Summary
Presentamos un protocolo para el ensayo de cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) específicamente en adipocitos utilizando clasificación de núcleos con tejidos adiposos aislados de ratones reporteros transgénicos con marcado de fluorescencia nuclear.
Abstract
El ensayo para cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es una técnica robusta que permite la elaboración de perfiles de accesibilidad de cromatina en todo el genoma. Esta técnica ha sido útil para comprender los mecanismos reguladores de la expresión génica en una variedad de procesos biológicos. Aunque ATAC-seq se ha modificado para diferentes tipos de muestras, no ha habido modificaciones efectivas de los métodos ATAC-seq para tejidos adiposos. Los desafíos con los tejidos adiposos incluyen la compleja heterogeneidad celular, el gran contenido de lípidos y la alta contaminación mitocondrial. Para superar estos problemas, hemos desarrollado un protocolo que permite ATAC-seq específico de adipocitos mediante el empleo de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia con tejidos adiposos del ratón transgénico reportero Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Este protocolo produce datos de alta calidad con lecturas de secuenciación desperdiciadas mínimas al tiempo que reduce la cantidad de entrada de núcleo y reactivos. Este documento proporciona instrucciones detalladas paso a paso para el método ATAC-seq validado para el uso de núcleos de adipocitos aislados de tejidos adiposos de ratón. Este protocolo ayudará en la investigación de la dinámica de la cromatina en adipocitos sobre diversas estimulaciones biológicas, lo que permitirá nuevos conocimientos biológicos.
Introduction
El tejido adiposo, que está especializado para almacenar el exceso de energía en forma de moléculas lipídicas, es un órgano clave para la regulación metabólica. El control estricto de la formación y mantenimiento de los adipocitos es vital para la función del tejido adiposo y la homeostasis energética de todo el cuerpo1. Muchos reguladores transcripcionales desempeñan un papel crítico en el control de la diferenciación, plasticidad y función de los adipocitos; Algunos de estos reguladores están implicados en trastornos metabólicos en humanos 2,3. Los avances recientes en técnicas de secuenciación de alto rendimiento para la expresión génica y el análisis epigenómico han facilitado aún más el descubrimiento de los reguladores moleculares de la biología de los adipocitos4. Los estudios de perfiles moleculares que utilizan tejidos adiposos son difíciles de realizar debido a la heterogeneidad de estos tejidos. El tejido adiposo consiste principalmente en adipocitos, que son responsables del almacenamiento de grasa, pero también contiene varios otros tipos de células, como fibroblastos, células endoteliales y células inmunes5. Además, la composición celular del tejido adiposo se altera dramáticamente en respuesta a cambios fisiopatológicos como la temperatura y el estado nutricional6. Para superar estos problemas, previamente desarrollamos un ratón reportero transgénico, llamado Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), que produce ribosomas marcados con GFP y núcleos biotinilados marcados con mCherry de una manera dependiente de la recombinasa Cre7. El sistema de doble etiquetado permite realizar análisis transcriptómicos y epigenómicos específicos del tipo de célula con tejidos. Utilizando ratones NuTRAP cruzados con líneas adiponectina-Cre específicas de adipocitos (Adipoq-NuTRAP), previamente caracterizamos perfiles de expresión génica y estados de cromatina de poblaciones de adipocitos puros in vivo y determinamos cómo se alteran durante la obesidad 7,8. Anteriormente, los ratones NuTRAP cruzados con líneas Ucp1-Cre específicas de adipocitos marrones y beige (Ucp1-NuTRAP) nos permitieron caracterizar la remodelación epigenómica de la rara población de adipocitos termogénicos, los adipocitos beige, en respuesta a los cambios de temperatura9.
