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Bioengineering

सबड्यूरल सॉफ्ट इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफी (ईसीओजी) सरणी आरोपण और मिनीपिग्स में दीर्घकालिक कॉर्टिकल रिकॉर्डिंग

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/64997
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory for Soft Bioelectronic Interfaces, Neuro-X Institute, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक मिनीपिग मॉडल में नरम सबड्यूरल इलेक्ट्रोड सरणियों के दीर्घकालिक प्रदर्शन और सुरक्षा मूल्यांकन के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, सर्जिकल विधि और उपकरण, पोस्टऑपरेटिव चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, श्रवण कॉर्टेक्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, प्रत्यारोपण के इलेक्ट्रोकेमिकल गुणों और पोस्टमॉर्टम इम्यूनोकैमिस्ट्री का वर्णन करते हैं।

Abstract

इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफी (ईसीओजी) सरणियों का उपयोग करके न्यूरोलॉजिकल हानि और बीमारियों का निदान या इलाज किया जा सकता है। दवा प्रतिरोधी मिर्गी में, ये मिर्गी क्षेत्र को ठीक करने में मदद करते हैं। मस्तिष्क-कंप्यूटर इंटरफेस जैसे दीर्घकालिक अनुप्रयोगों में, इन एपिकॉर्टिकल इलेक्ट्रोड का उपयोग मस्तिष्क के आंदोलन के इरादे को रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है, लकवाग्रस्त रोगियों के रोबोट अंगों को नियंत्रित करने के लिए। हालांकि, वर्तमान कठोर इलेक्ट्रोड ग्रिड उच्च-रिज़ॉल्यूशन मस्तिष्क रिकॉर्डिंग और दीर्घकालिक जैव एकीकरण की आवश्यकता का जवाब नहीं देते हैं। हाल ही में, उच्च प्रदर्शन के साथ दीर्घकालिक प्रत्यारोपण स्थिरता प्राप्त करने के लिए अनुरूप इलेक्ट्रोड सरणी प्रस्तावित की गई है। हालांकि, इन नई इम्प्लांट प्रौद्योगिकियों के लिए प्रीक्लिनिकल अध्ययन मानव रोगियों में उनके अनुवाद के लिए उनकी दीर्घकालिक कार्यक्षमता और सुरक्षा प्रोफ़ाइल को मान्य करने के लिए आवश्यक हैं। इस संदर्भ में, पोर्सिन मॉडल नियमित रूप से अपने बड़े अंग आकार और आसान पशु हैंडलिंग के कारण चिकित्सा उपकरणों को विकसित करने में कार्यरत हैं। हालांकि, साहित्य में केवल कुछ मस्तिष्क अनुप्रयोगों का वर्णन किया गया है, ज्यादातर सर्जरी सीमाओं और एक जीवित जानवर पर प्रत्यारोपण प्रणाली के एकीकरण के कारण।

यहां, हम मिनीपिग मॉडल में दीर्घकालिक आरोपण (6 महीने) और नरम ईसीओजी सरणियों के मूल्यांकन के लिए विधि की रिपोर्ट करते हैं। अध्ययन पहले इम्प्लांट सिस्टम को प्रस्तुत करता है, जिसमें चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) -संगत बहुलक ट्रांसडर्मल पोर्ट के साथ एकीकृत एक नरम माइक्रोफैब्रिकेटेड इलेक्ट्रोड सरणी शामिल है जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन कनेक्टर रखता है। फिर, अध्ययन शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का वर्णन करता है, सबड्यूरल आरोपण से पशु वसूली तक। हम श्रवण प्रांतस्था पर एक उदाहरण लक्ष्य क्षेत्र के रूप में ध्यान केंद्रित करते हैं जहां ध्वनिक उत्तेजना द्वारा उत्पन्न क्षमता एं प्रेरित होती हैं। हम अंत में एक डेटा अधिग्रहण अनुक्रम का वर्णन करते हैं जिसमें पूरे मस्तिष्क का एमआरआई, प्रत्यारोपण इलेक्ट्रोकेमिकल लक्षण वर्णन, इंट्राऑपरेटिव और स्वतंत्र रूप से चलने वाले इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और निकाले गए दिमाग के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला होना शामिल है।

इस मॉडल का उपयोग कॉर्टिकल प्रोस्थेसिस के उपन्यास डिजाइन की सुरक्षा और कार्य की जांच के लिए किया जा सकता है; मानव रोगियों के लिए अनुवाद की कल्पना करने के लिए अनिवार्य प्रीक्लिनिकल अध्ययन।

Introduction

इलेक्ट्रोकॉर्टिकोग्राफी (ईसीओजी) सरणियों का उपयोग करके न्यूरोलॉजिकल हानि और बीमारियों का निदान या इलाज किया जा सकता है। ये इलेक्ट्रोड ग्रिड मस्तिष्क की सतह पर प्रत्यारोपित होते हैं और मानव कॉर्टेक्स1 की रिकॉर्डिंग या उत्तेजना की अनुमति देते हैं। दवा प्रतिरोधी मिर्गी के मामले में, उदाहरण के लिए, वे मिर्गी क्षेत्र को ठीक करने में मदद करतेहैं। मस्तिष्क-कंप्यूटर इंटरफेस जैसे दीर्घकालिक अनुप्रयोगों में, इन एपिकॉर्टिकल इलेक्ट्रोड का उपयोग मस्तिष्क के आंदोलन के इरादे को रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है, लकवाग्रस्तरोगियों के रोबोट अंगों को नियंत्रित करने के लिए। हालांकि, वर्तमान इलेक्ट्रोड ग्रिड कठोर बहुलक सब्सट्रेट्स में एम्बेडेड कठोर धातु ब्लॉकों से बने होते हैं और उच्च-रिज़ॉल्यूशन मस्तिष्क रिकॉर्डिंग और दीर्घकालिक सबड्यूरल बायोइंटीग्रेशन (>30 दिन) की आवश्यकता का जवाब नहीं देते हैं। बल्कि, वे स्थानीय ऊतक प्रतिक्रियाएं बनाते हैं जो प्रत्यारोपित डिवाइस के फाइब्रोटिक एनकैप्सुलेशन का कारण बनते हैं, जिससे समय के साथ खराब प्रदर्शन होता है। हाल ही में, माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों द्वारा निर्मित पतली बहुलक सब्सट्रेट्स का उपयोग करके लचीले या खिंचाव योग्य इलेक्ट्रोड सरणियों को ऊतक प्रतिक्रिया 4,5 को सीमित करके दीर्घकालिक आरोपण में उच्च प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, इन नई इम्प्लांट प्रौद्योगिकियों के लिए प्रीक्लिनिकल अध्ययन उनकी दीर्घकालिक कार्यक्षमता और सुरक्षा प्रोफ़ाइल को मान्य करने के लिए आवश्यक हैं, ताकि मानव रोगियों के अनुवाद की कल्पना की जा सके। इस संदर्भ में, मिनीपिग और सुअर मॉडल नियमित रूप से अन्य चिकित्सा संदर्भों (जैसे, कार्डियोवैस्कुलर, कंकाल, या गैस्ट्रिक सिस्टम) में उपकरणों के विकास में नियोजित होते हैं क्योंकि उनके बड़े अंग आकार और आसान पशु हैंडलिंग 6,7,8 होते हैं। हालांकि, न्यूरोफिज़ियोलॉजी के लिए मस्तिष्क को लक्षित करने वाले केवल कुछ अनुप्रयोगों को साहित्य में वर्णित किया गया है, ज्यादातर सर्जिकल दृष्टिकोण सीमाओं और एक जीवित जानवरपर प्रत्यारोपण प्रणाली के एकीकरण के कारण 9,10,11,12। ये अक्सर जीवित जानवरों में पुरानी आरोपण के साथ संगत नहीं होते हैं, क्योंकि उन्हें आवश्यकता होगी, उदाहरण के लिए, इम्प्लांटेबल एम्बेडेड इलेक्ट्रॉनिक्स जैसे जटिल हार्डवेयर का विकास। इसके अतिरिक्त, वे लक्ष्य ऊतक पर प्रत्यारोपण प्रणाली के प्रभाव की जांच नहीं करते हैं, जो ट्रांसलेशनल अध्ययनों में जैव सुरक्षा पहलू के लिए महत्वपूर्ण है। पोर्सिन मॉडल कॉर्टिकल संरचना, खोपड़ी की हड्डी और त्वचा की मोटाई13 के संदर्भ में मानव शरीर रचना विज्ञान के करीब है। इसके अलावा, व्यवहार संबंधी कार्यों को सीखने की उनकी क्षमता उन्हें कार्यात्मक पुनर्वास रणनीतियों या संवेदी धारणाओंकी जांच के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बनाती है।

मनुष्यों के लिए नई प्रौद्योगिकियों और उपचारों के अनुवाद के लिए सक्षम चिकित्सा अधिकारियों द्वारा आवश्यक सुरक्षा और प्रभावकारिता के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। इन्हें आमतौर पर तकनीकी दस्तावेजों और मानदंडों15 में वर्णित किया जाता है, हालांकि उन्हें केवल इन परीक्षणों को पारित करने की आवश्यकता होती है और सुरक्षा अध्ययन के समानांतर डिवाइस आरोपण या अन्य उपयोगी डेटा के संग्रह के वास्तविक प्रभाव की जांच नहीं करते हैं। मस्तिष्क पर एक पूर्ण जैव सुरक्षा और प्रदर्शन अध्ययन के लिए, हम यहां मस्तिष्क इमेजिंग डेटा, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल माप, प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड के विद्युत रासायनिक गुणों का मूल्यांकन और पोर्सिन मॉडल में पोस्टमॉर्टम हिस्टोलॉजी का एक अनुदैर्ध्य और व्यवस्थित संग्रह प्रस्तुत करते हैं। इसे प्राप्त करने के लिए, एक पूर्ण प्रयोगात्मक मॉडल बनाने के लिए कई पहलुओं पर विचार करने की आवश्यकता है: (i) इलेक्ट्रोड से कनेक्ट करने के लिए यांत्रिक रूप से स्थिर ट्रांसडर्मल पोर्ट के साथ डिवाइस आरोपण के लिए न्यूनतम इनवेसिव सर्जिकल एक्सेस, (ii) एक मजबूत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग प्रतिमान जो एनेस्थीसिया के तहत और स्वतंत्र रूप से चलती परिस्थितियों में प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड के लिए प्रदर्शन आउटपुट के रूप में कार्य करता है, (iii) विवो इमेजिंग (कम्प्यूटरीकृत टोमोग्राफी [सीटी] और/या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग [एमआरआई]) में अलग-अलग समय पर मस्तिष्क और प्रत्यारोपण के विकास के साथ-साथ इमेजिंग उपकरण के साथ प्रत्यारोपित प्रणाली की संगतता का पालन करना, और (iv) हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए मस्तिष्क को निकालने के लिए एक ऊतक तैयारी पाइपलाइन।

