Summary
A malária é transmitida através da inoculação do estágio de esporozoíto do Plasmodium por mosquitos infectados. O Plasmodium Transgênico nos permitiu compreender melhor a biologia da malária e contribuiu diretamente para os esforços de desenvolvimento de vacinas contra a malária. Aqui, descrevemos uma metodologia simplificada para gerar esporozoítos transgênicos de Plasmodium berghei .
Abstract
A malária é uma doença mortal causada pelo parasita Plasmodium e é transmitida através da picada de fêmeas de mosquitos Anopheles . O estágio de esporozoíto do Plasmodium depositado por mosquitos na pele de hospedeiros vertebrados passa por uma fase de desenvolvimento obrigatório no fígado antes de iniciar a malária clínica. Sabemos pouco sobre a biologia do desenvolvimento do Plasmodium no fígado; o acesso ao estágio de esporozoíto e a capacidade de modificar geneticamente tais esporozoítos são ferramentas críticas para estudar a natureza da infecção por Plasmodium e a resposta imune resultante no fígado. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração de esporozoítos transgênicos de Plasmodium berghei . Nós modificamos geneticamente o estágio sanguíneo de P. berghei e usamos essa forma para infectar mosquitos Anopheles quando eles tomam uma refeição de sangue. Após o desenvolvimento dos parasitas transgênicos nos mosquitos, isolamos o estágio de esporozoíto do parasita das glândulas salivares do mosquito para experimentação in vivo e in vitro . Demonstramos a validade do protocolo gerando esporozoítos de uma nova cepa de P. berghei expressando a proteína fluorescente verde (GFP) subunidade 11 (GFP11), e mostramos como ele pode ser usado para investigar a biologia da malária em estádio hepático.
Introduction
Apesar dos avanços no desenvolvimento de medicamentos e na pesquisa para prevenção e tratamento da malária, a carga global de doenças da malária permanece alta. Mais de meio milhão de pessoas morrem de malária a cada ano, com os níveis mais altos de mortalidade observados entre crianças que vivem em regiões endêmicas de malária, como a África Subsaariana1. A malária é causada pelo parasita Plasmodium, que é transmitido aos seres humanos através da picada de fêmeas de mosquitos Anopheles portadores do parasita em suas glândulas salivares. O estágio infeccioso do Plasmodium - os esporozoítos - são depositados na pele dos hospedeiros vertebrados durante uma refeição de sangue e viajam pela corrente sanguínea para infectar as células do fígado, onde passam pelo desenvolvimento obrigatório (constituindo malária pré-eritrocitária) antes de infectar os eritrócitos. A infecção dos eritrócitos inicia o estágio sanguíneo da malária e é responsável pela totalidade da morbidade e mortalidade associadas à doença 2,3.
A natureza obrigatória do desenvolvimento pré-eritrocitário do Plasmodium tornou-o um alvo atraente para os esforços profiláticos de desenvolvimento de vacinas e fármacos4. Um pré-requisito para o estudo da biologia da malária pré-eritrocitária, bem como o desenvolvimento de vacinas ou drogas direcionadas ao estágio hepático, é o acesso aos esporozoítos de Plasmodium. Além disso, nossa capacidade de gerar esporozoítos de Plasmodium geneticamente modificados tem sido fundamental para o sucesso de tais esforços de pesquisa5,6,7,8,9. Linhagens transgênicas de Plasmodium expressando proteínas repórteres fluorescentes ou luminescentes têm permitido acompanhar seu desenvolvimento in vivo e in vitro10,11. Parasitas geneticamente atenuados (GAPs), gerados pela deleção de múltiplos genes no Plasmodium, também são alguns dos mais promissores candidatos vacinais12,13.
