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Immunology and Infection

कैंसर सेल लाइनों से प्राप्त कम एंडोटॉक्सिन सामग्री एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स का अलगाव

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/65062
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1
1Department of Clinical Immunology, Jagiellonian University Medical College, 2Doctoral School of Medical and Health Sciences, Jagiellonian University, 3Institute of Veterinary Sciences, University Center of Veterinary Medicine JU-AU, University of Agriculture in Kraków
* These authors contributed equally

Summary

प्रस्तावित प्रोटोकॉल में सेल कल्चर सुपरनैटेंट से बाह्य पुटिकाओं के अलगाव के दौरान एंडोटॉक्सिन के साथ संदूषण से बचने के लिए दिशानिर्देश शामिल हैं, और उनका ठीक से मूल्यांकन कैसे करें।

Abstract

एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) विट्रो और विवो में कोशिकाओं द्वारा जारी झिल्ली पुटिकाओं की एक विषम आबादी है। जैविक जानकारी के वाहक के रूप में उनकी सर्वव्यापीता और महत्वपूर्ण भूमिका उन्हें पेचीदा अध्ययन वस्तुएं बनाती है, उनके अलगाव के लिए विश्वसनीय और दोहराव वाले प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। हालांकि, उनकी पूरी क्षमता को महसूस करना मुश्किल है क्योंकि अभी भी उनके शोध (जैसे उचित अधिग्रहण) से संबंधित कई तकनीकी बाधाएं हैं। यह अध्ययन अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के आधार पर ट्यूमर सेल लाइनों के कल्चर सुपरनैटेंट से छोटे ईवी (एमआईएसईवी 2018 नामकरण के अनुसार) के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल में ईवी के अलगाव के दौरान एंडोटॉक्सिन के साथ संदूषण से बचने और उनका उचित मूल्यांकन करने के बारे में दिशानिर्देश शामिल हैं। ईवी का एंडोटॉक्सिन संदूषण बाद के प्रयोगों में काफी बाधा डाल सकता है या यहां तक कि उनके वास्तविक जैविक प्रभावों को भी मुखौटा कर सकता है। दूसरी ओर, एंडोटॉक्सिन की अनदेखी उपस्थिति गलत निष्कर्ष निकाल सकती है। मोनोसाइट्स सहित प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं का उल्लेख करते समय यह विशेष महत्व का है, क्योंकि मोनोसाइट्स एक आबादी का गठन करते हैं जो विशेष रूप से एंडोटॉक्सिन अवशेषों के प्रति संवेदनशील है। इसलिए, एंडोटॉक्सिन संदूषण के लिए ईवी को स्क्रीन करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, खासकर जब एंडोटॉक्सिन-संवेदनशील कोशिकाओं जैसे मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, माइलॉयड-व्युत्पन्न शमन कोशिकाओं या डेंड्राइटिक कोशिकाओं के साथ काम किया जाता है।

Introduction

एमआईएसईवी 2018 नामकरण के अनुसार एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी), सेल-स्रावित झिल्लीदार पुटिकाओं के विभिन्न उपप्रकारों का वर्णन करने वाला एक सामूहिक शब्द है जो कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, ईवी विभिन्न बीमारियों के साथ-साथ चिकित्सीय एजेंटों और दवा वितरण वाहनों के लिए नए बायोमाकर्स के रूप में वादा दिखाते हैं। हालांकि, उनकी पूरी क्षमता को महसूस करना मुश्किल है क्योंकि अभी भी उनकेअधिग्रहण से संबंधित कई तकनीकी बाधाएं हैं। ऐसी ही एक चुनौती एंडोटॉक्सिन-मुक्त ईवी का अलगाव है, जिसे कई मामलों में उपेक्षित किया गया है। सबसे आम एंडोटॉक्सिन में से एक लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) है, जो ग्राम-नकारात्मक जीवाणु कोशिका दीवारों का एक प्रमुख घटक है औरविभिन्न कोशिकाओं द्वारा बड़ी संख्या में भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई के कारण तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया का कारण बन सकता है। एलपीएस एलपीएस बाइंडिंग प्रोटीन से जुड़कर प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है, इसके बाद माइलॉयड कोशिकाओं पर सीडी 14 / टीएलआर 4 / एमडी 2 कॉम्प्लेक्स के साथ बातचीत होती है। यह बातचीत MyD88- और TRIF-निर्भर सिग्नलिंग मार्गों के सक्रियण की ओर ले जाती है, जो बदले में परमाणु कारक कप्पा बी (NFkB) को ट्रिगर करती है। नाभिक में एनएफकेबी का स्थानांतरण साइटोकिन्स6 के उत्पादन की शुरुआत करता है। मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज एलपीएस के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं, और एलपीएस के संपर्क में आने से भड़काऊ साइटोकिन्स और केमोकाइन्स (जैसे, आईएल -6, आईएल -12, आईएल -12, आईएक्सएल 8, और टीएनएफ -α) 7,8 की रिहाई होती है। सीडी 14 संरचना समान आत्मीयता के साथ विभिन्न एलपीएस प्रजातियों के बंधन को सक्षम बनाती है और अन्य टोल-जैसे रिसेप्टर्स (टीएलआर) (टीएलआर 1, 2, 3, 4, 6, 7, और 9)6 के लिए सह-रिसेप्टर के रूप में कार्य करती है। मैक्रोफेज पर ईवी के प्रभावों पर किए जा रहे अध्ययनों की संख्या अभी भी 9,10,11 बढ़ रही है। विशेष रूप से मोनोसाइट्स, उनकी उप-आबादी और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कार्यों का अध्ययन करने के दृष्टिकोण से, एंडोटॉक्सिन की उपस्थिति और यहां तक कि ईवी में उनकी नकाबपोश उपस्थिति काबहुत महत्व है। एंडोटॉक्सिन के साथ ईवी के अनदेखे संदूषण से भ्रामक निष्कर्ष निकल सकते हैं और उनकी वास्तविक जैविक गतिविधि छिप सकती है। दूसरे शब्दों में, मोनोसाइटिक कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए एंडोटॉक्सिन संदूषण13 की अनुपस्थिति में आत्मविश्वास की आवश्यकता होती है। एंडोटॉक्सिन के संभावित स्रोत पानी, व्यावसायिक रूप से प्राप्त मीडिया और सेरा, मीडिया घटक और एडिटिव्स, प्रयोगशाला ग्लासवेयर और प्लास्टिकवेयर 5,14,15 हो सकते हैं।

इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य कम एंडोटॉक्सिन युक्त ईवी के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करना था। प्रोटोकॉल ईवी से एंडोटॉक्सिन को हटाने के बजाय ईवी अलगाव के दौरान एंडोटॉक्सिन संदूषण से बचने के बारे में सरल संकेत प्रदान करता है। इससे पहले, कई प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए हैं कि एंडोटॉक्सिन को कैसे हटाया जाए, उदाहरण के लिए, नैनोमेडिसिन में उपयोग किए जाने वाले इंजीनियर नैनोकणों; हालांकि, उनमें से कोई भी ईवी जैसी जैविक संरचनाओं के लिए उपयोगी नहीं है। नैनोकणों के प्रभावी डीपायरोजेनेशन को इथेनॉल या एसिटिक एसिड कुल्ला करके किया जा सकता है, 3 घंटे के लिए 175 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया जा सकता है, γ विकिरण, या ट्राइटन एक्स -100 उपचार; हालांकि, इन प्रक्रियाओं से ईवी16,17 का विनाश होता है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक अग्रणी अध्ययन है जो ईवी में एंडोटॉक्सिन अशुद्धियों से बचने पर केंद्रित है, मोनोसाइट्स9 पर ईवी के प्रभाव पर पिछले अध्ययनों के विपरीत। प्रयोगशाला अभ्यास के लिए प्रस्तावित सिद्धांतों को लागू करने से विश्वसनीय शोध परिणाम प्राप्त करने में मदद मिल सकती है, जो क्लिनिक12 में चिकित्सीय एजेंटों के रूप में ईवी के संभावित उपयोग पर विचार करते समय महत्वपूर्ण हो सकता है।

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Protocol

1. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों की तैयारी

  1. बाँझ, एकल-उपयोग ट्यूबों का उपयोग करें। यदि यह संभव नहीं है, तो बाँझ पाश्चर पिपेट या अन्य एकल-उपयोग एप्लिकेटर का उपयोग करके डिटर्जेंट से धोने के बाद अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का पुन: उपयोग करें। याद रखें कि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को एक प्रकार की सेंट्रीफ्यूज सामग्री (सेल कल्चर सुपरनैटेंट / सीरम / प्लाज्मा) और प्रजातियों (मानव / माउस / आदि) के लिए समर्पित किया जाना चाहिए।
  2. डिटर्जेंट धोने के बाद, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को विआयनीकृत, एलपीएस-मुक्त पानी 3x के साथ धोएं।
    नोट: कम गुणवत्ता वाले पानी का उपयोग न करें।
  3. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को सुखाएं, और फिर उन्हें 70% इथेनॉल से भरें। रात भर कीटाणुशोधन के लिए ट्यूबों को 70% इथेनॉल के साथ छोड़ दें। इथेनॉल को हटा दें और ट्यूबों को फिर से सुखाएं।
  4. नसबंदी पैकेजिंग में ट्यूब और कैप रखें और उन्हें कसकर बंद करें। प्लाज्मा या गैस (एथिलीन ऑक्साइड) नसबंदी विधि18,19 का उपयोग करें। नसबंदी पैकेजिंग में संलग्न अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को एक सूखी जगह पर स्टोर करें, और समाप्ति तिथि से पहले उनका उपयोग करें।
    नोट: फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) और ईवी अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले पानी में एलपीएस स्तर की मासिक निगरानी करें। निगरानी में ट्यूबों को भी शामिल किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, पानी [धोने नियंत्रण] का परीक्षण करके जो कमरे के तापमान [आरटी] पर रात भर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में संग्रहीत किया गया है)।

2. ईवी-क्षीण कम-एंडोटॉक्सिन भ्रूण गोजातीय सीरम (ईई-एफबीएस) की तैयारी

  1. अल्ट्रा-लो एंडोटॉक्सिन एफबीएस का उपयोग करना सुनिश्चित करें (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध; सामग्री की तालिका देखें; <0.1 ईयू / एमएल)।
  2. पानी के स्नान में अल्ट्रा-लो एंडोटॉक्सिन एफबीएस की एक बोतल रखें और 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पूरक प्रणाली को निष्क्रिय करने के लिए यह चरण आवश्यक है।
  3. निष्क्रिय एफबीएस को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बदलें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए 100,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को बाँझ 50 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कैप संदूषण से बचने और ट्यूब की अंगूठी को गीला करने के लिए प्रति ट्यूब 45 एमएल से अधिक न हो।
  4. इस तरह से तैयार ईई-एफबीएस सीरम को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ईई-एफबीएस (चरण 6) में एलपीएस की एकाग्रता की जांच करें। एलपीएस एकाग्रता अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन से पहले के स्तर पर होनी चाहिए।

