Subdural myk elektrokortikografi (ECoG) arrayimplantasjon og langvarig kortikal registrering hos minigriser

Summary

Her presenterer vi en metode for langsiktig ytelse og sikkerhetsvurdering av myke subdurale elektrodearrays i en minigrismodell, som beskriver kirurgisk metode og verktøy, postoperativ magnetisk resonansavbildning, elektrofysiologi av hørselsbarken, implantatets elektrokjemiske egenskaper og postmortem immunokjemi.

Abstract

Nevrologiske funksjonsnedsettelser og sykdommer kan diagnostiseres eller behandles ved hjelp av elektrokortikografi (ECoG) arrays. Ved medikamentresistent epilepsi bidrar disse til å avgrense den epileptiske regionen til resekter. I langsiktige applikasjoner som hjerne-datamaskingrensesnitt, brukes disse epikortiske elektrodene til å registrere hjernens bevegelsesintensjon, for å kontrollere robotlemmer av lammede pasienter. Dagens stive elektrodegitter svarer imidlertid ikke på behovet for høyoppløselige hjerneopptak og langsiktig biointegrasjon. Nylig har konforme elektroderader blitt foreslått for å oppnå langsiktig implantatstabilitet med høy ytelse. Det er imidlertid nødvendig med prekliniske studier for disse nye implantatteknologiene for å validere deres langsiktige funksjonalitet og sikkerhetsprofil for oversettelse til humane pasienter. I denne sammenheng brukes svinemodeller rutinemessig i utviklingen av medisinsk utstyr på grunn av deres store organstørrelser og enkle dyrehåndtering. Imidlertid er bare noen få hjerneapplikasjoner beskrevet i litteraturen, hovedsakelig på grunn av kirurgiske begrensninger og integrering av implantatsystemet på et levende dyr.

Her rapporterer vi metoden for langtidsimplantasjon (6 måneder) og evaluering av myke ECoG-arrays i minigrismodellen. Studien presenterer først implantatsystemet, som består av en myk mikrofabrikert elektrodegruppe integrert med en magnetisk resonans imaging (MRI) -kompatibel polymer transdermal port som huser instrumenteringskontakter for elektrofysiologiske opptak. Deretter beskriver studien den kirurgiske prosedyren, fra subdural implantasjon til gjenoppretting av dyr. Vi fokuserer på hørselsbarken som et eksempel på et målområde der fremkalte potensialer induseres av akustisk stimulering. Vi beskriver til slutt en datainnsamlingssekvens som inkluderer MR av hele hjernen, implantatelektrokjemisk karakterisering, intraoperativ og fritt bevegelig elektrofysiologi og immunhistokjemifarging av de ekstraherte hjernene.

Denne modellen kan brukes til å undersøke sikkerheten og funksjonen til ny design av kortikale proteser; obligatorisk preklinisk studie for å se for seg oversettelse til menneskelige pasienter.

Introduction

Nevrologiske funksjonsnedsettelser og sykdommer kan diagnostiseres eller behandles ved hjelp av elektrokortikografi (ECoG) arrays. Disse elektrodegitterne er implantert på overflaten av hjernen og tillater opptak eller stimulering av den menneskelige cortex¹. I tilfelle av stoffresistent epilepsi, for eksempel, bidrar de til å avgrense den epileptiske regionen for å resektere². I langsiktige applikasjoner som hjerne-datamaskingrensesnitt, brukes disse epikortikale elektrodene til å registrere hjernens bevegelsesintensjon, for å kontrollere robotlemmer av lammede pasienter³. Imidlertid er nåværende elektrodegitter laget av stive metallblokker innebygd i stive polymere substrater og svarer ikke på behovet for høyoppløselige hjerneopptak og langsiktig subdural biointegrasjon (>30 dager). Snarere skaper de lokale vevsreaksjoner som fører til fibrotisk innkapsling av den implanterte enheten, noe som fører til dårligere ytelse over tid. Nylig har fleksible eller strekkbare elektroderader ved bruk av tynne polymere substrater produsert ved mikrofabrikasjonsteknikker blitt foreslått for å oppnå høy ytelse i langsiktige implantasjoner ved å begrense vevsreaksjonen ^4,5. Det er imidlertid behov for prekliniske studier for disse nye implantatteknologiene for å validere deres langsiktige funksjonalitet og sikkerhetsprofil, slik at oversettelse til menneskelige pasienter kan tenkes. I denne sammenheng brukes minigris- og grisemodeller rutinemessig i utviklingen av enheter i andre medisinske sammenhenger (f.eks. kardiovaskulære, skjelett- eller magesystemer) på grunn av deres store organstørrelser og enkel dyrehåndtering ^6,7,8. Imidlertid er bare noen få applikasjoner rettet mot hjernen for nevrofysiologi beskrevet i litteraturen, hovedsakelig på grunn av kirurgiske tilnærmingsbegrensninger og integrering av implantatsystemet på et levende dyr 9,10,11,12. Disse er ofte ikke kompatible med kronisk implantasjon i levende dyr, da de for eksempel vil kreve utvikling av kompleks maskinvare som implanterbar innebygd elektronikk. I tillegg undersøker de ikke implantatsystemets innflytelse på målvevet, noe som er avgjørende for biosikkerhetsaspektet i translasjonsstudier. Svinemodellen er nær menneskelig anatomi når det gjelder kortikal struktur, skallebein og hudtykkelse¹³. Videre gjør deres evne til å lære atferdsoppgaver dem til en kraftig modell for å undersøke funksjonelle rehabiliteringsstrategier eller sensoriske oppfatninger¹⁴.

Oversettelse av ny teknologi og behandling til mennesker nødvendiggjør vurdering av sikkerhet og effekt, slik det kreves av kompetente medisinske myndigheter. Disse er vanligvis beskrevet i tekniske dokumenter og normer¹⁵, men de krever bare bestått av disse testene og undersøker ikke den faktiske effekten av enhetens implantasjon eller innsamling av andre nyttige data parallelt med sikkerhetsstudien. For en komplett biosikkerhets- og ytelsesstudie på hjernen, presenterer vi her en longitudinell og systematisk samling av hjerneavbildningsdata, elektrofysiologiske målinger, vurdering av elektrokjemiske egenskaper til de implanterte elektrodene og post mortem histologi i en svinemodell. For å oppnå dette må flere aspekter vurderes for å skape en komplett eksperimentell modell: (i) minimal invasiv kirurgisk tilgang for enhetsimplantasjon sammen med en mekanisk stabil transdermal port for tilkobling til elektrodene, (ii) et robust elektrofysiologisk opptaksparadigme som fungerer som ytelsesutgang for de implanterte elektrodene både under anestesi og under fritt bevegelige forhold, (iii) in vivo avbildning (datastyrt tomografi [CT] og/eller magnetisk resonansavbildning [MRI]) på forskjellige tidspunkter for å følge utviklingen av hjernen og implantatet, samt kompatibiliteten til det implanterte systemet med bildeutstyret, og (iv) en vevsforberedelsesrørledning for å trekke ut hjernen for histologisk analyse.

