Summary
Le protocole proposé comprend des lignes directrices sur la façon d’éviter la contamination par l’endotoxine lors de l’isolement des vésicules extracellulaires à partir de surnageants de culture cellulaire, et sur la façon de les évaluer correctement.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont une population hétérogène de vésicules membranaires libérées par les cellules in vitro et in vivo. Leur omniprésence et leur rôle important en tant que porteurs d’informations biologiques en font des objets d’étude intrigants, nécessitant des protocoles fiables et répétitifs pour leur isolement. Cependant, il est difficile de réaliser leur plein potentiel car il existe encore de nombreux obstacles techniques liés à leur recherche (comme une acquisition appropriée). Cette étude présente un protocole pour l’isolement de petits VE (selon la nomenclature MISEV 2018) à partir du surnageant de culture de lignées cellulaires tumorales basé sur la centrifugation différentielle. Le protocole comprend des lignes directrices sur la façon d’éviter la contamination par des endotoxines pendant l’isolement des VE et sur la façon de les évaluer correctement. La contamination par les endotoxines des véhicules électriques peut entraver considérablement les expériences ultérieures ou même masquer leurs véritables effets biologiques. D’autre part, la présence négligée d’endotoxines peut conduire à des conclusions incorrectes. Ceci est particulièrement important lorsqu’il s’agit de cellules du système immunitaire, y compris les monocytes, car les monocytes constituent une population particulièrement sensible aux résidus d’endotoxines. Par conséquent, il est fortement recommandé de dépister la contamination par les endotoxines des VE, en particulier lorsque vous travaillez avec des cellules sensibles aux endotoxines telles que les monocytes, les macrophages, les cellules suppressives dérivées de myéloïdes ou les cellules dendritiques.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (VE), selon la nomenclature MISEV 2018, sont un terme collectif décrivant divers sous-types de vésicules membraneuses sécrétées par des cellules qui jouent un rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques 1,2. De plus, les véhicules électriques sont prometteurs en tant que nouveaux biomarqueurs pour diverses maladies, ainsi qu’en tant qu’agents thérapeutiques et véhicules d’administration de médicaments. Cependant, la réalisation de leur plein potentiel est difficile car il existe encore de nombreux obstacles techniques liés à leur acquisition3. L’un de ces défis est l’isolement des véhicules électriques exempts d’endotoxines, qui a été négligé dans de nombreux cas. L’une des endotoxines les plus courantes est le lipopolysaccharide (LPS), qui est un composant majeur des parois cellulaires bactériennes à Gram négatif et peut provoquer une réponse inflammatoire aiguë, en raison de la libération d’un grand nombre de cytokines inflammatoires par diverses cellules 4,5. Le LPS induit une réponse en se liant à la protéine de liaison LPS, suivie d’une interaction avec le complexe CD14/TLR4/MD2 sur les cellules myéloïdes. Cette interaction conduit à l’activation des voies de signalisation dépendantes de MyD88 et TRIF, qui à son tour déclenche le facteur nucléaire kappa B (NFkB). La translocation de NFkB vers le noyau initie la production de cytokines6. Les monocytes et les macrophages sont très sensibles au LPS, et leur exposition au LPS entraîne la libération de cytokines et de chimiokines inflammatoires (p. ex. IL-6, IL-12, CXCL8 et TNF-α)7,8. La structure CD14 permet la liaison de différentes espèces de LPS ayant une affinité similaire et sert de corécepteur pour d’autres récepteurs de type Toll (TLR) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 et 9)6. Le nombre d’études menées sur les effets des VE sur les monocytes/macrophages continue d’augmenter 9,10,11. Surtout du point de vue de l’étude des fonctions des monocytes, de leurs sous-populations et d’autres cellules immunitaires, la présence d’endotoxines et même leur présence masquée dans les VE est d’une grande importance12. La contamination négligée des VE par des endotoxines peut conduire à des conclusions trompeuses et cacher leur véritable activité biologique. En d’autres termes, travailler avec des cellules monocytaires nécessite de faire confiance à l’absence de contamination par les endotoxines13. Les sources potentielles d’endotoxines peuvent être l’eau, les milieux et sérums obtenus commercialement, les composants et additifs de médias, la verrerie de laboratoire et la vaisselle en plastique 5,14,15.