ATAC-seq es un método analítico ampliamente utilizado para evaluar la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma. La transposasa Tn5 hiperreactiva utilizada en ATAC-seq permite la identificación de regiones de cromatina abiertas mediante el etiquetado de adaptadores de secuenciación en la región accesible a la cromatina de los núcleos10. ATAC-seq es un método simple, pero proporciona resultados robustos y es altamente eficiente incluso con muestras de baja entrada. Por lo tanto, se ha convertido en uno de los métodos de perfil epigenómico más populares y ha contribuido a la comprensión de los mecanismos reguladores de la expresión génica en diversos contextos biológicos. Desde que se creó el protocolo ATAC-seq original, se han desarrollado varias técnicas derivadas de ATAC-seq para modificar y optimizar el protocolo para varios tipos de muestras. Por ejemplo, Fast-ATAC está diseñado para analizar muestras de células sanguíneas11, Omni-ATAC es un protocolo optimizado para muestras de tejido congelado 12 y MiniATAC-seq es eficaz para el análisis de embriones en etapa temprana13. Sin embargo, la aplicación del método ATAC-seq a los adipocitos, especialmente de muestras de tejido, sigue siendo un desafío. Además de la heterogeneidad del tejido adiposo, su alto contenido de lípidos puede interferir con reacciones de recombinación eficientes por la transposasa Tn5 incluso después del aislamiento del núcleo. Además, el alto contenido mitocondrial en los adipocitos, particularmente en los adipocitos marrones y beige, causa una alta contaminación del ADN mitocondrial y lecturas de secuenciación desperdiciadas. Este artículo describe un protocolo para ATAC-seq específico de adipocitos utilizando ratones Adipoq-NuTRAP (Figura 1). Al aprovechar la clasificación de núcleos marcados con fluorescencia, este protocolo permite la recolección de poblaciones puras de núcleos de adipocitos lejos de otros tipos de células de confusión y la eliminación eficiente de lípidos, mitocondrias y restos de tejidos. Por lo tanto, este protocolo puede generar datos de alta calidad específicos del tipo de célula y minimizar el desperdicio de las lecturas mitocondriales mientras se utiliza una cantidad reducida de entrada y reactivos en comparación con el protocolo estándar.
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Protocol
El cuidado y la experimentación de los animales se realizaron de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Indiana.
1. Preparativos antes de comenzar el experimento
- Preparación de tejidos
- Para el etiquetado del núcleo de los adipocitos, cruce ratones NuTRAP con líneas de adiponectina-Cre específicas de adipocitos (Adipoq-Cre) para generar ratones Adipoq-NuTRAP, que son hemicigotos tanto para Adipoq-Cre como para NuTRAP.
- Diseccionar los tejidos adiposos de interés de los ratones Adipoq-NuTRAP como se describió anteriormente14.
- Congele los tejidos en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C hasta su uso.
NOTA: Cada almohadilla de grasa se puede almacenar como un todo, y los tejidos congelados se pueden cortar más tarde en hielo seco en trozos más pequeños (~ 50 mg) para experimentos. Alternativamente, los tejidos grasos se pueden cortar, alícuota y congelar en tubos para su almacenamiento (~ 50 mg por tubo). Nunca se permite que las muestras congeladas se descongelen después de congelarlas hasta su uso.
- Preparación del tampón
NOTA: Mantenga los tampones en hielo durante todo el experimento.- Preparar tampón de preparación del núcleo (NPB): 250 mM de sacarosa, 10 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 y 0.1% NP40. Preparar 7 mL de NPB por muestra. Agregue un cóctel fresco de inhibidores de la proteasa 100x (1x final), DTT (1 mM final) y Hoechst (1 μg/ml final) al NPB antes de usarlo.
NOTA: Se recomienda preparar NPB fresco, pero se puede almacenar a 4 °C hasta por 1 mes. - Prepare 1x solución salina tamponada con fosfato con NP-40 al 0,1% (PBS-N).
- Preparar tampón de preparación del núcleo (NPB): 250 mM de sacarosa, 10 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 y 0.1% NP40. Preparar 7 mL de NPB por muestra. Agregue un cóctel fresco de inhibidores de la proteasa 100x (1x final), DTT (1 mM final) y Hoechst (1 μg/ml final) al NPB antes de usarlo.
2. Aislamiento del núcleo
- Homogeneizadores de vidrio Chill Dounce, con un vidrio Dounce por muestra, sobre hielo. Luego, agregue 7 ml de la mezcla NPB a cada vaso Dounce.