Her rapporterer vi om metoden for langtidsimplantasjon (6 måneder) og evaluering av myke ECoG-arrays i minigrismodellen (vist skjematisk i figur 1). De myke elektrodearrayene ble presentert i våre tidligere rapporter og er laget av tynne silikonmembraner som legger inn elastiske gulltynne filmer brukt som elektriske spor ^16,17. Kontakten med vevet er laget gjennom en blanding av platina nanopartikler innebygd i en silikonmatrise for et mykt og effektivt elektrokjemisk grensesnitt til hjernevevet¹⁸. Implantatene er koblet gjennom en fleksibel kabel tunnelert subduralt gjennom skallen og huden til en transdermal port som huser kontaktene på dyrets hode. Størrelsen og formen på implantatet kan tilpasses i henhold til målet og behovene til studien. De nåværende elektrodestrimlene i denne studien speiler den virkelige størrelsen på de kliniske strimlene. Klinisk tilgjengelige subdurale strimler og rutenett ble brukt som komparatorer med samme tilnærming. Den polymere MR-kompatible transdermale porten er plassert på skallen ved hjelp av et fotplatesystem som forankrer den fast til skallen. Her beskriver vi i detalj den kirurgiske prosedyren, fra subdural implantasjon av begge halvkule til utvinning av dyret. Vi fokuserer på hørselsbarken som et eksempelmålområde, hvor fremkalte potensialer induseres av akustisk stimulering både i bedøvede og fritt bevegelige forhold. På forskjellige tidspunkter avbildes dyrets hjerne i MR (eller CT for de kliniske elektrodene) under anestesi og elektrodenes elektrokjemiske egenskaper måles. Elektrodekarakteriseringsmetoder brukes til å følge utviklingen av implantatet og elektrodevevgrensesnittet (se Schiavone et ^al.19 for flere detaljer). Disse inkluderer kronoamperometri for å undersøke stimuleringsevnen til elektrodekontakten, elektrokjemisk impedansspektroskopi (EIS) som kan indikere utviklingen av de resistive og kapasitive komponentene i elektroden, og interkanalmotstandsmålinger for å undersøke for hermetiske innkapslingsfeil. Til slutt har vi utviklet en vevsekstraksjonsrørledning for å perfusere hjernen etter eutanasi, eksplantere den med elektrodene på plass, seksjonere den og utføre histologisk analyse ved hjelp av forskjellige betennelsesmarkører. Samlet sett vil denne metoden tillate prekliniske studier med robust multimodal datainnsamling for fremtidig klinisk oversettelse av ny teknologi og terapier på hjernen.

Protocol

Kirurgiske og atferdsmessige prosedyrer ble godkjent av den lokale etiske komiteen i samsvar med retningslinjene for stell og bruk av forsøksdyr og godkjent av lokale (kanton Genève) og føderale (sveitsiske) veterinærmyndigheter med autorisasjonsnummer GE11120A. Minigris fra Göttingen (n = 7) ved 2-6 måneders alder (5-8 kg) ble brukt i denne studien.

1. Prekirurgisk planlegging

1. In vitro karakterisering av mykimplantatsystemet
   1. Kronoamperometri: Registrer spenningsfallet ved injeksjon av en bifasisk strømpulsutvikling (dvs. spenningstransienten [VT]) ved hjelp av et oscilloskop koblet parallelt med en pulsgenerator. Koble pulsgeneratoren sekvensielt til hver elektrode og en platinateller i saltoppløsning (fosfatbufret saltvann [PBS] 1x). Se trinn 3.1 for innstillingene.
   2. Elektrokjemisk impedansspektrogram: Mål den elektrokjemiske impedansen ved forskjellige frekvenser ved hjelp av et potensiometer. Koble potensiometeret sekvensielt til hver elektrode ved hjelp av platinatelleren og en Ag / AgCl referanseelektrode i saltoppløsning (PBS 1x). Se trinn 3.2 for innstillingene.
   3. Motstand mellom kanaler: I tørr tilstand måler du likestrømsmotstanden (DC) mellom tilstøtende kanaler ved hjelp av et håndholdt multimeter.
   4. Valg av implantat: Etter de tre målingene nevnt ovenfor, velg implantatet sammen med følgende kriterier: impedans ved 1 kHz under 100 kΩ og ingen interkanalmotstand under 1 MΩ.
2. Sterilisering
   1. Implantatsterilisering: Plasser de valgte implantatene individuelt i steriliseringsposer sammen med en steriliseringsmarkør og forsegle dem. Bruk dobbel emballasje for å sikre sterilitet under operasjonen.
      MERK: I dette tilfellet brukes hydrogenperoksid (H 2 O₂) gasssterilisering på grunn av kort tidssyklus og lav temperatur (55 ° C). Alternativer er etylenoksid (ETO) gass eller autoklavsterilisering, men kompatibilitet med implantatsystemet bør sikres.
   2. Instrumentsterilisering: Plasser de rengjorte instrumentene i doble steriliseringsposer eller sterile instrumentbokser sammen med steriliseringsmarkører. Autoklavsterilisering er vanligst for instrumenter, men_H2O2eller ETO er mulige alternativer.