Par conséquent, cette étude visait à développer un protocole pour l’isolement des VE à faible teneur en endotoxines. Le protocole fournit des conseils simples sur la façon d’éviter la contamination par les endotoxines pendant l’isolement des VE au lieu d’éliminer les endotoxines des VE. Auparavant, de nombreux protocoles ont été présentés sur la façon d’éliminer les endotoxines, par exemple des nanoparticules modifiées utilisées en nanomédecine; cependant, aucun d’entre eux n’est utile pour les structures biologiques telles que les véhicules électriques. La dépyrogénation efficace des nanoparticules peut être réalisée par rinçage à l’éthanol ou à l’acide acétique, chauffage à 175 °C pendant 3 h, irradiation γ ou traitement au triton X-100; cependant, ces procédures conduisent à la destruction des VE16,17.
Le protocole présenté est une étude pionnière axée sur l’évitement des impuretés endotoxines dans les VE, contrairement aux études précédentes sur l’effet des VE sur les monocytes9. L’application des principes proposés à la pratique de laboratoire peut aider à obtenir des résultats de recherche fiables, ce qui peut être crucial lors de l’examen de l’utilisation potentielle des VE comme agents thérapeutiques en clinique12.
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Protocol
1. Préparation des tubes à ultracentrifugation
- Utilisez des tubes stériles à usage unique. Si cela n’est pas possible, réutilisez les tubes à ultracentrifugation après les avoir lavés avec un détergent à l’aide d’une pipette Pasteur stérile ou d’autres applicateurs à usage unique. Rappelez-vous que les tubes à ultracentrifugation doivent être dédiés à un type de matériau centrifugé (surnageant de culture cellulaire / sérum / plasma) et à une espèce (homme / souris / etc.).
- Après un lavage au détergent, rincer les tubes à ultracentrifugation avec de l’eau désionisée sans LPS 3x.
REMARQUE : N’utilisez pas d’eau de mauvaise qualité. - Sécher les tubes à ultracentrifugation, puis les remplir d’éthanol à 70%. Laissez les tubes avec de l’éthanol à 70 % pour une désinfection pendant la nuit. Retirez l’éthanol et séchez à nouveau les tubes.
- Placez les tubes et les bouchons dans un emballage de stérilisation et fermez-les hermétiquement. Utiliser la méthode de stérilisation au plasma ou au gaz (oxyde d’éthylène)18,19. Conservez les tubes à ultracentrifugeuses enfermés dans l’emballage de stérilisation dans un endroit sec et utilisez-les avant la date de péremption.
REMARQUE : Effectuer une surveillance mensuelle du niveau de LPS dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et de l’eau utilisée pour l’isolement des VE. La surveillance devrait également inclure les tubes (p. ex., en testant l’eau [contrôle du lavage] qui a été stockée dans les tubes à ultracentrifugeuses pendant la nuit à température ambiante [RT]).
2. Préparation de sérum fœtal bovin à faible teneur en endotoxines appauvri en EV (EE-FBS)
- S’assurer d’utiliser le FBS à très faible teneur en endotoxines (disponible dans le commerce; voir le tableau des matériaux; <0,1 UE/mL).
- Placer un flacon d’endotoxine FBS ultra-faible dans un bain-marie et incuber à 56 °C pendant 30 min. Cette étape est nécessaire pour désactiver le système de complément.
- Pipeter le FBS inactivé dans les tubes à ultracentrifugeuses et le centrifuger à 100 000 x g pendant 4 h à 4 °C. Recueillir le surnageant dans des tubes stériles de 50 mL, en veillant à ne pas dépasser 45 mL par tube pour éviter la contamination du bouchon et le mouillage de l’anneau du tube.
- Conserver le sérum EE-FBS ainsi préparé à -20 °C. Vérifiez la concentration de LPS dans EE-FBS (étape 6). La concentration de LPS doit être au même niveau qu’avant l’ultracentrifugation.
3. Culture cellulaire
- Pour cette étude, culture de lignées cellulaires SW480 et SW620 dans le milieu Eagle’s de Dulbecco modifié (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose, de L-glutamine, de pyruvate de sodium et de gentamicine (50 μL/mL) complétées avec 10 % d’EE-FBS en conséquence dans des flacons de culture de 75 cm2 en utilisant une technique aseptique. Ensemencer près de 4,5 x 10 6 cellules et 6,5 x 106 cellules par fiole pour SW480 et SW620, respectivement.