यहां, हम दीर्घकालिक आरोपण (6 महीने) और मिनीपिग मॉडल में नरम ईसीओजी सरणियों के मूल्यांकन के लिए विधि पर रिपोर्ट करते हैं (चित्रा 1 में योजनाबद्ध रूप से दिखाया गया है)। नरम इलेक्ट्रोड सरणियों को हमारी पिछली रिपोर्टों में प्रस्तुत किया गया था और पतली सिलिकॉन झिल्ली से बनाया गया है जो विद्युत ट्रैक16,17 के रूप में उपयोग की जाने वाली लोचदार सोने की पतली फिल्मों को एम्बेड करता है। ऊतक के साथ संपर्क मस्तिष्कके ऊतकों के लिए एक नरम और कुशल विद्युत रासायनिक इंटरफ़ेस के लिए सिलिकॉन मैट्रिक्स में एम्बेडेड प्लैटिनम नैनोकणों के मिश्रण के माध्यम से किया जाता है। प्रत्यारोपण एक लचीली केबल के माध्यम से खोपड़ी और त्वचा के माध्यम से एक ट्रांसडर्मल पोर्ट से जुड़ा होता है जिसमें जानवर के सिर पर कनेक्टर होते हैं। इम्प्लांट के आकार और आकार को लक्ष्य और अध्ययन की जरूरतों के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। इस अध्ययन में वर्तमान इलेक्ट्रोड स्ट्रिप्स नैदानिक स्ट्रिप्स के वास्तविक आकार को प्रतिबिंबित करते हैं। नैदानिक रूप से उपलब्ध सबड्यूरल स्ट्रिप्स और ग्रिड का उपयोग एक ही दृष्टिकोण का उपयोग करके तुलनित्र के रूप में किया गया था। पॉलीमेरिक एमआरआई संगत ट्रांसडर्मल पोर्ट को एक फुटप्लेट सिस्टम का उपयोग करके खोपड़ी पर रखा जाता है जो इसे खोपड़ी में मजबूती से लंगर डालता है। यहां, हम शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करते हैं, दोनों गोलार्धों के सबड्यूरल आरोपण से लेकर जानवर की वसूली तक। हम श्रवण प्रांतस्था पर एक उदाहरण लक्ष्य क्षेत्र के रूप में ध्यान केंद्रित करते हैं, जहां एनेस्थेटाइज्ड और स्वतंत्र रूप से चलती स्थितियों दोनों में ध्वनिक उत्तेजना द्वारा उत्पन्न क्षमता को प्रेरित किया जाता है। अलग-अलग समय बिंदुओं पर, पशु के मस्तिष्क को संज्ञाहरण के तहत एमआरआई (या नैदानिक इलेक्ट्रोड के लिए सीटी) में चित्रित किया जाता है और इलेक्ट्रोड के विद्युत रासायनिक गुणों को मापा जाता है। इलेक्ट्रोड लक्षण वर्णन विधियों का उपयोग प्रत्यारोपण और इलेक्ट्रोड-ऊतक इंटरफ़ेस के विकास का पालन करने के लिए किया जाता है (अधिक जानकारी के लिए शियावोन एट अल .19 देखें)। इनमें इलेक्ट्रोड संपर्क की उत्तेजना क्षमताओं की जांच करने के लिए क्रोनोएम्पेरोमेट्री, इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईआईएस) शामिल है जो इलेक्ट्रोड के प्रतिरोधक और कैपेसिटिव घटकों के विकास को इंगित कर सकता है, और हेर्मेटिक एनकैप्सुलेशन विफलताओं की जांच के लिए अंतर-चैनल प्रतिरोध माप। अंत में, हमने इच्छामृत्यु के बाद मस्तिष्क को शुद्ध करने के लिए एक ऊतक निष्कर्षण पाइपलाइन विकसित की है, इसे जगह में इलेक्ट्रोड के साथ खोजना, इसे विभाजित करना और विभिन्न सूजन मार्करों का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करना। कुल मिलाकर, यह विधि मस्तिष्क पर नई प्रौद्योगिकियों और उपचारों के भविष्य के नैदानिक अनुवाद के लिए मजबूत मल्टीमॉडल डेटा संग्रह के साथ प्रीक्लिनिकल अध्ययन की अनुमति देगी।

Protocol

सर्जिकल और व्यवहार प्रक्रियाओं को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुसार स्थानीय नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्राधिकरण संख्या GE11120A के साथ स्थानीय (जिनेवा कैंटन) और संघीय (स्विस) पशु चिकित्सा अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस अध्ययन में 2-6 महीने की उम्र (5-8 किलोग्राम) में मादा गौटिंगेन मिनीपिग्स (एन = 7) का उपयोग किया गया था।

1. प्रीसर्जिकल प्लानिंग

  1. नरम प्रत्यारोपण प्रणाली के इन विट्रो लक्षण वर्णन
    1. क्रोनोम्पेरोमेट्री: पल्स जनरेटर के समानांतर में जुड़े ऑसिलोस्कोप का उपयोग करके एक द्विध्रुवीय वर्तमान पल्स विकास (यानी, वोल्टेज क्षणिक [वीटी]) के इंजेक्शन पर वोल्टेज ड्रॉप रिकॉर्ड करें। पल्स जनरेटर को क्रमिक रूप से प्रत्येक इलेक्ट्रोड से कनेक्ट करें और खारा घोल (फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन [पीबीएस] 1 एक्स) में एक प्लैटिनम काउंटर। सेटिंग्स के लिए चरण 3.1 देखें।
    2. इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोग्राम: एक पोटेंशियोमीटर का उपयोग करके विभिन्न आवृत्तियों पर विद्युत रासायनिक प्रतिबाधा को मापें। प्लैटिनम काउंटर और खारा घोल (पीबीएस 1 एक्स) में एजी / एजीसीएल संदर्भ इलेक्ट्रोड का उपयोग करके पोटेंशियोमीटर को प्रत्येक इलेक्ट्रोड से क्रमिक रूप से कनेक्ट करें। सेटिंग्स के लिए चरण 3.2 देखें।
    3. इंटर-चैनल प्रतिरोध: शुष्क अवस्था में, एक हैंडहेल्ड मल्टीमीटर का उपयोग करके आसन्न चैनलों के बीच प्रत्यक्ष धारा (डीसी) प्रतिरोध को मापें।
    4. इम्प्लांट चयन: ऊपर उद्धृत तीन मापों के बाद, निम्नलिखित मानदंडों के साथ इम्प्लांट का चयन करें: 100 kHz से नीचे 1 kHz पर प्रतिबाधा और 1 mQ से नीचे कोई अंतर-चैनल प्रतिरोध नहीं।
  2. नसबंदी
    1. इम्प्लांट नसबंदी: चयनित प्रत्यारोपण को नसबंदी मार्कर के साथ नसबंदी बैग में व्यक्तिगत रूप से रखें और उन्हें सील करें। सर्जरी के दौरान बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए डबल पैकेजिंग का उपयोग करें।
      नोट: इस मामले में, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2 ओ2) गैस नसबंदी का उपयोग कम समय चक्र और कम तापमान (55 डिग्री सेल्सियस) के कारण किया जाता है। विकल्प एथिलीन ऑक्साइड (ईटीओ) गैस या आटोक्लेव नसबंदी हैं, लेकिन प्रत्यारोपण प्रणाली के साथ संगतता सुनिश्चित की जानी चाहिए।
    2. उपकरण नसबंदी: साफ किए गए उपकरणों को नसबंदी मार्करों के साथ डबल नसबंदी बैग या बाँझ उपकरण बक्से में रखें। उपकरणों के लिए आटोक्लेव नसबंदी सबसे आम है, लेकिन एच2 ओ2 या ईटीओ संभावित विकल्प हैं।