3. सेल संस्कृति

  1. इस अध्ययन के लिए, 4.5 ग्राम /एल ग्लूकोज, एल-ग्लूटामाइन, सोडियम पाइरूवेट और जेंटामाइसिन (50 μL / mL) के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) में कल्चर SW480 औरSW620 सेल लाइनों को तदनुसार 10% ईई-एफबीएस के साथ पूरक किया गया। एसडब्ल्यू 480 और एसडब्ल्यू620 के लिए क्रमशः प्रति फ्लास्क लगभग 4.5 x 10 6 कोशिकाएं और6.5 x 10 6 कोशिकाएं बीज।
  2. सप्ताह में दो बार (~ 10 एमएल प्रति फ्लास्क) सुपरनैटेंट एकत्र करें जब कोशिकाएं पूर्ण संयोजन (क्रमशः एसडब्ल्यू 480 और एसडब्ल्यू620 के लिए प्रति फ्लास्क ~ 13.5 x 10 6 और 20 x 106 कोशिकाएं) तक पहुंच जाती हैं, और विभाजित होती हैं। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं की व्यवहार्यता 99% से कम नहीं है और कोशिकाओं को 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर संवर्धित किया जाता है।
  3. सेल संस्कृति से सुपरनैटेंट को उचित रूप से लेबल किए गए 15 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा करें। सेल मलबे को हटाने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए 500 x g पर एकत्रित सुपरनैटेंट को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सतह पर तैरने वाले कणों को सावधानी से इकट्ठा करें, मलबे को दबाने से बचें, लेबल ट्यूबों में रखें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए 3,200 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन चरण से सुपरनैटेंट एकत्र करें, बाँझ में, 50 एमएल ट्यूब लेबल करें। ट्यूबों के किनारों को गीला करने से बचें। सुनिश्चित करें कि सतह पर तैरनेवाला की मात्रा 45 एमएल से अधिक नहीं है और ट्यूबों को लंबवत रखा गया है।
  6. ट्यूब की टोपी को बाँझ पारदर्शी फिल्म के साथ लपेटें और -80 डिग्री सेल्सियस पर ऊर्ध्वाधर स्थिति में सुपरनैटेंट स्टोर करें।
    नोट: माइकोप्लाज्मा एसपीपी का मासिक नियंत्रण करें। और ताजा संस्कृति सुपरनैटेंट में एलपीएस संदूषण (चरण 6)। यदि सतह पर तैरने वाले जानवरों में एंडोटॉक्सिन का स्तर 0.05 ईयू / एमएल से अधिक है, तो सत्यापित करें कि किस चरण में संदूषण हो सकता है और शुरुआत से प्रक्रिया को फिर से शुरू करें। यदि माइकोप्लाज्मा एसपीपी द्वारा कोशिका संस्कृति का संदूषण। यदि यह पता लगाया जाता है, तो ऐसे सुपरनैटेंट से ईवी के अलगाव को बंद कर दिया जाना चाहिए।

4. सेल कल्चर सुपरनैटेंट से ईवी का अलगाव

  1. उचित मात्रा के 0.22 μm सिरिंज फिल्टर और सिरिंज तैयार करें। कल्चर सुपरनैटेंट (90 एमएल) के साथ दो ट्यूब तैयार करें।
  2. सिरिंज को सतह पर तैरने वाले से भरें और फिल्टर को सुई एडाप्टर से संलग्न करें। भरी हुई सिरिंज को 50 एमएल ट्यूब पर फिल्टर के साथ रखें। प्लंजर फ्लैंज पर धक्का दें और ~ 90 एमएल फिल्ट्रेट इकट्ठा करें।
  3. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में फिल्ट्रेट (7 एमएल) को पिपेट करें (यह सुनिश्चित करना कि उचित संतुलन के लिए प्रत्येक ट्यूब में समान मात्रा पाइप की जाती है) और सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 100,000 एक्स जी पर।
    नोट: ईवी पेलेटिंग की दक्षता कई कारकों (जैसे, रोटर प्रकार, इसके के-फैक्टर, माइग्रेशन पथ की लंबाई, माध्यम की चिपचिपाहट, आदि) पर निर्भर करती है, जिन्हें ईवी20 की बेहतर वसूली के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
  4. बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें। लंबे, फ़िल्टर किए गए पिपेट युक्तियों का उपयोग करके शेष छर्रों को इकट्ठा करें और उन्हें दो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में पूल करें। ईवी को कुल्ला करने के लिए फ़िल्टर किए गए एंडोटॉक्सिन-मुक्त पीबीएस के साथ उन्हें 7 एमएल तक भरें।
  5. पीबीएस-पुन: निलंबित छर्रों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 100,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को पूरी तरह से हटा दें, और ईवी को फिर से निलंबित करने के लिए दोनों ट्यूबों में फ़िल्टर किए गए, एंडोटॉक्सिन-मुक्त पीबीएस के 200 μL जोड़ें। धीरे से सभी ईवी को इकट्ठा करने के लिए ईवी पेलेट को पिपेट करें।
  6. ईवी निलंबन को बाँझ 1.5 एमएल टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें (यदि संभव हो, तो कम प्रोटीन बाइंडिंग ट्यूब का उपयोग करें)। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) और अन्य उद्देश्यों (जैसे, प्रोटीन एकाग्रता माप) के लिए कमजोर पड़ने की तैयारी के लिए ईवी निलंबन के 10 μL को बनाए रखें।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एनटीए द्वारा माप के लिए फ़िल्टर किए गए पीबीएस (1: 1,000) के साथ ईवी को पतला करें। एक बाँझ पारदर्शी फिल्म के साथ टोपी लपेटकर ईवी ट्यूबों को सुरक्षित करें। ईवी को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. पश्चिमी सोख्ता द्वारा विशिष्ट मार्करों का पता लगाना