- Prélever les surnageants deux fois par semaine (~10 mL par fiole) lorsque les cellules atteignent leur pleine confluence (~13,5 x 10 6 et 20 x 106 cellules par fiole pour SW480 et SW620, respectivement) et les diviser. S’assurer que la viabilité des cellules n’est pas inférieure à 99 % et que les cellules sont cultivées à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 %.
- Recueillir les surnageants de la culture cellulaire dans des tubes de 15 ml étiquetés de manière appropriée. Centrifuger les surnageants collectés à 500 x g pendant 5 min à TA pour éliminer les débris cellulaires.
- Recueillir soigneusement les surnageants, éviter d’aspirer les débris, placer dans des tubes étiquetés et centrifuger à nouveau à 3 200 x g pendant 12 min à 4 °C.
- Recueillir les surnageants de la deuxième étape de centrifugation dans des tubes stériles étiquetés de 50 mL. Évitez de mouiller les bords des tubes. S’assurer que le volume de surnageant ne dépasse pas 45 mL et que les tubes sont maintenus verticalement.
- Envelopper le capuchon du tube avec un film transparent stérile et conserver les surnageants en position verticale à -80 °C.
REMARQUE: Effectuer un contrôle mensuel de Mycoplasma spp. et la contamination par le LPS dans les surnageants de culture fraîche (étape 6). Si le niveau d’endotoxine dans les surnageants dépasse 0,05 EU/mL, vérifier à quel stade la contamination a pu se produire et recommencer le processus depuis le début. Si la contamination de la culture cellulaire par Mycoplasma spp. est détecté, l’isolement des VE de ces surnageants doit être interrompu.
4. Isolement des VE à partir de surnageants de culture cellulaire
- Préparer des filtres à seringues de 0,22 μm et des seringues de volume approprié. Préparer deux tubes avec des surnageants de culture (90 mL).
- Remplissez la seringue avec le surnageant et fixez le filtre à l’adaptateur d’aiguille. Placez la seringue remplie avec le filtre sur un tube de 50 mL. Poussez sur la bride du piston et recueillez ~90 ml de filtrat.
- Pipeter le filtrat (7 mL) dans les tubes à ultracentrifugation (en veillant à ce que le même volume soit pipeté à chaque tube pour un bon équilibre) et centrifuger à 100 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
REMARQUE: L’efficacité de l’enrobage des VE dépend de nombreux facteurs (par exemple, le type de rotor, son facteur k, la longueur du chemin de migration, la viscosité du fluide, etc.), qui doivent être optimisés pour une meilleure récupération des VE20. - Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur stérile. Recueillir les granulés restants à l’aide de longues pointes de pipettes filtrées et les regrouper dans deux tubes à ultracentrifugeuses. Remplissez-les jusqu’à 7 ml de PBS filtré sans endotoxines pour rincer les VE.
- Centrifuger les pastilles remises en suspension par PBS à 100 000 x g pendant 2 h à 4 °C. Retirez complètement le surnageant à l’aide d’une pipette Pasteur stérile et ajoutez 200 μL de PBS filtré et exempt d’endotoxines aux deux tubes pour remettre les VE en suspension. Pipeter doucement les granulés de VE pour recueillir tous les VE.
- Transférer la suspension de VE dans un tube à essai stérile de 1,5 mL (si possible, utiliser un tube de liaison à faible teneur en protéines). Conserver 10 μL de la suspension EV pour préparer une dilution pour l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et à d’autres fins (p. ex. mesure de la concentration en protéines).
- Diluer les véhicules électriques avec du PBS filtré (1:1 000) pour les mesures par NTA, conformément aux instructions du fabricant. Fixez les tubes EV en enveloppant le bouchon avec un film transparent stérile. Entreposer les véhicules électriques à -80 °C.
5. Détection de marqueurs spécifiques par Western blot
- Déterminer le niveau de protéines dans les échantillons (p. ex., par le test de Bradford) et préparer les échantillons (20 μg) avec un tampon de charge. Préparer le tampon de chargement en mélangeant 5 μL de tampon échantillon (4x) et 2 μL d’agent réducteur d’échantillon (10x) jusqu’à un volume total de 20 μL. Incuber les échantillons à 70 °C pendant 10 min.