2. नरम ईसीओजी सरणियों का सर्जिकल आरोपण।

  1. संज्ञाहरण
    1. प्रीमेडिकेशन: जानवर को अलग करें और इसे रात भर उपवास करें। 0.75 मिलीग्राम / किग्रा पर मिडाज़ोलम का मिश्रण इंजेक्ट करें, 0.25 μg / kg पर एट्रोपिन, और 0.1 मिलीग्राम / किग्रा पर हल्डोल इंट्राडर्मल पर, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि जानवर बेहोश न हो जाए। आगे बढ़ने से पहले जानवर का वजन करें।
    2. अंतःशिरा (IV) लीड की स्थापना:
      1. पशु को हीटिंग पैड पर सर्जरी टेबल पर रखें। 3% -3.5% पर सेवोफ्लुरेन का उपयोग करके, जानवर पर फेस मास्क रखकर संज्ञाहरण को प्रेरित करें।
      2. पेट पर इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम लीड, पूंछ पर एक रक्त संतृप्ति सेंसर और नथुने में एक तापमान सेंसर रखें।
      3. कान की नस पर एक आईवी लीड रखें और खारा से भरे सिरिंज का उपयोग करके रक्त की पहुंच की पुष्टि करें। मलहम का उपयोग करके आंखों को हाइड्रेटेड रखना सुनिश्चित करें।
    3. इंटुबैशन: 0.5 मिलीग्राम / किग्रा पर एट्राक्यूरियम का एक बोलस, 1 मिलीग्राम / किलोग्राम पर केटामाइन और 1-2 μg / kg पर फेंटानिल इंजेक्ट करें। इंटुबैशन के लिए जानवर को उसकी पीठ पर रखें। एक 4.5 मिमी ट्यूब डालें।
    4. दवा: इंटुबैशन के बाद, सेवोफ्लूरेन एनेस्थीसिया को रोकें और 10 मिलीग्राम / किग्रा / घंटा पर प्रोपोफोल जलसेक, 2 μg / kg / h पर फेंटानिल, 0.2-0.5 मिलीग्राम / किग्रा / घंटा पर एट्राक्यूरियम और 4-7 मिलीग्राम / किग्रा / घंटा पर खारा स्थापित करें। सर्जरी के दौरान मस्तिष्क की सूजन को कम करने के लिए 1 ग्राम / किग्रा / घंटा पर मैनिटोल का जलसेक शुरू करें।
      नोट: स्थानीय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुशंसित होने पर एक मल्टीमॉडल एनाल्जेसिया आहार का उपयोग किया जा सकता है।
  2. प्रीऑपरेटिव एक्स-रे
    1. जानवर को स्फिंक्स स्थिति में उसके पेट पर रखें। जानवर के मस्तिष्क और खोपड़ी के आसपास के क्षेत्र में किसी भी धातु की वस्तु को अस्थायी रूप से हटा दें (उदाहरण के लिए, नाक में तापमान सीसा)।
    2. हड्डी के विपरीत के साथ एक अक्षीय और विमान एक्स-रे प्राप्त करें। मस्तिष्क के सामने और पीछे खोपड़ी की मोटाई को मापने के पैमाने के रूप में सेवा करने के लिए ज्ञात आयामों के साथ एक धातु की वस्तु रखें।
    3. ललाट साइनस (खोपड़ी के नीचे रिक्तियों द्वारा दिखाई देने वाले) के स्थान की पहचान करें और एक स्थायी मार्कर का उपयोग करके जानवर के सिर पर सबसे पीछे के स्थान को चिह्नित करें। यह सबसे दूर के बिंदु को इंगित करेगा जहां नीचे वर्णित सर्जिकल दृष्टिकोण में कोई क्रैनियोटॉमी या स्क्रू प्लेसमेंट किया जा सकता है।
  3. सड़न रोकनेवाला क्षेत्र और त्वचा की तैयारी: सर्जिकल क्षेत्र से परे सिर की पूरी सतह को शेव करें। एक बाँझ पैड का उपयोग करके, बीटाडीन के साथ सिर को अच्छी तरह से स्क्रब करें। इसके बाद, केवल सर्जिकल विंडो को प्रकट करने के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन टेबल पर और जानवर पर बाँझ ड्रेप रखें। अंत में, बीटाडीन का उपयोग करके बाँझ पैड के साथ सिर को फिर से स्क्रब करें।
  4. क्रैनियोटॉमी और ड्यूरोटॉमी
    1. त्वचा का कटना: मध्य रेखा के साथ एक स्केलपेल चाकू के साथ त्वचा को इंजेक्ट करें। मांसपेशियों और पेरीओस्टेम (दोनों तरफ ब्रेग्मा से 25 मिमी पार्श्व और ब्रेग्मा से 40 मिमी पूर्वकाल और पीछे की ओर) को एक रास्पेटरी का उपयोग करके हड्डी से अलग करें और बाद में ड्रिलिंग के लिए इष्टतम पहुंच प्राप्त करने के लिए स्प्रेडर रखें।
    2. माप और अंकन: ब्रेग्मा और लैम्ब्डा की पहचान करें, और उन्हें बाँझ सर्जिकल पेन (चित्रा 2 ए, बी) के साथ चिह्नित करें। एक बाँझ शासक का उपयोग करके, दोनों गोलार्धों पर आरोपण लक्ष्य के आसपास केंद्रित हड्डी फ्लैप रूपरेखा को परिभाषित करें। इस विशिष्ट मामले में, श्रवण कॉर्टेक्स को चुना गया था, जिसमें ब्रेग्मा से -5 मिमी से -15 मिमी और पार्श्व रूप से -4 मिमी से -20 मिमी निर्देशांक थे। फिर, क्रैनियोटॉमी को इम्प्लांट और शारीरिक स्थलों के आकार में समायोजित करें, उद्घाटन आकार को सीमित करें।
    3. क्रैनियोटॉमी:
      1. एक गोल काटने वाले बिट के साथ एक हड्डी ड्रिल का उपयोग करते हुए, चरण 2.2 में मापी गई खोपड़ी की मोटाई को ध्यान में रखते हुए, क्रैनियोटॉमी की रूपरेखा ड्रिल करें। हड्डी के अधिक गर्म होने से बचने के लिए खारे घोल के साथ ड्रिलिंग स्थान की सिंचाई करें।
      2. ड्यूरा मेटर तक पहुंचने तक रूपरेखा को सजातीय रूप से सावधानीपूर्वक ड्रिल करें। पहली सफलता पर, रूपरेखा को तब तक ड्रिल करना समाप्त करें जब तक कि यह लगभग टूटने के लिए पर्याप्त पतला न हो जाए। फिर, एक टुकड़े में हड्डी फ्लैप को तोड़ने के लिए एक फ्लैट स्पैटुला (या तो मध्य रेखा की तरफ या पार्श्व पक्ष पर) का उपयोग करें, क्रैनियोटॉमी किनारे का उपयोग लीवरेज के रूप में करें। यदि बहुत अधिक प्रतिरोध का सामना करना पड़ता है, तो हड्डी को पतला करना जारी रखें।
      3. हड्डी के टुकड़े को बाँझ नमकीन में रखें।
      4. एक बार हड्डी के फ्लैप को हटा दिए जाने के बाद, सावधानीपूर्वक क्रैनियोटॉमी के किनारे को दूर करें, केरिसन का उपयोग करके तेज हड्डी के किनारे को ड्यूरा मैटर में काटने से बचाया जा सके।
      5. यदि ड्यूरा मैटर या हड्डी पर अत्यधिक रक्तस्राव का सामना करना पड़ता है, तो क्रमशः जेलफोम या हड्डी मोम का उपयोग करें। क्रैनियोटॉमी में एक गीला संपीड़न (बाँझ नमकीन समाधान में मानक पैड) रखें और इस चरण को दूसरे गोलार्ध पर दोहराएं (चित्रा 2 बी)।
    4. Durotomy:
      1. 6-0 सीवन किट से सुई का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक ड्यूरा मैटर को क्रैनियोटॉमी के पूर्ववर्ती या पीछे के छोर पर मध्य और पार्श्व पक्ष के बीच छेद कर के उठाएं और चाकू से चीरे की शुरुआत करें।
      2. फिर, कॉर्टेक्स की रक्षा के लिए एक कटिंग बेस के रूप में कार्य करने वाले सबड्यूरल स्पेस में डाले गए एक छोटे फ्लैट स्पैटुला का उपयोग करके, दोनों उपकरणों के साथ एक साथ आगे बढ़ते हुए ड्यूरा मैटर में एक एंटेरोपोस्टीरियर स्लिट बनाएं। सुनिश्चित करें कि स्लिट इम्प्लांट की चौड़ाई से थोड़ा बड़ा है (चित्रा 2 सी)। यदि इस चरण में कोई रक्तस्राव या क्षति होती है, तो इसे जेल फोम के साथ कवर करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि यह बंद न हो जाए।
        नोट: स्लिट प्रक्षेपवक्र को अनुकूलित किया जाना चाहिए यदि रक्तस्राव से बचने के लिए ड्यूरा मैटर में बड़ी रक्त वाहिकाएं मौजूद हैं।
  5. आरोपण
    1. डिवाइस सम्मिलन:
      1. इम्प्लांट (पूरक चित्र 1 ए) को दोनों तरफ से खारा के साथ सिंचित करें ताकि यह सबड्यूरल स्पेस में अधिक आसानी से फिसल जाए। इम्प्लांट को ड्यूरा मैटर स्लिट के ऊपर रखें और छोटे बल के साथ, डिवाइस को प्रत्येक किनारे पर क्रमिक रूप से स्लाइड करके डालें।
      2. डिवाइस के पेडस्टल छोर को ध्यान से पकड़ें और प्रविष्टि में बाधा उत्पन्न करने वाले तनाव पैदा न करने के लिए इम्प्लांट के साथ आगे बढ़ें। जब कनेक्टर किनारा स्लिट के शीर्ष पर स्थित हो, तो सम्मिलन को रोकें।
    2. इम्प्लांट को सुरक्षित करें: इम्प्लांट को सुरक्षित करने के लिए, क्रैनियोटॉमी के किनारे के बाद या एंकरिंग विंग्स में केबल के ऊपर एक टाइटेनियम ब्रिज रखें और उचित स्क्रूड्राइवर (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके इसे एक या दो टाइटेनियम स्क्रू के साथ सुरक्षित करें।
    3. ग्राउंड प्लेसमेंट: जमीन के तारों के इन्सुलेशन के 1 सेमी को सावधानीपूर्वक हटा दें और इसे क्रानियोटॉमी (या रुचि के कॉर्टेक्स या बड़ी रक्त वाहिकाओं से दूर किसी भी एपिड्यूरल स्थान) के पीछे के छोर पर एपिड्यूरल डालें ( चित्रा 2 ई में तार)।
    4. चरण 2.4.4 दोहराएँ। और 2.5.1.-2.5.3 कॉन्ट्रा-लेटरल गोलार्ध पर।
    5. प्लेसमेंट की पुष्टि करने के लिए इंट्राऑपरेटिव एक्स-रे:
      1. ऊतक को हाइड्रेटेड रखने के लिए सर्जरी स्थान पर एक गीला पैड (बाँझ नमकीन समाधान में मानक पैड) रखें। इसके बाद, जानवर के सिर को ढंकने के लिए एक बाँझ सर्जरी ड्रेप करें।
      2. यह सुनिश्चित करने के लिए विमान एक्स-रे छवियां (अक्षीय और धन) लें कि प्रत्यारोपण अच्छी तरह से रखे गए हैं और मुड़े नहीं हैं, संकेतक के रूप में एक्स-रे मार्करों का उपयोग करके। यदि नहीं, तो ड्रेप को हटा दें और इसे फिर से सम्मिलित करने के लिए डिवाइस को खोजें (चरण 2.4.4. और 2.5.1.-2.5.3 का फिर से पालन करें)।
    6. ड्यूरा मैटर बंद होना: 3-0 पुनर्जीवित सीवन और एक छोटी सुई धारक का उपयोग करके इम्प्लांट केबल के चारों ओर ड्यूरा मैटर को सावधानी से घुमाएं। सीवन तार के साथ पतली झिल्ली के माध्यम से फाड़े बिना जितना संभव हो सके दो ड्यूरा मैटर किनारों को एक साथ लाएं (चित्रा 2 डी, ई)।
    7. अस्थि फ्लैप प्लेसमेंट: टाइटेनियम स्क्रू का उपयोग करके प्रत्येक हड्डी फ्लैप के पूर्ववर्ती और पीछे के हिस्से पर एक टाइटेनियम पुल ठीक करें। अगले चरणों में फुटप्लेट पैरों के प्लेसमेंट के संबंध में टी-ब्रिज की स्थिति की योजना बनाने के लिए सावधान रहें। टाइटेनियम पुलों के अंत को खोपड़ी तक पेंच करें (चित्रा 2 एफ, जी)।
  6. पेडस्टल और फुटप्लेट प्लेसमेंट
    1. पोजिशनिंग: इस विन्यास में, फुटप्लेट में दो पेंच छेद के साथ छह पैर होते हैं (पूरक चित्र 1 बी)। स्क्रू के स्थान को अनुकूलित करने के लिए खोपड़ी पर फुटप्लेट के प्लेसमेंट की योजना बनाएं (उन्हें क्रैनियोटॉमी के किनारे या अस्थायी मांसपेशी में रखने से बचें)। पैरों में छेद को छोड़ दें यदि उन्हें पेंच नहीं किया जा सकता है।
    2. फुटप्लेट सुरक्षा: फुटप्लेट के टाइटेनियम स्क्रू में पेंच जब तक कि यह मजबूती से जगह में न हो ( चित्रा 2 एच देखें)।
    3. पेडस्टल प्लेसमेंट: कनेक्शन केबलों पर टाइटेनियम पुलों को हटा दें और फुटप्लेट पर उतरने के लिए पेडस्टल पर फ्लिप करें। पेडस्टल को फुटप्लेट पर पेंच करें। जाँचें कि पेडस्टल मजबूती से जगह पर है (चित्रा 2I)।
  7. सीवन और बंद
    1. घाव की सफाई: खारा के साथ फ्लश करके किसी भी हड्डी या अन्य मलबे के चमड़े के नीचे की जगह को साफ करें। सिलेंडर के बाद एक गोल किनारा बनाने के लिए पेडस्टल किनारों के आसपास कुछ त्वचा काट लें।
    2. चमड़े के नीचे के सीवन: स्प्रेडर्स को हटा दें और त्वचा को एक साथ मोड़ें। सरल बाधित सीवन या सरल निरंतर सीवन का उपयोग करके 3 मिमी अलग 4-0 गैर-पुनर्जीवित सीवन तार के साथ चमड़े के नीचे के सीवन बनाएं। आसन से दूर शुरू करें, चीरे के दोनों किनारों पर इसकी ओर बढ़ें।
    3. त्वचीय सीवन: 6-0 गैर-पुनर्जीवित सीवन तार का उपयोग करके त्वचा को सीवन करें, जिसमें सीवन 5 मिमी अलग हों। आसन से दूर शुरू करें, चीरे के दोनों किनारों पर इसकी ओर बढ़ें। शून्य से बचने के लिए दो त्वचा फ्लैप के बीच और पेडस्टल किनारे के पास अच्छी ऊतक स्थिति प्राप्त करने के लिए ध्यान रखें (चित्रा 2 जे)।
    4. घाव ड्रेसिंग: एक बाँझ पैड और बीटाडीन के साथ घाव क्षेत्र को फिर से साफ करें। घाव पर एक स्व-चिपकने वाला बाँझ पट्टी लागू करें।
  8. विवो माप में: विवो माप में, अनुभाग 3, 4 और 5 का पालन करें।
  9. जागृति: सभी माप किए जाने के बाद, जानवर को सभी एनेस्थेटिक्स से हटा दें लेकिन वेंटिलेशन के तहत रखें। एनाल्जेसिया के लिए, 24 घंटे के लिए एक ब्यूप्रेनोर्फिन पैच (25 मिलीग्राम / घंटा) लागू करें। जागने के समय को तेज करने के लिए जानवर को ड्रेप से ढके हीटिंग पैड पर रखें। जब सहज श्वास ठीक हो जाता है, तो जानवर को बाहर निकालें और चेतना बरामद होने तक ऑक्सीजन फेस मास्क के नीचे रखें (जिसमें 1 से 4 घंटे लग सकते हैं)।
  10. पोस्टऑपरेटिव पशु देखभाल: 5 दिनों के लिए, जानवर को करीबी निगरानी में रखें। अन्य जानवरों से अलग, भोजन के साथ दिन में दो बार 75 मिलीग्राम पर सेफलेक्सिन की खुराक दें। भिगोए हुए बाँझ पैड के साथ बीटाडीन की प्रचुर मात्रा को लागू करके घाव का कीटाणुशोधन करें (भोजन के दौरान सबसे अच्छा किया जाता है)।
    नोट: दीर्घकालिक देखभाल और आवास: संचालित जानवर को 24 घंटे के लिए अलग रखा जाता है। इसे अपने मूल सामाजिक समूह में वापस रखा जाता है यदि जानवर अपने साथियों के साथ सामाजिक रूप से बातचीत करने के लिए पर्याप्त है। सिर पर डिवाइस के एकीकरण का पालन करने के लिए पेडस्टल और त्वचा के उद्घाटन का दैनिक अवलोकन किया जाना चाहिए। जब उचित हो, तो बीटाडीन की प्रचुर मात्रा के साथ पेडस्टल के आसपास के स्थान को साफ करें।