NOTA: Se recomienda utilizar hasta ocho muestras en cada experimento. Trabajar con más de ocho muestras retrasaría significativamente todos los pasos, y puede degradar especialmente la calidad del núcleo durante la clasificación. - Coloque el tejido adiposo congelado (50-100 mg) en el vaso y córtelo inmediatamente en unos trozos más pequeños con un par de tijeras largas. Carrera 10x con un mortero suelto para todas las muestras, y luego 10x con un mortero apretado.
NOTA: Los tejidos adiposos son blandos, por lo que cortarlos en unos pocos trozos pequeños debería ser suficiente. Para muestras raras, se pueden usar piezas más pequeñas (10-20 mg), aunque el número de núcleos de adipocitos recolectados puede variar. - Filtrar a través de un filtro de 100 μm en un nuevo tubo de 50 ml. Mueva los homogeneizados filtrados a un nuevo tubo de 15 ml vertiéndolos. Girar a 200 × g durante 10 min a 4 °C en una centrífuga de cubo oscilante. Retire el sobrenadante tanto como sea posible.
NOTA: Aspirar primero con una aspiradora y, a continuación, extraer el volumen restante con una micropipeta. - Resuspender el pellet en 500 μL de PBS-N golpeando suavemente pero minuciosamente los dedos.
NOTA: Evite el pipeteo, ya que esto puede dañar los núcleos. - Filtrar a través de un filtro de 40 μm en un nuevo tubo de 50 ml utilizando un pipeteo suave. Enjuague el colador con 250 μL de PBS-N. Transfiera la resuspensión nuclear filtrada a un tubo de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando una micropipeta.
NOTA: Si están disponibles, se pueden usar tubos y filtros celulares para volúmenes más pequeños para minimizar la pérdida de muestra.
3. Clasificación de núcleos
- Preparación del tubo de recolección
- Agregue 500 μL de PBS-N a los tubos nuevos de 1.5 ml e invierta varias veces para humedecer todas las superficies internas con el tampón.
- Gire brevemente los tubos para bajar todo el líquido y luego enfríelos en hielo hasta que se clasifiquen.
- FACS (Figura 2)
- Utilice la puerta FSC-A/FSC-H para singletes y FSC-A/SSC-A para la eliminación de residuos pequeños o grandes.
- Puerta para la población de núcleos de adipocitos mCherry/GFP-positivos.
- Recolectar 10.000 núcleos en cada uno de los tubos de recolección preparados en el paso 3.1.
- Preparación del núcleo posterior a la clasificación
- Agregue 500 μL de PBS-N a cada tubo de recolección e invierta varias veces para mezclar.
- Girar los tubos de recogida a 200 × g durante 10 min a 4 °C en una centrífuga de cubo oscilante. Retire completamente el sobrenadante.
NOTA: Use una aspiradora primero para eliminar las burbujas, vierta el sobrenadante y use toallitas de papel para eliminar el líquido restante por completo. El pellet es invisible en este punto. Prepare la mezcla maestra Tn5 durante la etapa de centrifugación como se describe a continuación.
4. Etiquetado Tn5 (Tabla 1)
- Para preparar 25 μL de mezcla maestra de Tn5, mezcle 12,5 μL de tampón de ADN de etiquetado 2x (tampón TD), 1,25 μL de transposasa Tn5 (enzima TDE I) y 11,25 μL de agua libre de nucleasa.
- Añadir 25 μL de mezcla maestra de Tn5 a cada pellet de núcleo, y resuspender mediante un pipeteo suave. Incubar a 600 rpm durante 30 min a 37 °C utilizando un termomezclador.
5. Purificación del ADN
NOTA: El siguiente procedimiento utiliza el kit de purificación de PCR mencionado en la Tabla de materiales. Se puede utilizar cualquier otro método similar de purificación del ADN.
- Añadir 25 μL de agua libre de nucleasas a los 25 μL de la mezcla de resuspensión del núcleo Tn5 obtenida tras la etapa 4.2. El volumen final es de 50 μL por muestra.
- Añadir 250 μL de tampón PB.
- Añadir 5 μL de acetato de sodio 3 M (NaOAc) (pH 5.2).