Modelos de malária em roedores e primatas não humanos têm nos ajudado a entender os mecanismos das interações parasita-hospedeiro na malária humana devido às semelhanças na biologia e no ciclo de vida entre as espécies de Plasmodium 14. O uso de espécies de Plasmodium que infectam roedores, mas não humanos (por exemplo, P. berghei) permite a manutenção do ciclo de vida completo do parasita e a geração de esporozoítos infecciosos para o estudo da malária em estágio hepático em um ambiente controlado de nível 1 de biossegurança. Uma variedade de protocolos separados já existe para a geração de parasitas transgênicos do Plasmodium em estágio sanguíneo 15, infecção de mosquitos16 e isolamento de esporozoítos17. Aqui, delineamos um protocolo abrangente combinando essas metodologias para gerar e isolar esporozoítos transgênicos de P. berghei, utilizando a nova cepa transgênica PbGFP11 como exemplo. A PbGFP 11 trafega a 11ª fita β da proteína fluorescente verde (GFP) superpasta, GFP11, para o vacúolo parasitóforo (PV) gerado nos hepatócitos hospedeiros. A PbGFP11 é usada em conjunto com hepatócitos transgênicos (Hepa1-6 background) expressando resíduos que constituem o fragmento GFP 1-10 (GFP 1-10) no citoplasma (células Hepa GFP 1-10). A PbGFP11 relata lise PV nos hepatócitos hospedeiros através da autocomplementação e da reforma da GFP funcional e do sinal verde de fluorescência18. De notar, GFP 11 é codificado como uma série de sete sequências tandem em PbGFP11 para aumentar o sinal de fluorescência resultante. Ao colorir esporozoítos de PbGFP11 com o corante citoplasmático CellTrace Violet (CTV), podemos rastrear os parasitas. A lise desses parasitas intracelulares corados pelo CTV resulta em extravasamento de CTV para o citoplasma da célula hospedeira e coloração da célula hospedeira. Além de visualizar e distinguir a lise do Plasmodium PV e/ou do parasita em hepatócitos hospedeiros, esse sistema pode ser usado de forma confiável para estudar as vias imunes responsáveis por qualquer um desses processos, através da perturbação genética ou terapêutica dos componentes moleculares dessas vias.
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Protocol
Todas as pesquisas envolvendo animais vertebrados em nosso laboratório foram realizadas de acordo com as diretrizes e protocolos de uso de animais da Universidade da Geórgia.
1. Geração de camundongos infectados por P. berghei
- Iniciar a infecção em estágio sanguíneo em camundongos C57BL/6 (B6) machos ou fêmeas com 6-8 semanas de idade usando parasitas selvagens de P. berghei. Para isso, transferir sangue criopreservado infectado por P. berghei (2 x 105 hemácias infectadas), reconstituído em 400 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), para um ou dois camundongos doadores por via intraperitoneal (i.p.).
- Transferir sangue fresco coletado através de sangramento retro-orbital dos camundongos doadores 5 dias após a infecção (d.p.i.) para dois camundongos B6 virgens. Para fazer isso, colete 200 μL de sangue, reconstitua com 300 μL de PBS e injete 200 μL i.p. nos camundongos receptores. Garantir que a parasitemia nos doadores neste momento seja de 2%-5%19,20.
- Monitorar a parasitemia conforme descrito anteriormente19,20, a partir de 2 d.p.i. nos receptores. Quando a parasitemia varia de 3%-5% (cerca de 5 d.p.i.), eutanasiar os camundongos receptores e, em seguida, coletar sangue através de punção cardíaca ou sangramento retro-orbital. Eutanásia dos camundongos por inalação de dióxido de carbono seguida de deslocamento cervical, ou de acordo com diretrizes institucionais.
NOTA: Uma vez que a parasitemia excede 5%, a eficiência da transfecção pode ser reduzida devido ao aumento da prevalência de hemácias infectadas multiplicadoramente.
2. Geração de esquizontos na cultura
- Recolher sangue dos ratinhos infectados no passo 1.3 (aproximadamente 2 ml no total de dois ratinhos) em 5 ml de solução de Alsever (ver Tabela de Materiais) num ambiente estéril. Execute as etapas 2.1 a 3.12 em condições estéreis.
NOTA: As condições estéreis incluem o uso de luvas, limpeza de luvas e superfícies com etanol 70%, o emprego de consumíveis e materiais estéreis e o trabalho dentro de um gabinete de biossegurança. - Centrifugar o sangue durante 8 minutos a 450 x g à temperatura ambiente (TR). Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio RPMI completo (RPMI 1640 com 20% de soro fetal bovino [SFB] e 1% de penicilina-estreptomicina, v/v).
- Centrifugar por 8 min a 450 x g em RT. Ressuspender o pellet em 25 mL de meio RPMI completo e transferir para um frasco de cultura T75 com tampa filtrante.
- Colocar em estufa a 36,5 °C e 5% CO2, agitando suavemente para manter as células em suspensão durante 16 horas.
- No ponto de tempo de 16 h, verifique o desenvolvimento de esquizont. Para isso, colete 500 μL da amostra, centrifugue a 450 x g por 8 min, ressuspenda o pellet em 10 μL de meio RPMI completo e prepare um esfregaço fino de sangue. Manchar o esfregaço sanguíneo com a coloração de Giemsa19 (ver Tabela de Materiais) e determinar a frequência dos esquizontos (Figura 1).
