Summary
Nükleer floresan etiketlemeli transgenik muhabir farelerden izole edilen yağ dokuları ile çekirdek sıralama kullanarak özellikle adipositler üzerinde yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için bir test protokolü sunuyoruz.
Abstract
Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için test, genom çapında kromatin erişilebilirlik profillemesini sağlayan sağlam bir tekniktir. Bu teknik, bir dizi biyolojik süreçte gen ekspresyonunun düzenleyici mekanizmalarını anlamak için yararlı olmuştur. ATAC-seq farklı numune tipleri için modifiye edilmiş olmasına rağmen, yağ dokuları için ATAC-seq yöntemlerinin etkili modifikasyonları olmamıştır. Yağ dokuları ile ilgili zorluklar arasında karmaşık hücresel heterojenite, büyük lipit içeriği ve yüksek mitokondriyal kontaminasyon sayılabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, transgenik muhabir Nuclear etiketleme ve Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) faresinden yağ dokuları ile floresan aktive edilmiş çekirdek sıralama kullanarak adiposit spesifik ATAC-seq sağlayan bir protokol geliştirdik. Bu protokol, çekirdek girişi ve reaktiflerin miktarını azaltırken minimum boşa harcanan sıralama okumalarıyla yüksek kaliteli veriler üretir. Bu yazıda, fare yağ dokularından izole edilen adiposit çekirdeklerinin kullanımı için doğrulanmış ATAC-seq yöntemi için ayrıntılı adım adım talimatlar verilmektedir. Bu protokol, adipositlerdeki kromatin dinamiklerinin çeşitli biyolojik stimülasyonlar üzerinde araştırılmasına yardımcı olacak ve bu da yeni biyolojik anlayışlara izin verecektir.
Introduction
Fazla enerjiyi lipit molekülleri şeklinde depolamak için uzmanlaşmış olan yağ dokusu, metabolik düzenleme için kilit bir organdır. Adiposit oluşumunun ve bakımının sıkı kontrolü, yağ dokusu fonksiyonu ve tüm vücut enerji homeostazı için hayati öneme sahiptir1. Birçok transkripsiyonel düzenleyici, adiposit farklılaşmasının, plastisitesinin ve fonksiyonunun kontrolünde kritik bir rol oynamaktadır; Bu düzenleyicilerin bazıları insanlarda metabolik bozukluklarla ilişkilidir 2,3. Gen ekspresyonu ve epigenomik analiz için yüksek verimli dizileme tekniklerindeki son gelişmeler, adiposit biyolojisinin moleküler düzenleyicilerinin keşfini daha da kolaylaştırmıştır4. Yağ dokularını kullanan moleküler profilleme çalışmaları, bu dokuların heterojenliği nedeniyle zordur. Yağ dokusu öncelikle yağ depolamadan sorumlu olan adipositlerden oluşur, ancak aynı zamanda fibroblastlar, endotel hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi çeşitli diğer hücre tiplerini de içerir5. Ek olarak, yağ dokusunun hücresel bileşimi, sıcaklık ve beslenme durumu6 gibi patofizyolojik değişikliklere yanıt olarak dramatik bir şekilde değişir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, daha önce GFP etiketli ribozomlar ve mCherry etiketli biyotinile çekirdekleri Cre rekombinazına bağımlı bir şekilde üreten Nükleer Etiketleme ve Çevirme Ribozom Afinite Saflaştırma (NuTRAP) adlı transgenik bir muhabir fare geliştirdik7. Çift etiketleme sistemi, dokularla hücre tipine özgü transkriptomik ve epigenomik analizlerin yapılmasını sağlar. Adiposit-spesifik adiponektin-Cre hatları (Adipoq-NuTRAP) ile çaprazlanan NuTRAP farelerini kullanarak, daha önce in vivo saf adiposit popülasyonlarından gen ekspresyon profillerini ve kromatin durumlarını karakterize ettik ve obezite sırasında nasıl değiştiklerini belirledik 7,8. Daha önce, NuTRAP fareleri kahverengi ve bej adiposit spesifik Ucp1-Cre çizgileri (Ucp1-NuTRAP) ile geçti, sıcaklık değişimlerine yanıt olarak nadir termojenik adiposit popülasyonunun, bej adipositlerin epigenomik yeniden şekillenmesini karakterize etmemize izin verdi9.