- Transfiera la mezcla a una columna (suministrada con el kit de referencia) y centrifugar a 17.900 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente (RT).
- Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección. Añadir 750 μL de PE tampón que contenga etanol absoluto (EtOH) y centrifugar a 17.900 × g durante 1 min a RT.
- Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección. Centrifugar a 17.900 × g durante 1 min a RT, y desechar el tubo de recolección con el caudal.
- Para eluyir los fragmentos de ADN, equipe la columna con un nuevo tubo de 1,5 ml, agregue 10 μL de tampón EB y déjelo en RT durante 3 minutos. Centrifugadora a 17.900 × g durante 1 min a RT.
NOTA: Las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante días o a -20 °C durante semanas.
6. Amplificación por PCR (Tabla 2)
NOTA: Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 3.
- Para amplificar los fragmentos de ADN transpuestos, prepare la mezcla maestra de PCR sin agregar un cebador de código de barras Ad2.n único (cebador # 2). Utilice 38 μL de la mezcla maestra de PCR por muestra: 11 μL de agua libre de nucleasa, 2 μL de 25 μM Ad1_noMX cebador (cebador #1) y 25 μL de 2x PCR Master Mix.
- Añadir 38 μL de la mezcla maestra de PCR en un tubo de PCR de 0,2 ml.
- Añadir 10 μL de los fragmentos de ADN eluyentes del paso 5.7.
- Agregue 2 μL de cebador #2 de 25 μM, que debe ser específico para cada muestra.
- Ejecutar la PCR de acuerdo con las condiciones de ciclismo indicadas en la Tabla 2.
7. Prueba de PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real (Tabla 4)
NOTA: Este paso tiene como objetivo determinar los ciclos adicionales necesarios para amplificar el ADN. Es opcional pero muy recomendable, especialmente para nuevos experimentos.
- Prepare la mezcla maestra de qPCR sin agregar la imprimación # 2. Utilice 9.975 μL de la mezcla maestra de qPCR por muestra: 4.41 μL de agua libre de nucleasa, 0.25 μL de 25 μM cebador #1, 5 μL de 2x PCR Master Mix y 0.09 μL 100x SYBR Green I.
NOTA: Para preparar 100x SYBR Green I, diluya el caldo 10,000x con agua libre de nucleasa. Como el volumen de 100x SYBR Green I utilizado para la mezcla maestra de qPCR es insignificante, es más fácil hacer una mezcla maestra adicional de 100x SYBR Green I diluido (por ejemplo, para 8-10 muestras). - Agregue 9.975 μL de la mezcla maestra de qPCR en cada pocillo de una placa de qPCR.
- Agregue 0.25 μL de cebador #2 de 25 μM en cada pocillo.
NOTA: Asegúrese de agregar el mismo cebador #2 para que coincida con lo que se agregó a cada muestra específica en el paso 6.4. - Añadir 5 μL de la reacción de PCR obtenida tras la amplificación por PCR en el paso 6.5, y mezclar por pipeteo.
NOTA: Los 45 μL restantes de la reacción de PCR se utilizarán para la segunda amplificación por PCR. - Ejecutar la qPCR de acuerdo con las condiciones de ciclismo indicadas en la Tabla 5.
- Verifique las curvas de amplificación e identifique el número de ciclos de PCR adicionales necesarios estimando el número de ciclos que alcanzaron ~ 35% del máximo (Figura 3A).
NOTA: Normalmente, 10.000 núcleos requieren de cinco a ocho ciclos de PCR adicionales.
8. Amplificación adicional de PCR
- Ejecute la PCR utilizando todos los 45 μL restantes de la reacción de PCR de acuerdo con los cálculos del paso 7.6 (Tabla 6).
NOTA: Cada muestra podría requerir un número diferente de ciclos de amplificación.
9. Segunda purificación del ADN utilizando el kit de purificación por PCR
- Utilice los mismos procedimientos que en la sección 5, pero eluya los fragmentos de ADN amplificados con 20 μL de tampón EB.