2. Kirurgisk implantasjon av myke ECoG-arrayer

1. Anestesi
   1. Premedisinering: Isoler dyret og faste det over natten. Injiser en blanding av midazolam med 0,75 mg/kg, atropin ved 0,25 μg/kg og haldol på 0,1 mg/kg intradermalt, og vent til dyret er sedert. Vei dyret før du fortsetter.
   2. Installasjon av intravenøs (IV) bly:
      1. Plasser dyret på operasjonsbordet på en varmepute. Indusere anestesi ved å plassere en ansiktsmaske på dyret, ved bruk av sevofluran på 3% -3,5%.
      2. Plasser elektrokardiogramledninger på magen, en blodmetningssensor på halen og en temperatursensor i neseboret.
      3. Plasser en IV-ledning på en ørevein og bekreft blodtilgang ved hjelp av en sprøyte fylt med saltvann. Sørg for at øynene holdes hydrert ved å bruke salve.
   3. Intubasjon: Injiser en bolus med atrakurium på 0,5 mg/kg, ketamin ved 1 mg/kg og fentanyl ved 1-2 μg/kg. Plasser dyret på ryggen for intubering. Sett inn et 4,5 mm rør.
   4. Medisinering: Etter intubasjon, stopp sevoflurananestesien og installer en propofolinfusjon ved 10 mg/kg/time, fentanyl ved 2 μg/kg/time, atrakurium ved 0,2-0,5 mg/kg/time og saltvann ved 4-7 mg/kg/time. Start en infusjon av mannitol ved 1 g / kg / t for å redusere hjernens hevelse under operasjonen.
      MERK: Et multimodalt analgesiregime kan brukes hvis anbefalt av den lokale dyreetiske komiteen.
2. Preoperativ røntgen
   1. Plasser dyret på magen i sfinxposisjonen. Fjern midlertidig metallgjenstander i nærheten av hjernen og hodeskallen til dyret (f.eks. temperaturledning i neseboret).
   2. Oppnå en aksial og sagittal plan røntgen med en kontrast av beinet. Plasser en metallgjenstand med kjente dimensjoner i sagittaloppkjøpsfeltet for å tjene som en skala for å måle skalletykkelsen på forsiden og baksiden av hjernen.
   3. Identifiser plasseringen av de frontale bihulene (synlig av hulrom under skallen) og merk den bakre plasseringen på dyrets hode ved hjelp av en permanent markør. Dette vil indikere det lengste punktet hvor eventuell kraniotomi eller skrueplassering kan gjøres i den kirurgiske tilnærmingen beskrevet nedenfor.
3. Aseptisk felt- og hudforberedelse: Barber hele overflaten av hodet utover det kirurgiske feltet. Bruk en steril pute, skrubb hodet grundig med betadin. Deretter plasserer du sterile gardiner på instrumenteringsbordet og på dyret for å avsløre bare det kirurgiske vinduet. Til slutt, skrubb hodet igjen med en steril pute ved hjelp av betadin.
4. Kraniotomi og durotomi
   1. Hudkutt: Snitt huden med en skalpellkniv langs midtlinjen. Separer muskel og periosteum (25 mm lateralt fra bregma på begge sider og 40 mm fremre og bakre for bregma) fra benet ved hjelp av raspatorisk og plasser spredere for å få optimal tilgang for senere boring.
   2. Målinger og merking: Identifiser bregma og lambda, og merk med steril kirurgisk penn (figur 2A, B). Bruk en steril linjal til å definere benklaffomrisset sentrert rundt implantasjonsmålet på begge halvkuler. I dette spesifikke tilfellet ble hørselsbarken valgt, med koordinatene -5 mm til -15 mm fra bregma og -4 mm til -20 mm lateralt. Deretter justerer kraniotomien til størrelsen på implantatet og anatomiske landemerker, og begrenser åpningsstørrelsen.
   3. Kraniotomi:
      1. Bruk et beinbor med en rund skjærekrone til å bore omrisset av kraniotomien, med tanke på tykkelsen på skallen målt i trinn 2.2. Skyll borelokasjonen med saltoppløsning for å unngå overoppheting av beinet.
      2. Bor omrisset forsiktig homogent til du når dura materen. Ved første gjennombrudd er du ferdig med å bore omrisset til det har blitt tynnere nok til nesten å bryte gjennom. Bruk deretter en flat slikkepott (enten på midtlinjesiden eller sidesiden) for å bryte bort beinklaffen i ett stykke, ved å bruke kraniotomikanten som innflytelse. Hvis det oppstår for mye motstand, fortsett å tynne beinet.
      3. Legg benstykket i sterilt saltvann.
      4. Når benlappen er fjernet, flis forsiktig kanten av kraniotomien bort, ved hjelp av en Kerison for å unngå at den skarpe beinkanten skjærer inn i dura materen.
      5. Hvis det oppstår overdreven blødning på dura materen eller beinet, bruk henholdsvis Gelfoam eller benvoks. Plasser en våtkompress (standard pute i steril saltoppløsning) i kraniotomien og gjenta dette trinnet på den andre halvkulen (figur 2B).
   4. Durotomi:
      1. Bruk nålen fra et 6-0 sutursett, stikk forsiktig hull og løft dura materen på den fremre eller bakre enden av kraniotomien halvveis mellom medial- og sidesiden og opprett begynnelsen på et snitt med stikkkniven.
      2. Deretter, ved hjelp av en liten flat spatel satt inn i subduralrommet som fungerer som en skjærebase for å beskytte cortexen, opprett en anteroposterior spalt i dura materen ved å fremme samtidig med begge verktøyene. Forsikre deg om at spalten er litt større enn implantatets bredde (figur 2C). Hvis det oppstår blødning eller skade på dette trinnet, dekk det med gelskum og vent til det stopper.
         MERK: Spaltbanen bør tilpasses hvis store blodkar er tilstede i dura materen for å unngå blødning.
5. Implantasjon
   1. Innsetting av enhet:
      1. Skyll implantatet (tilleggsfigur 1A) med saltvann på begge sider, slik at det lettere glir inn i subduralrommet. Plasser implantatet over dura mater-spalten, og sett enheten inn med små tang ved å skyve den sekvensielt på hver kant.
      2. Hold forsiktig sokkelenden av enheten og fortsett med implantatet for ikke å skape spenning som hindrer innsettingen. Når koblingskanten er plassert på toppen av spalten, stopper du innsettingen.
   2. Sikre implantatet: For å sikre implantatet på plass, plasser en titanbro over kabelen etter kanten av kraniotomien eller i forankringsvingene og fest den med en eller to titanskruer med riktig skrutrekker (figur 2D).
   3. Jordplassering: Fjern forsiktig 1 cm av isolasjonen av jordledningene og sett den epiduralt inn i den bakre enden av kraniotomien (eller et hvilket som helst epiduralsted langt fra cortex av interesse eller store blodkar) (ledning i figur 2E)
   4. Gjenta trinn 2.4.4. og 2.5.1.-2.5.3 på den kontralaterale halvkule.
   5. Intraoperativ røntgen for å bekrefte plassering:
      1. Plasser en våt pute (standard pute i steril saltoppløsning) over operasjonsstedet for å holde vevet hydrert. Deretter plasserer du en steril kirurgi drape for å dekke dyrets hode.
      2. Ta planrøntgenbilder (aksiale og sagittale) for å sikre at implantatene er godt plassert og ikke brettes, ved å bruke røntgenmarkørene som indikatorer. Hvis ikke, fjern gardinen og eksplant enheten for å sette den inn igjen (følg trinn 2.4.4. og 2.5.1.-2.5.3 igjen).
   6. Dura mater lukking: Sutur dura mater forsiktig rundt implantatkabelen ved hjelp av en 3-0 resorberbar sutur og en liten nålholder. Før de to dura mater-kantene sammen så mye som mulig uten å rive gjennom den tynne membranen med suturtråden (figur 2D, E).
   7. Benklaffplassering: Fest en titanbro på den fremre og bakre delen av hver benklaff ved hjelp av en titanskrue. Vær nøye med å planlegge plasseringen av Ti-broene med hensyn til plassering av fotplatebena i de neste trinnene. Skru enden av titanbroene til skallen (figur 2F, G).
6. Plassering av sokkel og fotplate
   1. Posisjonering: I denne konfigurasjonen har fotplaten seks ben med to skruehull hver (tilleggsfigur 1B). Planlegg plasseringen av fotplaten på skallen for å optimalisere plasseringen av skruene (unngå å plassere dem på kanten av kraniotomien eller i den temporale muskelen). Hopp over hullene i bena hvis de ikke kan skrus inn.
   2. Fotplatesikring: Skru inn titanskruene på fotplaten til den sitter godt på plass (se figur 2H).
   3. Plassering av sokkel: Fjern titanbroene over tilkoblingskablene og vipp over sokkelen for å lande på fotplaten. Skru sokkelen på fotplaten. Kontroller at sokkelen sitter godt på plass (figur 2I).
7. Sutur og lukking
   1. Rengjøring av såret: Rengjør det subkutane rommet for ben eller annet rusk ved å skylle med saltvann. Klipp bort litt hud rundt sokkelkantene for å skape en rund kant etter sylinderen.
   2. Subkutane suturer: Fjern sprederne og brett hudlappene sammen. Lag subkutane suturer med en 4-0 ikke-resorberbar suturtråd, 3 mm fra hverandre ved hjelp av enkle avbrutte suturer eller enkle kontinuerlige suturer. Start vekk fra sokkelen, beveg deg mot den på begge sider av snittet.
   3. Dermal suturer: Sutur huden med en 6-0 ikke-resorberbar suturtråd, med suturer 5 mm fra hverandre. Start vekk fra sokkelen, beveg deg mot den på begge sider av snittet. Pass på å oppnå god vevsapposisjon mellom de to hudlappene og nær sokkelkanten for å unngå tomrom (figur 2J).
   4. Sårbandasje: Rengjør sårområdet igjen med en steril pute og betadin. Påfør en selvklebende steril bandasje over såret.
8. In vivo målinger: For in vivo målinger, følg avsnitt 3, 4 og 5.
9. Oppvåkning: Etter at alle målingene er utført, ta dyret av alle bedøvelsesmidler, men hold under ventilasjon. Ved analgesi, påfør et buprenorfinplaster (25 mg/time) i 24 timer. Plasser dyret på en varmepute dekket med gardiner for å øke hastigheten på oppvåkningstiden. Når spontan pust er gjenopprettet, ekstuberer dyret og legger under en oksygen ansiktsmaske til bevisstheten er gjenopprettet (som kan ta 1 til 4 timer).
10. Postoperativ dyrepleie: I 5 dager, hold dyret under nøye overvåking. Gi en dose cephalexin på 75 mg to ganger daglig med mat, skilt fra andre dyr. Utfør desinfeksjon av såret daglig ved å bruke store mengder betadin med gjennomvåt sterile pads (best gjort under fôring).
    MERK: Langtidspleie og bolig: Det opererte dyret holdes isolert i 24 timer. Den blir satt tilbake i sin opprinnelige sosiale gruppe hvis dyret er godt nok til å samhandle sosialt med sine jevnaldrende. Daglig observasjon av sokkelen og hudåpningen må utføres for å følge integreringen av enheten på hodet. Når det er hensiktsmessig, rengjør du stedet rundt sokkelen med rikelige mengder betadin.