ATAC-seq, genom çapında kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan analitik bir yöntemdir. ATAC-seq'te kullanılan hiper-reaktif Tn5 transpozaz, çekirdeklerin kromatinden erişilebilir bölgesindeki dizileme adaptörlerini etiketleyerek açık kromatin bölgelerinin tanımlanmasına izin verir10. ATAC-seq basit bir yöntemdir, ancak sağlam sonuçlar sağlar ve düşük girişli numunelerde bile oldukça verimlidir. Bu nedenle, en popüler epigenomik profilleme yöntemlerinden biri haline gelmiştir ve çeşitli biyolojik bağlamlarda gen ekspresyonunun düzenleyici mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Orijinal ATAC-seq protokolü oluşturulduğundan beri, protokolü çeşitli numune türleri için değiştirmek ve optimize etmek için çeşitli ATAC-seq türevi teknikler daha da geliştirilmiştir. Örneğin, Fast-ATAC kan hücresi örneklerini analiz etmek için tasarlanmıştır11, Omni-ATAC dondurulmuş doku örnekleri12 için optimize edilmiş bir protokoldür ve MiniATAC-seq erken evre embriyo analizi13 için etkilidir. Bununla birlikte, ATAC-seq yönteminin adipositlere, özellikle doku örneklerinden uygulanması hala zordur. Yağ dokusunun heterojenliğine ek olarak, yüksek lipid içeriği, çekirdek izolasyonundan sonra bile Tn5 transpozaz tarafından etkili rekombinasyon reaksiyonlarına müdahale edebilir. Ayrıca, adipositlerdeki, özellikle kahverengi ve bej adipositlerdeki yüksek mitokondriyal içerik, yüksek mitokondriyal DNA kontaminasyonuna ve boşa harcanan dizileme okumalarına neden olur. Bu yazıda Adipoq-NuTRAP fareleri kullanılarak adiposit-spesifik ATAC-seq için bir protokol açıklanmaktadır (Şekil 1). Floresan etiketli çekirdek sıralamadan yararlanarak, bu protokol adiposit çekirdeğinin saf popülasyonlarının diğer kafa karıştırıcı hücre tiplerinden uzakta toplanmasına ve lipitlerin, mitokondrilerin ve doku kalıntılarının etkili bir şekilde uzaklaştırılmasına izin verir. Bu nedenle, bu protokol hücre tipine özgü yüksek kaliteli veriler üretebilir ve standart protokole kıyasla daha az miktarda girdi ve reaktif kullanırken mitokondriyal okumalardan kaynaklanan israfı en aza indirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakımı ve deneyleri, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan prosedürlere göre gerçekleştirildi.
1. Deneye başlamadan önceki hazırlıklar
- Doku hazırlama
- Adiposit çekirdeği etiketlemesi için, hem Adipoq-Cre hem de NuTRAP için hemizygot olan Adipoq-NuTRAP fareleri üretmek için NuTRAP farelerini adiposit spesifik adiponektin-Cre hatları (Adipoq-Cre) ile çaprazlayın.
- Daha önce tarif edildiği gibi Adipoq-NuTRAP farelerinden ilgilenilen yağ dokularını diseke edin14.
- Dokuları sıvı azot içinde çırpın ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
NOT: Her yağ yastığı bir bütün olarak saklanabilir ve dondurulmuş dokular daha sonra deneyler için kuru buz üzerinde daha küçük parçalara (~ 50 mg) kesilebilir. Alternatif olarak, yağ dokuları kesilebilir, beslenebilir ve depolama için tüplerde dondurulabilir (tüp başına ~ 50 mg). Dondurulmuş numunelerin dondurulduktan sonra kullanıma kadar çözülmesine asla izin verilmez.
- Tampon hazırlama
NOT: Deney boyunca tamponları buz üzerinde tutun.- Çekirdek hazırlama tamponu (NPB): 250 mM sakaroz, 10 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 ve %0.1 NP40. Numune başına 7 mL NPB hazırlayın. Kullanmadan önce NPB'ye taze 100x proteaz inhibitörü kokteyli (son 1x), DTT (son 1 mM) ve Hoechst (son 1 μg / mL) ekleyin.
NOT: Taze NPB hazırlanması önerilir, ancak 4 ° C'de 1 aya kadar saklanabilir. - % 0.1 NP-40 (PBS-N) ile 1x fosfat tamponlu salin hazırlayın.
- Çekirdek hazırlama tamponu (NPB): 250 mM sakaroz, 10 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 ve %0.1 NP40. Numune başına 7 mL NPB hazırlayın. Kullanmadan önce NPB'ye taze 100x proteaz inhibitörü kokteyli (son 1x), DTT (son 1 mM) ve Hoechst (son 1 μg / mL) ekleyin.
2. Çekirdek izolasyonu
- Soğuk cam Homojenizatörleri, numune başına bir cam Dounce ile, buz üzerinde. Ardından, her cam sıçramasına 7 mL NPB karışımı ekleyin.