10. Selección del tamaño del fragmento de ADN
NOTA: Utilice perlas de inmovilización reversibles en fase sólida, como se describe a continuación. Cualquier otra perla de purificación de ADN similar se puede utilizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La suspensión de perlas SPRI debe resuspenderse completamente y equilibrarse en RT con rotación antes de su uso.
- Transfiera el ADN eluyido a un nuevo tubo de PCR y agregue 80 μL de EB tampón para hacer un volumen final de 100 μL.
- Añadir 55 μL de perlas SPRI (0,55x volumen de muestra) y mezclar por pipeteo. Incubar durante 5 min en RT, y luego separar en un mini soporte magnético para tiras de PCR de 8 tubos durante 5 min.
- Transfiera 150 μL del sobrenadante a un nuevo tubo de PCR. Añadir 95 μL de perlas SPRI y mezclar por pipeteo.
NOTA: El sobrenadante contiene ADN de aproximadamente 500 pb o menos. - Incubar durante 5 minutos en RT, y luego separar en el mini soporte magnético durante 5 min. Deseche el sobrenadante cuidadosamente.
- Lave las perlas durante 1 minuto con 200 μL de EtOH al 70%. Repita dos veces para tres lavados en total.
NOTA: No mueva los tubos de PCR del soporte magnético durante los lavados. - Después del lavado final, gire los tubos a 1.000 × g durante 1 minuto y elimine el EtOH restante. Secar el pellet con la tapa abierta a 37 °C durante 2 min en una máquina de PCR.
NOTA: Los gránulos de cuentas deben mostrar solo algunas grietas menores una vez secas. Evite el secado excesivo. - Resuspender el pellet con 20 μL de tampón EB mediante pipeteo e incubar durante 5 min a RT. Separar en el mini soporte magnético durante 5 min, y luego transferir 18 μL del sobrenadante que contiene la biblioteca final a un nuevo tubo de 1,5 ml.
NOTA La biblioteca se puede almacenar a -20 °C mientras se realiza un control de calidad.
11. Cuantificación del ADN mediante un fluorómetro
- Para preparar la mezcla maestra, diluya el reactivo de alta sensibilidad (HS) 200x dsDNA con tampón dsDNA HS hasta una concentración final de 1x.
- Para los estándares, agregue 190 μL de la mezcla maestra 1x y 10 μL de la mezcla estándar 1 o estándar 2 a un tubo fluorómetro.
NOTA: Equilibre los estándares en RT en la oscuridad antes de comenzar la cuantificación. - Para las muestras de la biblioteca, agregue 198 μL de la mezcla maestra 1x y 2 μL de cada muestra a un tubo fluorómetro separado.
NOTA: Si las cantidades de muestra son limitadas, el volumen de muestra puede reducirse a 1 μL, y el volumen de mezcla maestra 1x puede aumentarse a 199 μL. - Vortex o agite los tubos fluorómetros, y déjelos reposar durante 5 minutos en RT en la oscuridad. Mida la concentración de ADN utilizando el ensayo dsDNA HS del fluorómetro.
12. Control de calidad de la biblioteca mediante sistemas de electroforesis de alta sensibilidad
- Tome la biblioteca ATAC-seq y diluya con agua libre de nucleasas hasta una concentración final de 1-5 ng / μL.
- Analice la distribución de tamaños de las bibliotecas ATAC-seq utilizando sistemas de electroforesis automatizados de alta sensibilidad siguiendo los protocolos del fabricante.
13. Control de calidad de la biblioteca ATAC-seq mediante qPCR dirigida
- Tome 5-10 ng de la biblioteca ATAC-seq y diluya con 50 μL de agua libre de nucleasa.
- Ejecutar la qPCR utilizando cebadores dirigidos a los promotores y potenciadores conocidos por ser activos en los adipocitos de acuerdo con las condiciones de ciclo indicadas en la Tabla 7.
- Utilizar cebadores de control negativo dirigidos a regiones genómicas cerradas/silenciosas (Tabla 7).
- Calcular el enriquecimiento del promotor/potenciador sobre los controles negativos (Tabla 8).
NOTA: Se espera ver enriquecimientos de ≥ 10-20 veces con muestras exitosas.