3. सॉफ्ट इम्प्लांट के विवो लक्षण वर्णन में

  1. क्रोनोम्पेरोमेट्री: पल्स जनरेटर के समानांतर में जुड़े एक ऑसिलोस्कोप का उपयोग करके एक द्विध्रुवीय वर्तमान पल्स विकास (यानी, वीटी) के इंजेक्शन पर वोल्टेज ड्रॉप रिकॉर्ड करें। पल्स जनरेटर को प्रत्येक इलेक्ट्रोड और ग्राउंड वायर से क्रमिक रूप से कनेक्ट करें। 100 हर्ट्ज पर 300 μs की पल्स चौड़ाई के साथ 100 μA पर उत्तेजना पल्स करें।
  2. इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी: एक पोटेंशियोमीटर का उपयोग करके विभिन्न आवृत्तियों पर विद्युत रासायनिक प्रतिबाधा को मापें। पल्स जनरेटर को प्रत्येक इलेक्ट्रोड से क्रमिक रूप से कनेक्ट करें, ग्राउंड वायर को काउंटर इलेक्ट्रोड और जमीन दोनों के रूप में उपयोग करें। उत्तेजना वोल्टेज को 200 एमवी पर सेट करें और आवृत्ति रेंज 1 हर्ट्ज से 1 मेगाहर्ट्ज तक हो, प्रति दशक तीन बिंदुओं के साथ।
  3. इंटर-चैनल लघु माप: हैंडहेल्ड मल्टीमीटर का उपयोग करके आसन्न चैनलों के बीच डीसी प्रतिरोध को मापें। विवो में, इंटर-चैनल डीसी प्रतिरोध केवल यह सत्यापित करने के लिए मापा जाता है कि 1 kY से नीचे कोई कमी दिखाई नहीं देती है, जो कुल एनकैप्सुलेशन विफलता का संकेत देती है।

4. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग

  1. सहज गतिविधि: पेडस्टल के माध्यम से वायरलेस रिकॉर्डिंग सिस्टम को प्लग करें और 2-3 मिनट के लिए बेसलाइन गतिविधि रिकॉर्ड करें। ये रिकॉर्डिंग श्रवण उत्पन्न क्षमता का विश्लेषण करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में काम करेगी।
  2. श्रवण क्षमता पैदा करता है: वायरलेस सिस्टम के अलावा, जानवरों के कानों में एक बंद क्षेत्र में स्पीकर डालें। प्ले टोन ध्वनिक उत्तेजना को विभिन्न आवृत्तियों (200-20,000 हर्ट्ज तक) पर लगभग 70 डीबी ध्वनि दबाव स्तर (एसपीएल) पर 120 पुनरावृत्तियों पर फटता है। फिर, रिकॉर्डिंग को औसत करें और विश्लेषण के लिए उत्तेजना अवधि में उन्हें संरेखित करें।
  3. संवेदी क्षमता उत्पन्न करें: सुइयों को तीन अलग-अलग स्थितियों में स्नूट में रखें। भर्ती वक्रों को प्राप्त करने के लिए विभिन्न आयामों पर पल्स जनरेटर के साथ ~ 30 सेकंड के लिए स्नूट को उत्तेजित करके संवेदी क्षमता को उजागर करें।

5. विवो इमेजिंग में

  1. पशु परिवहन: पशु को प्रोपोफोल संज्ञाहरण के तहत रखें, जैसा कि चरण 2.1 में वर्णित है। एक परिवहन गाड़ी का उपयोग करें जिसमें एक वेंटिलेटर, सिरिंज पंप और महत्वपूर्ण संकेत मॉनिटर होते हैं जो जानवर को सर्जरी कक्ष से इमेजिंग सुविधाओं और वापस ले जाने के लिए निगरानी करते हैं।
  2. कंप्यूटेड टोमोग्राफी एक्स-रे स्कैन: जानवर को स्कैनर टेबल पर रखें और सिर के चारों ओर किसी भी धातु की वस्तु को हटा दें (जैसे, तापमान सेंसर)। हड्डी के कंट्रास्ट के लिए स्वचालित वर्तमान और वोल्टेज चयन के साथ आइसोमेट्रिक अधिग्रहण का उपयोग करके सबसे छोटे रिज़ॉल्यूशन (0.4 मिमी स्लाइस मोटाई) पर सीटी स्कैन प्राप्त करें।
  3. चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग: जानवर से धातु युक्त सभी उपकरणों को हटा दें (एमआरआई-संगत IV लीड और इंटुबैशन ट्यूब का उपयोग करें)। एमआरआई कक्ष के बाहर स्थित वेंटिलेटर का उपयोग करके और जानवर को एक लंबी ट्यूब के माध्यम से लिंक करके 3% -3.5% पर सेवोफ्लुरेन के तहत जानवर को हवादार और एनेस्थेटाइज्ड रखें। पहले अनुक्रम से पहले, फेंटेनाइल के एक बोलस को 1-2 μg / kg पर इंजेक्ट करें। सबसे छोटे रिज़ॉल्यूशन पर तीन आइसोमेट्रिक अनुक्रमों का उपयोग करें: टी 1-, टी 2- और टर्बो स्पिन इको (टीएसई) -भारित अनुक्रम ( पूरक फ़ाइल 1 में दिखाए गए पैरामीटर)।

6. स्वतंत्र रूप से चलती रिकॉर्डिंग

  1. मस्तिष्क से जागृत संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए धारा 4 में वर्णित एक ही प्रक्रिया का पालन करें। वायरलेस हेडस्टेज को या तो प्रयोगकर्ता की बाहों में जानवर को पकड़कर प्लग करें या जानवर को विचलित करने के लिए उपचार के साथ खिलाएं। जानवर के करीब रखे बाहरी वक्ताओं का उपयोग करके ध्वनिक उत्तेजना प्रदान करें।