3. In vivo karakterisering av det myke implantatet

1. Kronoamperometri: Registrer spenningsfallet ved injeksjon av en bifasisk strømpulsutvikling (dvs. VT) ved hjelp av et oscilloskop koblet parallelt med en pulsgenerator. Koble pulsgeneratoren sekvensielt til hver elektrode og jordledning. Utfør stimuleringspulsen ved 100 μA med en pulsbredde på 300 μs ved 100 Hz.
2. Elektrokjemisk impedansspektroskopi: Mål den elektrokjemiske impedansen ved forskjellige frekvenser ved hjelp av et potensiometer. Koble pulsgeneratoren sekvensielt til hver elektrode, ved hjelp av jordledningen som både motelektrode og jord. Sett eksitasjonsspenningen til 200 mV og frekvensområdet fra 1 Hz til 1 MHz, med tre poeng per tiår.
3. Korte målinger mellom kanaler: Mål DC-motstanden mellom tilstøtende kanaler ved hjelp av et håndholdt multimeter. In vivo måles DC-motstanden mellom kanalene kun for å verifisere at det ikke oppstår mangel under 1 kΩ, noe som indikerer total innkapslingsfeil.

4. Elektrofysiologisk registrering

1. Spontan aktivitet: Koble det trådløse opptakssystemet gjennom pidestallen og registrer grunnlinjeaktiviteten i 2-3 minutter. Disse opptakene vil fungere som en kontroll for å analysere de auditive fremkalte potensialene.
2. Auditive fremkalte potensialer: I tillegg til det trådløse systemet, sett høyttalerne inn i et lukket felt i dyreørene. Spilltone burst akustisk stimulering ved forskjellige frekvenser (fra 200-20,000 Hz) på rundt 70 dB lydtrykknivå (SPL) over 120 repetisjoner. Deretter gjennomsnitt opptakene og juster dem over stimulusperioden for analyse.
3. Sensoriske fremkalte potensialer: Plasser nålene i snuten i tre forskjellige posisjoner. Fremkall sensoriske potensialer ved å stimulere snuten i ~ 30 s med pulsgeneratoren ved forskjellige amplituder for å oppnå rekrutteringskurver.

5. In vivo avbildning

1. Dyretransport: Hold dyret under propofolbedøvelse, som beskrevet i trinn 2.1. Bruk en transportvogn som huser en ventilator, sprøytepumpe og vitale tegn for å transportere dyret fra operasjonsrommet til bildebehandlingsfasilitetene og tilbake.
2. Computertomografi røntgenskanning: Plasser dyret på skannerbordet og fjern metallgjenstander rundt hodet (f.eks. temperatursensoren). Skaff deg en CT-skanning med den minste oppløsningen (0,4 mm skivetykkelse) ved hjelp av isometrisk oppkjøp med automatisk strøm- og spenningsvalg for beinkontrast.
3. Magnetisk resonanstomografi: Fjern alt utstyr som inneholder metall fra dyret (bruk MR-kompatible IV-ledninger og intubasjonsrør). Hold dyret ventilert og bedøvet under sevofluran på 3%-3,5%, ved hjelp av en ventilator plassert utenfor MR-kammeret og koblet gjennom et langt rør til dyret. Før den første sekvensen injiseres en bolus med fentanyl ved 1-2 μg/kg. Bruk tre isometriske sekvenser med minste oppløsning: T1-, T2- og turbospinnekko (TSE)-vektede sekvenser (parametere vist i tilleggsfil 1).

6. Fritt bevegelige opptak

1. Følg samme prosedyre som beskrevet i avsnitt 4 for registrering av våkne signaler fra hjernen. Plugg den trådløse headstage ved enten å holde dyret i eksperimentørens armer eller mate dyret med godbiter for å distrahere det. Gi den akustiske stimuleringen ved hjelp av eksterne høyttalere plassert nær dyret.