14. Secuenciación
- Envíe las bibliotecas ATAC-seq para su secuenciación. Utilice la secuenciación de extremo pareado (2 x 34 pb, 2 x 50 pb o más) con números de lectura promedio de 10-30 millones de lecturas por muestra.
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Representative Results
Para analizar el tejido adiposo utilizando este protocolo ATAC-seq, generamos ratones Adipoq-NuTRAP que fueron alimentados con dietas de comida; luego aislamos núcleos de adipocitos del tejido adiposo blanco epididimario (eWAT), tejido adiposo blanco inguinal (iWAT) y tejido adiposo marrón (BAT) mediante citometría de flujo. Los núcleos aislados se utilizaron para el marcado, seguido de purificación de ADN, amplificación por PCR, pasos de control de calidad, secuenciación y análisis de datos, como se describió anteriormente. El propósito de este experimento representativo fue perfilar la accesibilidad a la cromatina de poblaciones de adipocitos puros aislados de diferentes depósitos de grasa.
Observamos que los núcleos de adipocitos marcados con mCherry y GFP eran claramente distinguibles de los núcleos de otros tipos de células aisladas de los tejidos adiposos de un ratón Adipoq-NuTRAP utilizando citometría de flujo (Figura 2A-C). Hubo diferencias en las fracciones de adipocitos dependiendo del tipo de depósito adiposo: ~50% en eWAT, ~30% en iWAT y ~65% en BAT (Figura 2D)7. Recolectamos 10,000 núcleos dentro de 2-10 minutos por muestra y los usamos para los procedimientos ATAC-seq. Realizamos un total de 10-13 ciclos de PCR (cinco ciclos de la primera PCR y de cinco a ocho ciclos de la segunda PCR, Figura 3A). Si las muestras requieren más de un total de 15 ciclos de PCR, esto puede indicar muestras de baja calidad (Figura 3B). El análisis de distribución de tamaños de las bibliotecas ATAC-seq demostró múltiples picos correspondientes a la región libre de nucleosomas (NFR) y mono, di y multinucleosomas (Figura 4A-C), con tamaños promedio de ~ 500-800 pb. Las muestras de mala calidad típicamente mostraron principalmente NFR con pocos o nulos picos nucleosómicos (Figura 4D). Las pruebas de control de calidad por el análisis qRT-PCR mostraron enriquecimientos de 10-20 veces con los elementos genómicos positivos cerca de los genes marcadores de adipocitos como Adipoq, Fabp4, Plin1 y Pnpla2, mientras que no se mostró enriquecimiento con el control negativo (Figura 5). También observamos enriquecimiento con el gen termogénico Ucp1 específicamente en BAT pero no en eWAT o iWAT (Figura 5).
Después de la secuenciación y el análisis, identificamos ~ 55,000 picos combinados de tres depósitos adiposos diferentes (eWAT, iWAT y BAT). Las lecturas mitocondriales fueron <2%, y la fracción bajo los picos fue ~18%-44% (Figura 6A, B). Las muestras de mala calidad pueden tener lecturas de mitocondrias significativamente más altas y / o una fracción menor de lecturas en las regiones pico. La inspección visual de las pistas de la biblioteca ATAC-seq reveló múltiples picos fuertes con altas relaciones señal-ruido cerca de los genes marcadores de adipocitos, como Adipoq, Plin1 y Fabp4, de todos los depósitos adiposos (Figura 7A-C). También observamos fuertes picos ATAC-seq en el locus Ucp1 del fabricante de adipocitos marrones en la muestra BAT, pero estos picos no se observaron en las muestras eWAT o iWAT (Figura 7D). Todos estos datos indican datos ATAC-seq exitosos generados a partir de núcleos de adipocitos.
