Summary
マラリアは、感染した蚊による マラリア原虫 のスポロゾイト段階の接種によって伝染します。トランスジェニックマラリア原虫は、マラリアの生物学をよりよく理解することを可能にし、 マラリア ワクチン開発の取り組みに直接貢献しています。ここでは、トランスジェニック マラリア原虫 のスポロゾイトを生成するための合理化された方法論について説明します。
Abstract
マラリアは寄生虫マラリア原虫によって引き起こされる致命的な病気で、メスのハマダラカに刺されることで感染します。脊椎動物の宿主の皮膚に蚊によって沈着したマラリア原虫のスポロゾイト段階は、臨床的マラリアを開始する前に肝臓で強制的な発達段階を経ます。肝臓でのマラリア原虫の発生の生物学についてはほとんどわかっていません。スポロゾイト段階へのアクセスと、そのようなスポロゾイトを遺伝子組み換えする能力は、マラリア原虫感染の性質とその結果生じる肝臓の免疫応答を研究するための重要なツールです。ここでは、トランスジェニックPlasmodium berghei sporozoitesを生成するための包括的なプロトコルを紹介します。私たちは、血液期のP. bergheiを遺伝子改変し、この形態を利用して、ハマダラカが血食を摂取すると感染します。トランスジェニック寄生虫が蚊の中で発生した後、蚊の唾液腺から寄生虫のスポロゾイト段階を単離し、in vivoおよびin vitro実験を行います。我々は、緑色蛍光タンパク質(GFP)サブユニット11(GFP11)を発現するP. bergheiの新規株のスポロゾイトを生成することにより、プロトコルの妥当性を実証し、肝臓期マラリアの生物学を調査するためにどのように使用できるかを示します。
Introduction
マラリアの予防と治療に関する医薬品開発と研究が進歩しているにもかかわらず、マラリアの世界的な疾病負担は依然として高いままです。毎年50万人以上がマラリアで死亡しており、サハラ以南のアフリカなどのマラリア蔓延地域に住む子どもたちの死亡率が最も高い1。マラリアは、寄生虫マラリア原虫によって引き起こされ、唾液腺に寄生虫を宿している雌のハマダラカに刺されることで人間に感染します。マラリア原虫の感染段階であるスポロゾイトは、血食中に脊椎動物の宿主の皮膚に沈着し、血流に乗って肝細胞に感染し、赤血球に感染する前に必須の発達(赤血球性マラリア前症を構成する)を受けます。赤血球の感染はマラリアの血期を開始し、この疾患に関連する罹患率と死亡率のすべてに関与しています2,3。
マラリア原虫の前赤血球発生の義務的な性質は、予防的ワクチンおよび医薬品開発の取り組みの魅力的な標的となっています4。前赤血球性マラリアの生物学を研究し、肝臓段階を標的とするワクチンや薬を開発するための前提条件は、マラリア原虫スポロゾイトへのアクセスです。さらに、遺伝子組み換えマラリア原虫スポロゾイトを生成する私たちの能力は、そのような研究努力の成功に役立っています5,6,7,8,9。蛍光または発光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックマラリア原虫株は、in vivoおよびin vitroでその発生を追跡することを可能にしました10,11。マラリア原虫の複数の遺伝子の欠失によって生成される遺伝的弱毒化寄生虫(GAP)も、最も有望なワクチン候補の一部です12,13。
げっ歯類と非ヒト霊長類のマラリアモデルは、マラリア原虫種間の生物学とライフサイクルの類似性により、ヒトマラリアにおける宿主と寄生虫の相互作用のメカニズムを理解するのに役立っています14。げっ歯類には感染するがヒトには感染しないマラリア原虫種(例:P. berghei)の使用により、寄生虫のライフサイクル全体を維持し、肝臓期マラリアをバイオセーフティレベル1で研究するための感染性スポロゾイトの生成が可能になります。トランスジェニック血液段階のマラリア原虫の生成15、蚊の感染16、およびスポロゾイト17の単離については、すでにさまざまな個別のプロトコルが存在する。ここでは、新規トランスジェニック株PbGFP11を例に、トランスジェニックP.bergheiスポロゾイトを生成および分離するために、これらの方法論を組み合わせた包括的なプロトコルの概要を説明します。PbGFP 11は、スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質(GFP)の1 β 1本鎖であるGFP11を、宿主肝細胞で生成された寄生胞胞(PV)に輸送します。