7. छिड़काव और ऊतक तैयारी

  1. वैकल्पिक: यदि जानवर पहले से ही संज्ञाहरण के तहत नहीं है, तो संज्ञाहरण प्रोटोकॉल के लिए चरण 2.1 का पालन करें।
  2. छिड़काव के लिए कैरोटिड धमनी में कैथेटर का सम्मिलन (पूरक चित्र 2)।
    1. कैरोटिड धमनी और जुगुलर नस विच्छेदन: कटर का उपयोग करके मध्य रेखा पर गले को काट लें। पहले त्वचा को काटें और फिर मध्य सफेद रेखा (नीचे कोई वाहिका नहीं) के बाद मांसपेशियों को काटें (पूरक चित्रा 2 ए)।
    2. श्वासनली के चारों ओर और मांसपेशियों के नीचे जगह बनाने के लिए उंगलियों का उपयोग करके आगे खोलें। कैरोटिड धमनी (धड़कन और गुलाबी) की तलाश करें; योनि तंत्रिका कभी-कभी आसपास (सफेद) भी होती है, और जुगुलर नस नीचे या किनारे (लाल) हो सकती है। स्प्रेडर्स रखें ( पूरक चित्र 2 बी देखें)।
    3. महीन बल और गोल कैंची का उपयोग करके कैरोटिड धमनी का विच्छेदन शुरू करें। नेत्रश्लेष्मला ऊतक को खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें। यदि रक्त वाहिकाएं नहीं हैं, तो काट दें; यदि रक्त वाहिकाएं हैं, तो आगे बढ़ें (पूरक चित्रा 2 सी, डी)। जब पर्याप्त विच्छेदित किया जाता है, तो कैरोटिड धमनी के नीचे जाने के लिए एक क्लैंप का उपयोग करें ताकि यह पूरी तरह से अलग हो जाए (पूरक चित्रा 2 ई)।
    4. जुगुलर नस (पूरक चित्रा 2 एफ) के साथ एक ही ऑपरेशन दोहराएं।
    5. जब दोनों वाहिकाओं को पूरी तरह से विच्छेदित और अलग किया जाता है, तो उनके चारों ओर सीवन तार रखें। उन्हें अभी तक बंद न करें। कैरोटिड के चारों ओर दो सीवन, एक बहुत ही आधार पर (मस्तिष्क छिड़काव के लिए सीवन 1-हृदय पक्ष) और दूसरी तरफ एक (सीवन 2), पूरक चित्रा 2 जी में दिखाया गया है।
    6. जुगुलर नस (सीवन 3) के चारों ओर एक सीवन रखें, बंद नहीं; बाद में नस के विभाजन के लिए तारों को टेप से चिह्नित करें।
    7. सीवन 1 को बहुत मजबूती से बंद करें, अन्यथा इससे खून बहेगा (पूरक चित्र 2एच)। तीन गाँठें बांधें। वजन डालने और कैरोटिड धमनी में तनाव पैदा करने के लिए तार पर एक क्लैंप रखें।
    8. कैरोटिड धमनी विच्छेदन के विपरीत तरफ एक पोत क्लैंप का उपयोग करके कैरोटिड धमनी को दबाएं (मस्तिष्क छिड़काव के लिए मस्तिष्क पक्ष; पूरक चित्र 2I)। सीवन 2 बीच में है, अभी तक बंद नहीं हुआ है।
    9. कैरोटिड धमनी को पकड़ने और खींचने के लिए काले बल का उपयोग करें। बारीक कैंची का उपयोग करके, विच्छेदन के आधार के पास कैरोटिड धमनी का आधा हिस्सा (सीवन 1 के पास, हृदय पक्ष; पूरक चित्र 2 जे देखें)। सुनिश्चित करें कि अनुभाग जितना संभव हो उतना साफ है और जहाज तक ही पहुंचता है, न केवल "म्यान"; अन्यथा, कैथेटर नहीं जाएगा। पूरक चित्र 2K में दिखाए अनुसार कैथेटर डालें।
    10. पहले पीबीएस के साथ कैथेटर को फ्लश करें और भरें, इसलिए कैथेटर में कोई हवा नहीं बची है (पूरक चित्रा 2 के इनसेट)।
    11. सीवन 2 को मजबूती से बंद करें ताकि यह दूर न जाए, लेकिन बहुत अधिक नहीं ताकि कैथेटर अभी भी थोड़ा हिल सके (पूरक चित्रा 2 एल)। फिर, पोत क्लैंप को हटा दें, जहां तक संभव हो कैथेटर डालना समाप्त करें, और सीवन 2 (मजबूती से बंद) के बंद होने को अंतिम रूप दें।
    12. यदि वांछित हो, तो अतिरिक्त सुरक्षा कदम के रूप में घाव के बाहर निकलने पर कैथेटर के आधार को त्वचा से जोड़ने के लिए सीवन 1 पर सीवन तारों का उपयोग करें। फिर, जानवर को छिड़काव क्षेत्र में स्थानांतरित करें और इसे पीबीएस / हेपरिन में प्लग करें। जब छिड़काव शुरू होता है, तो सीवन 3 खींचें और जुगुलर नस को काट लें।
  3. इच्छामृत्यु: पेंटोबार्बिटल (90 मिलीग्राम / किग्रा) को अंतःशिरा रूप से वितरित करें और पूरी खुराक को सफलतापूर्वक प्रशासित करने के लिए लाइन को नमकीन के साथ फ्लश करें।
  4. छिड़काव: एक छिड़काव पंप (200 एमएल / मिनट) का उपयोग करके कैरोटिड कैथेटर को पीबीएस / हेपरिन (15 किलोग्राम सुअर के लिए 1 एल) और फिर पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) (15 किलोग्राम सुअर के लिए 5 एल) में प्लग करें। जब छिड़काव शुरू होता है, तो सीवन 3 खींचें और जुगुलर नस को काट लें।
  5. ऊतक संग्रह
    1. सिर कलम करना: जब छिड़काव समाप्त हो जाता है, तो त्वचा और मांसपेशियों को काटकर और पहले और दूसरे कशेरुक के बीच ब्लेड डालकर स्केलपेल का उपयोग करके जानवर के सिर को शरीर से अलग करें।
    2. पोस्टफिक्सेशन: पीबीएस में 4% पीएफए में सिर को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक और 48 घंटे के लिए डुबोएं और फिर मस्तिष्क निष्कर्षण से पहले पीबीएस में स्थानांतरित करें।
    3. मस्तिष्क और प्रत्यारोपण निष्कर्षण:
      1. स्केलपेल का उपयोग करके त्वचा को हटा दें और रीढ़ की हड्डी से सेरिबैलम तक पहुंचने के बाद, पहले कशेरुक से शुरू होने वाले रोंगेर का उपयोग करके हड्डी को सावधानी से काटना शुरू करें। एक बार सेरिबैलम उजागर होने के बाद, अस्थायी हड्डियों को ध्यान से हटा दें और पार्श्विका और ललाट लोब को उजागर करें।
      2. इस बिंदु पर, फुटप्लेट से पेडस्टल को पेंच करें और फुटप्लेट के पैरों को प्लर्स से काट दें। इम्प्लांट सिस्टम को हड्डी से मुक्त करने के लिए खोपड़ी में केबल प्रवेश के पास की हड्डी को हटा दें, प्रत्यारोपण को ड्यूरा मैटर निकास से बाहर खींचने के बिना।
      3. यदि इम्प्लांट केबल हड्डी में एम्बेडेड हैं, तो केबल को निकास के जितना संभव हो उतना करीब काटें। एक बार जब मस्तिष्क की पर्याप्त सतह उजागर हो जाती है, तो छोटी कैंची का उपयोग करके मध्य रेखा के बाद ड्यूरा को सावधानीपूर्वक काट लें।
      4. ड्यूरा मैटर निकास से इम्प्लांट केबलों को मुक्त करें। मस्तिष्क पर इम्प्लांट प्लेसमेंट से तस्वीरें लें। फिर, मस्तिष्क को नीचे की कपाल नसों से अलग करने के लिए एक छोटे चम्मच का उपयोग करें। ध्यान से मस्तिष्क निकालें। मस्तिष्क से प्रत्यारोपण को हटा दें।
    4. मस्तिष्क का पोस्टफिक्सेशन: छिड़काव की गुणवत्ता के आधार पर, निकाले गए मस्तिष्क को 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 4% पीएफए में 24 घंटे के लिए फिर से पोस्टफिक्स करें। मस्तिष्क के कट जाने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम पीबीएस में रखें।
    5. ब्रेन कट: रेजर ब्लेड का उपयोग करके दो गोलार्धों को अलग करें। फिर, मस्तिष्क को चार अलग-अलग टुकड़ों में ऑर्थोगोनल रूप से काटें। प्रत्यारोपित क्षेत्र और एक नियंत्रण क्षेत्र वाले दो ब्लॉक प्राप्त करने के लिए प्रत्यारोपित क्षेत्र को आधे में काट लें। यदि अधिक नियंत्रण स्लाइड ्स की आवश्यकता हो तो अन्य दो ब्लॉक संग्रहीत करें।
    6. मस्तिष्क क्रायोप्रोटेक्शन और ठंड: मस्तिष्क के ब्लॉक को पहले 15% सुक्रोज के घोल में स्थानांतरित करें और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज को तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि मस्तिष्क डूब न जाए और संतुलन तक न पहुंच जाए। फिर, ऊतक फ्रीजिंग सिस्टम में -55 डिग्री सेल्सियस पर आइसोपेंटेन में ऊतक को फ्रीज करें।

8. हिस्टोलॉजी

  1. ऊतक खंडन;
    1. क्रायोस्टैट: जमे हुए मस्तिष्क को क्रायोस्टेट में रखें और पूर्ण खंड प्राप्त होने तक ट्रिम करें। फिर, मस्तिष्क को 40 μm वर्गों में स्लाइस करें और अच्छी तरह से प्लेटों में 0.1 M PBS में तीन के समूहों में डुबोएं। प्लेटों के क्रम को ध्यान से नोट करें।
    2. अनुभाग चयन: विश्लेषण करने के लिए ज़ोन के आधार पर अनुभागों का चयन करें (प्रत्यारोपित क्षेत्र या नियंत्रण क्षेत्र). अनुभागों को क्रमिक रूप से अच्छी तरह से प्लेटों से बाहर निकालें, क्षति के लिए उनका निरीक्षण करने के लिए एक बारीक ब्रश का उपयोग करें। उन्हें और धुंधला करने के लिए 0.1 एम पीबीएस से भरे नए कुएं की प्लेटों में रखें।
  2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री।
    1. तैयारी: 15 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन एक्स / पीबीएस में अनुभागों को इनक्यूबेट करें, इसके बाद कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए)/पीबीएस लें।
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी: आरटी पर 48 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतकों को इनक्यूबेट करें (एंटी-जीएफएपी, चूहा, 1/300 पर पतला; एंटी आईबीए 1, खरगोश, 1/400 पर पतला; एंटी-न्यून, गिनीपिग, 1/1,000 पर पतला; सभी 1% बीएसए / पीबीएस में)। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ अच्छी तरह से प्लेटों को कवर करें।
    3. धोना: 0.1 एम पीबीएस के साथ कुओं को 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
    4. द्वितीयक एंटीबॉडी: आरटी पर 2 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ऊतकों को इनक्यूबेट करें (एलेक्सा फ्लुर 488, एलेक्सा फ्लुर 647, एलेक्सा फ्लुर 555; सभी 1% बीएसए / पीबीएस में 1/400 पर पतला)।
    5. DAPI (4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल): 15 मिनट के लिए DAPI के साथ ऊतकों को इनक्यूबेट करें (1% बीएसए / पीबीएस में 1/1,000)।
    6. धोना: 0.1 एम पीबीएस के साथ कुओं को 15 मिनट के लिए पांच बार धोएं।
    7. माउंटिंग: माउंटिंग मीडिया और कवरस्लिप का उपयोग करके स्लाइड्स को माउंट करें। स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में अंधेरे में रखें।
  3. इमेजिंग
    1. संपूर्ण स्लाइड इमेजिंग: तीन अलग-अलग तरंग दैर्ध्य (640 एनएम, 560 एनएम, 485 एनएम) पर स्लाइड स्कैनर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 10x आवर्धन (उद्देश्य कार्य दूरी मान = 3,100 μm) पर स्लाइड की छवि बनाएं। सभी शक्ति और लाभ की जानकारी पूरक फ़ाइल 2 में पाई जा सकती है।
    2. माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग: चार तरंग दैर्ध्य (एलेक्सा फ्लुर 647, डीएपीआई, साइ 3, ईजीएफपी) पर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 20x आवर्धन (एपोक्रोमैट 20x / 0.8 एम 27) पर रुचि के क्षेत्र की छवि बनाएं। सभी शक्ति और लाभ की जानकारी पूरक फ़ाइल 3 में पाई जा सकती है।