  1. नमूनों में प्रोटीन स्तर निर्धारित करें (उदाहरण के लिए, ब्रैडफोर्ड परख द्वारा), और लोडिंग बफर के साथ नमूने (20 μg) तैयार करें। नमूना बफर (4x) के 5 μL और नमूना रिड्यूसिंग एजेंट (10x) के 2 μL को 20 μL की कुल मात्रा में मिलाकर लोडिंग बफर तैयार करें। नमूनों को 10 मिनट के लिए 70 °C पर इनक्यूबेट करें।
  2. एसडीएस (10% -14%) के साथ पॉलीक्रिलामाइड जैल तैयार करें और प्रत्येक कुएं में ईवी के 20 μg लोड करें।
  3. 150 वी पर 45 मिनट के लिए रनिंग बफर (30 ग्राम ट्रिस, 144 ग्राम ग्लाइसिन, 10% एसडीएस प्रति 1 एल) के साथ वैद्युतकणसंचलन चलाएं।
  4. 1 घंटे के लिए 25 वी पर टॉवबिन बफर (1.51 ग्राम ट्राइस, 7.2 ग्राम ग्लाइसिन, 10% मेथनॉल प्रति 0.5 एल) के साथ एक ट्रांसफर मशीन में जेल से पॉलीविनाइलिडेन डाइफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली पर प्रोटीन का अर्ध-शुष्क हस्तांतरण करें।
  5. टीबीएसटी बफर में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ अवरुद्ध करने के लिए टीबीएसटी बफर (ट्वीन का 1 एमएल, ट्राइस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस 10एक्स) प्रति 1 एल) के 100 एमएल में झिल्ली रखें, और आरटी में रॉकर पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. 1% बीएसए में पतला (1: 1,000) एंटीबॉडी, एंटी-सीडी 91 (क्लोन # डी 8 ओ 1 ए) या एंटी-एलिक्स1 (क्लोन # 3 ए 9) जोड़ें और रॉकर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर झिल्ली के साथ इनक्यूबेट करें। एंटीबॉडी को हटा दें और 10 मिनट के लिए 10 एमएल 1 एक्स टीबीएसटी के साथ झिल्ली 3 एक्स धोएं।
  7. झिल्ली पर प्राथमिक एंटीबॉडी के आधार पर हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज के साथ संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश या बकरी विरोधी माउस (कमजोर पड़ना: 1: 2,000) द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें, और आरटी में रॉकर पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। एंटीबॉडी हटाएं और 10 मिनट के लिए 10 एमएल 1x TBST के साथ झिल्ली 3x धोएं।
  8. 1 एमएल समाधान प्राप्त करने के लिए सब्सट्रेट और ल्यूमिनोल को 1: 1 अनुपात में मिलाएं। घोल को झिल्ली पर डालें। इमेजिंग सिस्टम के माप कक्ष में झिल्ली को तुरंत रखें, केमिल्यूमिनेसेंस मॉड्यूल चुनें, और स्क्रीन पर प्रोटीन बैंड की कल्पना करें।

6. लिमुलस एमेबोसाइट लाइसेट टेस्ट (एलएएल) द्वारा एंडोटॉक्सिन स्तर का माप

  1. निर्माता की सिफारिश के अनुसार, एंडोटॉक्सिन स्तर का क्रोमोजेनिक एलएएल माप करें। संक्षेप में, लिमुलस एमेबोसाइट लाइसेट (एलएएल) के साथ एंडोटॉक्सिन की बातचीत के आधार पर विधि का उपयोग करें। इस विधि की पहचान सीमा 0.005 ईयू / एमएल है।
    नोट: लाल परख, इसकी सीमाओं के बावजूद, वर्तमान में विज्ञान या चिकित्सा में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न प्रकार के समाधानों और अन्य उत्पादों में एंडोटॉक्सिन संदूषण का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए मानक विधि बनी हुईहै। इस किट का सीमित कारक पुनर्गठित एमेबोसाइट लाइसेट समाधान की स्थिरता है, जो पुनर्गठन के तुरंत बाद जमे हुए होने पर -20 डिग्री सेल्सियस पर केवल 1 सप्ताह के लिए स्थिर है।
  2. ईवी और अन्य नमूनों को दस गुना कमजोर करने और सीरम को 50 गुना कमजोर करने का उपयोग करें। आगे के प्रयोगों के लिए, केवल कम-एंडोटॉक्सिन अभिकर्मकों जैसे ईई-एफबीएस, डीएमईएम, पीबीएस, आरपीएमआई (<0.005 ईयू / एमएल), और एलपीएस-मुक्त संस्कृति सुपरनैटेंट का उपयोग करें।

7. ईवी नमूनों में प्रोकैरियोटिक 16 एस आरआरएनए जीन का पता लगाना

  1. ईवी नमूनों से डीएनए को अलग करें। अभिकर्मकों और अलगाव की साइट को सड़न रोकनेवाला रखने की कोशिश करें। डीएनए एकाग्रता और गुणवत्ता को मापें (उदाहरण के लिए, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके)।
  2. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) करें, जैसा कि पहले वर्णितहै। पराबैंगनी प्रकाश (यूवी) में पीसीआर उत्पादों की कल्पना करने के लिए एथिडियम ब्रोमाइड या एसवाईबीआर ग्रीन के साथ 1.5% अगारोस जेल तैयार करें।
  3. 45 मिनट के लिए 75 वी पर टीआरआईएस-एसीटेट-ईडीटीए बफर के साथ नमूने और वजन मार्कर के वैद्युतकणसंचलन चलाएं। इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके डीएनए बैंड की कल्पना करें।

8. मानव मोनोसाइट मॉडल में उत्तेजना के लिए प्रभावी एलपीएस एकाग्रता का निर्धारण

  1. आरपीएमआई1640 में मोनोसाइट निलंबन के 2 x 10 6 मोनोसाइट्स / एमएल को एल-ग्लूटामाइन, ग्लूकोज और 2% ईई-एफबीएस के साथ पूरक तैयार करें। 96-वेल टिशू कल्चर प्लेट22 के प्रति कुएं के लिए 50 μL निलंबन जोड़ें।
  2. निम्नलिखित अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए एलपीएस या कल्चर माध्यम की उचित मात्रा जोड़ें: 0 pg/mL (नियंत्रण), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL, और 100 ng/mL, सेल निलंबन की कुल मात्रा में। प्रत्येक एलपीएस एकाग्रता की तीन प्रतियां बनाएं।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 18 घंटे के लिए कोशिकाओं कोकल्चर करें। सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें।
  4. 5 मिनट के लिए 2,000 x g पर सुपरनैटेंट को घुमाएं। सुपरनैटेंट को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें। निर्माता की प्रक्रियाके अनुसार, प्रवाह साइटोमीटर के साथ साइटोमेट्रिक बीड्स सरणी (सीबीए) मानव साइटोकिन किट के साथ एकत्रित सुपरनैटेंट में टीएनएफ 8,23 और आईएल -1023 एकाग्रता को मापें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के लिए एक शर्त या अनिवार्य कदम अभिकर्मकों से संभावित एंडोटॉक्सिन संदूषण का बहिष्करण है। उपयोग किए जा रहे सभी अभिकर्मकों, जैसे कि एफबीएस, डीएमईएम, आरपीएमआई, पीबीएस, और यहां तक कि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब, एंडोटॉक्सिन-मुक्त (<0.005 ईयू / एमएल) होना चाहिए। कोई एंडोटॉक्सिन संदूषण के शासन को बनाए रखना आसान नहीं है, उदाहरण के लिए, सेल संस्कृति के लिए नियमित / मानक सीरम इसका समृद्ध स्रोत हो सकता है (0.364 ईयू / एमएल; तालिका 1 देखें)।