Figura 1: Un diagrama de flujo esquemático de ATAC-seq específico de adipocitos utilizando ratones NuTRAP. Los pasos exclusivos de este protocolo se resaltan en los cuadros sombreados en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Activación representativa del sistema de control de los bienes sobre el terreno que ilustra el aislamiento de núcleos de adipocitos marcados con mCherry/GFP de los tejidos adiposos de un ratón Adipoq-NuTRAP. (A-C) Análisis de citometría de flujo de núcleos aislados del eWAT, iWAT y BAT de un ratón Adipoq-NuTRAP. (D) Análisis cuantitativo de núcleos de adipocitos y no adipocitos en el eWAT, iWAT y BAT de un ratón Adipoq-NuTRAP. Los datos son medias ± SEM (n = 3). Estos datos de recuento de núcleos son de Roh et al.7. Abreviaturas: FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; GFP = proteína verde fluorescente; eWAT = tejido adiposo blanco epididimario; iWAT = tejido adiposo blanco inguinal; MTD = tejido adiposo marrón; NuTRAP = marcaje nuclear y purificación de afinidad ribosómica; Adipoq-NuTRAP = ratón NuTRAP cruzado con la línea adiponectina-Cre específica de adipocitos; FSC-A = área de pico de dispersión hacia adelante; FSC-H = altura del pico de dispersión hacia adelante; SSC-A = área de pico de dispersión lateral; FITC-A = área pico de isotiocianato de fluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Curvas de amplificación representativas de qRT-PCR. (A) Muestra de buena calidad que necesita siete ciclos de amplificación adicionales. (B) Muestra de mala calidad que necesita ≥15 ciclos adicionales. Abreviatura: qRT-PCR = PCR de transcripción inversa cuantitativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Perfiles de distribución de tamaño de las bibliotecas ATAC-seq. (A-C) Las bibliotecas de buena calidad y (D) de mala calidad se muestran como resultados representativos. Abreviaturas: ATAC-seq = ensayo para cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento; FU = unidades de fluorescencia; PA = pares de bases; NFR = región libre de nucleosomas; eWAT = tejido adiposo blanco epididimario; iWAT = tejido adiposo blanco inguinal; MTD = tejido adiposo marrón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis qPCR de control de calidad de las librerías ATAC-seq. Enriquecimientos para promotores y potenciadores cerca de los marcadores generales de adipocitos Adipoq, Fabp4, Plin1 y Pnpla2 o el marcador de adipocitos marrón Ucp1. Abreviaturas: ATAC-seq = ensayo para cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento; NC = control negativo; eWAT = tejido adiposo blanco epididimario; iWAT = tejido adiposo blanco inguinal; MTD = tejido adiposo marrón. Los datos son medias ± SEM (n = 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Lecturas mitocondrias y fracciones bajo los picos de las bibliotecas ATAC-seq. (A) Las mitocondrias leen (%) y (B) fracciones por debajo de los picos (%) de eWAT, iWAT y BAT. Abreviaturas: ATAC-seq = ensayo para cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento; eWAT = tejido adiposo blanco epididimario; iWAT = tejido adiposo blanco inguinal; MTD = tejido adiposo marrón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Pistas de señal ATAC-seq en los loci de genes representativos. (A-C) Genes marcadores de adipocitos generales. (B) Marcador marrón específico de adipocitos. Abreviaturas: ATAC-seq = ensayo para cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento; eWAT = tejido adiposo blanco epididimario; iWAT = tejido adiposo blanco inguinal; MTD = tejido adiposo marrón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Componentes de la mezcla maestra Tn5. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Componentes de la mezcla maestra de PCR y condiciones iniciales de ciclo de PCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Lista de cebadores con código de barras para amplificación por PCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 4: Componentes de la mezcla maestra de qPCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 5: condiciones de ciclo de qPCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 6: Condiciones de ciclo de segunda PCR para amplificación adicional. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 7: Secuencias de cebadores y condiciones de ciclo de qPCR específicas para el control de calidad de la biblioteca ATAC-seq. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 8: Análisis de los resultados de la qPCR para el control de calidad. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
En este trabajo, hemos presentado un protocolo ATAC-seq optimizado para evaluar la accesibilidad de la cromatina específica de adipocitos in vivo. Este protocolo ATAC-seq que utiliza el ratón Adipoq-NuTRAP generó con éxito perfiles de accesibilidad de cromatina específicos de adipocitos. El factor más crítico para los experimentos ATAC-seq exitosos y reproducibles es la calidad del núcleo. Es fundamental congelar inmediatamente los tejidos adiposos disecados en nitrógeno líquido y almacenarlos de forma segura a -80 °C sin descongelarlos hasta su uso. También es importante prevenir el daño del núcleo de los adipocitos durante el aislamiento y la clasificación del núcleo. Las muestras deben manipularse suavemente mediante centrifugación a baja velocidad y un pipeteo mínimo durante todo el proceso de aislamiento de núcleos.