Representative Results

प्लेसमेंट (चित्रा 3 ए) और उपकरणों की कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए, पेडस्टल प्लेसमेंट के बाद इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग इंट्राऑपरेटिव रूप से की जाती है। बेसलाइन सिग्नल को पहले बेसल गतिविधि के नियंत्रण के रूप में बिना किसी उत्तेजना के 2 मिनट से अधिक प्राप्त किया जाता है। दूसरे, जानवर को विभिन्न आवृत्तियों (500-20,000 हर्ट्ज) पर एक स्वर विस्फोट के साथ ध्वनिक रूप से उत्तेजित किया जाता है, और कच्चे डेटा को उत्तेजना अवधि में सरणी में श्रवण उत्पन्न क्षमता को मैप करने के लिए औसत किया जाता है (उदाहरण के लिए, बेसलाइन की तुलना में 800 हर्ट्ज पर; चित्रा 3 बी)। यहां दिखाया गया डेटा असंसाधित है, लेकिन यदि बहुत अधिक शोर मौजूद है, तो नॉच और बैंडपास फिल्टर लागू किए जा सकते हैं। सर्जिकल थिएटर में शोर के विशिष्ट स्रोतों में हीटिंग पैड, प्लग ्ड ड्रिल, और सक्शन या कॉटराइजर (दूसरों के बीच) शामिल हैं जिन्हें अधिग्रहण से पहले हटा दिया जाना चाहिए। जागृत रिकॉर्डिंग में, सिर के चारों ओर बड़ी मांसपेशियों की गति, जैसे कि चबाना, क्लीनर डेटा सेट के लिए टाला जाना चाहिए।

यह प्रोटोकॉल हर रिकॉर्डिंग समय बिंदु पर लागू किया गया था, और समय के साथ एकल चैनल के लिए संकेतों की तुलना की जा सकती है। एक उदाहरण चित्रा 3 सी में चित्रित किया गया है, जो प्रतिक्रिया की मजबूती और विकास को दर्शाता है। प्रयोग के समय के दौरान प्रत्येक संपर्क की रिकॉर्डिंग क्षमता का मूल्यांकन हर समय बिंदु (चित्रा 3 डी) पर बेसलाइन सिग्नल के मानक विचलन की गणना करके किया जा सकता है। इस अध्ययन में, रिकॉर्डिंग अवधि (यानी, 2 मिनट) की सीमित अवधि के कारण कुछ परिवर्तनशीलता के बावजूद, सिग्नल-टू-शोर अनुपात दिन 0 और महीने 6 के बीच कम हो गया और बस गया। इसे आगे इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा से सहसंबद्ध किया जा सकता है।

विवो इमेजिंग मस्तिष्क की स्थिति और प्रत्यारोपण की स्थिति का आकलन करने के लिए पोस्टऑपरेटिव रूप से किया जाता है। प्रोटोकॉल के पहले पुनरावृत्ति में, कोई इंट्राऑपरेटिव एक्स-रे नहीं किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक मुड़ा हुआ डिवाइस था, जैसा कि टी 1-भारित एमआरआई अनुक्रम पर चित्रा 4 ए में दिखाई देता है (इसके अलावा चित्रा 4 बी देखें)। जानवर में कोई व्यवहार परिवर्तन नहीं देखा गया था, लेकिन समय के साथ, इसके परिणामस्वरूप इम्प्लांट स्थान के आसपास मस्तिष्क के मैक्रोस्कोपिक संपीड़न के कारण डिवाइस के चारों ओर एक फाइब्रोटिक एनकैप्सुलेशन हुआ (चित्रा 4 सी)। इस अनुभव के बाद, इंट्राऑपरेटिव एक्स-रे पेश किया गया था, जैसा कि चित्रा 4 डी में दिखाया गया है, जहां रेडियोपारदर्शी मार्कर (इनसेट चित्रा 4 डी में प्रत्यारोपण पर दिखाई देने वाली काली सलाखों) को अच्छी तरह से तैनात दिखाया गया है। मस्तिष्क की सतह तब बरकरार है, जैसा कि चित्रा 4 ई में पोस्टऑपरेटिव एमआरआई में देखा जा सकता है। कुल मिलाकर, इस इम्प्लांट और पेडस्टल सिस्टम के साथ, पूरे मस्तिष्क की इमेजिंग संभव है। कोरोनल विमानों में विभिन्न अनुक्रम शारीरिक संरचनाओं को देखने में सक्षम होते हैं (चित्रा 4 एफ, जी; टी 1 और टी 2 एमआरआई अनुक्रम) या प्रत्यारोपण के चारों ओर तरल और रक्त की उपस्थिति (चित्रा 4 एच; टीएसई-भारित एमआरआई अनुक्रम)। पेडस्टल सिस्टम टाइटेनियम स्क्रू के चारों ओर कुछ छोटे काले-विपरीत रिक्तियों को छोड़कर लगभग कोई कलाकृतियां नहीं बनाता है (चित्रा 4 जी देखें)। इसके अतिरिक्त, नैदानिक इलेक्ट्रोड का उपयोग इस अध्ययन में तुलनित्र के रूप में किया जाता है, लेकिन हीटिंग और सुरक्षा चिंताओं के कारण एमआरआई में चित्रित नहीं किया जा सकता है। इसलिए, इन जानवरों पर सीटी स्कैन प्राप्त किए जाते हैं, जैसा कि चित्रा 4 आई में दिखाया गया है। इलेक्ट्रोड स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, और पेडस्टल सिस्टम छवि की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं कर रहा है।