7. Perfusjon og vevsforberedelse

1. VALGFRITT: Hvis dyret ikke allerede er under anestesi, følg trinn 2.1 for anestesiprotokollen.
2. Innsetting av kateter i halspulsåren for perfusjon (tilleggsfigur 2)
   1. Carotis arterie og jugularis vene disseksjon: Kutt halsen på midtlinjen ved hjelp av en cauterizer / kutter. Skjær huden først og deretter muskelen etter den midterste hvite linjen (ingen kar under) (tilleggsfigur 2A).
   2. Åpne videre, ved hjelp av fingrene for å få plass rundt luftrøret og under muskelen. Se etter halspulsåren (slo og rosa); Vagalnerven er noen ganger også rundt (hvit), og vena jugularis kan være under eller på siden (rød). Plasser sprederne (se tilleggsfigur 2B).
   3. Start disseksjonen av halspulsåren ved hjelp av fin tang og rund saks. Bruk saks til å åpne konjunktivvev. Hvis det ikke er blodårer, kutt; hvis det er blodårer, cauterize og gå videre (tilleggsfigur 2C, D). Når dissekert nok, bruk en klemme for å gå under halspulsåren slik at den er helt isolert (tilleggsfigur 2E).
   4. Gjenta samme operasjon med halsvenen (tilleggsfigur 2F).
   5. Når begge fartøyene er fullstendig dissekert og isolert, plasser suturtråd rundt dem. Ikke lukk dem ennå. To suturer rundt carotis, en helt ved basis (sutur 1-hjerteside for hjerneperfusjon) og en på den andre siden (sutur 2), er vist i tilleggsfigur 2G.
   6. Plasser en sutur rundt halsvenen (sutur 3), ikke lukket; Merk ledningene med tape for seksjonering av venen senere.
   7. Lukk sutur 1 veldig fast, ellers vil den blø (tilleggsfigur 2H). Knytt tre knuter. Plasser en klemme på ledningen for å legge vekt og skape spenning i halspulsåren.
   8. Klem halspulsåren ved hjelp av en karklemme på motsatt side av halspulsåredisseksjonen (hjernesiden for hjerneperfusjon; Tilleggsfigur 2I). Sutur 2 er i midten, ikke lukket ennå.
   9. Bruk svart tang for å fange og trekke halspulsåren. Bruk fin saks til å snitte halvparten av halspulsåren nær roten av disseksjonen (nær sutur 1, hjerteside; se tilleggsfigur 2J). Sørg for at seksjonen er så ryddig som mulig og når selve fartøyet, ikke bare "skjeden"; Ellers vil kateteret ikke gå gjennom. Sett inn kateteret som vist i tilleggsfigur 2K.
   10. Skyll og fyll kateteret, først med PBS, slik at det ikke er luft igjen i kateteret (tilleggsfigur 2K-innsats ).
   11. Lukk sutur 2 godt nok slik at den ikke går bort, men ikke for mye slik at kateteret fortsatt kan bevege seg litt (tilleggsfigur 2L). Fjern deretter beholderklemmen, fullfør kateteret så langt som mulig, og fullfør lukkingen av sutur 2 (lukk godt).
   12. Hvis ønskelig, bruk suturtråder ved sutur 1 for å feste bunnen av kateteret til huden ved utgangen av såret som et ekstra sikkerhetstrinn. Overfør deretter dyret til perfusjonssonen og koble det til PBS/heparin. Når perfusjonen starter, trekk sutur 3 og kutt halsvenen
3. Eutanasi: Injiser pentobarbital (90 mg/kg) intravenøst og skyll slangen med saltvann for å sikre at hele dosen administreres vellykket.
4. Perfusjon: Bruk en perfusjonspumpe (200 ml/min) til å koble carotiskateteret til PBS/heparin (1 l for en 15 kg gris) og deretter til PBS inneholdende 4 % paraformaldehyd (PFA) (5 l for en 15 kg gris). Når perfusjonen starter, trekk sutur 3 og kutt halsvenen.
5. Vev samling
   1. Halshugging: Når perfusjonen er over, løsne dyrets hode fra kroppen ved hjelp av en skalpell, ved å kutte gjennom huden og muskelen og sette bladet mellom første og andre ryggvirvler.
   2. Postfiksering: Dypp hodet i 4% PFA i PBS i ytterligere 48 timer ved 4 ° C og overfør deretter til PBS før hjerneekstraksjon.
   3. Hjerne- og implantatekstraksjon:
      1. Fjern huden ved hjelp av en skalpell og begynn å kutte beinet forsiktig ved hjelp av en rongeur fra de første ryggvirvlene, etter ryggmargen til lillehjernen. Når lillehjernen er utsatt, fjern forsiktig de temporale beinene og utsett parietale og frontale lober.
      2. På dette tidspunktet skru sokkelen av fotplaten og kutt føttene på fotplaten med tang. Fjern beinet nær kabelinngangen i skallen for å frigjøre implantatsystemet fra beinet, uten å trekke implantatene ut av dura mater-utgangen.
      3. Hvis implantatkablene er innebygd i beinet, kutter du kabelen så nær utgangen som mulig. Når nok hjerneoverflate er eksponert, kutt forsiktig duraen etter midtlinjen med en liten saks.
      4. Frigjør implantatkablene fra dura mater-utgangen. Ta bilder fra implantatplasseringen på hjernen. Bruk deretter en liten skje for å løsne hjernen fra kranialnervene nedenfor. Trekk forsiktig ut hjernen. Fjern implantatene fra hjernen.
   4. Postfiksering av hjernen: Avhengig av perfusjonskvaliteten, postfiks den ekstraherte hjernen igjen i 24 timer i 4% PFA i PBS ved 4 °C. Oppbevares i 0,1 M PBS ved 4 °C til hjernen er kuttet.
   5. Brain cut: Skill de to halvkule ved hjelp av et barberblad. Deretter kutter du hjernen ortogonalt i fire forskjellige biter. Klipp den implanterte sonen i to for å oppnå to blokker som inneholder den implanterte sonen og et kontrollområde. Lagre de to andre blokkene hvis det er behov for flere kontrolllysbilder.
   6. Hjernekryobeskyttelse og frysing: Overfør hjerneblokkene til en løsning på 15% av sukrose først og deretter 30% av sukrose ved 4 ° C til hjernen stuper og når likevekt. Deretter fryses vevet i isopentan ved -55 °C i et vevsfrysesystem.