La activación cuidadosa durante la clasificación de los núcleos es crucial para aislar selectivamente los núcleos de adipocitos marcados con mCherry/GFP (Figura 1). Es importante garantizar una separación clara entre las poblaciones mCherry/GFP-positivas y negativas. Del mismo modo, el manejo suave y la clasificación rápida son necesarios para preservar la naturaleza de la cromatina en los núcleos. Si la fluorescencia es débil, la clasificación lleva demasiado tiempo y/o las fracciones de adipocitos están fuera de los rangos previstos, esto indica que puede haber problemas con las muestras o problemas durante los procedimientos de aislamiento de núcleos. Este protocolo puede ser modificado dependiendo de las circunstancias experimentales. Primero, el número de núcleos requeridos para el ATAC-seq puede bajar a 1.000 o hasta 100.000. Si hay menos de 5.000 núcleos, el uso de un volumen reducido adicional (0,6 μL) de la enzima TDE I evitaría el etiquetado excesivo. Para un número de núcleos igual o superior a 50.000, el volumen de la mezcla maestra Tn5 puede duplicarse a 50 μL, que es el mismo volumen utilizado en el protocolo original10.
En segundo lugar, se pueden usar otros sistemas de etiquetado de núcleos, como los ratones INTACT (aislamiento de núcleos marcados en tipos de células específicos), en lugar de los ratones NuTRAP16. Como los ratones INTACTOS expresan la proteína de membrana nuclear SUN1 marcada con GFP, los núcleos marcados con GFP pueden aislarse mediante clasificación y usarse para ATAC-seq utilizando los mismos métodos descritos en este protocolo. También se puede adoptar cualquier otro método de etiquetado nuclear. Por último, los adipocitos cultivados in vitro también se pueden utilizar para ATAC-seq siguiendo este protocolo. Para esto, las células cultivadas en platos / platos se raspan, se recolectan usando NPB y luego se someten a los mismos procedimientos posteriores, excepto que la clasificación debe hacerse solo en función del tamaño, la complejidad y Hoechst, no mCherry / GFP como se describió anteriormente15.
Este protocolo ATAC-seq específico de adipocitos que utiliza la técnica NuTRAP plantea una limitación ya que no funciona sin marcado fluorescente; Por lo tanto, el análisis de muestras humanas no funcionará con esta técnica. Sin embargo, todavía es posible realizar ATAC-seq con adipocitos aislados por métodos de digestión tisular y flotación. Cabe señalar que trabajar con adipocitos flotantes humanos tiene algunas limitaciones, como la contaminación por otros tipos de células cuando se utiliza centrifugación de baja velocidad y la pérdida de adipocitos grandes cuando se utiliza centrifugación de mayor velocidad. Este protocolo se puede aplicar a cualquier tipo de célula para la que se disponga de líneas Cre específicas, lo que permite un perfil eficiente de cromatina específica del tipo de célula incluso con entradas de celda limitadas17. En conclusión, este protocolo ATAC-seq mejorado será útil para los investigadores que deseen evaluar la accesibilidad a la cromatina de tipos celulares específicos dentro de tejidos heterogéneos ex vivo, además de los adipocitos que discutimos aquí.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros relevantes o materiales relacionados con la investigación descrita en este documento.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el IUSM Showalter Research Trust Fund (a H.C.R.), una subvención piloto y de viabilidad del Centro IUSM para la diabetes y las enfermedades metabólicas (a H.C.R.), el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (R01DK129289 a H.C.R.), y el Premio de la Facultad Junior de la Asociación Americana de Diabetes (7-21-JDF-056 a H.C.R.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
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