- Préparez des gels de polyacrylamide avec des FDS (10%-14%) et chargez les 20 μg de VE dans chaque puits.
- Faire fonctionner l’électrophorèse avec un tampon courant (30 g de Tris, 144 g de glycine, 10% de SDS pour 1 L) pendant 45 min à 150 V.
- Effectuer un transfert semi-sec des protéines du gel sur la membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) dans une machine de transfert avec tampon Towbin (1,51 g de Tris, 7,2 g de glycine, 10% de méthanol par 0,5 L) à 25 V pendant 1 h.
- Placer la membrane dans un tampon TBST (1 mL de Tween, 100 mL de solution saline tamponnée Tris (TBS 10x) par 1 L) pour bloquer avec 1% d’albumine sérique bovine (BSA) dans le tampon TBST, et incuber pendant 1 h sur la bascule à TA.
- Ajouter des anticorps dilués (1:1 000), anti-CD9 1 (clone#D8O1A) ou anti-Alix 1 (clone#3A9), dans1% BSA et incuber avec la membrane pendant une nuit à 4 °C sur la bascule. Retirer les anticorps et laver la membrane 3x avec 10 mL de 1x TBST pendant 10 minutes.
- Ajouter un anticorps secondaire anti-lapin ou chèvre anti-souris (dilution : 1:2 000) conjugué à la peroxydase de raifort, selon l’anticorps primaire sur la membrane, et incuber pendant 1 h sur la bascule à TA. Retirer les anticorps et laver la membrane 3x avec 10 ml de 1x TBST pendant 10 minutes.
- Mélanger le substrat et le luminol dans un rapport de 1:1 pour obtenir une solution de 1 mL. Versez la solution sur la membrane. Placez immédiatement la membrane dans la chambre de mesure du système d’imagerie, choisissez le module de chimiluminescence et visualisez les bandes de protéines sur l’écran.
6. Mesure du niveau d’endotoxines par test de lysat d’amébocyte Limulus (LAL)
- Effectuer une mesure LAL chromogène du niveau d’endotoxine, conformément aux recommandations du fabricant. En bref, utilisez la méthode basée sur l’interaction de l’endotoxine avec le lysat d’amébocyte de limulus (LAL). La limite de détection de cette méthode est de 0,005 EU/mL.
NOTE: Le test LAL, malgré ses limites, reste actuellement la méthode standard pour détecter et quantifier la contamination par les endotoxines dans différents types de solutions et d’autres produits utilisés en science ou en médecine8. Le facteur limitant de ce kit est la stabilité de la solution de lysat d’amébocyte reconstituée, qui n’est stable que pendant 1 semaine à -20 °C si elle est congelée immédiatement après reconstitution. - Utiliser une dilution décuplée des VE et autres échantillons et une dilution de 50 fois du sérum. Pour d’autres expériences, utilisez uniquement des réactifs à faible teneur en endotoxines tels que EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/mL) et des surnageants de culture sans LPS.
7. Détection du gène de l’ARNr procaryote 16S dans les échantillons EV
- Isolez l’ADN des échantillons de VE. Essayez de garder les réactifs et le site d’isolement aseptiques. Mesurer la concentration et la qualité de l’ADN (p. ex., à l’aide d’un spectrophotomètre).
- Effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR), comme décrit précédemment21. Préparer du gel d’agarose à 1,5% avec du bromure d’éthidium ou du vert SYBR pour visualiser les produits de PCR en lumière ultraviolette (UV).
- Exécutez l’électrophorèse de l’échantillon et du marqueur de poids avec un tampon TRIS-acétate-EDTA à 75 V pendant 45 min. Visualisez les bandes d’ADN à l’aide du système d’imagerie.
8. Détermination de la concentration efficace de LPS pour la stimulation dans un modèle monocytaire humain
- Préparer 2 x 106 monocytes/mL de suspension monocytaire dans RPMI 1640 supplémentée en L-glutamine, glucose et 2% EE-FBS. Ajouter 50 μL de la suspension par puits d’une plaque de culture tissulaire de 96 puits22.
- Ajouter un volume approprié de LPS ou de milieu de culture pour obtenir les concentrations finales suivantes : 0 pg/mL (témoin), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL et 100 ng/mL, dans 100 μL de volume total de suspension cellulaire. Faire des triples de chaque concentration de LPS.