यद्यपि इस प्रोटोकॉल को कम एंडोटॉक्सिन सामग्री वाले ईवी को अलग करने के लिए विकसित किया गया था, लेकिन पृथक ईवी को चिह्नित करना महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन में, ईवी को दो कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों, एसडब्ल्यू 480 और एसडब्ल्यू 620 से अलग किया गया था। ईवी मार्करों, सीडी 9 और एलिक्स की अभिव्यक्ति की पुष्टि पश्चिमी धब्बा (चित्रा 1 ए) द्वारा की गई थी। SW480 और SW620 कोशिकाओं (क्रमशः 134 nm और 128.2 nm) से पृथक ईवी के औसत आकार में कोई अंतर नहीं था; चित्र 1 बी)। इसके अतिरिक्त, इन सेल लाइनों (चित्रा 1 सी) के बीच पृथक ईवी की एकाग्रता में कोई अंतर नहीं था। एनटीए द्वारा मापे गए ईवी आकार के अनुकरणीय वितरण, चित्रा 1 डी में प्रस्तुत किए गए हैं। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का समय सीवीजेत्कोविच एट अल.20 के परिणामों के अनुसार अनुकूलित किया गया था। संक्षेप में, दो निश्चित कोण रोटर (70 टीआई और टी -1270) के बीच केन्द्रापसारक रन मापदंडों के रूपांतरण के लिए गणितीय सूत्र का उपयोग किया गया था। 100,000 x g पर 120 मिनट के लिए T-1270 रोटर के साथ घूमने से छोटे ईवी की कमी की प्रभावशीलता 155 मिनट के लिए 118,000 x g पर 70 Ti रोटर का उपयोग करके हासिल की गई तुलना में थोड़ी कम थी; हालांकि, यह अभी भी प्रभावी आरएनए और प्रोटीन पेलेटिंग की सीमा में था। गणना की पुष्टि प्रयोगात्मक डेटा (तालिका एस 1) द्वारा की गई थी, जहां सेंट्रीफ्यूजेशन के विस्तारित समय (4 घंटे बनाम 2 घंटे) का पैलेट किए गए या अभी भी सुपरनैटेंट में मौजूद ईवी की संख्या पर कोई सार्थक प्रभाव नहीं पड़ा।

मोनोसाइट प्रतिक्रिया का कारण बनने वाले एलपीएस के स्तर का आकलन किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, मानव मोनोसाइट्स को एलपीएस (0 पीजी / एमएल, 10 पीजी / एमएल, 50 पीजी / एमएल, 100 पीजी / एमएल, 1 एनजी / एमएल, और 100 एनजी / एमएल) की क्रमिक सांद्रता के साथ संवर्धित किया गया था। रातोंरात संस्कृति के बाद, आईएल -10 और टीएनएफ का स्तर संस्कृति सुपरनैटेंट्स में निर्धारित किया गया था। इस अध्ययन में, मोनोसाइट्स में आईएल -10 और टीएनएफ के स्राव को सक्षम करने वाले एलपीएस की सबसे कम खुराक 50 पीजी / एमएल थी, जो 0.5 ईयू / एमएल (चित्रा 2) के अनुरूप थी।

अंत में, अंतिम चरण ऊपर दिए गए ईवी में एलपीएस के स्तर का परीक्षण करने से संबंधित था। ईवी नमूनों का एलपीएस संदूषण लगभग 0.5 ईयू / एमएल (50 पीजी / एमएल) था। चित्र 3) दोनों सेल लाइनों के लिए (45.80 ± 20.39 pg/mL और SW480 और SW620 के लिए क्रमशः 45.80 ± 7.412 pg/mL)। इसका मतलब यह है कि 1 μL EV (लगभग 109 EV) में 0.05 pg से कम एंडोटॉक्सिन होता है, और जब मोनोसाइट निलंबन के 100 μL (प्रति एक मोनोसाइट 104 EV का अनुपात) में जोड़ा जाता है तो यह 100 बार पतला हो जाता है (LPS की अंतिम सांद्रता लगभग 0.5 pg / mL है)।

इसके अतिरिक्त, ईवी की शुद्धता का परीक्षण पीसीआर द्वारा 16 एस आरआरएनए जीन21 के लिए किया गया था, जो एसडब्ल्यू 480 और एसडब्ल्यू 620 सेल लाइनों (पूरक चित्रा 1) से अलग ईवी में जीवाणु संदूषण की कमी की पुष्टि करता है।

Figure 1
(ए) एसडब्ल्यू 480 और एसडब्ल्यू 620 सेल लाइनों से अलग ईवी के प्रोटीन मार्करों का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। (ख) एनटीए का उपयोग एसडब्ल्यू480 और एसडब्ल्यू620 सेल लाइनों (एनएम) से पृथक ईवी के आकार को मापने के लिए किया गया था। (ग) एनटीए का उपयोग एसडब्ल्यू480 और एसडब्ल्यू620 सेल लाइनों (ईवी/एमएल) से पृथक ईवी की सांद्रता को मापने के लिए किया गया था। (डी) एनटीए द्वारा मापा गया ईवी आकार का अनुकरणीय वितरण (नीली संख्या वक्र पर दिए गए बिंदु पर कण आकार को इंगित करती है)। बी और सी में डेटा को एसडी (एन = 10) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए टी-टेस्ट का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एलपीएस की विभिन्न खुराक के साथ उत्तेजित मोनोसाइट्स द्वारा आईएल -10 और टीएनएफ स्राव। मोनोसाइट्स द्वारा साइटोकिन्स का स्राव एलपीएस खुराक के साथ उत्तेजना के बाद निर्धारित किया गया था: नियंत्रित मोनोसाइट्स (एमओ) की तुलना में 10 पीजी / एमएल, 50 पीजी / एमएल, 100 पीजी / एमएल, 1 एनजी / एमएल, और 100 एनजी / एमएल। डेटा को एसडी (एन = 4) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है; मैन-व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग किया गया था। टीएनएफ और आईएल -10 सांद्रता को साइटोमेट्रिक बीड्स सरणी (सीबीए) विधि द्वारा संस्कृति सुपरनैटेंट में मापा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: क्रोमोजेनिक एलएएल परीक्षण द्वारा पृथक ईवी नमूनों में एलपीएस स्तर का माप। एसडब्ल्यू 480 और एसडब्ल्यू 620 सेल लाइनों (पीजी / एमएल) से प्राप्त ईवी नमूनों में एलपीएस सामग्री। डेटा को एसडी (एन = 6) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