8. Histologi

1. Vev seksjonering
   1. Kryostat: Plasser den frosne hjernen i en kryostat og trim til hele seksjoner er oppnådd. Deretter skjærer du hjernen i 40 μm seksjoner og senker den i grupper på tre i 0,1 M PBS i brønnplater. Legg nøye merke til rekkefølgen på platene.
   2. Seksjonsvalg: Velg seksjonene avhengig av sonen som skal analyseres (implantert region eller kontrollsone). Ta seksjonene sekvensielt ut av brønnplatene, ved hjelp av en fin børste for å inspisere dem for skade. Plasser dem i nye brønnplater fylt med 0,1 M PBS for ytterligere farging.
2. Immunhistokjemi
   1. Forberedelse: Inkuber seksjonene i 0,3% Triton X / PBS i 15 minutter, etterfulgt av 3% bovint serumalbumin (BSA) / PBS i 1 time ved romtemperatur (RT).
   2. Primære antistoffer: Inkuber vevet med primære antistoffer i 48 timer ved RT (anti-GFAP, rotte, fortynnet ved 1/300; anti Iba1, kanin, fortynnet ved 1/400; anti-NeuN, marsvin, fortynnet ved 1/1000; alt i 1% BSA/PBS). Dekk brønnplatene med aluminiumsfolie.
   3. Vask: Vask brønnene med 0,1 M PBS tre ganger i 5 minutter.
   4. Sekundære antistoffer: Inkuber vevet med sekundære antistoffer i 2 timer ved RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; alle fortynnet ved 1/400 i 1% BSA / PBS).
   5. DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol): Inkuber vevet med DAPI i 15 minutter (1/1,000 i 1% BSA / PBS).
   6. Vask: Vask brønnene med 0,1 M PBS fem ganger i 15 minutter.
   7. Montering: Monter lysbildene ved hjelp av monteringsmedier og et deksel. Oppbevar lysbildene i mørket i kjøleskap ved 4 °C.
3. Imaging
   1. Hele lysbildet: Avbilde lysbildene ved 10x forstørrelse (objektiv arbeidsavstandsverdi = 3 100 μm) ved hjelp av et lysbildeskannermikroskop ved tre forskjellige bølgelengder (640 nm, 560 nm, 485 nm). All informasjon om makt og gevinst finner du i tilleggsfil 2.
   2. Mikroskopisk avbildning: Avbilde interesseområdet ved 20x forstørrelse (apokromat 20x/0,8 M27) ved hjelp av et konfokalmikroskop ved fire bølgelengder (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). All informasjon om makt og gevinst finner du i tilleggsfil 3.

Representative Results

For å bekrefte plassering (figur 3A) og funksjonalitet av apparatene gjøres elektrofysiologiske registreringer intraoperativt etter plassering av sokkel. Baselinesignalet innhentes først over 2 minutter uten stimuli som kontroll av basal aktivitet. For det andre stimuleres dyret akustisk med et toneutbrudd ved forskjellige frekvenser (500-20 000 Hz), og rådataene gjennomsnittes over stimulusperioden for å kartlegge auditivt fremkalte potensialer over hele matrisen (f.eks. ved 800 Hz sammenlignet med baseline; Figur 3B). Dataene som vises her, er ubehandlet, men hvis det er for mye støy, kan hakk- og båndpassfiltre brukes. Typiske støykilder i operasjonssalen inkluderer varmeputer, pluggede bor og suge- eller cauterizers (blant andre) som bør fjernes før oppkjøp. I våkne opptak bør store muskelbevegelser rundt hodet, for eksempel tygging, unngås for renere datasett.

Denne protokollen ble brukt på hvert opptakstidspunkt, og signaler for en enkelt kanal kunne sammenlignes over tid. Et eksempel er illustrert i figur 3C, som viser responsens robusthet og utvikling. Opptakskapasiteten til hver kontakt i løpet av eksperimentet kan evalueres ved å beregne standardavviket til baselinesignalet ved hvert tidspunkt (figur 3D). I denne studien sank signal-støy-forholdet og la seg mellom dag 0 og måned 6, til tross for en viss variasjon på grunn av den begrensede varigheten av registreringsperioden (dvs. 2 minutter). Dette kan ytterligere korreleres med elektrodeimpedanser.

In vivo-avbildningen utføres postoperativt for å vurdere hjernens tilstand og implantatposisjonering. I den første iterasjonen av protokollen ble det ikke utført intraoperativ røntgen, noe som resulterte i en foldet enhet, som det fremgår av figur 4A på en T1-vektet MR-sekvens (se i tillegg figur 4B). Ingen atferdsendring ble observert hos dyret, men over tid resulterte dette i en fibrotisk innkapsling rundt enheten på grunn av makroskopisk kompresjon av hjernen rundt implantatplasseringen (figur 4C). Etter denne erfaringen ble intraoperativ røntgen introdusert, som vist i figur 4D, hvor de røntgentette markørene (svarte striper synlige på implantatet i innfelt figur 4D) er vist å være godt posisjonert. Hjerneoverflaten er da intakt, slik man kan observere på postoperativ MR-undersøkelse i figur 4E. Totalt sett, med dette implantatet og sokkelsystemet, er avbildning av hele hjernen mulig. Ulike sekvenser i koronalplanene gjør det mulig å se anatomiske strukturer (figur 4F,G; T1 og T2 MR-sekvenser) eller tilstedeværelsen av væske og blod rundt implantatet (figur 4H; TSE-vektet MR-sekvens). Pidestallsystemet skaper nesten ingen artefakter, bortsett fra noen små hulrom med svart kontrast rundt titanskruene (se figur 4G). I tillegg brukes kliniske elektroder som komparatorer i denne studien, men kan ikke avbildes i MR på grunn av oppvarmings- og sikkerhetshensyn. Derfor er CT-skanning ervervet på disse dyrene, som vist i figur 4I. Elektrodene er godt synlige, og sokkelsystemet påvirker ikke bildekvaliteten.

Etter implantasjonsperioden blir dyret perfundert, og hjernen ekstrahert. I denne studien utføres analysen av den inflammatoriske responsen på hver halvkule uavhengig. Å kutte hjernen i to er lettere for vevspreparering før snitting, og har den fordelen at snitt kan monteres på standard mikroskopilysbilder. Et eksempel på en hjerneprøve er vist før (figur 5A) og etter (figur 5B) skjæring i blokker. Omrisset av implantatet er godt synlig og har skapt en liten bulk i hjernen. Ved å kutte i parallelle plan er vevet allerede justert til kryostaten, og snitt kan lett kuttes uten vevstap for trimming (figur 5C). Etter farging avbildes hele vevssnittet (figur 5D), hvor for eksempel nevronlaget er godt synlig i detalj (se NeuN-markør). Hele seksjoner er skjøre og kan noen ganger føre til noe tap av vev (se nederst i figur 5D), men interesseområdet er intakt. Ved nærmere øyesyn, aktivert ved konfokalmikroskopiavbildning ved 40x, er cellene klart definert og muliggjør fin undersøkelse av inflammatoriske markører, for eksempel (figur 5E). Ytterligere kvantifiserende analyse kan utføres for å sammenligne betennelse mellom kontroll og implanterte hemisfærer. Figur 6 viser den elektrokjemiske karakteriseringen av de implanterte elektrodene. In vitro elektrokjemisk impedansspektroskopi av mykelektrodematrisen med impedansmodul og fase er vist i figur 6A, og impedansmodulen ved 1 kHz over 6 måneders implantasjon er vist i figur 6B.

