Summary
Önerilen protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EV'ler), in vitro ve in vivo hücreler tarafından salınan heterojen bir membran vezikülü popülasyonudur. Her yerde bulunmaları ve biyolojik bilgi taşıyıcıları olarak önemli rolleri, onları izolasyonları için güvenilir ve tekrarlayan protokoller gerektiren ilgi çekici çalışma nesneleri haline getirir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü araştırmalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır (uygun edinim gibi). Bu çalışma, küçük EV'lerin (MISEV 2018 terminolojisine göre) diferansiyel santrifüjlemeye dayalı tümör hücre hatlarının kültür süpernatantından izolasyonu için bir protokol sunmaktadır. Protokol, EV'lerin izolasyonu sırasında endotoksinlerle kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir. EV'lerin endotoksin kontaminasyonu, sonraki deneyleri önemli ölçüde engelleyebilir veya hatta gerçek biyolojik etkilerini maskeleyebilir. Öte yandan, gözden kaçan endotoksinlerin varlığı yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu, monositler de dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin hücrelerine atıfta bulunurken özellikle önemlidir, çünkü monositler endotoksin kalıntılarına özellikle duyarlı bir popülasyon oluşturur. Bu nedenle, özellikle monositler, makrofajlar, miyeloid türevli baskılayıcı hücreler veya dendritik hücreler gibi endotoksine duyarlı hücrelerle çalışırken, EV'lerin endotoksin kontaminasyonu açısından taranması şiddetle tavsiye edilir.
Introduction
MISEV 2018 terminolojisine göre hücre dışı veziküller (EV'ler), çok sayıda fizyolojik ve patolojik süreçte çok önemli rol oynayan hücre salgılanan membranöz veziküllerin çeşitli alt tiplerini tanımlayan kolektif bir terimdir 1,2. Dahası, EV'ler çeşitli hastalıklar için yeni biyobelirteçler, terapötik ajanlar ve ilaç dağıtım araçları olarak umut vaat etmektedir. Bununla birlikte, tam potansiyellerini gerçekleştirmek zordur, çünkü satın almalarıyla ilgili hala birçok teknik engel vardır3. Böyle bir zorluk, birçok durumda ihmal edilen endotoksin içermeyen EV'lerin izolasyonudur. En yaygın endotoksinlerden biri, gram-negatif bakteriyel hücre duvarlarının önemli bir bileşeni olan veçeşitli hücreler tarafından çok sayıda enflamatuar sitokinin salınması nedeniyle akut enflamatuar yanıta neden olabilen lipopolisakkarittir (LPS) 4,5. LPS, LPS bağlayıcı proteine bağlanarak bir yanıt indükler, ardından miyeloid hücreler üzerinde CD14 / TLR4 / MD2 kompleksi ile etkileşime girer. Bu etkileşim, MyD88 ve TRIF'e bağımlı sinyal yollarının aktivasyonuna yol açar ve bu da nükleer faktör kappa B'yi (NFkB) tetikler. NFkB'nin çekirdeğe translokasyonu, sitokinlerin üretimini başlatır6. Monositler ve makrofajlar LPS'ye karşı oldukça hassastır ve LPS'ye maruz kalmaları enflamatuar sitokinlerin ve kemokinlerin (örneğin, IL-6, IL-12, CXCL8 ve TNF-α) salınımına neden olur7,8. CD14 yapısı, benzer afiniteye sahip farklı LPS türlerinin bağlanmasını sağlar ve diğer toll-like reseptörleri (TLR'ler) için bir ko-reseptör görevi görür (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 ve 9)6. EV'lerin monositler / makrofajlar üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmaların sayısı halaartmaktadır 9,10,11. Özellikle monositlerin, alt popülasyonlarının ve diğer bağışıklık hücrelerinin fonksiyonlarını incelemek açısından bakıldığında, EV'lerde endotoksin varlığı ve hatta maskelenmiş varlığı büyük önem taşımaktadır12. EV'lerin endotoksinlerle göz ardı edilen kontaminasyonu, yanıltıcı sonuçlara yol açabilir ve gerçek biyolojik aktivitelerini gizleyebilir. Başka bir deyişle, monositik hücrelerle çalışmak, endotoksin kontaminasyonunun yokluğunda güven gerektirir13. Endotoksinlerin potansiyel kaynakları su, ticari olarak elde edilen ortam ve serumlar, ortam bileşenleri ve katkı maddeleri, laboratuvar cam eşyaları ve plastik eşyalar olabilir 5,14,15.