- Para uma eficiência de transfecção ideal, 60%-70% dos parasitas devem estar no estágio esquizonto. Se for determinado um limite inferior a este limiar, continue a cultivar como no passo 2.4 e verifique de hora em hora se o limiar acima é ultrapassado antes de prosseguir.
3. Transfecção de esquizontos de Plasmodium
- Preparar um tampão de centrifugação de gradiente reconstituindo 13 ml de meio de depósito com gradiente de densidade (ver Tabela de Materiais) com 1,44 ml de NaCl 1,5 M e 5,6 ml de NaCl 0,15 M num tubo de centrifugação de 50 ml.
- Transferir 25 mL de hemocultura para um tubo de centrifugação fresco de 50 mL. Coloque cuidadosamente 20 mL de tampão de centrifugação gradiente no fundo do tubo de centrifugação usando uma pipeta de vidro estreita para criar uma coluna de gradiente. Tome cuidado para não perturbar as camadas líquidas e interfaces e garanta uma divisão clara entre o buffer e a mídia.
- Centrifugar por 20 min a 450 x g sem freio em RT. Usando uma pipeta de Pasteur, remova cuidadosamente a camada de esquizonta15 localizada na interface do meio de cultura e o tampão de centrifugação de gradiente e coloque-a em um novo tubo de centrifugação de 50 mL.
- Ressuspender os esquizontos isolados em meio RPMI completo e elevar o volume total para 40 mL. Centrifugar a 450 x g por 8 min em RT e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender os esquizontos em 10 mL de meio RPMI completo. Em seguida, transferir 1 mL dessa solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para cada transfecção e centrifugar a 16.000 x g por 5 s para peletizar as hemácias infectadas. As hemácias infectadas derivadas de dois camundongos da maneira acima podem ser usadas para até 10 transfecções separadas.
- Combinar 100 μL do tampão de eletroporação (solução de nucleofector do kit de eletroporação; ver Tabela de Materiais) em RT com 5 μg de DNA plasmidial alvo circular ou linearizado (em volume máximo de 10 μL), conforme aplicável para cada transfecção em tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mL. Uma amostra "sem plasmídeo" deve ser incluída como controle para transfecção e seleção de antibióticos.
- Remover o sobrenadante após centrifugação do passo 3.5 e ressuspender cuidadosamente as hemácias infectadas na solução nucleofector preparada + ADN plasmidial (a partir do passo 3.6).
- Transferir a suspensão (solução de nucleofector + plasmídeo + esquizontos; máximo de 110 μL) para cubetas de eletroporação. Transfect usando um programa de nucleofector adequado (U-033, ver Tabela de Materiais).
Observação : verifique se as etapas 3.8 a 3.10 são executadas no RT. - Adicione 100 μL de meio RPMI completo à cubeta e transfira toda a solução (agora 200 μL de volume total) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e mantenha em RT.
- Injetar a solução de 200 μL de parasitas transfectados em camundongos por via intravenosa (i.v.), trabalhando para minimizar o tempo entre a transfecção e a injeção final em camundongos.
NOTA: Esquizontes transfectados são injetados em camundongos menos de 5 min após a eletroporação para maximizar a eficiência do protocolo.
4. Seleção dos parasitas transfectados
- Verificar os níveis de parasitemia nos camundongos inoculados com os esquizontos transfectados diariamente a partir de 2 d.p.i. para verificar a infecção.
- Uma vez verificada a infecção, iniciar a seleção de drogas usando a administração oral da droga em água potável, oferecida ad libitum.
NOTA: A pirimetamina foi empregada como marcador de droga selecionável para o plasmídeo. Neste caso, 17,5 mg de pirimetamina foram adicionados a 250 mL de água limpa (concentração final de 70 mg/L). Além disso, 10 g de açúcar foram adicionados a essa água para incentivar o consumo adequado da água contendo pirimetamina por camundongos. - Monitorar a parasitemia a cada dois dias usando esfregaços de sangue feitos com 5 μl de sangue, a partir de 6 dias após o início do tratamento com pirimetamina. A ausência de parasitas detectáveis após 15 dias indica falha na transfecção; Nesse caso, reinicie o processo da etapa 1.1 para uma nova tentativa.