- Culture des cellules pendant 18 h à 37 °C, 5% CO2. Récupérez le surnageant.
- Faire tourner le surnageant à 2 000 x g pendant 5 min. Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes. Mesurer la concentration de TNF8,23 et IL-1023 dans les surnageants collectés avec le kit de cytokines humaines à réseau de billes cytométriques (CBA), selon la procédure du fabricant, avec un cytomètre en flux.
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Representative Results
Une étape préalable ou obligatoire pour ce protocole est l’exclusion d’une éventuelle contamination par les endotoxines par les réactifs. Tous les réactifs utilisés, tels que les tubes FBS, DMEM, RPMI, PBS et même les tubes à ultracentrifugeuses, doivent être exempts d’endotoxines (<0,005 EU/mL). Il n’est pas facile de maintenir le régime d’absence de contamination par les endotoxines car, par exemple, le sérum régulier/standard pour la culture cellulaire peut être sa riche source (0,364 EU/ml ; voir tableau 1).
Bien que ce protocole ait été développé pour isoler les VE à faible teneur en endotoxines, il est important de caractériser les VE isolés. Dans cette étude, les VE ont été isolés à partir de deux lignées cellulaires de cancer colorectal, SW480 et SW620. L’expression des marqueurs EVs, CD9 et Alix, a été confirmée par transfert Western (Figure 1A). Il n’y avait aucune différence dans la taille moyenne des VE isolés des cellules SW480 et SW620 (134 nm et 128,2 nm, respectivement; Figure 1B). De plus, il n’y avait aucune différence dans la concentration de VE isolés entre ces lignées cellulaires (figure 1C). Les distributions exemplaires de la taille des VE, telles que mesurées par NTA, sont présentées à la figure 1D. Le temps d’ultracentrifugation a été optimisé en fonction des résultats de Cvjetkovic et al.20. En bref, la formule mathématique pour la conversion des paramètres de fonctionnement centrifuge entre deux rotors à angle fixe (70Ti et T-1270) a été utilisée. L’efficacité de l’épuisement des petits véhicules électriques en tournant avec un rotor T-1270 pendant 120 min à 100 000 x g était légèrement inférieure à celle obtenue en utilisant un rotor 70Ti à 118 000 x g pendant 155 min; cependant, il était toujours dans la gamme de granulation efficace de l’ARN et des protéines. Le calcul a été confirmé par des données expérimentales (tableau S1), où le temps prolongé de centrifugation (4 h contre 2 h) n’a pas eu d’impact significatif sur le nombre de VE granulés ou encore présents dans les surnageants.
Le niveau de LPS qui a provoqué une réponse monocytaire a été évalué. À cette fin, des monocytes humains ont été cultivés avec des concentrations successives de LPS (0 pg/mL, 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL et 100 ng/mL). Après culture de nuit, le niveau d’IL-10 et de TNF a été déterminé dans les surnageants de culture. Dans cette étude, la dose la plus faible de LPS permettant la sécrétion d’IL-10 et de TNF dans les monocytes était de 50 pg/mL, ce qui correspondait à 0,5 EU/mL (Figure 2).
Enfin, la dernière étape consistait à tester le niveau de LPS dans les véhicules électriques isolés comme ci-dessus. La contamination LPS des échantillons de VE était d’environ 0,5 EU/mL (50 pg/mL ; Graphique 3) pour les deux lignées cellulaires (45,80 ± 20,39 pg/mL et 48,75 ± 7,412 pg/mL pour SW480 et SW620, respectivement). Cela signifie que 1 μL de VE (environ 109 EV) contient moins de 0,05 pg d’endotoxine, et lorsqu’il est ajouté à 100 μL de suspension monocytaire (rapport de 104 EV par monocyte) est dilué 100 fois (la concentration finale de LPS est d’environ 0,5 pg / mL).
De plus, la pureté des VE a été testée par PCR pour le gène21 de l’ARNr 16S, ce qui confirme l’absence de contamination bactérienne dans les VE isolés à partir de lignées cellulaires SW480 et SW620 (Figure supplémentaire 1).