Bu nedenle, bu çalışma düşük endotoksin içeren EV'lerin izolasyonu için bir protokol geliştirmeyi amaçlamıştır. Protokol, endotoksinleri EV'lerden çıkarmak yerine, EV'lerin izolasyonu sırasında endotoksin kontaminasyonunun nasıl önleneceğine dair basit ipuçları sağlar. Daha önce, endotoksinlerin, örneğin nanotıpta kullanılan mühendislik nanopartiküllerinden nasıl çıkarılacağına dair birçok protokol sunulmuştu; ancak, hiçbiri EV'ler gibi biyolojik yapılar için yararlı değildir. Nanopartiküllerin etkili depirojenasyonu, etanol veya asetik asit durulama, 3 saat boyunca 175 ° C'de ısıtma, γ ışınlama veya triton X-100 muamelesi ile gerçekleştirilebilir; ancak, bu prosedürler EV'lerin 16,17'nin tahrip olmasına yol açmaktadır.
Sunulan protokol, EV'lerin monositler üzerindeki etkisi üzerine yapılan önceki çalışmaların aksine, EV'lerde endotoksin safsızlıklarından kaçınmaya odaklanan öncü bir çalışmadır9. Önerilen ilkelerin laboratuvar uygulamalarına uygulanması, EV'lerin klinikte terapötik ajanlar olarak potansiyel kullanımı göz önüne alındığında çok önemli olabilecek güvenilir araştırma sonuçlarının elde edilmesine yardımcı olabilir12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ultra santrifüj tüplerinin hazırlanması
- Steril, tek kullanımlık tüpler kullanın. Bu mümkün değilse, ultrasantrifüj tüplerini steril bir Pasteur pipet veya diğer tek kullanımlık aplikatörler kullanarak bir deterjanla yıkadıktan sonra tekrar kullanın. Ultra santrifüj tüplerinin bir tür santrifüjlü malzemeye (hücre kültürü süpernatan / serum / plazma) ve türlere (insan / fare / vb.)
- Bir deterjanla yıkadıktan sonra, ultra santrifüj tüplerini deiyonize, LPS içermeyen suyla 3x durulayın.
NOT: Düşük kaliteli su kullanmayın. - Ultra santrifüj tüplerini kurutun ve% 70 etanol ile doldurun. Gece boyunca dezenfeksiyon için tüpleri% 70 etanol ile bırakın. Etanol çıkarın ve tüpleri tekrar kurutun.
- Tüpleri ve kapakları sterilizasyon ambalajına yerleştirin ve sıkıca kapatın. Plazma veya gaz (etilen oksit) sterilizasyon yöntemini kullanın18,19. Sterilizasyon ambalajı içinde bulunan ultrasantrifüj tüplerini kuru bir yerde saklayın ve son kullanma tarihinden önce kullanın.
NOT: Fosfat tamponlu salin (PBS) içindeki LPS seviyesinin ve EV'lerin izolasyonu için kullanılan suyun aylık olarak izlenmesini sağlayın. İzleme, tüpleri de içermelidir (örneğin, ultrasantrifüj tüplerinde gece boyunca oda sıcaklığında [RT] depolanan suyu [yıkama kontrolü] test ederek).
2. EV tükenmiş düşük endotoksin fetal sığır serumunun (EE-FBS) hazırlanması
- Ultra düşük endotoksin FBS kullandığınızdan emin olun (ticari olarak temin edilebilir; bakınız Malzeme Tablosu; <0.1 AB / mL).
- Bir şişe ultra düşük endotoksin FBS'yi bir su banyosuna yerleştirin ve 30 dakika boyunca 56 ° C'de inkübe edin. Bu adım, kompleman sistemini devre dışı bırakmak için gereklidir.
- Devre dışı bırakılmış FBS'yi ultra santrifüj tüplerine pipet edin ve 4 °C'de 4 saat boyunca 100.000 x g'de santrifüj edin. Süpernatantı steril 50 mL'lik tüplere toplayın, kapak kontaminasyonunu önlemek ve tüpün halkasını ıslatmak için tüp başına 45 mL'yi aşmadığından emin olun.
- Bu şekilde hazırlanan EE-FBS serumunu -20 °C'de saklayınız. EE-FBS'deki LPS konsantrasyonunu kontrol edin (adım 6). LPS konsantrasyonu, ultrasantrifüjlemeden önceki ile aynı seviyede olmalıdır.
3. Hücre kültürü
- Bu çalışma için, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Kartal besiyerinde (DMEM) 4.5 g / L glikoz, L- glutamin, sodyum piruvat ve gentamisin (50 μL / mL) ile kültür SW480 ve SW620 hücre hatları, aseptik teknik kullanılarak 75cm2 kültür şişelerinde% 10 EE-FBS ile desteklenmiştir. SW480 ve SW620 için şişe başına sırasıyla yaklaşık 4,5 x 10 6 hücre ve 6,5 x 106 hücre tohumlayın.