PbGFP 11は、細胞質(Hepa GFP 1-10細胞)においてGFP 1-10フラグメント(GFP 1-10)を構成する残基を発現するトランスジェニック肝細胞(Hepa1-6バックグラウンド)と組み合わせて使用されます。 PbGFP11は、機能的GFPおよび緑色蛍光シグナルの自己相補および再形成による宿主肝細胞におけるPV溶解を報告する18。注目すべきは、GFP11は、PbGFP11において一連の7つのタンデム配列としてコードされ、結果として生じる蛍光シグナルを増強することである。PbGFP11 スポロゾイトを細胞質色素CellTrace Violet(CTV)で染色すると、寄生虫を追跡することができます。このようなCTV染色された細胞内寄生虫の溶解自体が、CTVの宿主細胞質への漏出と宿主細胞の染色をもたらす。このシステムは、宿主肝細胞におけるマラリア原虫PVおよび/または寄生虫の溶解を視覚化および区別することに加えて、そのような経路の分子成分の遺伝的または治療的摂動を通じて、これらのプロセスのいずれかに関与する免疫経路を研究するために確実に使用できます。
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Protocol
私たちの研究室における脊椎動物に関するすべての研究は、ジョージア大学の動物使用ガイドラインとプロトコルに準拠して実施されました。
1. P. berghei に感染したマウスの作製
- 野生型 P. berghei 寄生虫を使用して、雄または雌の 6-8 週齢の C57BL/6 (B6) マウスで血液段階の感染を開始します。これを行うには、凍結保存された P.berghei感染血液(2 x 105 感染RBC)を、400 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再構成し、1匹または2匹のドナーマウスに腹腔内(i.p.)に移植します。
- 感染後5日目のドナーマウス(d.p.i.)から眼窩後出血によって採取した新鮮な血液を、2匹のナイーブB6マウスに移植する。これを行うには、200 μLの血液を採取し、300 μLのPBSで再構成し、200 μLのi.p.をレシピエントマウスに注入します。この時点でのドナーの寄生虫血症が2%〜5%であることを確認してください19,20。
- 以前に説明したように寄生虫血症を監視します19,20、レシピエントの2d.p.i.から開始します。寄生虫血症が3%〜5%(約5 d.p.i.)の範囲の場合、レシピエントマウスを安楽死させ、心臓穿刺または眼窩後出血によって採血します。二酸化炭素を吸入した後、子宮頸部脱臼を行うか、施設のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。
注:寄生虫血症が5%を超えると、多重感染した赤血球の有病率の増加により、トランスフェクション効率が低下する可能性があります。
2.文化におけるシゾントの生成
- ステップ1.3で感染したマウスから血液を採取し(2匹のマウスから合計約2 mL)、無菌環境で5 mLのAlsever溶液( 材料表を参照)に入れます。ステップ2.1から3.12を無菌条件下で実行します。
注:無菌状態には、手袋の着用、手袋と表面を70%エタノールで拭くこと、滅菌された消耗品と材料の使用、バイオセーフティキャビネット内での作業が含まれます。 - 室温(RT)で450 x g で8分間血液を遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを10 mLの完全なRPMI培地(20%ウシ胎児血清[FBS]および1%ペニシリン-ストレプトマイシン、v/vを含むRPMI 1640)に再懸濁します。
- 室温で450 x g で8分間遠心分離し、ペレットを25 mLの完全なRPMI培地に再懸濁し、フィルターキャップ付きのT75培養フラスコに移します。
- 36.5°C、5%CO2のインキュベーターに入れ、静かに振とうしながら細胞を16時間懸濁液に保ちます。
- 16時間の時点で、統合失調症の発生を確認します。これを行うには、500 μLのサンプルを採取し、450 x g で8分間遠心分離し、ペレットを10 μLの完全なRPMI培地に再懸濁し、薄い血液塗抹標本を調製します。血液塗抹標本をギムザ染色19 ( 材料表を参照)で染色し、シゾントの頻度を決定します(図1)。