S.No। नमूना एंडोटॉक्सिन स्तर [ईयू / एमएल] एंडोटॉक्सिन स्तर [pg / mL]
1 DMEM <0.005 <0.5
2 RPMI1640 <0.005 <0.5
3 एफबीएस अल्ट्रा लो एंडोटॉक्सिन <0.005 <0.5
4 4 घंटे सेंट्रीफ्यूजेशन (ईई-एफबीएस) के बाद एफबीएस अल्ट्रा लो एंडोटॉक्सिन <0.005 <0.5
5 नियमित FBS 0.368 36.8
6 फ़िल्टर किया गया PBS <0.005 <0.5
7 2 घंटे सेंट्रीगेशन के बाद एसडब्ल्यू 480 कोशिकाओं का निर्माण करता है <0.005 <0.5
8 2 घंटे सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एसडब्ल्यू 620 कोशिकाओं से कल्चर सुपरनैटेंट <0.005 <0.5
9 धोने नियंत्रण (अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में संग्रहीत पानी) <0.005 <0.5

तालिका 1: क्रोमोजेनिक एलएएल परीक्षण द्वारा निर्धारित विभिन्न अभिकर्मकों और नमूनों में एलपीएस स्तर। माप EU / mL और pg / mL के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। नमूने में डीएमईएम, आरपीएमआई, ईई-एफबीएस, एफबीएस, फ़िल्टर किए गए पीबीएस और वॉश कंट्रोल (अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब से पानी) शामिल थे।

अनुपूरक तालिका 1: एसडब्ल्यू 480 और एसडब्ल्यू 620 सेल लाइनों और पीबीएस से कल्चर सुपरनैटेंट के 2 घंटे या 4 घंटे सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद छर्रों और सुपरनैटेंट में ईवी एकाग्रता (ईवी / एमएल) और आकार (एनएम) माप के प्रतिनिधि उदाहरण। माप एनटीए द्वारा किए गए थे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: निम्नलिखित नमूनों में पैन-प्रोकैरियोट 16 एस आरआरएनए जीन प्रवर्धन के पीसीआर परिणाम, बाईं ओर से: आणविक भार सीढ़ी (एमडब्ल्यू, 100-1000 बीपी), एनसी-नकारात्मक नियंत्रण, एसडब्ल्यू 480 और एसडब्ल्यू 620 से प्राप्त ईवी, और पीसी (सकारात्मक नियंत्रण-बैक्टीरियल डीएनए) कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पिछले कुछ वर्षों में, उचित ईवी अलगाव के तरीके तेजी से महत्वपूर्ण हो गए हैं, जिससे उनके आगे के विश्वसनीय विश्लेषण सक्षम हो गए हैं, उदाहरण के लिए, विश्वसनीय ओमिक्स और कार्यात्मक डेटाप्राप्त करने के संदर्भ में। पिछले शोध अनुभव के आधार पर, ऐसा लगता है कि न केवल अलगाव विधि का प्रकार, बल्कि इस प्रक्रिया के दौरान अन्य स्थितियां भी महत्वपूर्ण हो सकती हैं। ईवी-क्षीण एफबीएस का उपयोग व्यापक रूप से आवश्यकता25,26 के रूप में मान्यता प्राप्त है; हालांकि, ईवी में एंडोटॉक्सिन संदूषण की निगरानी अक्सर उपेक्षित होती है।

फिर भी, ईवी के अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी तरीकों को प्रक्रिया के हर चरण में कठोर सड़न रोकनेवाला हैंडलिंग और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए मानक विकसित करना चाहिए था। यह ईवी के आगे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग के कारण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल एंडोटॉक्सिन-संवेदनशील कोशिकाओं, जैसे मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज के साथ पिछले अनुभव का परिणाम है, जो एंडोटॉक्सिन संवेदनशील हैं। सीडी 14, मोनोसाइट्स का एक मार्कर, पिकोमोलर सांद्रता पर एलपीएस को बांधने में सक्षम है। प्राप्त परिणामों से संकेत मिलता है कि एलपीएस के 50 पीजी / एमएल (0.5 ईयू / एमएल) के साथ उत्तेजना के बाद मोनोसाइट्स टीएनएफ और आईएल -10 का स्राव करते हैं। यांग एट अल, हालांकि, बताया कि एंडोटॉक्सिन के 0.1 ईयू / एमएल (10 पीजी / एमएल) भी एक शक्तिशाली प्रतिक्रिया (भड़काऊ आईएल 1 बी जीन का अपरेगुलेशन) 27 को प्रेरित कर सकते हैं। इसके अलावा, चैवट एट अल ने प्रदर्शित किया कि मोनोसाइट्स में टीएनएफ और आईएल -6 का इंट्रासेल्युलर उत्पादन क्रमशः एलपीएस, 2.5 पीजी / एमएल या 5 पीजी / एमएल की कम सांद्रता से प्रेरित हो सकताहै। अल्वारेज़ एट अल ने पुष्टि की कि मोनोसाइट सक्रियण दर (गणना मूल्य) एलपीएस की एक छोटी एकाग्रता के बाद बढ़ती है, जैसे कि 5 पीजी / एमएल28। इसलिए, अलगाव प्रोटोकॉल के हर संभव चरण में ईवी में एंडोटॉक्सिन संदूषण को सीमित करना एलपीएस-संवेदनशील कोशिकाओं के साथ किए गए आगे के प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान में, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन ईवी अलगाव के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है। हालांकि, हमारे ज्ञान के अनुसार, इस पद्धति द्वारा पृथक ईवी के एलपीएस संदूषण पर कोई अध्ययन नहीं है। इसलिए, उपरोक्त प्रोटोकॉल कल्चर सुपरनैटेंट से बाहरी ईवी संदूषण के बिना कम-एंडोटॉक्सिन ईवी प्राप्त करने पर केंद्रित है।