- Süpernatantları haftada iki kez (şişe başına ~ 10 mL) hücreler tam akıcılığa ulaştığında toplayın (SW480 ve SW620 için şişe başına sırasıyla ~ 13.5 x 106 ve 20 x 106 hücre) ve bölün. Hücrelerin yaşayabilirliğinin% 99'dan az olmadığından ve hücrelerin% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de kültürlendiğinden emin olun.
- Süpernatantları hücre kültüründen uygun şekilde etiketlenmiş 15 mL tüplere toplayın. Hücre kalıntılarını temizlemek için toplanan süpernatantları RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin.
- Süpernatantları dikkatlice toplayın, aspire edici döküntülerden kaçının, etiketli tüplere yerleştirin ve 4 ° C'de 12 dakika boyunca 3.200 x g'de tekrar santrifüj yapın.
- İkinci santrifüjleme adımından süpernatantları steril, etiketli 50 mL tüplere toplayın. Tüplerin kenarlarını ıslatmaktan kaçının. Süpernatant hacminin 45 mL'yi geçmediğinden ve tüplerin dikey olarak tutulduğundan emin olun.
- Tüpün kapağını steril şeffaf bir filmle sarın ve süpernatantları -80 ° C'de dikey konumda saklayın.
NOT: Mycoplasma spp'nin aylık kontrolünü gerçekleştirin. ve taze kültür süpernatantlarında LPS kontaminasyonu (adım 6). Süpernatantlardaki endotoksin seviyesi 0.05 EU / mL'yi aşarsa, kontaminasyonun hangi aşamada meydana gelmiş olabileceğini doğrulayın ve işlemi en baştan başlatın. Hücre kültürünün Mycoplasma spp ile kontaminasyonu durumunda. tespit edilirse, EV'lerin bu tür süpernatantlardan izolasyonu durdurulmalıdır.
4. EV'lerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu
- 0.22 μm şırınga filtreleri ve uygun hacimde şırıngalar hazırlayın. Kültür süpernatantları (90 mL) ile iki tüp hazırlayın.
- Şırıngayı süpernatant ile doldurun ve filtreyi iğne adaptörüne takın. Doldurulmuş şırıngayı filtreyle birlikte 50 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin. Piston flanşını itin ve ~ 90 mL filtrat toplayın.
- Filtreyi (7 mL) ultra santrifüj tüplerine pipet edin (uygun denge için her bir tüpe aynı hacmin pipetlenmesini sağlayın) ve 4 °C'de 2 saat boyunca 100.000 x g'de santrifüjleyin.
NOT: EV'lerin peletlenmesinin verimliliği, EV'lerin20'sinin daha iyi geri kazanılması için optimize edilmesi gereken birçok faktöre (örneğin, rotor tipi, k-faktörü, göç yolu uzunluğu, ortamın viskozitesi vb.) bağlıdır. - Steril bir Pasteur pipet kullanarak süpernatantı atın. Uzun, filtrelenmiş pipet uçlarını kullanarak kalan peletleri toplayın ve iki ultrasantrifüj tüpünde toplayın. EV'leri durulamak için filtrelenmiş endotoksin içermeyen PBS ile 7 mL'ye kadar doldurun.
- PBS ile yeniden askıya alınmış peletleri 100.000 x g'de 4 °C'de 2 saat boyunca santrifüj edin. Steril bir Pasteur pipet kullanarak süpernatantı tamamen çıkarın ve EV'leri yeniden askıya almak için her iki tüpe de 200 μL filtrelenmiş, endotoksin içermeyen PBS ekleyin. Tüm EV'leri toplamak için EV'lerin peletini nazikçe pipetin.
- EV'lerin süspansiyonunu steril bir 1,5 mL test tüpüne aktarın (mümkünse, düşük proteinli bir bağlama tüpü kullanın). Nanopartikül izleme analizi (NTA) ve diğer amaçlar (örneğin, protein konsantrasyonu ölçümü) için bir seyreltme hazırlamak için EV süspansiyonunun 10 μL'sini koruyun.
- Üreticinin talimatlarına göre, NTA ile ölçümler için EV'leri filtrelenmiş PBS (1: 1.000) ile seyreltin. Kapağı steril şeffaf bir filmle sararak EV tüplerini sabitleyin. EV'leri -80 ° C'de saklayın.
5. Batı lekelenmesi ile spesifik belirteçlerin tespiti
- Numunelerdeki protein seviyesini belirleyin (örneğin, Bradford testi ile) ve numuneleri (20 μg) yükleme tamponu ile hazırlayın. 5 μL numune tamponu (4x) ve 2 μL numune indirgeyici maddeyi (10x) toplam 20 μL hacme karıştırarak yükleme tamponunu hazırlayın.
- SDS (% 10 -% 14) ile poliakrilamid jeller hazırlayın ve 20 μg EV'leri her bir kuyucuğa yükleyin.
- Elektroforezi çalışan tamponla (30 g Tris, 144 g glisin, 1 L başına %10 SDS) 150 V'ta 45 dakika boyunca çalıştırın.