- 最適なトランスフェクション効率を得るには、寄生虫の60%〜70%がシゾント段階にある必要があります。この閾値を下回ると判断された場合は、ステップ2.4と同様に培養を続行し、1時間ごとに上記の閾値を超えていることを確認してから続行します。
3. Plasmodium schizontsのトランスフェクション
- 13 mL の密度グラジエントストック培地( 材料表を参照)を 1.44 mL の 1.5 M NaCl および 5.6 mL の 0.15 M NaCl と 50 mL の遠心分離チューブに再溶解して、グラジエント遠心分離バッファーを調製します。
- 25 mLの血液培養液を新しい50 mLの遠心分離チューブに移します。20 mL のグラジエント遠心分離バッファーを、細いガラスピペットを使用して遠心分離チューブの底部に慎重に層状にし、グラジエントカラムを作成します。液体の層や界面を乱さないように注意し、バッファーと培地を明確に分離してください。
- 450 x g で20分間遠心分離し、室温でブレーキをかけずに分離します。 パスツールピペットを使用して、培地とグラジエント遠心分離バッファーの界面にあるシゾント層15 を慎重に除去し、新しい50 mL遠心分離チューブに入れます。
- 単離したシゾントを完全なRPMI培地に再懸濁し、総容量を40 mLにします。室温で 450 x g で 8 分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- シゾントを10 mLの完全RPMI培地に再懸濁します。次に、トランスフェクションごとにこの溶液1 mLを1.5 mLの微量遠心チューブに移し、16,000 x g で5秒間遠心分離して、感染した赤血球をペレット化します。上記の方法で2匹のマウスに由来する感染した赤血球は、最大10回の別々のトランスフェクションに使用できます。
- 100 μL のエレクトロポレーションバッファー(エレクトロポレーションキットのヌクレオフェクター溶液、 材料表を参照)を 5 μg の環状または直鎖化ターゲットプラスミド DNA(最大容量 10 μL)と室温で混合し、トランスフェクションごとに別々の 1.5 mL 微量遠心チューブに入れます。「プラスミドなし」のサンプルは、トランスフェクションおよび抗生物質選択のコントロールとして含める必要があります。
- ステップ3.5から遠心分離後に上清を除去し、調製したヌクレオフェクター溶液+プラスミドDNAに感染した赤血球を慎重に再懸濁します(ステップ3.6から)。
- 懸濁液(ヌクレオフェクター溶液+プラスミド+シゾント、最大110 μL)をエレクトロポレーションキュベットに移します。適切な核酸プログラム(U-033、材料表を参照)を使用してトランスフェクションします。
メモ: 手順 3.8 から 3.10 が RT で実行されていることを確認します。 - 100 μLの完全RPMI培地をキュベットに加え、溶液全体(総容量200 μL)を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、室温で保持します。
- トランスフェクションした寄生虫の200 μL溶液をマウスに静脈内注射し(i.v.)、トランスフェクションからマウスへの最終注射までの時間を最小化します。
注:トランスフェクションされたシゾントは、エレクトロポレーション後5分以内にマウスに注入され、プロトコルの効率が最大化されます。
4. トランスフェクションされた寄生虫の選別
- トランスフェクションしたシゾントを毎日2d.p.i.から接種したマウスの寄生虫血症レベルをチェックし、感染を確認します。
- 感染が確認されたら、飲料水への薬物の経口投与を使用して薬物の選択を開始し、 アドリビタムで提供されます。
注:ピリメタミンは、プラスミドの選択可能な薬物マーカーとして採用されました。この場合、250 mLの浄水(最終濃度70 mg/L)に17.5 mgのピリメタミンを添加しました。さらに、この水に10gの砂糖を加えて、マウスによるピリメタミン含有水の適切な消費を促しました。 - ピリメタミン治療開始から6日後から、5μlの血液で作られた血液塗抹標本を使用して、2日ごとに寄生虫血症を監視します。.15日後に検出可能な寄生虫がない場合は、トランスフェクションの失敗を示します。この場合、手順 1.1 からプロセスを再開して、もう一度やり直してください。
- 寄生虫血症が少なくとも1%に達したら、寄生虫をナイーブB6マウスに移し、血液期の寄生虫ストックを作成します。寄生虫血症が2%〜5%に達するまで、新たに感染したマウスで選択を続け、その時点でストックを生成して凍結保存します21。
5. トランスジェニック株による蚊の感染
- 選択した寄生虫を含む血液200 μLをB6マウスに感染させます(2 x 105 感染したRBC/マウス、静脈内)。蚊の摂食と感染の日にこれらのマウスの寄生虫症を決定します。2%〜5%の寄生虫血症は、蚊の感染に最適です。確認したら、手順5.2〜5.4に従って、すぐにメスのハ マダラカ に感染を移します。
注意: 感染用の蚊を含むインキュベーターは、20.5°C、湿度80%、および12時間の明暗サイクル(午前7:00から午後07:00の間に点灯)に維持する必要があります。 - 蚊に感染する前日に、37°Cに加熱した水で満たされた薄いプラスチック製の蚢や手袋など、雄と雌の両方の蚊が入ったケージの上に熱源を置いて、雌の蚊を分離します。 熱源に引き寄せられた雌の蚊を、昆虫吸引器で取り除き、別の小さなケージに移して感染させます。
注:オスの蚊は、体のサイズがわずかに小さく、羽毛の触角によってメスの蚊と区別できます。 - 感染したマウスに全身麻酔薬(例:.、2%トリブロモエタノール/アベルチン)を注射する。各マウスのフットパッドをしっかりとつまんで、完全な麻酔を確保します。それらが反応しない場合、それらは十分に鎮静され、感染を蚊に移す準備ができています。
- 麻酔をかけたマウスを、胸骨横臥位下でケージに入れた雌の蚊の上(ステップ5.2から)に置きます。前脚と後脚を手動で広げて、蚊の餌付けに最大の表面積を提供します。感染したマウスを各ケージに合計15分間放置し、5分ごとにマウスが目覚めていないことを確認します。給餌が完了したら、子宮頸管脱臼を使用して、または施設の動物使用プロトコルに従ってマウスを安楽死させ、安全に処分します。
6.スポロゾイトの収集
- 約10 d.p.i.で蚊の中腸にオーシストがないかチェックし、蚊の感染と蚊内での マラリア原虫 の発生が成功することを確認します。鉗子を使用して腹部末端部分を除去することにより、腹部から蚊の中腸を分離します。偏光下で中腸を可視化し、オーシストの存在を確認します22.
- 野生型のスポロゾイトは、感染したマウスを食べてから18〜21日後に蚊の唾液腺に存在すると予想されます。18日目に、5〜10匹の蚊を解剖して、スポロゾイトの数を評価します。
注:蚊はエタノールで洗浄して殺します。その後、死んだ蚊をPBSで2回洗浄し、解剖前に破片を取り除きます。 - 胞子嚢を分離して数えるには、鉗子または細い解剖針を使用して蚊の胸部に圧力をかけながら、蚊の頭を慎重に取り除きます。唾液腺は、切除した頭部に付着したままです(図2)。
- 唾液腺から追加の蚊の残骸を取り除き、400 μLの蚊解剖培地(1%マウス血清、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコの改変Ealge培地[DMEM]; 材料表を参照)を含む微量遠心チューブに入れます。
- 30Gの針付きシリンジを15〜20回通過させることにより、孤立した唾液腺を破壊します。.破壊された唾液腺10 μLを蚊の解剖培地に入れ、血球計算盤に入れてカウントします。マウスへの注射、細胞培養への接種、または長期凍結保存のために、所望の濃度の蚊解剖培地またはPBSに再懸濁します23,24。
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Representative Results
シゾントの頻度と発生を決定することは、十分な生存可能な寄生虫がトランスフェクションに最適な段階にあることを保証するために重要です。未熟なシゾントは、赤血球の細胞内空間全体を埋めないメロゾイトが少ないことで、完全に成熟したシゾントと区別できます(図1B)。培養血液から血液塗抹標本を作成する場合、感染した赤血球が破裂し、血液塗抹標本中に遊離細胞外メロゾイトが観察される可能性があることに注意することが重要です(図1)。このようなメロゾイトは、ステップ2.5のシゾントの頻度の評価にはカウントされません。
蚊から唾液腺を除去することは、ユーザーが蚊の生理学や小規模な解剖に慣れていない場合、困難な場合があります。唾液腺を蚊から分離する際には、唾液腺の半透明を利用して、不透明な蚊の残骸と区別できることに注意してください(図2)。腺を破壊した後のスポロゾイトの計数は、400倍の倍率で最も効率的であり、位相差の使用により、計数チャンバー内のスポロゾイトの識別が容易になります。
我々は、肝細胞中のマラリア原虫の90%以上が、細胞内在性免疫機構によって排除される可能性があることを示した23。そのため、かなりの数の肝細胞の寄生虫が溶解を起こすことが予想されます。宿主肝細胞におけるマラリア原虫またはそのPVの溶解を決定するためのツールとして、GFP 1-10サブユニットを発現するトランスジェニック肝細胞(Hepa-GFP 1-10)と、GFP11サブユニットを発現してPVに輸送するトランスジェニックP.berghei(Pb-GFP11)を作製しました。GFP発色団を構成する残基を含むGFP 1-10フラグメントは、それ自体では非蛍光性であり、GFP 11と会合した場合にのみ、おそらく自己相補を介して蛍光を発します。マラリア原虫の遺伝子導入を機能的に検証することに加えて、Pb-GFP11に感染したHepa-GFP 1-10宿主細胞における緑色蛍光シグナルの生成は、PVの溶解を示しました(図3)。野生型 P. berghei に感染した Hepa-GFP 1-10 細胞またはPb-GFP11 に感染した野生型 Hepa 1-6 細胞は、緑色蛍光シグナルを生成できませんでした (データは示していません)。PVの溶解は、肝段階のマラリア原虫の破壊における重要な先行ステップであると考えています。また、Pb-GFP11スポロゾイトをCTVで染色し、肝細胞内の寄生虫を可視化しました。CTVは、寄生虫自体が溶解した場合にのみ宿主細胞に漏出すると予想されます(図3)。宿主肝細胞で観察された分散CTVシグナルは、肝細胞内での寄生虫の溶解を示している可能性があります。CTVシグナルとGFPシグナルの密接な重複は、PVと寄生虫の両方の同時溶解を伴うと予想されます。このシステムにより、マラリア原虫またはそのPVの溶解を調節する際の自然免疫経路および細胞内因性免疫経路における個々の宿主分子の明確な寄与を照会することができます。
図1: Plasmodium berghei schizonts。 Gimsa染色で染色した寄生マウス血液培養(16時間)中の P. berghei schizontsを示す代表的な光学顕微鏡画像。矢印は、完全に成熟した(A)または未熟な(B)シゾントを示します。スケールバー:5μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:蚊の唾液腺とスポロゾイト。Pb-GFP11に感染した雌のハマダラカから分離された唾液腺を示す光学顕微鏡画像。(A)唾液腺(矢印)が解剖中に無傷のままで、除去およびさらなる処理を行う前の蚊の頭の画像(スケールバー:1 mm)。(B、C)低倍率(B)と高倍率(C)での唾液腺の代表的な画像(スケールバー:それぞれ0.1mmと0.04mm)。スポロゾイトは腺の内側と外側の両方に見られます(矢印)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:宿主肝細胞におけるマラリア原虫とその寄生胞子の溶解の検出。 Pb-GFP11スポロゾイトに感染したHepa-GFP 1-10肝細胞を描写したオーバーレイによる微分干渉コントラスト(DIC)および疑似カラー免疫蛍光画像。スポロゾイトは、感染前にCTVで染色しました(スケールバー:10 μm)。合計1×106個のHepa-GFP1〜10個の肝細胞を35/10mmのガラス底培養皿に播種し、播種後4時間後に3×10 5PbGFP11スポロゾイトを接種した。画像は倒立蛍光顕微鏡で600倍の倍率で、感染後16時間で撮影しました。略語:DIC = differential interference contrast。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
