen for å opprettholde ønsket perfusjonstrykk. Vanligvis er en strømning på 3-4 ml / min (tilsvarer 5-6 o / min for pumpen vår) tilstrekkelig for et 350-450 g rottehjerte. Hematokritnivået er en determinant for parfysatviskositet21. For vår krets er det optimale hematokritområdet 25% til 30%. Til tross for bruken av den minste eksperimentelle oksygenatoren, kan det store gassutvekslingsarealet på 0, 05 m2 for et parfysatvolum på 12 ml føre til fordampning og følgelig væsketap over tid. Dette væsketapet kan utbedres ved tilsetning av destillert vann etter behov. Det anbefales ikke å legge til saltvann eller ringeroppløsning til perfusatet, da de kan forårsake hypernatremi. Perfusatglukosekonsentrasjonen bør opprettholdes på 100-150 mg/dl.

Det er avgjørende å unngå arytmi under perfusjon, da det betyr forverring av en eller flere fysiologiske parametere i ex situ-miljøet 10. Takyarytmi eller venstre ventrikkelflimmer er ofte forbundet med ulike faktorer, for eksempel elektrolytisk ubalanse, lav hematokrit, acidose / alkalose, hypertermi og overdreven etterbelastning. På den annen side er bradyarytmi hovedsakelig forårsaket av hypotermi. Laktat og kalium er nøkkelparametrene for å vurdere myokardial levedyktighet. Forhøyede laktatverdier (>5 mmol/L) og hyperkalemi (>5,0 mg/dl) indikerer betydelig grad av myokardskade22.

Nøye overvåking av anestesidosering og pustemønster hos mottakerrotte er avgjørende under kirurgiske prosedyrer. Siden dyrene ikke ventileres, kan kontinuerlig administrering av overdreven anestesi føre til hypoventilasjon og svikt. Den totale laparotomi og ekstraksjon av bukorganer resulterer i betydelig varmetap, noe som ytterligere kan forverre mottakerens tilstand. Derfor er bruk av en temperaturregulator utstyrt med en varmepute og temperatursonde avgjørende for å redusere virkningen av varmetap og opprettholde en stabil kroppstemperatur.

Kritiske skritt
De kritiske stadiene i den kirurgiske prosedyren involverer disseksjon av aortabuen og MPA, aortakanylering for ex situ perfusjon, avlufting før ex situ perfusjon og avlufting før klemmene fjernes etter implantasjon. Disse trinnene er svært sårbare og er ofte forbundet med feil. Nøkkelen til å overvinne disse utfordringene ligger imidlertid i å identifisere riktig teknikk og få tilstrekkelig praksis. Under fartøyisolering hos mottakeren må det tas særlig hensyn til høyre ureter, som ligger i nærheten av IVC i retroperitonealrommet og kan etterligne lymfekanalen. I forbindelse med veneanastomose anbefales det først å sikre den kaudale enden ved hjelp av oppholdssuturer etterfulgt av kranialenden for å forhindre rifter og stenose. Dette er spesielt viktig på grunn av den relativt skjøre naturen til venene i forhold til aorta.

Begrensninger
De kirurgiske prosedyrene som er involvert i dette eksperimentet er betydelig komplekse, spesielt når man får donorhjertet og parfymerer blod fra samme dyr. De funksjonelle vurderingene etter implantasjon er begrenset da vi benyttet en ikke-utkastende modell. En utkastingsmodell anses å gi mer avanserte resultater i et ex situ-miljø . Ved heterotopisk transplantasjon er det imidlertid begrenset på grunn av tilstedeværelsen av et støttende vertshjerte i sirkulasjonssystemet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et stipend B2021-0991 fra Chonnam National University Hospital Biomedical Research Institute og NRF-2020R1F1A1073921 fra National Research Foundation of Korea