- Quando a parasitemia atinge pelo menos 1%, transfira os parasitas para camundongos B6 virgens para a criação de estoques de parasitas em estágio sanguíneo. Continuar a seleção nos camundongos recém-infectados até que a parasitemia atinja 2%-5%, momento em que gere estoques e criopreserve21.
5. Infecção de mosquitos com as linhagens transgênicas
- Infectar camundongos B6 com 200 μL de sangue contendo os parasitas selecionados (2 x 105 hemácias infectadas/camundongo, i.v.). Determinar a parasitemia nesses camundongos no dia da alimentação e infecção do mosquito. A parasitemia entre 2%-5% é ideal para a infecção de mosquitos. Uma vez verificada, transferir imediatamente a infecção para as fêmeas de mosquitos Anopheles stephensi de acordo com os passos 5.2-5.4).
NOTA: As incubadoras contendo mosquitos para infecção devem ser mantidas a 20,5 °C, com 80% de umidade e em um ciclo claro/escuro de 12 h (luzes acesas entre 07:00 e 19:00). - No dia anterior à infecção do mosquito, separe as fêmeas de mosquitos colocando uma fonte de calor em cima da gaiola contendo mosquitos machos e fêmeas, como uma bexiga de plástico fina ou luva cheia de água aquecida a 37 °C. Remova as fêmeas de mosquitos, que são atraídas pela fonte de calor, usando um aspirador de insetos e transfira-os para uma gaiola separada e menor para infecção.
NOTA: Os mosquitos machos podem ser distinguidos dos mosquitos fêmeas por seu tamanho corporal ligeiramente reduzido e antenas plumosas. - Injetar um anestésico geral nos camundongos infectados (por exemplo, tribromoetanol/avertin a 2%). Garanta a anestesia completa apertando firmemente a almofada do pé de cada mouse. Se não reagirem, estão suficientemente sedados e prontos para transferir a infecção para os mosquitos.
- Coloque os camundongos anestesiados sobre as fêmeas de mosquitos enjauladas (a partir do passo 5.2) sob decúbito esternal. Espalhe manualmente as patas dianteiras e traseiras para fornecer a maior área de superfície para a alimentação do mosquito. Deixe os camundongos infectados sobre cada gaiola por um total de 15 min, verificando a cada 5 min para garantir que os camundongos não estejam acordados. Uma vez concluída a alimentação, eutanasiar os camundongos usando deslocamento cervical, ou de acordo com o protocolo institucional de uso de animais, e descartá-los com segurança.
6. Coleta de esporozoítos
- Verifique o intestino médio do mosquito para oocistos em aproximadamente 10 d.p.i. para verificar a infecção bem-sucedida e o desenvolvimento de Plasmodium dentro dos mosquitos. Isole o intestino médio do mosquito do abdômen removendo o segmento abdominal terminal usando pinças. Visualize o intestino médio sob luz polarizada para a presença de oocistos22.
- Espera-se que esporozoítos selvagens estejam presentes nas glândulas salivares de mosquitos 18-21 dias após se alimentarem de camundongos infectados. No dia 18, dissecar 5-10 mosquitos para avaliar o número de esporozoítos.
NOTA: Os mosquitos são lavados e mortos em etanol. Posteriormente, os mosquitos mortos são lavados duas vezes com PBS para remover detritos antes da dissecção. - Para isolar e contar os esporozoítos, remova cuidadosamente a cabeça do mosquito enquanto aplica pressão no tórax do mosquito usando pinça ou uma agulha de dissecação fina. As glândulas salivares permanecem aderidas à cabeça removida (Figura 2).
- Remova quaisquer restos adicionais de mosquito das glândulas salivares e coloque em um tubo de microcentrífuga contendo 400 μL de meio de dissecção de mosquito (meio Ealge modificado de Dulbecco [DMEM] com 1% de soro de camundongo, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina; ver Tabela de Materiais).
- Interrompa as glândulas salivares isoladas passando por uma seringa agulhada de 30 G 15-20 vezes. Coloque 10 μL das glândulas salivares rompidas no meio de dissecção do mosquito em um hemocitômetro e conte. Ressuspender na concentração desejada de meio de dissecação de mosquito ou PBS para injeção em camundongos, inoculação em culturas de células ou criopreservação a longo prazo23,24.
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Representative Results
Determinar a frequência e o desenvolvimento de esquizontos é fundamental para garantir que parasitas viáveis suficientes estejam no estágio ideal para transfecção. Esquizontes imaturos podem ser diferenciados de esquizontes totalmente maduros pela presença de menos merozoítos que não preenchem todo o espaço intracelular da hemácia (Figura 1B). É importante notar que, ao fazer esfregaços sanguíneos a partir de sangue cultivado, as hemácias infectadas podem se romper, resultando na observação de merozoítos extracelulares livres no esfregaço sanguíneo (Figura 1). Tais merozoítos não contam para a avaliação da frequência de esquizontes no passo 2.5.
A remoção de glândulas salivares de mosquitos pode ser um desafio se o usuário não estiver familiarizado com a fisiologia do mosquito ou dissecações em pequena escala. Durante o isolamento das glândulas salivares dos mosquitos, nota-se que a translucidez das glândulas pode ser usada para diferenciá-las dos restos opacos do mosquito (Figura 2). A contagem de esporozoítos após a ruptura das glândulas é mais eficiente em aumento de 400x, e o uso de contraste de fase permite uma identificação mais fácil dos esporozoítos dentro da câmara de contagem.
Demonstramos que mais de 90% do Plasmodium presente nos hepatócitos é possivelmente eliminado por mecanismos imunes intrínsecos àscélulas23. Portanto, espera-se que parasitas em um número considerável de hepatócitos sofram lise. Como ferramenta para determinar a lise do Plasmodium ou de seu PV nos hepatócitos hospedeiros, geramos hepatócitos transgênicos expressando a subunidade GFP 1-10 (Hepa-GFP1-10) e P. berghei transgênico expressando e traficando a subunidade GFP 11 para sua VP (Pb-GFP 11). O fragmento GFP 1-10, que contém os resíduos que constituem o cromóforo GFP, não é fluorescente por si só e fluoresce somente quando associado à GFP 11, potencialmente através da auto-complementação. Além de validar funcionalmente a transgênese em Plasmodium, a geração de sinal verde de fluorescência nas células hospedeiras Hepa-GFP 1-10 infectadas com Pb-GFP11 indicou a lise do PV (Figura 3). Células Hepa-GFP 1-10 infectadas por P. berghei selvagem ou células Hepa1-6 infectadas por Pb-GFP 11 não conseguiram gerar nenhum sinal de fluorescência verde (dados não mostrados). Consideramos a lise do PV como um passo precedente fundamental na destruição do Plasmodium em estágio hepático. Os esporozoítos Pb-GFP11 também foram corados com CTV para visualização dos parasitas nos hepatócitos. Espera-se que a CTV vaze para a célula hospedeira somente após a lise do próprio parasita (Figura 3). O sinal de CTV disperso observado no hepatócito hospedeiro provavelmente indica lise do parasita dentro do hepatócito. A estreita sobreposição entre os sinais de CTV e GFP é esperada com a lise concomitante do PV e do parasita. Este sistema nos permite consultar as distintas contribuições das moléculas individuais do hospedeiro em vias imunes inatas e intrínsecas celulares na modulação da lise de Plasmodium ou de seu PV.
Figura 1: Esquizontos de Plasmodium berghei . Imagens representativas de microscopia óptica mostrando esquizontes de P. berghei em hemocultura de camundongos parasitados (16 h) corados pela coloração de Giemsa. As setas indicam esquizontes totalmente amadurecidos (A) ou imaturos (B). Barras de escala: 5 μm . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Glândulas salivares do mosquito e esporozoítos. Imagens de microscopia óptica mostrando glândulas salivares isoladas de fêmeas de mosquitos Anopheles infectadas com Pb-GFP11. (A) Imagem de cabeça de mosquito com as glândulas salivares (seta) ainda intactas durante a dissecção, antes de sua remoção e posterior processamento (barra de escala: 1 mm). (B,C) Imagens representativas das glândulas salivares nos aumentos inferior (B) e superior (C) (barras de escala: 0,1 mm e 0,04 mm, respectivamente). Esporozoítos podem ser vistos dentro e fora da glândula (seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Detecção da lise do Plasmodium e seu vacúolo parasitóforo em hepatócitos do hospedeiro. Contraste de interferência diferencial (CIVD) e imagens de imunofluorescência pseudocolorida com sobreposição mostrando hepatócitos Hepa-GFP1-10 infectados com esporozoítos Pb-GFP11. Os esporozoítos foram corados com CTV antes da infecção (barra de escala: 10 μm). Um total de 1 x 106 hepatócitos Hepa-GFP 1-10 foram plaqueados em uma placa de cultura com fundo de vidro de 35/10 mm e inoculados com 3 x 10 5PbGFP11 esporozoítos 4 h após o plaqueamento. As imagens foram obtidas em microscópio de fluorescência invertida em aumento de 600x e 16 h pós-infecção. Abreviações: DIC = contraste de interferência diferencial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Utilizamos o protocolo acima em nosso laboratório para criar várias linhagens de parasitas transgênicos de P. berghei. Embora otimizado para P. berghei, também usamos com sucesso este protocolo para gerar esporozoítos transgênicos de P. yoelii. Depois de injetar os esquizontos transfectados em camundongos, os parasitas são detectáveis tipicamente no máximo 3 d.p.i. em todos os grupos, incluindo o controle sem plasmídeo. A seleção é iniciada somente após a detecção da parasitemia para garantir a viabilidade dos parasitas após a eletroporação. Além disso, ao se preparar para a seleção de drogas, a acidificação da água com ácido clorídrico, reduzindo o pH para 4, pode ser necessária para que a pirimetamina se dissolva completamente. Esperamos a eliminação completa dos parasitas do grupo controle sem plasmídeo, enquanto os camundongos inoculados com os transfectantes permanecem infectados. A depuração nos ratos de controlo ocorre tipicamente 5-8 dias após o início do tratamento com pirimetamina. É importante ressaltar que camundongos B6 infectados com P. berghei podem apresentar sinais de malária cerebral experimental e sucumbir à morte (seguir desfechos humanos de acordo com as diretrizes institucionais de uso de animais), tipicamente no intervalo de 6-12 d.p.i. Isso pode ser evitado realizando a seleção de drogas dos transfectantes em camundongos TCRaKO25, ou transferindo os parasitas submetidos à seleção a 5 d.p.i. para novos receptores B6 e continuando a seleção nestes últimos. A transgênese em Plasmodium pode ser verificada usando uma variedade de abordagens, tais como rastreamentos genéticos, avaliação fenotípica ou ganho ou perda de funções específicas.
É importante notar que a seleção de um plasmídeo adequado é crucial para o sucesso da transfecção e retenção do DNA introduzido no parasita. Os plasmídeos também podem apresentar eficácia limitada na obtenção de transgênese entre diferentes espécies de Plasmodium. Por exemplo, o plasmídeo pSKspGFP11 (baseado em PL0017; BEI) que utilizamos para gerar PbGFP11 pode ser usado para gerar eficientemente P. yoelli transgênico também, mas não P. chabaudi. Para gerar pSKspGFP11, substituímos a sequência mutante3 GFP no plasmídeo pL0017 pai (recursos BEI) por sete sequências em tandem da 11ª cadeia β da superpasta GFP, GFP 11 (GFP11-7X)18. Embora a linearização dos plasmídeos antes da transfecção permita uma melhor integração genômica, tanto os plasmídeos lineares quanto os circulares apresentam eficiências de transfecção semelhantes usando nosso protocolo. As linhagens de Plasmodium geradas pela transfecção com plasmídeos circulares também parecem manter suas propriedades transgênicas ao longo da geração de esporozoítos nos mosquitos.
Notavelmente, apenas mosquitos fêmeas podem abrigar e transmitir Plasmodium. Após o isolamento dos mosquitos, recomenda-se não fornecer aos mosquitos isolados uma fonte de água com açúcar nesta fase. Esfomeá-los dessa maneira aumentaria a chance de qualquer mosquito macho que pode ter sido transferido inadvertidamente morrer, e as fêmeas alimentarem o sangue de forma mais eficiente dos camundongos infectados. Normalmente, devolvemos a água com açúcar 1 dia após a transferência da infecção de camundongos para mosquitos. Vale ressaltar que o período de tempo para o desenvolvimento e maturação do esporozoíto em mosquitos pode variar entre linhagens transgênicas de Plasmodium . Portanto, é importante avaliar o número de esporozoítos nas glândulas salivares em múltiplos momentos após a infecção antes que um protocolo específico para cada linhagem transgênica seja estabelecido.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant AI168307 ao SPK. Agradecemos ao Núcleo de Citometria de Fluxo UGA CTEGD e ao Núcleo de Microscopia UGA CTEGD. Também agradecemos as contribuições de Ash Pathak, Anne Elliot e da equipe da UGA Sporocore na otimização do protocolo. Queremos agradecer ao Dr. Daichi Kamiyama por insights valiosos, discussões e os plasmídeos pais contendo GFP11 e GFP 1-10. Também gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Kurup por seu constante apoio, paciência e incentivo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
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