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, एंडोटॉक्सिन संदूषण के विभिन्न स्रोत हो सकते हैं। सबसे पहले, इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि एंडोटॉक्सिन एक कठिन ओप्पोनेंट है, और ग्लास या प्लास्टिकवेयर की नसबंदी के सभी तरीके इसे हटाने या गिरावट में प्रभावी नहीं हैं। उदाहरण के लिए, मानक ऑटोक्लेविंग प्रक्रिया एंडोटॉक्सिन की उच्च गर्मी स्थिरता27 के कारण एलपीएस को खत्म नहीं कर सकती है। इसके अलावा, धोने, यहां तक कि बड़े पैमाने पर, एंडोटॉक्सिन को पूरी तरह से नहीं हटा सकता है। प्रयोगशाला अभ्यास के लिए अधिक डेपायरोजेनिक तरीकों को लागू करके, जैसे प्लाज्मा या ईटीओ (एथिलीन ऑक्साइड) नसबंदी18,19, एंडोटॉक्सिन संदूषण को सीमित किया जा सकता है। इसके बाद, संभावित संदूषण की स्थायी निगरानी और रोकथाम महत्वपूर्ण है। प्रस्तुत परिणाम संस्कृति पूरकता के लिए सीरम जैसे अल्ट्रा-लो एंडोटॉक्सिन अभिकर्मकों का उपयोग करने के महत्व को इंगित करते हैं। इसके अलावा, सभी अभिकर्मकों (जैसे पीबीएस, डीएमईएम और आरपीएमआई) और यहां तक कि प्लास्टिकवेयर (जैसे, ट्यूब) के एंडोटॉक्सिन संदूषण का नियमित नियंत्रण अत्यधिक अनुशंसित है। एंडोटॉक्सिन संचय को रोकने के लिए ईवी अलगाव से पहले कल्चर सुपरनैटेंट की पूर्व-जांच करना भी आवश्यक है। जैसा कि ऊपर प्रस्तुत किया गया है, एलएएल परख द्वारा एंडोटॉक्सिन स्तरों के मानक माप का एक दिलचस्प विकल्प बैक्टीरियल 16 एस आरआरएनए जीन का पीसीआर प्रवर्धन है। ईवी में एलपीएस के अनुमेय (जो मोनोसाइट उत्तेजना को प्रेरित नहीं करता है) एंडोटॉक्सिन स्तर का निर्धारण महत्वपूर्ण है। संस्कृति की स्थिति (मोनोसाइट्स की एकाग्रता और लागू ईवी के एलपीएस के साथ संदूषण) को ध्यान में रखते हुए, ईवी की एकाग्रता; चित्रा 3), एंडोटॉक्सिन की अंतिम एकाग्रता जो ईवी के साथ उत्तेजित मोनोसाइट्स को प्रभावित करती है, 0.5 पीजी / एमएल से अधिक नहीं है (ईवी आमतौर पर 100-1,000 बार पतला होते हैं)। यह खुराक चैवट एट अल द्वारा बताई गई खुराक की तुलना में पांच गुना कम है क्योंकि कम से कम प्रभावी खुराक (2.5 पीजी / एमएल) मोनोसाइट्स23 द्वारा टीएनएफ के उत्पादन को प्रेरित करने में सक्षम है। अध्ययन में, साइटोकाइन उत्पादन को फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके निर्धारित किया गया था और परिमाणीकरण के बिना एमएफआई (औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता) शिफ्ट के रूप में प्रस्तुत किया गया था। इसके अलावा, एलपीएस की बहुत कम खुराक के साथ मोनोसाइट उत्तेजना 10% एफबीएस के साथ पूरक माध्यम में की गई थी, जो एलपीएस23 का एक अतिरिक्त स्रोत हो सकता है। यह सुझाव दे सकता है कि मोनोसाइट उत्तेजना के लिए उपयोग किए जाने वाले एलपीएस की प्रभावी खुराक अधिक थी। इस प्रकार, प्रस्तुत परिणामों और साहित्य डेटा पर विचार करते हुए, ऐसा लगता है कि ईवी में 50 पीजी / एमएल (0.5 ईयू / एमएल) तक एंडोटॉक्सिन की एकाग्रता अनुमेय है, और मोनोसाइट्स के सक्रियण का कारण नहीं है। इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में अगला कदम एंडोटॉक्सिन संदूषण को और कम करना है, यहां तक कि एलएएल या सेल-आधारित परख द्वारा अज्ञात स्तर तक भी। हाल ही में, नकाबपोश एंडोटॉक्सिन संदूषण का पता लगाने के लिए जैविक मॉडल का उपयोग करने का महत्व, जिसे कम एंडोटॉक्सिन रिकवरी (एलईआर) कहा जाता है, दृढ़तासे अनुशंसित है।

इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल इस संबंध में अभिनव है क्योंकि यह सबसे कम संभव एंडोटॉक्सिन सामग्री के साथ ईवी के अलगाव के लिए आवश्यक सभी पहलुओं को एकत्र करता है, जिसे अभी तक अन्य अध्ययनों में संबोधित नहीं किया गया है।