आरोपण अवधि के बाद, जानवर को संक्रमित किया जाता है, और मस्तिष्क निकाला जाता है। इस अध्ययन में, भड़काऊ प्रतिक्रिया का विश्लेषण प्रत्येक गोलार्ध पर स्वतंत्र रूप से किया जाता है। सेक्शनिंग से पहले ऊतक तैयारी के लिए मस्तिष्क को आधे में काटना आसान है, और इसका लाभ यह है कि वर्गों को मानक माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर रखा जा सकता है। मस्तिष्क के नमूने का एक उदाहरण ब्लॉक में काटने से पहले (चित्रा 5 ए) और बाद में (चित्रा 5 बी) दिखाया गया है। इम्प्लांट की रूपरेखा स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही है और इसने मस्तिष्क में एक छोटी सी सेंध लगा दी है। समानांतर विमानों में काटने से, ऊतक को पहले से ही क्रायोस्टैट के साथ संरेखित किया जाता है, और वर्गों को ट्रिमिंग के लिए ऊतक हानि के बिना आसानी से काटा जा सकता है (चित्रा 5 सी)। धुंधला होने के बाद, पूरे ऊतक अनुभाग को चित्रित किया जाता है (चित्रा 5 डी), जहां उदाहरण के लिए, न्यूरॉन परत स्पष्ट रूप से विस्तार से दिखाई देती है (देखें न्यून मार्कर)। पूरे खंड नाजुक होते हैं और कभी-कभी ऊतक के कुछ नुकसान का कारण बन सकते हैं ( चित्रा 5 डी का निचला भाग देखें), लेकिन रुचि का क्षेत्र बरकरार है। करीब से देखने पर, 40x पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा सक्षम, कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से परिभाषित किया जाता है और भड़काऊ मार्करों की ठीक जांच को सक्षम किया जाता है, उदाहरण के लिए (चित्रा 5 ई)। नियंत्रण और प्रत्यारोपित गोलार्धों के बीच सूजन की तुलना करने के लिए आगे मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है। चित्रा 6 प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड के विद्युत रासायनिक लक्षण वर्णन को दर्शाता है। प्रतिबाधा मापांक और चरण के साथ नरम इलेक्ट्रोड सरणी की इन विट्रो इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी को चित्र 6 ए में दिखाया गया है और प्रत्यारोपण के 6 महीने में 1 किलोहर्ट्ज पर प्रतिबाधा मापांक चित्रा 6 बी में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्र 1: प्रयोग का योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मस्तिष्क पर नरम ईसीओजी का न्यूनतम इनवेसिव आरोपण। (ए) ब्रेग्मा के संकेत के साथ खोपड़ी तक सर्जिकल पहुंच। (बी) दिखाई देने वाले ड्यूरा मेटर के साथ द्विपक्षीय क्रैनियोटॉमी। (सी) पहले गोलार्ध पर स्लिट ड्यूरोटॉमी। (घ) नरम ईसीओजी और ड्यूरा मैटर बंद करने का सबड्यूरल आरोपण। (ई) दूसरे गोलार्ध पर स्लिट ड्यूरोटॉमी। टाइटेनियम पुलों का उपयोग करके पहले गोलार्ध पर हड्डी फ्लैप निर्धारण। (च) दूसरे गोलार्द्ध पर नरम ईसीओजी का आरोपण और ड्यूरा मेटर बंद होना। (जी) दूसरे गोलार्ध पर हड्डी फ्लैप निर्धारण। (एच) खोपड़ी पर फुटप्लेट पोजिशनिंग। (i) फुटप्लेट पर पेडस्टल निर्धारण। (जे) पेडस्टल बेस के आसपास त्वचा बंद होना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: श्रवण क्षमता की रिकॉर्डिंग ने क्षमता पैदा की । (ए) टेम्पोरल लोब की सतह पर इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट का योजनाबद्ध। (बी) बेसलाइन गतिविधि (ग्रे निशान) और श्रवण के प्रतिनिधि मानचित्रण ने 800 हर्ट्ज टोन बर्स्ट उत्तेजना (बैंगनी ट्रेस) के जवाब में क्षमता पैदा की। प्रत्येक औसत नरम ईसीओजी सरणी पर एक चैनल से मेल खाता है। ध्वनि उत्तेजना से एनालॉग इनपुट सिग्नल पर औसत ट्रिगर होता है। "ऑन" और "ऑफ" ध्वनिक उत्तेजना अवधि नीचे बाईं ओर एक चैनल पर नोट की जाती है। (सी) ध्वनिक उत्तेजना के बाद एकल चैनल प्रतिक्रिया के समय (दिन 0, महीने 2, और महीने 5) के साथ विकास, बेसलाइन सिग्नल की तुलना में जब कोई उत्तेजना प्रस्तुत नहीं की जाती है (ग्रे)। ध्वनि उत्तेजना से एनालॉग इनपुट सिग्नल पर औसत ट्रिगर होता है। "ऑन" और "ऑफ" उत्तेजना अवधि नीचे नोट की जाती है। "ओएन" उत्तेजना की उत्पन्न क्षमता तीरों के साथ चिह्नित है। (डी) बेसलाइन रिकॉर्डिंग के प्रति समय बिंदु प्रति चैनल (रंगीन बिंदु) मानक विचलन। माध्य मूल्यों को बोल्ड नीले रंग में दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मस्तिष्क और प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड की विवो इमेजिंग में। (ए) कोरोनल विमान में पोस्टऑपरेटिव टी 1-भारित एमआरआई। एक तीर एक मुड़ा हुआ प्रत्यारोपण इंगित करता है। (बी) ए का आवर्धित भाग, जहां इम्प्लांट की तह मस्तिष्क में सेंध लगाती है। (सी) 1 महीने के प्रत्यारोपण पर टी 1-भारित एमआरआई, सी के समान स्थान पर मस्तिष्क के फाइब्रोटिक एनकैप्सुलेशन के कारण मस्तिष्क के संपीड़न को दर्शाता है। (डी) इंटरऑपरेटिव प्लेन एक्स-रे इम्प्लांट प्लेसमेंट को सत्यापित करता है और कोई फोल्डिंग नहीं करता है, जैसा कि रेडियोपारदर्शी मार्कर प्लेसमेंट द्वारा देखा गया है। इनसेट: रेडियोपारदर्शी मार्कर के साथ प्रत्यारोपण की तस्वीर दिखाई देती है। (ई) इष्टतम प्रत्यारोपण प्लेसमेंट के साथ कोरोनल विमान में पोस्टऑपरेटिव टी 1-भारित एमआरआई। (एफ) 1 महीने के प्रत्यारोपण पर टी 1-भारित एमआरआई। (जी) 1 महीने के प्रत्यारोपण पर टी 2-भारित एमआरआई। एक तीर खोपड़ी पर पैर की प्लेट को पकड़ने वाले टाइटेनियम स्क्रू से इमेजिंग आर्टिफैक्ट दिखाता है। (एच) 1 महीने के प्रत्यारोपण पर टीएसई-भारित एमआरआई। (i) नैदानिक इलेक्ट्रोड के साथ प्रत्यारोपित पशु का सीटी स्कैन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: दीर्घकालिक आरोपण के बाद मस्तिष्क का हिस्टोलॉजी विश्लेषण। (ए) एक खोजे हुए और संक्रमित मस्तिष्क-बाएं गोलार्ध की तस्वीर। (बी) ठंड के चरण से पहले ब्लॉक में संक्रमित मस्तिष्क कट। (सी) क्रायोस्टैट पर पूरे ब्लॉक सेक्शनिंग सेटअप की तस्वीर; पूरे "प्री-कट ब्लॉक" को वर्गीकृत किया जा सकता है। (डी) पूरे गोलार्ध की इम्यूनोस्टेनिंग इमेजिंग (स्लाइड स्कैनर, 20x उद्देश्य) और (ई) कॉर्टेक्स की पहली परतों पर ज़ूमिंग (कॉन्फोकल इमेजिंग, 40x उद्देश्य) ग्लियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स को दिखाते हुए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड का विद्युत रासायनिक लक्षण वर्णन । (ए) प्रतिबाधा मापांक (ऊपर) और चरण (नीचे) के साथ नरम इलेक्ट्रोड सरणी (प्रत्येक चैनल के लिए छोटी ग्रे लाइनें, लाल रंग में औसत) की इन विट्रो इलेक्ट्रोकेमिकल प्रतिबाधा स्पेक्ट्रोस्कोपी। (बी) आरोपण के 6 महीनों में 1 किलोहर्ट्ज पर प्रतिबाधा मापांक का विकास (नीले रंग में मतलब; ग्रे लाइनें अलग-अलग चैनल हैं; इन विट्रो माप लाल रंग में संदर्भ के रूप में दिया गया है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: एमआरआई-संगत पेडस्टल। (ए) नरम इलेक्ट्रोड सरणी तक पहुंचने के लिए क्रोनिक एमआरआई-संगत ट्रांसडर्मल कनेक्शन सिस्टम (पेडस्टल)। (बी) खोपड़ी लंगर डालने के लिए फुटप्लेट पर लगाए गए इलेक्ट्रोड के साथ पेडस्टल। इनसेट: फुटप्लेट का विवरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: मस्तिष्क के इष्टतम छिड़काव के लिए सर्जिकल पहुंच। (ए) त्वचा का कट और कैरोटिड धमनी और जुगुलर नस के स्थान तक पहुंच। (बी) रक्त वाहिकाओं के आसपास ऊतक का विच्छेदन। (C, D) कैरोटिड धमनी और जुगुलर नस के आसपास ऊतक की पहचान और विच्छेदन। (ई) नीचे ऊतक से कैरोटिड धमनी का अलगाव। (एफ) नीचे ऊतक से जुगुलर नस का अलगाव। (जी) कैरोटिड धमनी (सीवन 1 और सीवन 2) और जुगुलर नस (सीवन 3) के चारों ओर सीवन तार प्लेसमेंट। (एच) वाहिका के उद्घाटन के दौरान रक्तस्राव से बचने के लिए कैरोटिड धमनी (हृदय पक्ष) के आधार पर सीवन 3 को बंद करना। (I) एच से विपरीत दिशा में कैरोटिड धमनी का क्लैंपिंग। (जे) कैरोटिड धमनी का सेक्शनिंग। (के) जे से उद्घाटन में कैथेटर डाला गया। इनसेट: एक सिरिंज से कैथेटर टिप तक सलाइन फ्लश के साथ प्राइमेड कैथेटर। (एल) कैथेटर को जगह पर और धमनी के साथ बनाए रखने के लिए सीवन 2 को बंद करना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: टी 1- (पृष्ठ 1-2), टी 2- (पृष्ठ (3-4) और टीएसई-भारित (पृष्ठ 5-6) एमआरआई अनुक्रमों के लिए पैरामीटर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: सना हुआ मस्तिष्क स्लाइस की पूरी स्लाइड इमेजिंग के लिए स्लाइड स्कैनर के लिए मेटाडेटा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: दाग वाले मस्तिष्क स्लाइस के आवर्धित खंड के कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए मेटाडेटा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हम यहां नरम ईसीओजी सरणियों के दीर्घकालिक आरोपण और मूल्यांकन के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। इस अध्ययन में, हमने टेम्पोरल लोब (यहां, श्रवण कॉर्टेक्स को लक्षित करते हुए) पर कार्यात्मक इलेक्ट्रोड ग्रिड के द्विपक्षीय आरोपण के लिए एक सुसंगत, न्यूनतम इनवेसिव सर्जिकल दृष्टिकोण तैयार किया है। हमने पहले अध्ययन (6 महीने) के समय के दौरान सफलतापूर्वक विकसित क्षमता ओं को रिकॉर्ड करके और इलेक्ट्रोड के विद्युत रासायनिक गुणों को ट्रैक करके ग्रिड की कार्यक्षमता का मूल्यांकन किया ( चित्रा 6 देखें)। दूसरे, हमने एमआरआई का उपयोग करके और पूरी तरह से एमआरआई-संगत प्रणाली स्थापित करके और ऊतक संग्रह और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल डिजाइन करके पोस्टमॉर्टम में ग्रिड की जैव सुरक्षा का आकलन किया।

आक्रामकता को कम करने के लिए, हमने क्रैनियोटॉमी विंडो के आकार को अनुकूलित किया। टेम्पोरल लोब पर स्थित श्रवण कॉर्टेक्स तक पहुंचने के लिए और अस्थायी मांसपेशियों को बचाने से बचने के लिए, हमने ड्यूरा के नीचे इम्प्लांट को स्लाइड करने की एक तकनीक विकसित की है। यह तकनीक उजागर मस्तिष्क की सतह को काफी कम करने और अभी भी दूर-दूर के लक्ष्यों तक पहुंचने की अनुमति देती है। हालांकि इस प्रकार का आरोपण अंधा लग सकता है, इंट्राऑपरेटिव प्लेन एक्स-रे में देखे गए उपकरणों पर रेडियोपारदर्शी मार्करों का कार्यान्वयन स्थिति के सत्यापन की अनुमति देता है, और यह सुनिश्चित करता है कि सरणी ड्यूरा मैटर के नीचे मुड़ी हुई नहीं है। सबड्यूरल स्लाइडिंग हमारे द्वारा किए गए अधिकांश पुनरावृत्तियों में सुरक्षित साबित हुई है। इसके अतिरिक्त, एक स्लिट दृष्टिकोण में ड्यूरोटॉमी क्रैनियोटॉमी के खुले होने के दौरान मस्तिष्क के उभार को कम करता है और कृत्रिम ड्यूरा मैटर जैसी अतिरिक्त सामग्री की आवश्यकता के बिना प्रत्यारोपण के चारों ओर बंद करने की सुविधा प्रदान करता है, जो भड़काऊ प्रतिक्रिया को पूर्वाग्रह कर सकता है। अंत में, इस सर्जिकल दृष्टिकोण की ताकत विभिन्न कॉर्टिकल क्षेत्रों में बदलने की क्षमता है। निर्देशांक, क्रैनियोटॉमी स्थिति और डिवाइस आकार के साथ खेलना, जिसे सभी समायोजित किया जा सकता है, इस विधि को कॉर्टेक्स क्षेत्र के अधिकांश को लक्षित करने में सक्षम बनाता है।