Figure 1 : Caractérisation des VE isolés. (A) Analyse par transfert Western des marqueurs protéiques des VE isolés à partir de lignées cellulaires SW480 et SW620. (B) NTA a été utilisé pour mesurer la taille des VE isolés à partir de lignées cellulaires SW480 et SW620 (nm). (C) NTA a été utilisé pour mesurer la concentration de VE isolés à partir de lignées cellulaires SW480 et SW620 (EV/mL). (D) Exemples de distributions de la taille des VE, telle que mesurée par NTA (les nombres bleus indiquent la taille des particules en un point donné de la courbe). Les données de B et C sont présentées sous forme de moyenne ± ET (n = 10); Le test t pour l’analyse statistique a été utilisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Sécrétion d’IL-10 et de TNF par les monocytes stimulés par différentes doses de LPS. La sécrétion de cytokines par les monocytes a été déterminée après stimulation avec des doses de LPS comme indiqué : 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL et 100 ng/mL, par rapport aux monocytes témoins (MO). Les données sont présentées sous forme d’écart-type moyen ± (n = 4); Le test U de Mann-Whitney a été utilisé. Les concentrations de TNF et d’IL-10 ont été mesurées dans les surnageants de culture par la méthode du réseau cytométrique de billes (CBA). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Mesure du taux de LPS dans des échantillons isolés de VE par test LAL chromogénique. Teneur en LPS dans les échantillons EV obtenus à partir de lignées cellulaires SW480 et SW620 (pg/mL). Les données sont présentées sous forme d’écart-type moyen ± (n = 6). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| S.No. | échantillon | taux d’endotoxines [UE/mL] | Taux d’endotoxines [pg/mL] | ||
| 1 | DMEM | <0,005 | <0,5 | ||
| 2 | RPMI1640 | <0,005 | <0,5 | ||
| 3 | FBS ultra faible endotoxine | <0,005 | <0,5 | ||
| 4 | FBS ultra faible endotoxine après 4 h de centrifugation (EE-FBS) | <0,005 | <0,5 | ||
| 5 | FBS régulier | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | PBS filtré | <0,005 | <0,5 | ||
| 7 | surnageant de culture formant des cellules SW480 après 2 h de centrifigation | <0,005 | <0,5 | ||
| 8 | surnageant de culture à partir de cellules SW620 après 2 h de centrifugation | <0,005 | <0,5 | ||
| 9 | Contrôle du lavage (eau stockée dans des tubes à ultracentrifugeuses) | <0,005 | <0,5 | ||
Tableau 1 : Niveau de LPS dans divers réactifs et échantillons déterminés par test LAL chromogénique. Les mesures sont présentées en EU/mL et pg/mL. Les échantillons comprenaient DMEM, RPMI, EE-FBS, FBS, PBS filtré et contrôle de lavage (eau provenant de tubes d’ultracentrifugation).
Tableau supplémentaire 1 : Exemples représentatifs de mesures de concentration de VE (EVs/mL) et de taille (nm) dans des granulés et des surnageants après centrifugation de 2 h ou 4 h de surnageants de culture à partir de lignées cellulaires SW480 et SW620 et de PBS. Les mesures ont été effectuées par NTA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 1 : Résultats de la PCR de l’amplification du gène de l’ARNr pan-procaryote 16S dans les échantillons suivants, de gauche à droite : échelle de poids moléculaire (MW, 100-1000 pb), contrôle NC-négatif, EV dérivés de SW480 et SW620, et PC (contrôle positif-ADN bactérien) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Au cours des dernières années, les méthodes d’isolation correcte des véhicules électriques sont devenues de plus en plus importantes, permettant leurs analyses plus fiables, par exemple dans le contexte de l’obtention de données omiques et fonctionnelles fiables24. Sur la base de l’expérience de recherche antérieure, il semble que non seulement le type de méthode d’isolement, mais aussi d’autres conditions au cours de cette procédure peuvent être importants. L’utilisation de FBS appauvri en VE est largement reconnue comme une nécessité25,26; cependant, la surveillance de la contamination par les endotoxines dans les véhicules électriques est souvent négligée.