NOT: Her deneyde en fazla sekiz numune kullanılması önerilir. Sekizden fazla numuneyle çalışmak tüm adımları önemli ölçüde geciktirir ve özellikle sıralama sırasında çekirdek kalitesini düşürebilir. - Dondurulmuş yağ dokusunu (50-100 mg) cam Dounce'a koyun ve hemen uzun bir makas çifti kullanarak birkaç küçük parçaya bölün. Tüm numuneler için gevşek bir havaneli ile 10x ve daha sonra sıkı bir havaneli ile 10x inme.
NOT: Yağ dokuları yumuşaktır, bu nedenle birkaç küçük parçaya ayırmak yeterli olmalıdır. Nadir örnekler için, toplanan adiposit çekirdeği sayısı değişebilse de, daha küçük parçalar (10-20 mg) kullanılabilir. - 100 μm'lik bir süzgeçten yeni bir 50 mL tüpe filtreleyin. Filtrelenmiş homojenatları dökerek yeni bir 15 mL tüpe taşıyın. Bir salıncak kovalı santrifüjde 4 ° C'de 10 dakika boyunca 200 × g'da döndürün. Süpernatantı mümkün olduğunca çıkarın.
NOT: Önce bir vakum kullanarak aspire edin ve ardından bir mikropipet kullanarak kalan hacmi çıkarın. - Peletin 500 μL PBS-N içinde nazik ama kapsamlı bir parmak dokunuşuyla tekrar askıya alın.
NOT: Pipetlemeden kaçının, çünkü bu çekirdeklere zarar verebilir. - Nazik pipetleme kullanarak 40 μm'lik bir süzgeçten geçerek 50 mL'lik yeni bir tüpe filtreleyin. Süzgeci 250 μL PBS-N ile durulayın. Filtrelenmiş nükleer resüspansiyonu bir mikropipet kullanarak floresan ile aktive edilmiş hücre ayıklama (FACS) tüpüne aktarın.
NOT: Varsa, numune kaybını en aza indirmek için daha küçük hacimler için tüpler ve hücre süzgeçleri kullanılabilir.
3. Çekirdek sıralama
- Toplama tüpü hazırlama
- Yeni 1,5 mL tüplere 500 μL PBS-N ekleyin ve tüm iç yüzeyleri tamponla ıslatmak için birkaç kez ters çevirin.
- Tüm sıvıyı aşağı çekmek için tüpleri kısaca döndürün ve ardından sıralayana kadar buz üzerinde soğutun.
- FACS (Şekil 2)
- Tekiller için FSC-A/FSC-H geçidini ve küçük veya büyük enkaz kaldırma için FSC-A/SSC-A geçidini kullanın.
- mCherry/GFP-pozitif adiposit çekirdeği popülasyonu için kapı.
- Adım 3.1'de hazırlanan toplama tüplerinin her birinde 10.000 çekirdek toplayın.
- Ayıklama sonrası çekirdek hazırlığı
- Her toplama tüpüne 500 μL PBS-N ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin.
- Toplama tüplerini 200 × g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca bir salıncak kovalı santrifüjde döndürün. Supernatan'ı tamamen çıkarın.
NOT: Kabarcıkları çıkarmak için önce bir vakum kullanın, süpernatanı dökün ve kalan sıvıyı tamamen çıkarmak için kağıt mendil kullanın. Pelet bu noktada görünmezdir. Santrifüjleme adımı sırasında Tn5 ana karışımını aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın.
4. Tn5 Etiketleme (Tablo 1)
- 25 μL Tn5 ana karışımı hazırlamak için, 12.5 μL 2x etiketleme DNA tamponu (TD tamponu), 1.25 μL Tn5 transpozaz (TDE I enzimi) ve 11.25 μL nükleaz içermeyen suyu karıştırın.
- Her çekirdek peletine 25 μL Tn5 ana karışımı ekleyin ve nazik pipetleme ile tekrar askıya alın. Bir termomikser kullanarak 37 °C'de 30 dakika boyunca 600 rpm'de inkübe edin.
5. DNA saflaştırma
NOT: Aşağıdaki prosedür, Malzeme Tablosunda belirtilen PCR saflaştırma kitini kullanır. Diğer benzer DNA saflaştırma yöntemleri kullanılabilir.
- Adım 4.2'den sonra elde edilen Tn5 çekirdek resüspansiyonunun 25 μL'sine 25 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. Son hacim numune başına 50 μL'dir.
- 250 μL tampon PB ekleyin.
- 5 μL 3 M sodyum asetat (NaOAc) (pH 5.2) ekleyin.