यहां प्रस्तुत सर्जिकल विधि, समय के साथ बायोइंटीग्रेशन के कार्यात्मक मूल्यांकन और जांच के साथ, इस रिपोर्ट में उपयोग की जाने वाली नरम इलेक्ट्रोड तकनीक तक सीमित नहीं है। मानव अनुवाद के लिए विकसित किए जा रहे अन्य सबड्यूरल इलेक्ट्रोड का मूल्यांकन उसी प्रोटोकॉल के साथ किया जा सकता है। इस विधि की ताकत इस तथ्य पर निर्भर करती है कि अधिकांश टुकड़े, जैसे केबल और पेडस्टल, मॉड्यूलर, व्यक्तिगत हैं, और परीक्षण के तहत विशिष्ट डिवाइस के लिए अनुकूलित किए जा सकते हैं। इसके अतिरिक्त, इंट्राकॉर्टिकल या डीप पेनिट्रेटिंग प्रोब का उपयोग सबड्यूरल इलेक्ट्रोड के बजाय या संयोजन में भी किया जा सकता है, क्योंकि इसके लिए केवल क्रैनियोटॉमी और ड्यूरोटॉमी ज्यामिति को समायोजित करने की आवश्यकता होती है। दीर्घकालिक परिणामों की तुलना उनके नैदानिक समकक्षों से की जा सकती है, जैसा कि हमने यहां किया है।

प्रस्तुत विधि की प्रमुख सीमाओं में से एक मिनीपिग्स में खोपड़ी साइनस की उपस्थिति है, जो पहले वर्ष12 के दौरान विकसित होती है। उस संबंध में, ध्यान में रखने के लिए महत्वपूर्ण पहलुओं में आरोपण की उम्र और जानवर का आकार भी शामिल है। वयस्क खोपड़ी में क्रैनियोटॉमी करने से साइनस की अखंडता टूट जाती है और पुरानी सेटिंग्स में बड़े संक्रमण का उच्च जोखिम होता है। इस तरह के साइनस प्लेन एक्स-रे और सीटी स्कैन में प्रीऑपरेटिव रूप से दिखाई देते हैं। दूसरी ओर, एक जानवर में बहुत जल्दी क्रोनिक प्रत्यारोपण करना, जो बहुत छोटा है, भी इष्टतम नहीं है जब खोपड़ी बड़े पैमाने पर विकास और रीमॉडेलिंग से गुजर रही है। हमने अनुमान लगाया कि सर्जरी के बाद ये "खोपड़ी आंदोलन" प्रत्यारोपण को स्थानांतरित करने और मोड़ने का कारण बन सकते हैं, जो अंततः प्रयोग के लिए हानिकारक है। हमने यहां पाया है कि आरोपण के समय लगभग 5-6 महीने (और 8 किलोग्राम) के गौटिंगेन मिनीपिग्स को सबसे अच्छा परिणाम देना चाहिए।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए प्रत्यारोपित ईसीओजी के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए, हमने श्रवण इवोकेटेड पोटेंशियल (एईपी) रिकॉर्डिंग के लिए एक रैपिड प्रोटोकॉल स्थापित किया है जिसका उपयोग स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों और बेहोश करने की क्रिया के तहत किया जा सकता है। इसमें कुछ मिनटों के दौरान विशिष्ट आवृत्तियों पर ध्वनिक स्वर फटने की एक श्रृंखला प्रस्तुत करना शामिल है। इस तरह के प्रोटोकॉल का लाभ यह तथ्य है कि इसे जांच की गई आवृत्तियों की संख्या को कम करके रिकॉर्डिंग की उपलब्ध लंबाई के लिए ट्यून किया जा सकता है। संज्ञाहरण के तहत कॉर्टिकल संकेतों को रिकॉर्ड करते समय एक चुनौती यह है कि डेटा का विश्लेषण और तुलना करते समय जानवर की चेतना के स्तर को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

छिड़काव के लिए प्रोटोकॉल को निकाले गए मस्तिष्क की गुणवत्ता के अवलोकन द्वारा समय के साथ समायोजित किया गया था। दरअसल, हमें केवल कैरोटिड धमनी को कैथेटर करना आसान लगा, न कि जुगुलर नस। प्रारंभ में, साहित्य उन तरीकों को प्रस्तुत करता है जहां जुगुलर नस को अपशिष्टनिकालने के लिए कैथेटरीकृत किया जाता है। व्यावहारिक रूप से, यह मस्तिष्क से बाहर प्रवाह को सीमित करता है और रक्त के खराब निष्कर्षण और छिड़काव की समग्र गुणवत्ता की ओर जाता है। जुगुलर नस को काटने और तरल को एक बड़े कंटेनर में भागने के लिए छोड़ कर जहां जानवर झूठ बोलता है, छिड़काव की दक्षता बढ़ जाती है।

हमने एक मजबूत ऊतक तैयारी विधि विकसित की है जो सूजन अनुरेखण के लिए नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के साथ काम करती है। हमने व्यावहारिक कारणों से दो गोलार्धों को अलग किया है, क्योंकि सुअर का आधा मस्तिष्क मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर फिट बैठता है और इस प्रकार हिस्टोलॉजी प्रयोगशालाओं में उपलब्ध अधिकांश इमेजिंग उपकरणों के साथ संगत है। मस्तिष्क को ब्लॉकों में काटकर, पूरे मस्तिष्क को काटने या ऊतक के व्यापक हिस्सों को ट्रिम करने की आवश्यकता के बिना रुचि के क्षेत्र तक सीधी पहुंच संभव हो जाती है। 40 μm पर मस्तिष्क स्लाइस को मानक अच्छी प्लेटों में पूल किया जा सकता है और अन्य प्रजातियों के इम्यूनोस्टेनिंग से प्रमुख प्रोटोकॉल परिवर्तन के बिना एक मुक्त-फ्लोटिंग फैशन में दाग दिया जा सकता है। पूर्ण मस्तिष्क इम्यूनोस्टेनिंग को भी कल्पना की जा सकती है, उदाहरण के लिए, स्पष्टता विधि21।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल, जो व्यक्तिगत प्रत्यारोपण डिजाइन को आरोपण, कार्यक्षमता अनुवर्ती और जैव सुरक्षा मूल्यांकन को कवर करता है, मजबूत और सुसंगत है। हमने यहां श्रवण प्रणाली का अध्ययन करने के लिए इसकी व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया, लेकिन इसे अन्य शारीरिक कार्यों का परीक्षण करने के लिए बदला जा सकता है। इसके अलावा, हमारी विधि की ताकत इस तथ्य में रहती है कि यह मिनीपिग्स तक ही सीमित नहीं है, बल्कि भेड़, बकरियों या गैर-मानव प्राइमेट्स जैसी अन्य प्रजातियों के लिए पूरी तरह से हस्तांतरणीय है। कुछ हद तक, इसे आसानी से चूहों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Disclosures

एफ.एफ. और एस.पी.एल. सॉफ्ट इलेक्ट्रोड सरणियों को विकसित करने वाले न्यूरोसॉफ्ट बायोइलेक्ट्रॉनिक्स एसए के सह-संस्थापक और शेयरधारक हैं।

Acknowledgments

लेखक बर्टारेली फाउंडेशन और एसएनएसएफ सिनेर्जिया अनुदान CRSII5_183519 से वित्तीय सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं। लेखक हिस्टोलॉजी के लिए स्टेनिंग प्रोटोकॉल विकसित करने में उनकी मदद के लिए ईपीएफएल की कैटिया गैलन, निर्माण प्रक्रियाओं में मदद के लिए जिनेवा में वायस सेंटर फॉर बायो एंड न्यूरोइंजीनियरिंग के न्यूरल माइक्रोसिस्टम्स प्लेटफॉर्म के कर्मचारियों, पशु देखभाल के लिए जिनेवा विश्वविद्यालय (यूएनआईजीई) में यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (सीएमयू) में पशु मंच के कर्मचारियों को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। जिनेवा विश्वविद्यालय में सेंटर फॉर बायोमेडिकल इमेजिंग (सीआईबीएम) के टीम के सदस्य (जूलियन सोंगियन, फ्रैंकोइस लाज़ेरास, और रेयर सलोमिर), यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल जिनेवा (एचयूजी) में पैथोलॉजी विभाग के स्टाफ सदस्य (सामी श्रांज, फ्रांसेस्का वर्सिली, मिनीपिग (जॉन डायपर, जेवियर बेलिन, फैबिएन फोंटाओ और वालिद हैब्रे) के सर्जिकल सहायता, और पोस्टऑपरेटिव प्रबंधन। रूबेन सोटो, और कोरेलिन एगर), और यूनिवर्सिटी ग्रेनोबल्स-एल्प्स से ब्लेज़ यवर्ट क्रोनिक मिनीपिग प्रयोगों पर अपने इनपुट और आदान-प्रदान के लिए। लेखक न्यूरोसॉफ्ट बायोइलेक्ट्रॉनिक्स एसए के कर्मचारियों की मदद को स्वीकार करना चाहते हैं, निर्माण प्रक्रिया में उनकी मदद के लिए और मिनीपिग प्रयोगों (बेनोइट हगुएट और मार्गक्स रूलेट) में उनकी मदद के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bone drill BBraun Elan 4 with  GA861 handpiece
Bone drill bit BBraun Neurocutter GP204R
Bonewax Ethicon W31G
Catheter Venisystems Abbocath 14G
Confocal Microscope Zeiss LSM 880
Cryostat Leica CM1950
Gelfoam Pfizer Gelfoam
Insert speakers Etymotic Etymotic ER2 insert Earphones
Multimeter Fluke Fluke 1700
Oscilloscope Tektronix MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope
Perfusion pump Shenzen LabS3/UD15
Potentiostat Gamry Instruments Reference 600
Primary Antibody Anti-GFAP Thermofischer Anti-GFAP, Rat, # 13-0300
Primary Antibody Anti-Iba1 Fujifilm Anti Iba1, Rabbit, 019-19741
Primary Antibody Anti-NeuN SigmaAldrich Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90
Pulse Generator AM Systems Model 2100 Isolated Pulse Stimulator
Recording headstage Multichannel systems W2100-HS32
Recording system Multichannel systems W2100
Screwdriver Medtronic Handle: 001201, Shaft: 8001205
Secondary Antibody 488 Thermofischer Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, # A-11006
Secondary Antibody 555 Thermofischer Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, # A-21435
Secondary Antibody 647 Thermofischer Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, # A-21245
Slide Scanner Olympus VS120
Snapfrost Excilone Excilone Snapfrost
Stab knife Fine Science Tools 10316-14
Suture wire dermal Ethicon Vicryl 2-0
Suture wire dura mater Ethicon Mersilk 5-0 
Suture wire for catheter Ethicon Vycril 3-0 without needle
Suture wire for lifting dura Ethicon Prolene 6-0 with BV-1 needle
Suture wire subcutaneous Ethicon Vicryl 4-0
Titanium bridge Medtronic TiMesh 015-2001-4 Cut out the required size
Titanium screws Medtronic 9001635, 9001640
X-ray system GE GE OEC 9800 Plus C-Arm

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References

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Fallegger, F., Trouillet, A., Lacour, S. P. Subdural Soft Electrocorticography (ECoG) Array Implantation and Long-Term Cortical Recording in Minipigs. J. Vis. Exp. (193), e64997, doi:10.3791/64997 (2023).

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