- Proteinlerin jelden poliviniliden diflorür (PVDF) membranına yarı kuru transferini, 1 saat boyunca 25 V'ta Towbin tamponlu (1.51 g Tris, 7.2 g glisin, 0.5 L'de %10 metanol) bir transfer makinesinde gerçekleştirin.
- TBST tamponunda %1 sığır serum albümini (BSA) ile bloke etmek için membranı TBST tamponuna (1 mL Ara, 1 L başına 100 mL Tris tamponlu salin (TBS 10x)) yerleştirin ve RT'deki rocker'da 1 saat inkübe edin.
- %1 BSA'ya seyreltilmiş (1:1.000) antikorlar, anti-CD9 1 (klon#D8O1A) veya anti-Alix1 (klon#3A9) ekleyin ve rocker üzerinde gece boyunca 4 °C'de membranla inkübe edin. Antikorları çıkarın ve membranı 10 dakika boyunca 10 mL 1x TBST ile 3x yıkayın.
- Membrandaki birincil antikora bağlı olarak, yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan veya keçi anti-fare (seyreltme: 1: 2.000) ikincil antikoru ekleyin ve RT'deki rocker üzerinde 1 saat inkübe edin. antikorları çıkarın ve membranı 10 dakika boyunca 10 mL 1x TBST ile 3x yıkayın.
- 1 mL'lik bir çözelti elde etmek için substratı ve luminol'ü 1:1 oranında karıştırın. Çözeltiyi membran üzerine dökün. Membranı hemen görüntüleme sisteminin ölçüm odasına yerleştirin, kemilüminesans modülünü seçin ve ekranda protein bantlarını görselleştirin.
6. Limulus Amebosit Lizat testi (LAL) ile endotoksin düzeyinin ölçülmesi
- Üreticinin tavsiyesine göre endotoksin seviyesinin kromojenik LAL ölçümünü yapın. Kısaca, endotoksinin limulus amebosit lizatı (LAL) ile etkileşimine dayanan yöntemi kullanın. Bu yöntemin algılama sınırı 0,005 EU/mL'dir.
NOT: LAL testi, sınırlamalarına rağmen, şu anda bilim veya tıpta kullanılan farklı çözeltilerde ve diğer ürünlerde endotoksin kontaminasyonunu tespit etmek ve ölçmek için standart yöntem olmaya devam etmektedir8. Bu kitin sınırlayıcı faktörü, yeniden yapılandırılan amebosit lizat çözeltisinin stabilitesidir, bu da sulandırıldıktan hemen sonra dondurulduğunda -20 ° C'de sadece 1 hafta stabil kalır. - EV'lerin ve diğer numunelerin on kat seyreltilmesini ve 50 kat serum seyreltilmesini kullanın. Daha ileri deneyler için, sadece EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0.005 AB / mL) ve LPS içermeyen kültür süpernatantları gibi düşük endotoksin reaktifleri kullanın.
7. EV örneklerinde prokaryotik 16S rRNA geninin tespiti
- DNA'yı EV örneklerinden izole edin. Reaktifleri ve izolasyon bölgesini aseptik tutmaya çalışın. DNA konsantrasyonunu ve kalitesini ölçün (örneğin, bir spektrofotometre kullanarak).
- Daha önce21'de açıklandığı gibi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin. PCR ürünlerini ultraviyole ışıkta (UV) görselleştirmek için ethidyum bromür veya SYBR yeşili ile% 1.5 agaroz jeli hazırlayın.
- Numunenin elektroforezini ve ağırlık işaretleyicisini TRIS-asetat-EDTA tamponu ile 75 V'ta 45 dakika boyunca çalıştırın. Görüntüleme sistemini kullanarak DNA bantlarını görselleştirin.
8. İnsan monosit modelinde stimülasyon için etkili LPS konsantrasyonunun belirlenmesi
- RPMI 1640'ta L-glutamin, glikoz ve% 2 EE-FBS ile desteklenmiş 2 x 106 monosit / mL monosit süspansiyonu hazırlayın. 96 delikli bir doku kültürü plakası22'nin kuyucuğu başına 50 μL süspansiyon ekleyin.
- Aşağıdaki son konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda LPS veya kültür ortamı ekleyin: 100 μL toplam hücre süspansiyonu hacminde 0 pg / mL (kontrol), 10 pg / mL, 50 pg / mL, 100 pg / mL, 1 ng / mL ve 100 ng / mL. Her LPS konsantrasyonunun üçlüsünü yapın.
- Hücreleri 37 ° C'de 18 saat boyunca kültürleyin,% 5 CO2. Supernatan'ı topla.