Figur 1: Skjematisk fremstilling av eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2 Minimalt invasiv implantasjon av mykt ECoG på hjernen. (A) Kirurgisk tilgang til skallen, med indikasjon på bregma. (B) Bilateral kraniotomi med synlig dura mater. (C) Slit durotomy på den første halvkule. (D) Subdural implantasjon av myk ECoG og dura mater lukking. (E) Slit durotomy på den andre halvkule. Benklafffiksering på den første halvkule ved bruk av titanbroer. (F) Implantasjon av myk ECoG på den andre halvkule og dura mater lukking. (G) Benlappfiksering på den andre halvkule. (H) Fotplateplassering på skallen. (I) Pidestallfiksering på fotplaten. (J) Hudlukking rundt sokkelbasen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Opptak av auditivt fremkalt potensial . (A) Skjematisk plassering av elektrode på overflaten av tinninglappen. (B) Representativ kartlegging av baselineaktivitet (grå spor) og auditivt fremkalt potensial som respons på en 800 Hz tone burst stimulering (lilla spor). Hvert gjennomsnitt tilsvarer én kanal på den myke ECoG-matrisen. Gjennomsnittet utløses på det analoge inngangssignalet fra lydstimuleringen. "ON" og "OFF" akustiske stimuleringsperioder er notert på en kanal nederst til venstre. (C) Evolusjon over tid (dag 0, måned 2 og måned 5) av en enkelt kanalrespons etter akustisk stimulus, sammenlignet med baselinesignal når ingen stimulus presenteres (grå). Gjennomsnittet utløses på det analoge inngangssignalet fra lydstimuleringen. Stimuleringsperiodene "ON" og "OFF" er notert nederst. Det fremkalte potensialet for "ON" -stimuleringen er merket med piler. (D) Standardavvik per kanal (fargede prikker) per tidspunkt for grunnlinjeregistreringen. Medianverdiene er representert i fet skrift. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: In vivo avbildning av hjerne og implanterte elektroder . (A) Postoperativ T1-vektet MR-undersøkelse i koronalplan. En pil indikerer et brettet implantat. (B) Forstørret del av A, hvor foldingen av implantatet skaper en bulk i hjernen. (C) T1-vektet MR ved 1 måneds implantasjon, som viser kompresjon av hjernen på grunn av fibrotisk innkapsling av hjernen på samme sted som C. (D) Intraoperativ plan røntgenverifiserende implantatplassering og ingen folding, som observert ved radiopaque markørplassering. Innfelt: Fotografi av implantat med røntgentett markør synlig. (E) Postoperativ T1-vektet MR i koronalplan med optimal implantatplassering. (F) T1-vektet MR ved implantasjon ved 1 måned. (G) T2-vektet MR ved implantasjon ved 1 måned. En pil viser bildeartefakten fra titanskruene som holder fotplaten på plass på skallen. (H) TSE-vektet MR ved implantasjon ved 1 måned. (I) CT-skanning av dyret implantert med de kliniske elektrodene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5 Histologianalyse av hjernen etter langtidsimplantasjon. (A) Fotografi av en eksplantert og perfundert hjerne-venstre halvkule. (B) Perfusert hjerne kuttet i blokker før frysetrinnet. (C) Bilde av hele blokkseksjonsoppsettet på kryostaten; Hele "pre-cut blokker" kan seksjoneres. (D) Immunfarging av hele hemisfæren (lysbildeskanner, 20x objektiv) og (E) zooming på de første lagene av cortex (konfokal avbildning, 40x objektiv) som viser gliaceller, astrocytter og nevroner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Elektrokjemisk karakterisering av de implanterte elektrodene. (A) In vitro elektrokjemisk impedansspektroskopi av mykelektrodegruppen (små grå linjer for hver kanal, gjennomsnittet i rødt) med impedansmodul (øverst) og fase (nederst). (B) Utvikling av impedansmodulen ved 1 kHz over 6 måneder med implantasjon (gjennomsnitt i blått; grå linjer er de individuelle kanalene; in vitro-målingen er gitt som referanse i rødt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: MR-kompatibel pidestall. (A) Kronisk MR-kompatibelt depottilkoblingssystem (sokkel) for å få tilgang til mykelektrodematrisen. (B) Pidestall med elektroder montert på fotplaten for hodeskalleforankring. Innfelt: Detaljer om fotplaten. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: Kirurgisk tilgang for optimal perfusjon av hjernen. (A) Hudskjæring og tilgang til plasseringen av halspulsåren og halsvenen. (B) Disseksjon av vevet rundt blodårene. (C,D) Identifisering og disseksjon av vevet rundt halspulsåren og halsvenen. (E) Isolering av halspulsåren fra vevet under. (F) Isolering av halsvenen fra vevet under. (G) Suturtrådplassering rundt halspulsåren (sutur 1 og sutur 2) og halsvena (sutur 3). (H) Lukking av sutur 3 ved bunnen av halspulsåren (hjertesiden) for å unngå blødning under åpning av karet. (I) Klemming av halspulsåren på motsatt side av H. (J) Snitting av halspulsåren. (K) Innsatt kateter i åpningen fra J. Innfelt: Primet kateter med saltvann skyllet fra en sprøyte til kateterspissen. (L) Lukking av sutur 2 for å holde kateteret på plass og langs arterien. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Parametere for henholdsvis T1- (side 1-2), T2- (side 3-4) og TSE-vektede (side 5-6) MR-sekvenser. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Metadata for lysbildeskanner for hele lysbildeavbildning av fargede hjernestykker. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Metadata for konfokal avbildning av forstørret del av fargede hjernestykker. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Vi rapporterer her en metode for langsiktig implantasjon og evaluering av myke ECoG-arrayer. I denne studien har vi designet en konsistent, minimalt invasiv kirurgisk tilnærming for bilateral implantasjon av funksjonelle elektrodegitter over tinninglappene (her rettet mot hørselsbarken). Vi evaluerte først funksjonaliteten til nettet ved vellykket registrering av fremkalte potensialer i løpet av studien (6 måneder) og sporing av elektrokjemiske egenskaper til elektrodene (se figur 6). For det andre vurderte vi biosikkerheten til nettene, in vivo ved å bruke MR og etablere et fullt MR-kompatibelt system, og post mortem ved å designe en protokoll for vevsinnsamling og immunfarging.

For å minimere invasivitet optimaliserte vi størrelsen på kraniotomivinduet. For å nå hørselsbarken som ligger på tinninglappen og for å unngå resektering av tinningmuskelen, har vi utviklet en teknikk for å skyve implantatet under duraen. Denne teknikken gjør det mulig å drastisk redusere overflaten av den eksponerte hjernen og fortsatt nå langt unna mål. Selv om denne typen implantasjon kan virke blind, tillater implementeringen av røntgentette markører på enhetene som visualiseres i det intraoperative planet røntgen verifisering av posisjonering, og sikrer at arrayet ikke brettes under dura materen. Subduralglidningen har vist seg å være trygg i de fleste repetisjonene vi har utført. I tillegg minimerer durotomi i en spaltetilnærming hjernebuking i løpet av tiden kraniotomien er åpen og letter lukkingen rundt implantatet uten å kreve ekstra materiale som kunstig dura mater, noe som kan forstyrre den inflammatoriske responsen. Til slutt er styrken til denne kirurgiske tilnærmingen dens evne til å bli overført til forskjellige kortikale regioner. Å leke med koordinater, kraniotomiposisjonen og enhetsstørrelsen, som alle kan justeres, gjør at denne metoden kan målrette mot det meste av cortexområdet.