- Karışımı bir kolona aktarın (referans verilen kit ile birlikte verilir) ve oda sıcaklığında (RT) 1 dakika boyunca 17.900 × g'da santrifüjleyin.
- Akışı atın ve döndürme sütununu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin. Mutlak etanol (EtOH) içeren 750 μL tampon PE ekleyin ve RT'de 1 dakika boyunca 17.900 × g'da santrifüj yapın.
- Akışı atın ve spin sütununu tekrar aynı toplama tüpüne yerleştirin. RT'de 1 dakika boyunca 17.900 × g'da santrifüj yapın ve toplama tüpünü akışla birlikte atın.
- DNA parçalarını çıkarmak için, sütunu yeni bir 1.5 mL tüp ile donatın, 10 μL tampon EB ekleyin ve RT'de 3 dakika bekletin. RT'de 1 dakika boyunca 17.900 × g'da santrifüj.
NOT: Numuneler günlerce 4 °C'de veya haftalarca -20 °C'de saklanabilir.
6. PCR amplifikasyonu (Tablo 2)
NOT: Bu çalışmada kullanılan primerler Tablo 3'te listelenmiştir.
- Transpoze DNA fragmanlarını yükseltmek için, benzersiz bir Ad2.n barkodlama astarı (primer #2) eklemeden PCR ana karışımını hazırlayın. Numune başına 38 μL PCR ana karışımı kullanın: 11 μL nükleaz içermeyen su, 2 μL 25 μM Ad1_noMX astar (astar #1) ve 25 μL 2x PCR Master Mix.
- PCR ana karışımının 38 μL'sini 0,2 mL'lik bir PCR tüpüne ekleyin.
- Adım 5.7'den salınan DNA parçalarının 10 μL'sini ekleyin.
- Her numune için spesifik olması gereken 2 μL 25 μM astar #2 ekleyin.
- PCR'yi Tablo 2'de belirtilen döngü koşullarına göre çalıştırın.
7. Gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) testi (Tablo 4)
NOT: Bu adım, DNA'yı büyütmek için gereken ek döngüleri belirlemeyi amaçlamaktadır. İsteğe bağlıdır, ancak özellikle yeni deneyler için şiddetle tavsiye edilir.
- Astar #2 eklemeden qPCR ana karışımını hazırlayın. Numune başına 9,975 μL qPCR ana karışımı kullanın: 4,41 μL nükleaz içermeyen su, 0,25 μL 25 μM astar #1, 5 μL 2x PCR Master Mix ve 0,09 μL 100x SYBR Green I.
NOT: 100x SYBR Green I hazırlamak için, 10.000x stoğu nükleaz içermeyen suyla seyreltin. qPCR ana karışımı için kullanılan 100x SYBR Green I hacmi ihmal edilebilir olduğundan, seyreltilmiş 100x SYBR Green I'in ek bir ana karışımını yapmak daha kolaydır (örneğin, 8-10 numune için). - Bir qPCR plakasının her bir kuyucuğuna 9.975 μL qPCR ana karışımı ekleyin.
- Her bir kuyucuğa 0,25 μL 25 μM astar #2 ekleyin.
NOT: Adım 6.4'te her bir belirli örneğe eklenenlerle eşleşmesi için aynı astar #2'yi eklediğinizden emin olun. - Adım 6.5'te PCR amplifikasyonundan sonra elde edilen PCR reaksiyonunun 5 μL'sini ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
NOT: PCR reaksiyonunun kalan 45 μL'si ikinci PCR amplifikasyonu için kullanılacaktır. - qPCR'yi Tablo 5'te belirtilen döngü koşullarına göre çalıştırın.
- Amplifikasyon eğrilerini kontrol edin ve maksimumun ~% 35'ine ulaşan döngü sayısını tahmin ederek ihtiyaç duyulan ek PCR döngülerinin sayısını belirleyin (Şekil 3A).
NOT: Tipik olarak, 10.000 çekirdek beş ila sekiz ek PCR döngüsü gerektirir.
8. Ek PCR amplifikasyonu
- PCR'yi, adım 7.6'daki hesaplamalara göre PCR reaksiyonunun kalan 45 μL'sinin tamamını kullanarak çalıştırın (Tablo 6).
NOT: Her numune farklı sayıda amplifikasyon döngüsü gerektirebilir.
9. PCR saflaştırma kiti kullanılarak ikinci DNA saflaştırma
- Bölüm 5'teki prosedürlerin aynısını kullanın, ancak güçlendirilmiş DNA parçalarını 20 μL tampon EB ile temizleyin.
10. DNA fragmanı boyutu seçimi
NOT: Aşağıda açıklandığı gibi katı faz geri dönüşümlü immobilizasyon boncukları kullanın. Diğer benzer DNA saflaştırma boncukları, üreticinin talimatlarına göre kullanılabilir. SPRI boncuk süspansiyonu tamamen yeniden askıya alınmalı ve kullanımdan önce RT'de rotasyonla dengelenmelidir.
- Salınan DNA'yı yeni bir PCR tüpüne aktarın ve 100 μL'lik son bir hacim elde etmek için 80 μL tampon EB ekleyin.
- 55 μL SPRI boncuk (0,55x numune hacmi) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin ve ardından PCR 8 tüplü şeritler için mini bir manyetik standda 5 dakika boyunca ayırın.
- Süpernatantın 150 μL'sini yeni bir PCR tüpüne aktarın. 95 μL SPRI boncuk ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
NOT: Süpernatant yaklaşık 500 bp veya daha küçük DNA içerir. - RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin ve ardından mini manyetik standda 5 dakika boyunca ayırın. Supernatant'ı dikkatlice atın.
- Boncukları 200 μL% 70 EtOH ile 1 dakika yıkayın. Toplamda üç yıkama için iki kez tekrarlayın.
NOT: Yıkama sırasında PCR tüplerini manyetik standdan hareket ettirmeyin. - Son yıkamadan sonra, tüpleri 1 dakika boyunca 1.000 × g'da döndürün ve kalan EtOH'yi pipetleyin. Pelet, kapağı açıkken PCR makinesinde 2 dakika boyunca 37 °C'de kurutun.
NOT: Boncuk topakları kurutulduktan sonra sadece bazı küçük çatlaklar göstermelidir. Aşırı kurutmadan kaçının. - Peletleri pipetleme ile 20 μL tampon EB ile tekrar askıya alın ve RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin. mini manyetik standda 5 dakika ayırın ve ardından son kütüphaneyi içeren süpernatantın 18 μL'sini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
NOT - Kütüphane, kalite kontrolü yapılırken -20 °C'de saklanabilir.
11. Florometre kullanarak DNA ölçümü
- Ana karışımı hazırlamak için, 200x dsDNA Yüksek Hassasiyetli (HS) reaktifi dsDNA HS tamponu ile 1x'lik bir son konsantrasyona seyreltin.
- Standartlar için, bir florometre tüpüne 1x ana karışımın 190 μL'sini ve standart 1 veya standart 2'nin 10 μL'sini ekleyin.
NOT: Nicelemeye başlamadan önce karanlıkta RT'deki standartları dengeleyin. - Kütüphane örnekleri için, ayrı bir florometre tüpüne 1x ana karışımın 198 μL'sini ve her numunenin 2 μL'sini ekleyin.
NOT: Numune miktarları sınırlıysa, numune hacmi 1 μL'ye düşürülebilir ve 1x ana karışım hacmi 199 μL'ye çıkarılabilir. - Florometre tüplerini vorteks edin veya sallayın ve karanlıkta RT'de 5 dakika bekletin. Florometrenin dsDNA HS testini kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.
12. Yüksek hassasiyetli elektroforez sistemleri ile kütüphane kalite kontrolü
- ATAC-seq kütüphanesini alın ve nükleaz içermeyen suyla 1-5 ng / μL'lik son bir konsantrasyona kadar seyreltin.
- ATAC-seq kitaplıklarının boyut dağılımını, üreticinin protokollerini takip eden yüksek hassasiyetli, otomatik elektroforez sistemlerini kullanarak analiz edin.
13. ATAC-seq kütüphanesinin hedeflenen qPCR kullanılarak kalite kontrolü
- ATAC-seq kütüphanesinden 5-10 ng alın ve 50 μL nükleaz içermeyen su ile seyreltin.
- qPCR'yi, Tablo 7'de belirtilen döngü koşullarına göre adipositlerde aktif olduğu bilinen promotörleri ve arttırıcıları hedefleyen primerleri kullanarak çalıştırın.
- Kapalı/sessiz genomik bölgeleri hedefleyen negatif kontrol primerleri kullanın (Tablo 7).
- Destekleyici/arttırıcıların negatif kontroller üzerindeki zenginleştirmesini hesaplayın (Tablo 8).
NOT: Başarılı numunelerle ≥10-20 kat zenginleştirme yapılması beklenmektedir.
14. Sıralama
- ATAC-seq kitaplıklarını sıralama için gönderin. Örnek başına ortalama 10-30 milyon okuma sayısıyla çift uçlu sıralamayı (2 x 34 bp, 2 x 50 bp veya daha uzun) kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu ATAC-seq protokolünü kullanarak yağ dokusunu analiz etmek için, chow diyetleriyle beslenen Adipoq-NuTRAP fareleri ürettik; daha sonra epididim beyaz yağ dokusundan (eWAT), inguinal beyaz yağ dokusundan (iWAT) ve kahverengi yağ dokusundan (BAT) akım sitometrisi kullanarak adiposit çekirdeklerini izole ettik. İzole edilen çekirdekler etiketleme için kullanıldı, bunu yukarıda açıklandığı gibi DNA saflaştırma, PCR amplifikasyonu, kalite kontrol adımları, dizileme ve veri analizi izledi. Bu temsili deneyin amacı, farklı yağ depolarından izole edilen saf adiposit popülasyonlarının kromatin erişilebilirliğinin profilini çıkarmaktı.
mCherry etiketli ve GFP işaretli adiposit çekirdeklerinin, akış sitometrisi kullanılarak bir Adipoq-NuTRAP faresinin yağ dokularından izole edilen diğer hücre tiplerinin çekirdeklerinden açıkça ayırt edilebildiğini gözlemledik (Şekil 2A-C). Yağ deposunun tipine bağlı olarak adiposit fraksiyonlarında farklılıklar vardı: eWAT'ta ~%50, iWAT'ta ~%30 ve BAT'ta ~%65 (Şekil 2D)7. Numune başına 2-10 dakika içinde 10.000 çekirdek topladık ve bunları ATAC-seq prosedürleri için kullandık. Toplam 10-13 PCR döngüsü çalıştırdık (ilk PCR'nin beş döngüsü ve ikinci PCR'nin beş ila sekiz döngüsü, Şekil 3A). Numuneler toplam 15'ten fazla PCR döngüsü gerektiriyorsa, bu düşük kaliteli numunelere işaret edebilir (Şekil 3B). ATAC-seq kütüphanelerinin boyut dağılımı analizi, nükleozomsuz bölgeye (NFR) ve mono, di ve çoklu nükleozomlara (Şekil 4A-C) karşılık gelen ve ortalama boyutları ~ 500-800 bp olan çoklu pikleri göstermiştir. Düşük kaliteli örnekler tipik olarak çoğunlukla nükleozomal zirveleri olmayan veya az sayıda NFR gösterdi (Şekil 4D). qRT-PCR analizi ile yapılan kalite kontrol testleri, Adipoq, Fabp4, Plin1 ve Pnpla2 gibi adiposit marker genlerine yakın pozitif genomik elementlerle 10-20 kat zenginleşme gösterirken, negatif kontrol ile zenginleştirme gösterilmemiştir (Şekil 5). Ayrıca, termojenik gen Ucp1 ile özellikle BAT'ta zenginleştirme gözlemledik, ancak eWAT veya iWAT'ta değil (Şekil 5).
Sıralama ve analizden sonra, üç farklı yağ deposundan (eWAT, iWAT ve BAT) birleştirilmiş ~ 55.000 tepe noktası belirledik. Mitokondriyal okumalar% <2 idi ve zirvelerin altındaki fraksiyon ~% 18 -% 44 idi (Şekil 6A, B). Düşük kaliteli numuneler, pik bölgelerde önemli ölçüde daha yüksek mitokondri okumalarına ve / veya daha düşük bir okuma fraksiyonuna sahip olabilir. ATAC-seq kütüphanesi izlerinin görsel incelemesi, tüm yağ depolarından Adipoq, Plin1 ve Fabp4 gibi adiposit belirteç genlerinin yakınında yüksek sinyal-gürültü oranlarına sahip çok sayıda güçlü tepe noktası ortaya çıkardı (Şekil 7A-C). Ayrıca BAT örneğindeki kahverengi adiposit üreticisi Ucp1 lokusunda güçlü ATAC-seq zirveleri gözlemledik, ancak bu pikler eWAT veya iWAT örneklerinde gözlenmedi (Şekil 7D). Tüm bu veriler, adiposit çekirdeklerinden üretilen başarılı ATAC-seq verilerini göstermektedir.
Şekil 1: NuTRAP fareleri kullanılarak adiposit spesifik ATAC-seq'in şematik akış şeması. Bu protokole özgü adımlar kırmızı gölgeli kutularda vurgulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: mCherry/GFP etiketli adiposit çekirdeklerinin bir Adipoq-NuTRAP faresinin yağ dokularından izolasyonunu gösteren temsili FACS geçidi. (A-C) Bir Adipoq-NuTRAP farenin eWAT, iWAT ve BAT'ından izole edilmiş çekirdeklerin akış sitometrisi analizi. (D) Bir Adipoq-NuTRAP faresinin eWAT, iWAT ve BAT'ındaki adipositlerden ve adiposit olmayanlardan gelen çekirdeklerin kantitatif analizi. Veriler SEM ± ortalamadır (n = 3). Bu çekirdek sayısı verileri Roh ve ark.7'den alınmıştır. Kısaltmalar: FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama; GFP = yeşil floresan proteini; eWAT = epididim beyaz yağ dokusu; iWAT = kasık beyaz yağ dokusu; BAT = kahverengi yağ dokusu; NuTRAP = nükleer etiketleme ve ribozom afinite saflaştırmasının çevrilmesi; Adipoq-NuTRAP = NuTRAP faresi adiposit-spesifik adiponektin-Cre hattı ile çaprazlanmış; FSC-A = ileri saçılma-tepe alanı; FSC-H = ileri saçılma-tepe yüksekliği; SSC-A = yan saçılma-tepe alanı; FITC-A = floresein izotiyosiyanat-tepe alanı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: qRT-PCR'den temsili amplifikasyon eğrileri. (A) Yedi ek amplifikasyon döngüsüne ihtiyaç duyan kaliteli numune. (B) ≥15 ek döngüye ihtiyaç duyan düşük kaliteli numune. Kısaltma: qRT-PCR = kantitatif ters transkripsiyon PCR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: ATAC-seq kitaplıklarının boyut dağılım profilleri. (A-C) İyi kaliteli ve (D) düşük kaliteli kitaplıklar temsili sonuçlar olarak gösterilir. Kısaltmalar: ATAC-seq = yüksek verimli dizileme ile transpozaz erişilebilir kromatin için tahlil; FU = floresan birimleri; bp = baz çiftleri; NFR = nükleozomsuz bölge; eWAT = epididim beyaz yağ dokusu; iWAT = kasık beyaz yağ dokusu; BAT = kahverengi yağ dokusu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: ATAC-seq kütüphanelerinin kalite kontrol qPCR analizi. Genel adiposit belirteçleri Adipoq, Fabp4, Plin1 ve Pnpla2 veya kahverengi adiposit markörü Ucp1'in yakınındaki promotörler ve arttırıcılar için zenginleştirmeler. Kısaltmalar: ATAC-seq = yüksek verimli dizileme ile transpozaz erişilebilir kromatin için tahlil; NC = negatif kontrol; eWAT = epididim beyaz yağ dokusu; iWAT = kasık beyaz yağ dokusu; BAT = kahverengi yağ dokusu. Veriler SEM ± ortalamadır (n = 2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Mitokondri, ATAC-seq kütüphanelerinin zirveleri altında okur ve kesirlenir. (A) Mitokondri, eWAT, iWAT ve BAT'den zirvelerin (%) altındaki (%) fraksiyonları okur. Kısaltmalar: ATAC-seq = yüksek verimli dizileme ile transpozaz erişilebilir kromatin için tahlil; eWAT = epididim beyaz yağ dokusu; iWAT = kasık beyaz yağ dokusu; BAT = kahverengi yağ dokusu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: ATAC-seq sinyal izleri, temsili genlerin lokuslarında. (A-C) Genel adiposit belirteç genleri. (B) Kahverengi adiposit spesifik belirteç. Kısaltmalar: ATAC-seq = yüksek verimli dizileme ile transpozaz erişilebilir kromatin için tahlil; eWAT = epididim beyaz yağ dokusu; iWAT = kasık beyaz yağ dokusu; BAT = kahverengi yağ dokusu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Tn5 ana karışımının bileşenleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: PCR ana karışımının bileşenleri ve başlangıç PCR çevrim koşulları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: PCR amplifikasyonu için barkodlu primerlerin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 4: qPCR ana karışımının bileşenleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 5: qPCR çevrim koşulları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 6: Ek amplifikasyon için ikinci PCR döngü koşulları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 7: ATAC-seq kütüphanesinin kalite kontrolü için astar dizileri ve hedeflenen qPCR döngü koşulları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 8: Kalite kontrolü için qPCR sonuçlarının analizi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, adiposit spesifik kromatin erişilebilirliğini in vivo olarak değerlendirmek için optimize edilmiş bir ATAC-seq protokolü sunduk. Adipoq-NuTRAP fareyi kullanan bu ATAC-seq protokolü, adiposite özgü kromatin erişilebilirlik profillerini başarıyla oluşturdu. Başarılı ve tekrarlanabilir ATAC-seq deneyleri için en kritik faktör çekirdek kalitesidir. Disseke edilmiş yağ dokularının sıvı azot içinde derhal yapışıp dondurulması ve kullanıma kadar çözülmeden -80 ° C'de güvenli bir şekilde saklanması çok önemlidir. Çekirdek izolasyonu ve sıralama sırasında adiposit çekirdeği hasarını önlemek de önemlidir. Numuneler, tüm çekirdek izolasyon prosesi boyunca düşük hızlı santrifüjleme ve minimum pipetleme yoluyla nazikçe işlenmelidir.