प्रत्येक विधि के साथ, इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, प्रस्तावित प्रोटोकॉल एंडोटॉक्सिन संदूषण को कम करता है लेकिन इसे खत्म नहीं करता है। दूसरा, यह अज्ञात है कि क्या प्राप्त शुद्धता अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए पर्याप्त है। इसलिए, प्रत्येक प्रोटोकॉल को आगे के आवेदन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस तरह के प्रोटोकॉल की स्थापना से ऐसे परिणाम प्राप्त करने की अनुमति मिलेगी जो उनके आकस्मिक संदूषण की तुलना में ईवी के जैविक रूप से सक्रिय घटकों के अनुरूप होंगे। अंत में, कई एंडोटॉक्सिन परीक्षण किट और कम एंडोटॉक्सिन सीरम खरीदने की आवश्यकता के कारण प्रक्रिया सामान्य से अधिक महंगी है। एक आशाजनक विकल्प के रूप में, बुसोलाटी ने स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन द्वारा ईवी अलगाव के लिए एक नई, परिष्कृत विधि प्रस्तुत की। यह विधि कम एंडोटॉक्सिसिटी (0.1-0.7 ईयू / एमएल; 10-70 पीजी / एमएल) 29 के साथ ईवी के अधिग्रहण की अनुमति देती है। अब तक, इस नई विधि का उपयोग आमतौर पर ईवी अलगाव के लिए नहीं किया गया है, और स्पर्शरेखीय प्रवाह निस्पंदन (टीएफएफ) प्रणाली के रूप में विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। हाल ही में, गेलुस्का एट अल ने पॉलीमाइक्सिन बी30 का उपयोग करके वायु प्रदूषकों (ईवी के आकार के साथ लेकिन झिल्ली संरचना के बिना कण पदार्थ) से एंडोटॉक्सिन को खत्म करने का एक अलग तरीका प्रस्तावित किया। हालांकि, सेल-व्युत्पन्न पुटिकाओं के लिए इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता को जैविक मॉडल के माध्यम से सत्यापित करने की आवश्यकता है, खासकर जब विवो प्रयोगों में इसके बारे में सोचा जाता है । पॉलीमिक्सिन बी और सोडियम डीऑक्सीकोलेट (एंडोटॉक्सिन हटाने के लिए भी लागू) को पहले न्यूरो- और नेफ्रोटॉक्सिक31 के रूप में वर्णित किया गया है। अन्य संभावनाएं पॉली (ε-लाइसिन) के साथ आत्मीयता कॉलम हैं, जो चुनिंदा एंडोटॉक्सिन को बांधते हैं। यह विधि त्वरित और कुशल है, हालांकि, प्रोटीन नमूने / समाधान के लिए समर्पित है; इसलिए, इसे ईवी जैसी जटिल संरचनाओं पर लागू करने के लिए सत्यापन की आवश्यकता होतीहै। इसके अलावा, ये कॉलम उच्च प्रारंभिक एंडोटॉक्सिन स्तर वाले नमूनों के लिए अभिप्रेत हैं, और एलपीएस की अपेक्षाकृत कम मात्रा को हटाने में उनकी प्रभावशीलता अज्ञात है और सत्यापन की आवश्यकता है। एलपीएस-क्षयकारी स्तंभों के साथ शुद्धिकरण के बाद एलपीएस की अंतिम प्रत्याशित एकाग्रता अभी भी प्रतिरक्षा कोशिका परीक्षणों के लिए बहुत अधिक हो सकती है (उदाहरण के लिए, <5 ईयू / एमएल)।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल ने प्रस्तावित किया कि प्रयोगशाला अभ्यास के लिए कई सिद्धांतों को लागू करके एंडोटॉक्सिन संदूषण से कैसे बचा जाए, जैसे कि ईवी अलगाव के सभी चरणों के दौरान कठोर सड़न रोकनेवाला तकनीक, अल्ट्रा-लो एंडोटॉक्सिन अभिकर्मकों का उपयोग करना, सभी प्रक्रिया चरणों में एंडोटॉक्सिन अशुद्धियों की निगरानी करना और नसबंदी विधि को बदलना। इसके अलावा, प्रस्तुत प्रोटोकॉल अलगाव प्रक्रिया के हर चरण में एंडोटॉक्सिन के स्तर को नियंत्रित करने के तरीके के बारे में संकेत प्रदान करता है। ईवी में मौजूद एलपीएस प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कार्य को प्रभावित करता है, और इसलिए इन कोशिकाओं के साथ किए गए परीक्षणों में गलत परिणाम पैदा कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे हितों के संभावित टकराव के रूप में बनाया जा सकता है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र, पोलैंड, अनुदान संख्या 2019/33/B/NZ5/00647 द्वारा समर्थित किया गया था। हम ईवी में बैक्टीरियल डीएनए का पता लगाने में उनकी अमूल्य मदद के लिए जगिएलोनियन यूनिवर्सिटी मेडिकल कॉलेज के आणविक मेडिकल माइक्रोबायोलॉजी विभाग के प्रोफेसर टॉमाज़ गोसिवस्की और एग्निएस्का क्राव्स्की को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Alix (3A9) Mouse mAb  Cell Signaling Technology 2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic GoogLab Scientific GBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow Cytometr BD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II BD Biosciences 551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 13174
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad Laboratories, Inc.  17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)  Corning 10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate Reader BIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine Serum Gibco 16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin  Biowest  S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL  PAN – Biotech P06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005
Immun-Blot PVDF Membrane Bio-Rad Laboratories, Inc.  1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE)  Enzo Life Sciences, Inc. ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad Laboratories, Inc.  1703930
Nanoparticle Tracking Analysis  Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)  Invitrogen  NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)  Invitrogen NP0004
Parafilm Sigma Aldrich P7793 transparent film
Perfect 100-1000 bp DNA Ladder EURx E3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit Thermo Scientific A39552
PP Oak Ridge Tube with sealing caps Thermo Scientific 3929, 03613
RPMI 1640 RPMI-1640 (Gibco) 11875093
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystem A24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor Thermo Scientific 75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System Bio-Rad Laboratories, Inc.  1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34577
SW480 cell line American Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell line American Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 um TPP 99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad Laboratories, Inc.  1703940 Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mL SARSTEDT 86.1171.001

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 192
कैंसर सेल लाइनों से प्राप्त कम एंडोटॉक्सिन सामग्री एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स का अलगाव
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Babula, A., Siemińska, I.,… More

Babula, A., Siemińska, I., Baj-Krzyworzeka, M. Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (192), e65062, doi:10.3791/65062 (2023).

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