Néanmoins, toutes les méthodes utilisées pour isoler les véhicules électriques devraient avoir élaboré des normes pour une manipulation aseptique rigoureuse et un contrôle de la qualité à chaque étape de la procédure. Ceci est particulièrement important en raison de l’application ultérieure des véhicules électriques en aval. Le protocole proposé est le résultat d’une expérience antérieure avec des cellules sensibles aux endotoxines, telles que les monocytes et les macrophages, qui sont sensibles aux endotoxines. CD14, un marqueur des monocytes, est capable de lier le LPS à des concentrations picomolaires. Les résultats obtenus indiquent que les monocytes, après stimulation avec 50 pg/mL (0,5 EU/mL) de LPS, sécrètent du TNF et de l’IL-10. Yang et coll., cependant, ont rapporté que même 0,1 EU/mL (10 pg/mL) d’endotoxine pourrait induire une réaction puissante (régulation positive du gène inflammatoire IL1B )27. De plus, Chaiwut et al. ont démontré que la production intracellulaire de TNF et d’IL-6 dans les monocytes pourrait être induite par des concentrations encore plus faibles de LPS, 2,5 pg/mL ou 5 pg/mL, respectivement23. Alvarez et al. ont confirmé que le taux d’activation des monocytes (valeur calculée) augmente après une faible concentration de LPS, telle que 5 pg/mL28. Par conséquent, limiter la contamination par les endotoxines dans les VE à chaque étape possible du protocole d’isolement est crucial pour d’autres expériences menées avec des cellules sensibles au LPS. Actuellement, l’ultracentrifugation est la méthode la plus largement utilisée pour l’isolation des VE. Cependant, à notre connaissance, il n’existe aucune étude sur la contamination par le LPS des véhicules électriques isolés par cette méthode. Par conséquent, le protocole ci-dessus se concentre sur l’obtention de VE à faible teneur en endotoxines sans contamination externe par les surnageants de culture.
Comme mentionné ci-dessus, la contamination par les endotoxines peut avoir diverses sources. Tout d’abord, il convient de souligner que l’endotoxine est un inconvénient difficile et que toutes les méthodes de stérilisation du verre ou de la plasticulture ne sont pas efficaces pour l’éliminer ou la dégrader. Par exemple, la procédure standard d’autoclavage ne peut pas éliminer le LPS en raison de la stabilité thermique élevée de l’endotoxine27. En outre, le lavage, même étendu, ne peut pas éliminer complètement l’endotoxine. En appliquant davantage de méthodes dépyrogènes à la pratique de laboratoire, telles que la stérilisation au plasma ou à l’ETO (oxyde d’éthylène)18,19, la contamination par les endotoxines peut être limitée. Ensuite, la surveillance permanente et la prévention d’une éventuelle contamination sont cruciales. Les résultats présentés indiquent l’importance d’utiliser des réactifs d’endotoxines ultra-faibles, tels que le sérum, pour la supplémentation en culture. En outre, le contrôle de routine de la contamination par les endotoxines de tous les réactifs (tels que PBS, DMEM et RPMI) et même des articles en plastique (par exemple, les tubes) est fortement recommandé. Il est également nécessaire de prévérifier les surnageants de culture avant l’isolement des VE pour prévenir l’accumulation d’endotoxines. Comme présenté ci-dessus, une alternative intéressante à la mesure standard des niveaux d’endotoxines par le test LAL est l’amplification par PCR du gène de l’ARNr bactérien 16s. La détermination des niveaux d’endotoxines permissifs (qui n’induisent pas de stimulation monocytaire) de LPS dans les VE est cruciale. Tenir compte des conditions de culture (concentration de monocytes et contamination par le LPS des VE appliqués, concentration des VE; Figure 3), la concentration finale d’endotoxine qui affecte les monocytes stimulés par les VE n’est pas supérieure à 0,5 pg/mL (les VE sont habituellement dilués 100 à 1 000 fois). Cette dose est cinq fois inférieure à celle postulée par Chaiwut et al. comme la dose la moins efficace (2,5 pg/mL) capable d’induire la production de TNF par les monocytes23. Dans l’étude de Chaiwut et al., la production de cytokines a été déterminée par cytométrie en flux et présentée comme un décalage d’intensité fluorescente moyenne (MFI) sans quantification. De plus, une stimulation monocytaire avec de très faibles doses de LPS a été réalisée en milieu supplémenté en FBS à 10%, ce qui peut être une source supplémentaire de LPS23. Cela peut suggérer que la dose efficace de LPS utilisée pour la stimulation monocytaire était plus élevée. Ainsi, compte tenu des résultats présentés et des données de la littérature, il semble que la concentration d’endotoxines jusqu’à 50 pg / mL (0,5 UE / mL) dans les VE soit permissive et ne soit pas la cause de l’activation des monocytes. La prochaine étape de l’optimisation de ce protocole consiste à réduire davantage la contamination par les endotoxines, même à un niveau non détecté par les tests LAL ou cellulaires. Récemment, l’importance d’utiliser des modèles biologiques pour détecter la contamination masquée par les endotoxines, appelée récupération faible des endotoxines (LEG), a été fortement recommandée8.