Çekirdek sıralama sırasında dikkatli geçitleme, mCherry/GFP etiketli adiposit çekirdeklerini seçici olarak izole etmek için çok önemlidir (Şekil 1). mCherry / GFP-pozitif ve negatif popülasyonlar arasında net bir ayrım sağlamak önemlidir. Benzer şekilde, çekirdeklerdeki kromatinin doğasını korumak için nazik kullanım ve hızlı sıralama gereklidir. Floresan zayıfsa, sıralama çok uzun sürerse ve / veya adiposit fraksiyonları beklenen aralıkların dışındaysa, bu, çekirdek izolasyon prosedürleri sırasında numunelerle ilgili sorunlar veya problemler olabileceğini gösterir. Bu protokol deneysel koşullara bağlı olarak değiştirilebilir. İlk olarak, ATAC-seq için gereken çekirdek sayısı 1.000'e veya 100.000'e kadar düşebilir. 5.000'den az çekirdek varsa, TDE I enziminin daha da azaltılmış bir hacmini (0.6 μL) kullanmak aşırı etiketlemeyi önleyecektir. 50.000'e eşit veya daha yüksek çekirdek sayıları için, Tn5 ana karışımının hacmi, orijinal protokol 10'da kullanılanla aynı hacim olan50 μL'ye iki katına çıkarılabilir.
İkincisi, NuTRAP fareleri16 yerine INTACT (belirli hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonu) fareleri gibi diğer çekirdek etiketleme sistemleri kullanılabilir. INTACT fareler GFP etiketli SUN1 nükleer membran proteinini eksprese ettiğinden, GFP etiketli çekirdekler sıralanarak izole edilebilir ve bu protokolde açıklanan aynı yöntemler kullanılarak ATAC-seq için kullanılabilir. Diğer nükleer etiketleme yöntemleri de benimsenebilir. Son olarak, in vitro kültürlü adipositler bu protokolü takiben ATAC-seq için de kullanılabilir. Bunun için, tabaklarda / tabaklarda yetiştirilen hücreler kazınır, NPB kullanılarak toplanır ve daha sonra aynı aşağı akış prosedürlerine tabi tutulur - sıralamanın daha önce açıklandığı gibi mCherry / GFP'ye değil, yalnızca boyuta, karmaşıklığa ve Hoechst'e göre yapılması gerektiği dışında,15.
NuTRAP tekniğini kullanan bu adiposit spesifik ATAC-seq protokolü, floresan etiketleme olmadan çalışmadığı için bir sınırlama getirir; Bu nedenle, insan örneklerini analiz etmek bu teknikle çalışmayacaktır. Bununla birlikte, doku sindirimi ve yüzdürme yöntemleri ile izole edilen adipositler ile ATAC-seq yapmak hala mümkündür. İnsan floater adipositleri ile çalışmanın, düşük hızlı santrifüjleme kullanırken diğer hücre tipleri tarafından kontaminasyon ve yüksek hızlı santrifüjleme kullanıldığında büyük adipositlerin kaybı gibi bazı sınırlamaları olduğu belirtilmelidir. Bu protokol, belirli Cre hatlarının mevcut olduğu herhangi bir hücre tipine uygulanabilir ve sınırlı hücre girişleriyle bile verimli hücre tipine özgü kromatin profillemesine izin verir17. Sonuç olarak, bu geliştirilmiş ATAC-seq protokolü, burada tartıştığımız adipositlere ek olarak, ex vivo heterojen dokular içindeki spesifik hücre tiplerinden kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek isteyen araştırmacılara yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu makalede açıklanan araştırma ile ilgili herhangi bir ilgili veya maddi finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, IUSM Showalter Araştırma Güven Fonu (H.C.R.'ye), bir IUSM Diyabet ve Metabolik Hastalıklar Merkezi Pilot ve Fizibilite hibesi (HCR'ye), Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK129289'dan H.C.R.'ye) ve Amerikan Diyabet Derneği Genç Fakülte Ödülü (7-21-JDF-056'dan H.C.R.'ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Farmer, S. R.
- Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507 (2019).
- Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
- Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
- Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215 (2016).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086 (2020).
- Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
- Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619 (2022).
- Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805 (2021).
- Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).