- Süpernatantı 5 dakika boyunca 2.000 x g'de döndürün. Süpernatantları yeni tüplere aktarın. Toplanan süpernatantlardaki TNF8,23 ve IL-1023 konsantrasyonunu, üreticinin prosedürüne göre, bir akış sitometresi ile sitometrik boncuk dizisi (CBA) insan sitokin kiti ile ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol için ön koşul veya zorunlu bir adım, olası endotoksin kontaminasyonunun reaktiflerden dışlanmasıdır. FBS, DMEM, RPMI, PBS ve hatta ultrasantrifüj tüpleri gibi kullanılan tüm reaktifler endotoksin içermemelidir (<0.005 AB / mL). Endotoksin kontaminasyonu olmayan rejimin sürdürülmesi kolay değildir, çünkü örneğin, hücre kültürü için düzenli / standart serum zengin kaynağı olabilir (0.364 AB / mL; bakınız Tablo 1).
Bu protokol düşük endotoksin içeriğine sahip EV'leri izole etmek için geliştirilmiş olsa da, izole edilmiş EV'leri karakterize etmek önemlidir. Bu çalışmada, EV'ler iki kolorektal kanser hücre hattından, SW480 ve SW620'den izole edildi. EVs belirteçlerinin, CD9 ve Alix'in ekspresyonu, batı lekesi ile doğrulanmıştır (Şekil 1A). SW480 ve SW620 hücrelerinden izole edilen EV'lerin ortalama boyutlarında fark yoktu (sırasıyla 134 nm ve 128.2 nm; Şekil 1B). Ek olarak, bu hücre hatları arasında izole EV'lerin konsantrasyonunda hiçbir fark yoktu (Şekil 1C). NTA ile ölçülen EV boyutunun örnek dağılımları Şekil 1D'de sunulmuştur. Ultra santrifüjleme süresi, Cvjetkovic ve ark.20'nin sonuçlarına göre optimize edildi. Kısaca, iki sabit açılı rotor (70Ti ve T-1270) arasındaki santrifüj çalışma parametrelerinin dönüştürülmesi için matematiksel formül kullanılmıştır. 100.000 x g'de 120 dakika boyunca bir T-1270 rotoru ile dönerek küçük EV'lerin tükenmesinin etkinliği, 155 dakika boyunca 118.000 x g'de bir 70Ti rotor kullanılarak elde edilenden biraz daha azdı; Bununla birlikte, hala etkili RNA ve protein peletleme aralığındaydı. Hesaplama, uzatılmış santrifüjleme süresinin (4 saate karşı 2 saat) süpernatantlarda peletlenmiş veya hala mevcut olan EV'lerin sayısı üzerinde anlamlı bir etkisi olmadığı deneysel verilerle (Tablo S1) doğrulanmıştır.
Monosit yanıtına neden olan LPS düzeyi değerlendirildi. Bu amaçla, insan monositleri ardışık LPS konsantrasyonları (0 pg / mL, 10 pg / mL, 50 pg / mL, 100 pg / mL, 1 ng / mL ve 100 ng / mL) ile kültürlendi. Bir gecede kültürden sonra, kültür süpernatantlarında IL-10 ve TNF düzeyi belirlendi. Bu çalışmada, monositlerde IL-10 ve TNF'nin salgılanmasını sağlayan en düşük LPS dozu, 0.5 AB / mL'ye karşılık gelen 50 pg / mL idi (Şekil 2).
Son olarak, son adım, yukarıdaki gibi izole edilen EV'lerdeki LPS seviyesini test etmekle ilgiliydi. EV numunelerinin LPS kontaminasyonu yaklaşık 0,5 EU/mL (50 pg/mL; Şekil 3) her iki hücre satırı için de (SW480 ve SW620 için sırasıyla 45.80 ± 20.39 pg/mL ve 48.75 ± 7.412 pg/mL). Bu, 1 μL EV'nin (yaklaşık 109 EV) 0.05 pg'den daha az endotoksin içerdiği ve 100 μL monosit süspansiyonuna (bir monosit başına 104 EV oranı) eklendiğinde 100 kez seyreltildiği anlamına gelir (LPS'nin nihai konsantrasyonu yaklaşık 0.5 pg / mL'dir).
Ek olarak, EV'lerin saflığı, SW480 ve SW620 hücre hatlarından izole edilen EV'lerde bakteriyel kontaminasyon eksikliğini doğrulayan 16S rRNA geni21 için PCR ile test edilmiştir (Ek Şekil 1).
Şekil 1: İzole EV'lerin karakterizasyonu. (A) SW480 ve SW620 hücre hatlarından izole edilen EV'lerin protein belirteçlerinin Batı leke analizi. (B) NTA, SW480 ve SW620 hücre hatlarından (nm) izole edilen EV'lerin boyutunu ölçmek için kullanıldı. (C) NTA, SW480 ve SW620 hücre hatlarından (EV'ler / mL) izole edilen EV'lerin konsantrasyonunu ölçmek için kullanıldı. (D) NTA ile ölçülen EV'lerin boyutunun örnek dağılımları (mavi sayılar eğri üzerinde belirli bir noktada parçacık boyutunu gösterir). B ve C'deki veriler ortalama ± SD (n = 10) olarak sunulur; İstatistiksel analiz için t-testi kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı dozlarda LPS ile uyarılan monositler tarafından IL-10 ve TNF sekresyonu. Monositler tarafından sitokinlerin sekresyonu, belirtildiği gibi LPS dozları ile stimülasyondan sonra belirlendi: 10 pg / mL, 50 pg / mL, 100 pg / mL, 1 ng / mL ve 100 ng / mL, kontrol monositlerine (MO) kıyasla. Veriler ortalama ± SD (n = 4) olarak sunulur; Mann-Whitney U testi kullanıldı. TNF ve IL-10 konsantrasyonları kültür süpernatantlarında sitometrik boncuk dizisi (CBA) yöntemi ile ölçüldü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İzole edilmiş EV numunelerinde LPS seviyesinin kromojenik LAL testi ile ölçülmesi. SW480 ve SW620 hücre hatlarından (pg/mL) elde edilen EV numunelerindeki LPS içeriği. Veriler ortalama ± SD (n = 6) olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| S.No. | örnek | endotoksin seviyesi [EU/mL] | endotoksin seviyesi [pg/mL] | ||
| 1 | cesaret | <0,005 | <0.5 | ||
| 2 | RPMI1640 | <0,005 | <0.5 | ||
| 3 | FBS ultra düşük endotoksin | <0,005 | <0.5 | ||
| 4 | FBS 4 saat santrifüjlemeden sonra ultra düşük endotoksin (EE-FBS) | <0,005 | <0.5 | ||
| 5 | düzenli FBS | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | filtrelenmiş PBS | <0,005 | <0.5 | ||
| 7 | kültür süpernatantı 2 saat merkezleme sonrası SW480 hücreleri oluşturur | <0,005 | <0.5 | ||
| 8 | 2 saat santrifüjlemeden sonra SW620 hücrelerinden kültür süpernatantı | <0,005 | <0.5 | ||
| 9 | yıkama kontrolü (ultrasantrifüj tüplerinde depolanan su) | <0,005 | <0.5 | ||
Tablo 1: Kromojenik LAL testi ile belirlenen çeşitli reaktiflerde ve numunelerde LPS düzeyi. Ölçümler EU/mL ve pg/mL olarak sunulmaktadır. Numuneler arasında DMEM, RPMI, EE-FBS, FBS, filtrelenmiş PBS ve yıkama kontrolü (ultrasantrifüjleme tüplerinden gelen su) vardı.
Ek Tablo 1: SW480 ve SW620 hücre hatlarından ve PBS'den kültür süpernatantlarının 2 saat veya 4 saat santrifüjlenmesinden sonra pelet ve süpernatantlarda EV'lerin konsantrasyon (EV'ler / mL) ve boyut (nm) ölçümlerinin temsili örnekleri. Ölçümler NTA ile yapıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Aşağıdaki örneklerde pan-prokaryot 16S rRNA gen amplifikasyonunun PCR sonuçları, soldan: moleküler ağırlık merdiveni (MW, 100-1000 bp), NC-negatif kontrol, SW480 ve SW620'den türetilen EV'ler ve PC (pozitif kontrol-bakteriyel DNA) Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son birkaç yılda, uygun EV'lerin izolasyonu için yöntemler giderek daha önemli hale geldi ve örneğin güvenilir omikler ve fonksiyonel veriler elde etme bağlamında daha güvenilir analizleri mümkün kıldı24. Önceki araştırma deneyimlerine dayanarak, sadece izolasyon yönteminin türünün değil, aynı zamanda bu prosedür sırasındaki diğer koşulların da önemli olabileceği görülmektedir. EV tükenmiş FBS'nin kullanımı yaygın olarak bir gereklilik olarak kabul edilmektedir25,26; Bununla birlikte, EV'lerde endotoksin kontaminasyonunun izlenmesi genellikle ihmal edilmektedir.
Bununla birlikte, EV'lerin izolasyonu için kullanılan tüm yöntemler, prosedürün her aşamasında titiz aseptik kullanım ve kalite kontrol için standartlar geliştirmiş olmalıdır. Bu, EV'lerin daha fazla aşağı akış uygulaması nedeniyle özellikle önemlidir. Önerilen protokol, endotoksine duyarlı monositler ve makrofajlar gibi endotoksine duyarlı hücrelerle ilgili önceki deneyimlerin sonucudur. Monositlerin bir belirteci olan CD14, LPS'yi pikomolar konsantrasyonlarda bağlayabilir. Elde edilen sonuçlar, monositlerin 50 pg/mL (0.5 EU/mL) LPS ile stimülasyondan sonra TNF ve IL-10 salgıladıklarını göstermektedir. Bununla birlikte, Yang ve ark., 0.1 AB / mL (10 pg / mL) endotoksinin bile güçlü bir reaksiyona (enflamatuar IL1B geninin yukarı regülasyonu) indükleyebileceğini bildirmiştir27. Dahası, Chaiwut ve ark., monositlerde TNF ve IL-6'nın hücre içi üretiminin, sırasıyla 2.5 pg / mL veya 5 pg / mL, daha düşük LPS konsantrasyonları ile indüklenebileceğini göstermiştir23. Alvarez ve ark., monosit aktivasyon hızının (hesaplanan değer) 5 pg / mL28 gibi küçük bir LPS konsantrasyonundan sonra yükseldiğini doğruladı. Bu nedenle, izolasyon protokolünün mümkün olan her aşamasında EV'lerde endotoksin kontaminasyonunu sınırlamak, LPS'ye duyarlı hücrelerle yapılan daha ileri deneyler için çok önemlidir. Şu anda, ultrasantrifüjleme EV izolasyonu için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, bu yöntemle izole edilen EV'lerin LPS kontaminasyonu ile ilgili herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle, yukarıdaki protokol, kültür süpernatantlarından harici EV'ler kontaminasyonu olmadan düşük endotoksin EV'lerin elde edilmesine odaklanmaktadır.
Yukarıda belirtildiği gibi, endotoksin kontaminasyonunun çeşitli kaynakları olabilir. İlk olarak, endotoksinin zor bir rakip olduğu ve cam veya plastik eşyaların sterilizasyonunun tüm yöntemlerinin çıkarılmasında veya bozulmasında etkili olmadığı vurgulanmalıdır. Örneğin, standart otoklavlama prosedürü, endotoksinin yüksek ısı stabilitesi nedeniyle LPS'yi ortadan kaldıramaz27. Ayrıca, yıkama, kapsamlı olsa bile, endotoksini tamamen çıkaramaz. Plazma veya ETO (etilen oksit) sterilizasyonu18,19 gibi laboratuvar uygulamalarına daha fazla depirojenik yöntem uygulanarak, endotoksin kontaminasyonu sınırlandırılabilir. Daha sonra, olası kontaminasyonun sürekli izlenmesi ve önlenmesi çok önemlidir. Sunulan sonuçlar, kültür takviyesi için serum gibi ultra düşük endotoksin reaktiflerinin kullanılmasının önemini göstermektedir. Ek olarak, tüm reaktiflerin (PBS, DMEM ve RPMI gibi) ve hatta plastik eşyaların (örneğin tüpler) endotoksin kontaminasyonunun rutin kontrolü şiddetle tavsiye edilir. Endotoksin birikimini önlemek için EV'lerin izolasyonundan önce kültür süpernatantlarının önceden kontrol edilmesi de gereklidir. Yukarıda sunulduğu gibi, LAL testi ile endotoksin seviyelerinin standart ölçümüne ilginç bir alternatif, bakteriyel 16s rRNA geninin PCR amplifikasyonudur. EV'lerde LPS'nin izin verilen (monosit stimülasyonunu indüklemeyen) endotoksin seviyelerinin belirlenmesi çok önemlidir. Kültür koşulları göz önüne alındığında (monositlerin konsantrasyonu ve uygulanan EV'lerin LPS ile kontaminasyonu, EV'lerin konsantrasyonu; Şekil 3), EV'lerle uyarılan monositleri etkileyen endotoksinin nihai konsantrasyonu 0.5 pg / mL'den yüksek değildir (EV'ler genellikle 100-1.000 kez seyreltilir). Bu doz, Chaiwut ve ark. tarafından varsayılandan beş kat daha düşüktür. monositler23 tarafından TNF üretimini indükleyebilen en az etkili doz (2.5 pg / mL). Chaiwut ve ark. çalışmasında, sitokin üretimi akış sitometrisi kullanılarak belirlenmiş ve nicelleştirme olmaksızın MFI (ortalama floresan yoğunluğu) kayması olarak sunulmuştur. Ayrıca, çok düşük dozlarda LPS ile monosit stimülasyonu, ek bir LPS23 kaynağı olabilecek % 10 FBS ile desteklenmiş ortamda gerçekleştirilmiştir. Bu, monosit stimülasyonu için kullanılan LPS'nin etkili dozunun daha yüksek olduğunu düşündürebilir. Bu nedenle, sunulan sonuçlar ve literatür verileri göz önüne alındığında, EV'lerde 50 pg / mL'ye (0.5 EU / mL) kadar endotoksin konsantrasyonunun izin verildiği ve monositlerin aktivasyonunun nedeni olmadığı görülmektedir. Bu protokolün optimize edilmesindeki bir sonraki adım, endotoksin kontaminasyonunun, LAL veya hücre bazlı tahliller tarafından tespit edilmeyen seviyeye kadar daha da azaltılmasıdır. Son zamanlarda, düşük endotoksin geri kazanımı (LER) olarak adlandırılan maskelenmiş endotoksin kontaminasyonunu tespit etmek için biyolojik modellerin kullanılmasının önemi şiddetle tavsiye edilmektedir8.
Bu nedenle, bu protokol bu açıdan yenilikçidir, çünkü diğer çalışmalarda henüz ele alınmamış olan, mümkün olan en düşük endotoksin içeriğine sahip EV'lerin izolasyonu için gerekli tüm yönleri toplar.
Her yöntemde olduğu gibi, bu protokolün de bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, önerilen protokol endotoksin kontaminasyonunu azaltır, ancak ortadan kaldırmaz. İkincisi, elde edilen saflığın diğer bağışıklık hücreleri için yeterli olup olmadığı bilinmemektedir. Bu nedenle, her protokol daha fazla uygulama için uyarlanmalıdır. Böyle bir protokolün oluşturulması, EV'lerin biyolojik olarak aktif bileşenlerine, kazara kontaminasyonlarından daha fazla karşılık gelecek sonuçların elde edilmesini sağlayacaktır. Son olarak, birkaç endotoksin test kiti ve düşük endotoksin serumu satın alma ihtiyacı nedeniyle prosedür normalden daha pahalıdır. Umut verici bir alternatif olarak Bussolati, teğetsel akış filtrasyonu ile EV'lerin izolasyonu için yeni, sofistike bir yöntem sundu. Bu yöntem, düşük endotoksisiteye sahip EV'lerin (0.1-0.7 EU/mL; 10-70 pg/mL)29 elde edilmesini sağlar. Şimdiye kadar, bu yeni yöntem EV'lerin izolasyonu için yaygın olarak kullanılmamıştır ve teğetsel akış filtrasyon (TFF) sistemi şeklinde özel ekipman gerektirir. Son zamanlarda, Gałuszka ve ark., polimiksin B30 kullanarak endotoksini hava kirleticilerinden (EV'lerin büyüklüğüne sahip ancak membran yapısı olmayan partikül madde) elimine etmenin farklı bir yolunu önerdi. Bununla birlikte, bu protokolün hücre kaynaklı veziküller için kullanışlılığının, özellikle in vivo deneyler hakkında düşünürken, biyolojik modellerle doğrulanması gerekir. Polimiksin B ve sodyum deoksikolat (endotoksin giderimi için de uygulanabilir) daha önce nöro- ve nefrotoksik31 olarak tanımlanmıştır. Diğer olasılıklar, endotoksinleri seçici olarak bağlayan poli(ε-lizin) ile afinite sütunlarıdır. Bununla birlikte, bu yöntem hızlı ve verimlidir, ancak protein örneklerine / çözeltilerine adanmıştır; bu nedenle, EV'ler gibi karmaşık yapılara uygulanması için doğrulamagerekir 32. Ayrıca, bu sütunlar yüksek başlangıç endotoksin seviyelerine sahip numuneler için tasarlanmıştır ve nispeten az miktarda LPS'nin çıkarılmasındaki etkinlikleri bilinmemektedir ve doğrulama gerektirir. LPS tüketen kolonlarla saflaştırmadan sonra beklenen son LPS konsantrasyonu, bağışıklık hücresi testleri için hala çok yüksek olabilir (örneğin, <5 AB / mL).
Özetle, bu protokol, EV'lerin izolasyonunun tüm aşamalarında titiz aseptik teknik, ultra düşük endotoksin reaktifleri kullanma, tüm prosedür adımlarında endotoksin safsızlıklarını izleme ve sterilizasyon yöntemini değiştirme gibi laboratuvar uygulamalarına çeşitli prensipler uygulayarak endotoksin kontaminasyonunun nasıl önleneceğini önermiştir. Ayrıca, sunulan protokol, izolasyon prosedürünün her adımında endotoksin seviyelerinin nasıl kontrol edileceğine dair ipuçları sağlar. EV'lerde bulunan LPS, bağışıklık hücrelerinin işlevini etkiler ve bu nedenle bu hücrelerle yapılan testlerde yanlış sonuçlara neden olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak inşa edilebilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Polonya Ulusal Bilim Merkezi, 2019/33/B/NZ5/00647 hibe numarası ile desteklenmiştir. Jagiellonian Üniversitesi Tıp Fakültesi Moleküler Tıbbi Mikrobiyoloji Bölümü'nden Profesör Tomasz Gosiewski ve Agnieszka Krawczyk'e EV'lerde bakteri DNA'sının tespitinde paha biçilmez yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al.
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B.