Ainsi, ce protocole est innovant à cet égard car il recueille tous les aspects nécessaires à l’isolement des VE ayant la plus faible teneur en endotoxines possible, ce qui n’a pas encore été abordé dans d’autres études.
Comme pour chaque méthode, ce protocole a certaines limites. Premièrement, le protocole proposé réduit la contamination par les endotoxines, mais ne l’élimine pas. Deuxièmement, on ne sait pas si la pureté obtenue est suffisante pour les autres cellules immunitaires. Par conséquent, chaque protocole devrait être adapté pour une application ultérieure. L’établissement d’un tel protocole permettra d’obtenir des résultats qui correspondront davantage aux composants biologiquement actifs des VE qu’à leur contamination accidentelle. Enfin, la procédure est plus coûteuse que d’habitude en raison de la nécessité d’acheter plusieurs kits de test d’endotoxines et un sérum à faible teneur en endotoxines. Comme alternative prometteuse, Bussolati a présenté une nouvelle méthode sophistiquée pour l’isolation des VE par filtration à flux tangentiel. Cette méthode permet l’acquisition de VE à faible endotoxicité (0,1-0,7 EU/mL; 10-70 pg/mL)29. Jusqu’à présent, cette nouvelle méthode n’a pas été couramment utilisée pour l’isolation des véhicules électriques et nécessite un équipement spécialisé sous la forme d’un système de filtration à flux tangentiel (TFF). Récemment, Gałuszka et al. ont proposé une façon différente d’éliminer l’endotoxine des polluants atmosphériques (matières particulaires de la taille des VE mais sans structure membranaire) en utilisant la polymyxine B30. Cependant, l’utilité de ce protocole pour les vésicules dérivées de cellules doit être vérifiée par des modèles biologiques, en particulier lorsque l’on pense à des expériences in vivo . La polymixine B et le désoxycholate de sodium (également applicable à l’élimination des endotoxines) ont déjà été décrits comme neurotoxiques et néphrotoxiques31. D’autres possibilités sont les colonnes d’affinité avec la poly(ε-lysine), qui se lient sélectivement aux endotoxines. Cette méthode est cependant rapide et efficace, dédiée aux échantillons/solutions de protéines ; par conséquent, son application à des structures aussi complexes que les véhicules électriques doit être validée32. De plus, ces colonnes sont destinées aux échantillons présentant des niveaux initiaux élevés d’endotoxines, et leur efficacité à éliminer des quantités relativement faibles de LPS est inconnue et nécessite une vérification. La concentration finale prévue de LPS après purification avec des colonnes appauvrissant le LPS peut encore être trop élevée pour les tests sur cellules immunitaires (par exemple, <5 EU/mL).
En résumé, ce protocole proposait comment éviter la contamination par les endotoxines en appliquant plusieurs principes à la pratique du laboratoire, tels qu’une technique aseptique rigoureuse à toutes les étapes de l’isolement des VE, l’utilisation de réactifs à très faible teneur en endotoxines, la surveillance des impuretés d’endotoxines à toutes les étapes de la procédure et la modification de la méthode de stérilisation. De plus, le protocole présenté fournit des conseils sur la façon de contrôler les niveaux d’endotoxines à chaque étape de la procédure d’isolement. Le LPS présent dans les VE affecte la fonction des cellules immunitaires et peut donc provoquer de faux résultats dans les tests effectués avec ces cellules.
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Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être construite comme un conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Centre national des sciences, Pologne, numéro de subvention 2019/33/B/NZ5/00647. Nous tenons à remercier le professeur Tomasz Gosiewski et Agnieszka Krawczyk du département de microbiologie médicale moléculaire du Collège médical de l’Université Jagellonne pour leur aide inestimable dans la détection de l’ADN bactérien dans les véhicules électriques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
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