Den kirurgiske metoden som presenteres her, sammen med funksjonsvurdering og undersøkelse av biointegrasjonen over tid, er ikke begrenset til mykelektrodeteknologien som er brukt i denne rapporten. Andre subdurale elektroder som utvikles for menneskelig oversettelse kan evalueres med samme protokoll. Styrken til denne metoden er avhengig av det faktum at de fleste brikkene, for eksempel kabelen og sokkelen, er modulære, personlige og kan tilpasses den spesifikke enheten som testes. I tillegg kan intrakortikale eller dype penetrerende sonder også brukes i stedet for eller i kombinasjon med subdurale elektroder, da dette bare krever justering av kraniotomi og durotomi geometri. De langsiktige resultatene kan da sammenlignes med deres kliniske kolleger, som vi har gjort her.

En av de største begrensningene i den presenterte metoden er tilstedeværelsen av skallen bihuler i minipigs, som utvikler seg i løpet av det første året¹². I den forbindelse inkluderer viktige aspekter å ta hensyn til implantasjonsalderen og også størrelsen på dyret. Å utføre kraniotomier i den voksne skallen bryter bihulenes integritet og fører til høy risiko for alvorlig infeksjon i kroniske innstillinger. Slike bihuler er synlige i planrøntgen og CT-skanning preoperativt. På den annen side er det heller ikke optimalt å utføre kronisk implantasjon for tidlig, i et dyr som er for lite, når skallen gjennomgår massiv vekst og ombygging. Vi antydet at disse "hodeskallebevegelsene" etter operasjonen kunne føre til at implantatet beveger seg og bretter seg, noe som til slutt er skadelig for eksperimentet. Vi har her funnet ut at Göttingen minigriser, ca. 5-6 måneder gamle (og 8 kg) på implantasjonstidspunktet, skal gi de beste resultatene.

For å evaluere ytelsen til den implanterte ECoG for elektrofysiologiske registreringer, har vi satt opp en hurtigprotokoll for opptak av auditivt fremkalt potensial (AEP) som kan brukes i fritt bevegelige dyr og under sedasjon. Den består av å presentere en rekke akustiske toneutbrudd på bestemte frekvenser i løpet av noen få minutter. Fordelen med en slik protokoll er at den kan stilles inn på den tilgjengelige lengden på opptaket ved å redusere antall frekvenser som undersøkes. En utfordring ved registrering av kortikale signaler under anestesi er at bevissthetsnivået til dyret bør tas i betraktning ved analyse og sammenligning av dataene.

Protokollen for perfusjon ble justert over tid ved observasjon av den ekstraherte hjernens kvalitet. Faktisk fant vi det lettere å kateterisere halspulsåren bare, og ikke halsvenen. Innledningsvis presenterer litteraturen metoder der halsvenen kateteriseres for å drenere avfall²⁰. I praksis begrenser dette strømmen ut av hjernen og fører til dårligere ekstraksjon av blod og den generelle kvaliteten på perfusjonen. Ved å kutte halsvenen og la væsken slippe ut i en stor beholder der dyret ligger, øker perfusjonens effektivitet.

Vi har utviklet en robust vevsprepareringsmetode som fungerer med antistoffer som rutinemessig brukes til betennelsessporing. Vi har skilt de to halvkulene av praktiske årsaker, da halve grisens hjerne passer på standard mikroskopglass og dermed er kompatibelt med det meste av bildeutstyr som er tilgjengelig i histologilaboratorier. Ved å kutte hjernen i blokker, er direkte tilgang til interessesonen gjort mulig uten å kreve ytterligere kutting av hele hjernen eller trimming av store deler av vevet. Hjerneskivene ved 40 μm kan samles i standard brønnplater og farges på en frittflytende måte uten store protokollendringer fra andre arters immunfarginger. Full hjerneimmunfarging kan også tenkes ved å bruke for eksempel CLARITY-metoder²¹.

Samlet sett er denne protokollen, som dekker personlig implantatdesign til implantasjon, funksjonalitetsoppfølging og biosikkerhetsvurdering, robust og konsistent. Vi demonstrerte her muligheten til å studere hørselssystemet, men det kan transponeres for å teste andre fysiologiske funksjoner. Videre ligger styrken til metoden vår i det faktum at den ikke er begrenset til minigriser, men fullt omsettelig til andre arter som sauer, geiter eller ikke-menneskelige primater. Til en viss grad kan den også lett tilpasses rotter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone drill	BBraun	Elan 4 with  GA861 handpiece
Bone drill bit	BBraun	Neurocutter GP204R
Bonewax	Ethicon	W31G
Catheter	Venisystems	Abbocath 14G
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Cryostat	Leica	CM1950
Gelfoam	Pfizer	Gelfoam
Insert speakers	Etymotic	Etymotic ER2 insert Earphones
Multimeter	Fluke	Fluke 1700
Oscilloscope	Tektronix	MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope
Perfusion pump	Shenzen	LabS3/UD15
Potentiostat	Gamry Instruments	Reference 600
Primary Antibody Anti-GFAP	Thermofischer	Anti-GFAP, Rat, # 13-0300
Primary Antibody Anti-Iba1	Fujifilm	Anti Iba1, Rabbit, 019-19741
Primary Antibody Anti-NeuN	SigmaAldrich	Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90
Pulse Generator	AM Systems	Model 2100 Isolated Pulse Stimulator
Recording headstage	Multichannel systems	W2100-HS32
Recording system	Multichannel systems	W2100
Screwdriver	Medtronic	Handle: 001201, Shaft: 8001205
Secondary Antibody 488	Thermofischer	Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, # A-11006
Secondary Antibody 555	Thermofischer	Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, # A-21435
Secondary Antibody 647	Thermofischer	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, # A-21245
Slide Scanner	Olympus	VS120
Snapfrost	Excilone	Excilone Snapfrost
Stab knife	Fine Science Tools	10316-14
Suture wire dermal	Ethicon	Vicryl 2-0
Suture wire dura mater	Ethicon	Mersilk 5-0
Suture wire for catheter	Ethicon	Vycril 3-0 without needle
Suture wire for lifting dura	Ethicon	Prolene 6-0 with BV-1 needle
Suture wire subcutaneous	Ethicon	Vicryl 4-0
Titanium bridge	Medtronic	TiMesh 015-2001-4	Cut out the required size
Titanium screws	Medtronic	9001635, 9001640
X-ray system	GE	GE OEC 9800 Plus C-Arm