私たちの研究室では、上記のプロトコルを使用して、トランスジェニック P.berghei 寄生虫の数系統を作成しました。 P. bergheiに最適化されていますが、このプロトコルを使用してトランスジェニックな P. yoelii sporozoitesを生成することにも成功しています。トランスフェクションしたシゾントをマウスに注入した後、寄生虫は通常、プラスミドなし対照を含むすべてのグループで遅くとも3d.p.i.以内に検出可能です。選択は、エレクトロポレーション後の寄生虫の生存率を確保するために、寄生虫血症が検出された場合にのみ開始されます。さらに、薬物選択の準備をする際には、ピリメタミンを完全に溶解させるために、塩酸で水を酸性化し、pHを4に下げる必要がある場合があります。プラスミドなし対照群からの寄生虫の完全な除去を期待していますが、トランスフェクタントを接種したマウスは感染したままです。対照マウスにおけるクリアランスは、典型的には、ピリメタミン処理の開始後5〜8日で起こる。注目すべきは、 P. berghei に感染したB6マウスは、実験的脳マラリアの徴候を示し、通常6〜12 d.p.i.の間隔で死に至る可能性があることです(施設の動物使用ガイドラインに従って人道的なエンドポイントに従います)。これは、TCRaKOマウス25においてトランスフェクタントの薬物選択を行うこと、または5 d.p.i.で選択を受けている寄生虫を新しいB6レシピエントに移し、後者で選択を継続することによって回避することができる。 マラリア原虫 のトランスジェネシスは、遺伝子スクリーニング、表現型評価、特定の機能の獲得または喪失など、さまざまなアプローチを使用して検証できます。
適切なプラスミドの選択は、トランスフェクションを成功させ、導入したDNAを寄生虫に保持するために重要であることに注意することが重要です。プラスミドはまた、異なるマラリア原虫種間でのトランスジェネシスの達成において限られた有効性を示す可能性があります。例えば、pSKspGFP11プラスミド(PL0017;PbGFP11の生成に利用したBEIリソース)は、トランスジェニックP.yoelliの効率的な生成にも使用できますが、P.chabaudiは使用できません。pSKspGFP11を作製するために、親pL0017プラスミド(BEIリソース)のGFP変異体3配列を、スーパーフォルダーGFPの11 β鎖GFP11(GFP11-7X)18の7つのタンデム配列に置き換えました。トランスフェクション前のプラスミドの直鎖化により、より良いゲノム統合が可能になりますが、直鎖状プラスミドと環状プラスミドの両方が、当社のプロトコルを使用して同様のトランスフェクション効率を示します。環状プラスミドによるトランスフェクションによって生成されたマラリア原虫株も、蚊のスポロゾイトの生成過程にわたってトランスジェニック特性を維持しているようです。
特に、メスの蚊だけが マラリア原虫 を抱いて伝染させることができます。蚊の隔離後、この段階では隔離された蚊に砂糖水を供給しないことをお勧めします。この方法で蚊を飢餓状態にすると、誤って移された雄の蚊が死ぬ可能性が高まり、雌は感染したネズミからより効率的に血液を吸い込むことになります。通常、マウスから蚊に感染を移してから1日後に砂糖水を戻します。蚊におけるスポロゾイトの発達と成熟の時間枠は、トランスジェニック マラリア原虫 系統によって異なる可能性があることは注目に値します。したがって、各トランスジェニック株に特異的なプロトコルが確立される前に、感染後の複数の時点で唾液腺のスポロゾイト数を評価することが重要です。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、SPKにAI168307された国立衛生研究所の助成金によって支援されました。 UGA CTEGD Flow Cytometry Core と UGA CTEGD Microscopy Core に感謝します。また、プロトコルの最適化におけるAsh Pathak氏、Anne Elliot氏、UGA Sporocoreのスタッフの貢献にも感謝します。貴重な洞察、議論、そしてGFP11およびGFP1-10を含む親プラスミドについて、神山大地博士に感謝します。また、Kurupラボの方々のご支援、忍耐、励ましに心より感謝申し上げます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
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