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AES active evacuation system Smiths medical PC-6769-51A Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine Smiths medical PC-8801-01A Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor GE medical systems B20 to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System Harvard apparatus 55-7020 To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator Dongguan Kewei medical instruments Micro-MO For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set COOK medical G48007 for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope Amscope MU1403 For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe SurgiTel L2S09 For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump AMP all SP-8800 To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor Transonic ME3PXL-M5 Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module Transonic TS410 flow acquiring system
Watson - Marlow pumps Harvard apparatus 010.6131.DAO Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A JEIO TECH E03056D Heating bath
Sprague-Dawley rats Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops SENTRIX Animal care wet ointments for eye
Cefazolin JW pharmaceutical For prophilaxis
Custodiol DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH For heart harvesting
Diclofenac Myungmoon Pharm. Co. Ltd For pain control
Heparin JW pharmaceutical Anticoagulant
Insulin JW pharmaceutical hormon therapy
Saline JW pharmaceutical For hydration therapy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langmuur, S. J. J., et al. Normothermic ex-situ heart perfusion with the organ care system for cardiac transplantation: A meta-analysis. Transplantation. 106 (9), 1745-1753 (2022).
  2. Ardehali, A., et al. Ex-vivo perfusion of donor hearts for human heart transplantation (PROCEED II): a prospective, open-label, multicentre, randomized non-inferiority trial. Lancet. 385 (9987), 2577-2584 (2015).
  3. Dang Van, S., et al. Ex vivo perfusion of the donor heart: Preliminary experience in high-risk transplantations. Archives of Cardiovascular Diseases. 114 (11), 715-726 (2021).
  4. Zhou, P., et al. Donor heart preservation with hypoxic-conditioned medium-derived from bone marrow mesenchymal stem cells improves cardiac function in a heart transplantation model. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 5f6 (2021).
  5. Messer, S., Large, S. Resuscitating heart transplantation: the donation after circulatory determined death donor.European. Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 49 (1), 1-4 (2016).
  6. Trahanas, J. M., et al. Achieving 12 hour normothermic ex situ heart perfusion: an experience of 40 porcine hearts. ASAIO Journal. 62 (4), 470-476 (2016).
  7. Yang, Y., et al. Keeping donor hearts in completely beating status with normothermicblood perfusion for transplants. The Annals of Thoracic Surgery. 95 (6), 2028-2034 (2013).
  8. Van Caenegem, O., et al. Hypothermic continuous machine perfusion enables preservation of energy charge and functional recovery of heart grafts in an ex vivo model of donation following circulatory death. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 49 (5), 1348-1353 (2016).
  9. Lu, J., et al. Normothermic ex vivo heart perfusion combined with melatonin enhances myocardial protection in rat donation after circulatory death hearts via inhibiting NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 733183 (2021).
  10. Pinnelas, R., Kobashigawa, J. A. Ex vivo normothermic perfusion in heart transplantation: a review of the TransMedics Organ Care System. Future Cardiology. 18 (1), 5-15 (2022).
  11. Fuchs, M., et al. Does the heart transplant have a future. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 55, i38-i48 (2019).
  12. Pahuja, M., Case, B. C., Molina, E. J., Waksman, R. Overview of the FDA's circulatory system devices panel virtual meeting on the TransMedics Organ Care System (OCS) Heart - portable extracorporeal heart perfusion and monitoring system. American Heart Journal. 247, 90-99 (2022).
  13. Jawitz, O. K., Devore, A. D., Patel, C. B., Bryner, B. S., Schroder, J. N. Expanding the donor pool: quantifying the potential impact of a portable organ-care system for expanded criteria heart donation. Journal of Cardiac Failure. 27 (12), 1462-1465 (2021).
  14. van Suylen, V., et al. Ex situ perfusion of hearts donated after euthanasia: a promising contribution to heart transplantation. Transplantation Direct. 7 (3), e676 (2021).
  15. Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), e0214513 (2019).
  16. Qin, G., Jernryd, T., Sjoberg, S., Steen, S., Nilsson, J. Machine perfusion for human heart preservation: A systematic review. Transplant International. 35, 10258 (2022).
  17. Dang Van, S., Brunet, D., Akamkam, A., Decante, B., Guihaire, J. Functional assessment of the donor heart during ex situ perfusion: insights from pressure-volume loops and surface echocardiography. Journal of Visual Experiments. (188), e63945 (2022).
  18. Fu, X., Segiser, A., Carrel, T. P., Tevaearai Stahel, H. T., Most, H. Rat heterotopic heart transplantation model to investigate unloading-induced myocardial remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 3, 34 (2016).
  19. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
  20. Qi, X., et al. The evaluation of constant coronary artery flow versus constant coronary perfusion pressure during normothermic ex-situ heart perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 41 (12), 1738-1750 (2022).
  21. Okahara, S., et al. A novel blood viscosity estimation method based on pressure-flow characteristics of an oxygenator during cardiopulmonary bypass. Artificial Organs. 41 (3), 262-266 (2017).
  22. Quader, M., Torrado, J. F., Mangino, M. J., Toldo, S. Temperature and flow rate limit the optimal ex-vivo perfusion of the heart - an experimental study. Journal of Cardiothoracic Surgery. 15 (1), 180 (2020).

Tags

Medisin utgave 194

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 08/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.

Section 4 of the Protocol was updated from:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.

to:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
  8. After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C. 
    NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments.
  9. Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
    NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
Rottemodell av normoterm ex-situ perfusert heterotopisk hjertetransplantasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D.,… More

Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D., Kwak, Y., Obiweluozor, F. O., Yoon, N., Kim, H. S., Cho, H. J. Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. J. Vis. Exp. (194), e64954, doi:10.3791/64954 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter