Summary
نقدم بروتوكولا يمكن استخدامه لإجراء اختبار الأدوية العلاجية باستخدام عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض.
Abstract
سرطان المبيض هو سرطان نسائي قاتل والسبب الرئيسي الخامس للوفاة بالسرطان بين النساء في الولايات المتحدة. يعد تطوير علاجات دوائية جديدة أمرا بالغ الأهمية للنهوض بالرعاية الصحية وتحسين نتائج المرضى. Organoids هي أعضاء مصغرة متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد في المختبر. قد تكون النماذج العضوية المشتقة من المريض (PDO) لسرطان المبيض مثالية لفحص الأدوية لأنها تلخص الأنسجة ذات الأهمية بشكل أكثر دقة من نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد وغير مكلفة مقارنة بالطعوم الخارجية المشتقة من المريض. بالإضافة إلى ذلك ، تحاكي PDOs لسرطان المبيض البيئة المكروية المتغيرة للورم والخلفية الجينية التي لوحظت عادة في سرطان المبيض. هنا ، يتم وصف طريقة يمكن استخدامها لاختبار الأدوية التقليدية والجديدة على PDOs المشتقة من أنسجة سرطان المبيض والاستسقاء. يتم استخدام مقايسة الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) القائم على التلألؤ لقياس الجدوى ومعدل النمو وحساسية الدواء. يمكن إكمال شاشات الأدوية في PDOs في 7-10 أيام ، اعتمادا على معدل تكوين الأعضاء والعلاجات الدوائية.
Introduction
على الرغم من ندرته ، يعد سرطان المبيض أحد أكثر سرطانات أمراض النساء فتكا 1,2. يتمثل التحدي في تطوير علاجات جديدة في أن سرطان المبيض غير متجانس ، وأن البيئة المكروية للورم تختلف اختلافا كبيرا بين المرضى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من سرطانات المبيض تطور مقاومة للعلاج الكيميائي القائم على البلاتين ومثبطات بوليميراز بولي (ADP-ribose) ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى خيارات علاجية أكبر3،4،5.
أحد الأساليب التي قد تكون مفيدة في تحديد العلاجات الجديدة هو استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs). الكائنات العضوية عبارة عن مجموعات ثلاثية الأبعاد من أنواع خلايا متعددة تنظم نفسها وتشكل في المختبر "أعضاء صغيرة"6،7،8،9،10. يمكن للعضويات تلخيص مورفولوجيا الأنسجة المهمة وملامح التعبير الجيني11,12. تم اشتقاق بعض الكائنات العضوية الأولى من خلايا سرطان الأمعاء والمعدة والقولون من كل من الفئران والبشر8،9،13. تم إنشاء مزارع عضوية طويلة العمر من مجموعة واسعة من الأنسجة الحميدة والخبيثة ، بما في ذلك المثانة والقولون والمعدة والبنكرياس والدماغ والشبكية والكبد14،15،16. لقد أظهرنا سابقا طرقا لإنشاء PDOs من أورام سرطان المبيض وعينات الاستسقاء17. يمكن استخدام PDOs لدراسة الخصائص الجزيئية والآليات الخلوية والعلاجات الدوائية الجديدة18،19،20. تتمتع PDOs بالعديد من المزايا مقارنة بمزارع الخلايا الأولية التقليدية ثنائية الأبعاد لفحص الأدوية. على الرغم من أن الثقافات الأولية ثنائية الأبعاد هي طريقة منخفضة التكلفة لشاشات الأدوية ، إلا أن مزارع الخلايا الأولية هي أنواع أحادية الخلية وتفتقر إلى البنية ثلاثية الأبعاد للأورام21،22،23. ومع ذلك ، تعد PDOs موردا ثمينا ، وهناك حاجة إلى بروتوكولات فعالة من حيث التكلفة لتحسين استخدامها في فحص الأدوية العلاجية.
توضح هذه المقالة طريقة في المختبر لاستخدام PDOs سرطان المبيض لاختبار آثار الأدوية المعروفة أو المرشحة. في حين أن شاشات الأدوية الحالية متوسطة وعالية الإنتاجية التي تستخدم PDOs تتطلب أدوات صرف آلية باهظة الثمن24،25،26 ، فإن هذه الطريقة الفعالة من حيث التكلفة تستخدم لوازم المختبرات الأساسية المتاحة بسهولة ومقايسة صلاحية الخلية القائمة على ATP في شكل لوحة قياسية من 96 بئرا (الشكل 1 أ). ستسهل هذه الطريقة الاختبارات الأولية لأدوية سرطان المبيض الجديدة قبل التوسع إلى شاشات أكبر27,28. على الرغم من استخدام PDOs لسرطان المبيض هنا ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على نماذج السرطان العضوية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جمع العينات البشرية لهذا البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لكلية الطب بجامعة واشنطن. جميع المرضى المؤهلين الذين تزيد أعمارهم عن 18 عاما لديهم تشخيص أو تشخيص مفترض لسرطان المبيض المصلي عالي الدرجة وكانوا مستعدين وقادرين على تقديم موافقة مستنيرة. تم الحصول على أنسجة الورم من المواقع الأولية أو النقيلية ، بالإضافة إلى الاستسقاء والسائل الجنبي ، من المرضى الموافقين في وقت الرعاية.
1. اختيار PDOs المنشأة لفحص الجدوى
ملاحظة: عادة ما تكون هذه الكائنات العضوية ضمن المقاطع الخمسة الأولى. كما هو موضح سابقا ، يتم تشكيل PDOs لسرطان المبيض عن طريق تعليق تعليق الخلايا الأولية في مستخلص الغشاء القاعدي (BME) مثل Cultrex أو Matrigel17 (انظر جدول المواد).
- يجب أن يكون لدى PDOs وقت مضاعفة متصور من 24-72 ساعة للحصول على أفضل كفاءة للفحص. قم بتقدير وقت المضاعفة المتصور عن طريق التحديد البصري لعدد الأيام التي تستغرقها الكائنات العضوية لتكوين بعد المرور / الطلاء.
ملاحظة: في تجربتنا ، لا يمكن استخدام المواد العضوية التي تستغرق أكثر من ثلاثة أيام لتكوينها لمقايسة تثبيط النمو هذه. - حدد الأدوية وحدد مجموعة من التركيزات لاختبارها (على سبيل المثال ، كاربوبلاتين ، 0-50 ميكرومتر ، انظر جدول المواد).
- تحديد إعداد اللوحة. سيتم إجراء هذا الفحص في ثلاث نسخ ، مما يحد من عدد الأدوية والتركيزات التي يمكن اختبارها على لوحة واحدة.
ملاحظة: يجب مراعاة خطوط شركة تنمية نفط عمان المختارة بعناية قبل إجراء الفحص. تشكل PDOs لسرطان المبيض الراسخة كرات صلبة ومجوفة متعددة الخلايا بأشكال ناشئة تشبه الورم (الشكل 1 ب). يجب مقارنة مورفولوجيا PDO ، والملف الجينومي ، وما إلى ذلك ، بعينة المريض (عندما يكون ذلك ممكنا) قبل إجراء الفحص29-33. يمكن إنشاء PDOs لسرطان المبيض من عينات الورم الأولية والنقيلي والاستسقاء17.
2. إعداد الكاشف لفحص الجدوى
- الوسائط الأساسية: إلى DMEM / F12 المتقدم ، أضف 1٪ (v / v) البنسلين - الستربتومايسين ، 1x الجلوتاماكس ، و 1٪ (v / v) HEPES17 (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد الوسائط العضوية المتقدمة لعضويات سرطان المبيض بعد التقريرالمنشور سابقا 17.
3. طلاء المواد العضوية (~ يوم -2)
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة قبل 1-3 أيام من إضافة الأدوية. قبل البدء ، قم بتسخين جميع الكواشف (الوسائط الأساسية ، الوسائط العضوية المتقدمة ، وكاشف تفكك الأعضاء ؛ انظر جدول المواد) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. قم بإذابة BME في حمام ماء مثلج.
- استخدم مجهر برايت فيلد لتأكيد ما إذا كانت الكائنات العضوية ذات الأهمية متقاربة بنسبة 70٪ -90٪.
ملاحظة: يوصى بحفظ صور المواد العضوية للرجوع إليها في المستقبل. - أضف 1-2 مل من الوسائط الأساسية الدافئة إلى المواد العضوية التي تحتوي على البئر والماصة لأعلى ولأسفل لفصل المواد العضوية المحتوية على BME ميكانيكيا. انقل المحلول بالكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل17.
ملاحظة: عادة ما يكون 1-2 مل من الوسائط كافيا لتخفيف BME بشكل صحيح. يمكن الجمع بين المواد العضوية لنفس المريض والممر. - دوامة لمدة 5-10 ثوان لمزيد من فصل الخلايا ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1107 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة أحادية القناة وتجاهلها. أعد تعليق المواد العضوية في كاشف تفكك عضوي سعة 1 مل (انظر جدول المواد) وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. احتضان لمدة 7 دقائق على 37 درجة مئوية.
- إذا كانت الحبيبات لا تزال هلامية بسبب BME المتبقية ، أضف 1 مل إضافي من الوسائط الأساسية ، دوامة لمدة 5-10 ثوان ، وكرر الطرد المركزي.
- جهاز طرد مركزي عند 1107 × جم لمدة 5 دقائق في RT. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من الوسائط الأساسية.
- احسب عدد الخلايا في كل مزرعة PDO باستخدام عداد الخلايا التلقائي (انظر جدول المواد) أو مقياس الدم.
- أعد تعليق الخلايا عند 20000 خلية لكل 10 ميكرولتر من 25٪ وسائط أساسية و 75٪ BME. افعل ذلك عن طريق تعليق المواد العضوية في الوسائط والاختلاط مع BME.
- صفيحة واحدة 3 ميكرولتر من خلايا BME + PDO المعاد تعليقها في بئر واحدة من صفيحة سوداء غير شفافة ذات 96 بئرا (انظر جدول المواد). ضع القطرات في وسط كل بئر. لوحة كل تركيز المخدرات في ثلاث نسخ.
ملاحظة: نظرا لأن مقايسة صلاحية الخلية تعتمد على التلألؤ ، فمن الأفضل استخدام لوحات سوداء غير شفافة لتجنب الخلفية. يمكن استخدام الألواح الشفافة لتصور المواد العضوية أثناء الفحص ، ولكن يجب تغطية الجزء السفلي من الألواح بشريط معتم قبل قياس التلألؤ. - احتضان طبق في حاضنة زراعة الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- أضف 100 ميكرولتر من الوسائط العضوية المتقدمة إلى كل بئر. احتضان لوحة لمدة 24-72 ساعة (حدد وفقا لوقت مضاعفة PDO المتصور). أضف 100 ميكرولتر من الوسائط العضوية المتقدمة إلى بئر فارغة لاستخدامها فارغة.
ملاحظة: الهدف هو السماح بتكوين المواد العضوية. - اختياري: لتحليل معدل النمو ، لوحة PDOs إضافية ثلاثية في لوحة منفصلة. سيتم استخدام هذا لحساب عدد الخلايا في الوقت = 0 ويجب فحصه في اليوم 0 باستخدام مقايسة الجدوى الموضحة في القسم 5.
4. إضافة أدوية لفحص الجدوى في اليوم 0
ملاحظة: يشير اليوم 0 إلى اليوم الذي تضاف فيه الأدوية إلى المواد العضوية المشكلة بالكامل.
- تمييع الأدوية المختارة في الوسائط العضوية المتقدمة إلى التركيزات المطلوبة. يمكن إجراء التخفيفات في أنابيب سعة 1.5 مل أو في لوحة 96 بئر معدة مسبقا ، مما يسمح باستخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع الوسائط.
ملاحظة: يجب إعادة تعليق الأدوية في المذيب الذي اقترحته الشركة المصنعة ، مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد. لهذه الدراسة ، تم إجراء التخفيفات التالية للكاربوبلاتين في الوسائط العضوية المتقدمة: 1 و 5 و 10 و 25 و 50 و 75 ميكرومتر. - قم بإزالة الوسائط من كل بئر باستخدام ماصة واحدة أو متعددة القنوات ، مع الحرص على عدم لمس أو إزعاج قطرة PDO / BME.
- أضف 100 ميكرولتر من الوسائط العضوية المتقدمة والدواء (الأدوية) المطلوبة إلى كل بئر. تأكد من إضافة وسائط جديدة إلى آبار التحكم الثلاثة.
ملاحظة: ستختلف تركيزات الدواء وتعتمد على السؤال العلمي وآلية عمل الدواء. عند تحديد التركيزات التي يجب استخدامها ، نبدأ بتركيزات الدواء المحددة مسبقا في خطوط خلايا 2D المماثلة (على سبيل المثال ، خطوط خلايا سرطان المبيض الخالدة). قد تحتاج إلى زيادة التركيزات إذا لم يكن هناك تأثير ملحوظ على المواد العضوية. - قم بتحديث الوسائط والأدوية حسب الحاجة (كرر الخطوات 4.1-4.3). يعتمد ما إذا كانت الوسائط ستحتاج إلى تحديث على طول الفحص والنشاط البيولوجي للدواء وعمر النصف للدواء. بالنسبة للمقايسات التي تزيد عن أسبوع واحد ، ستحتاج الوسائط إلى التحديث مرة واحدة على الأقل.
5. إنهاء مقايسة الجدوى للقراءة (~ اليوم 7)
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة في الأيام 7-10. يجب تحديد طول الفحص وفقا لعمر النصف والديناميكا الدوائية للأدوية التي يتم اختبارها.
- اسمح لكواشف فحص الجدوى بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة في الظلام. قم بتخزين الكواشف في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل (في الظلام) لتقليل وقت الذوبان.
- قم بإزالة لوحة الفحص من حاضنة زراعة الخلايا واتركها تتأقلم مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لا يجب أن تتأقلم اللوحة في الظلام.
- أضف 100 ميكرولتر من كاشف فحص الجدوى (انظر جدول المواد) إلى كل بئر (لحجم إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر) ، وضعه على شاكر لوحة لمدة 5 دقائق (80 دورة في الدقيقة). أخرج الطبق من الخلاط واحتضنه لمدة 25 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. تأكد من حماية اللوحة دائما من الضوء من خلال تغطيتها بورق أو صندوق غير شفاف.
- قم بتشغيل قارئ لوحة التلألؤ الحيوي وافتح برنامج i-control (انظر جدول المواد).
- ضمن الاتصال ب: اسم الأداة، حدد 200Pro لانهائي.
- حدد التلألؤ والبرنامج النصي الافتراضي.
- من القائمة المنسدلة ، اختر نوع اللوحة [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black.
- حدد الآبار التي يجب قراءتها وتمييز الآبار المقابلة تحت جزء من اللوحة.
- ضمن القياسات على الجانب الأيسر من الشاشة ، اسحب التلألؤ وأفلته أسفل جزء اللوحة.
- حدد معلمات التلألؤ: التوهين: لا شيء ؛ وقت التكامل: 1000 مللي ثانية ؛ استقرار الوقت: 0 مللي ثانية.
- قم بإزالة الغطاء من اللوحة وقم بتحميله في قارئ اللوحة. اضغط على ابدأ للبدء.
- عند الانتهاء ، قم بتصدير البيانات وحفظها.
6. تحليل البيانات
- احسب النسبة المئوية لصلاحية الخلية.
- اطرح "فارغ" من كل بئر للقراءات الفارغة المصححة. بعد ذلك ، احسب متوسط التحكم عن طريق حساب متوسط آبار التحكم الثلاثة.
- استخدم المعادلة التالية لحساب النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة في كل بئر: (بئر تجريبي / متوسط التحكم) × 100
- رسم البيانات الناتجة في برنامج التحليل (انظر جدول المواد).
- فحص مقاييس معدل النمو (GR).
- حساب مقاييس الموارد الوراثية يدويا وفقا للتقريرالمنشور 34.
- وبدلا من ذلك، استخدم حاسبة الموارد الوراثية على الإنترنت (انظر جدول المواد) لإنشاء المقاييس35. استخدم قياسات اليوم 0 ك "cell_count_time0" ، والتي تعكس معدل نمو PDOs غير المعالجة.
- تصدير البيانات والرسم البياني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توضح هذه النتائج استجابة اثنين من PDOs لعقار العلاج الكيميائي كاربوبلاتين ، والذي يستخدم لعلاج سرطان المبيض. تم اشتقاق المواد العضوية من خزعة الورم (PDO # 1) ومن الاستسقاء (PDO # 2). تم اختيار هذه الكائنات العضوية بناء على وقت المضاعفة المتصور (1-2 أيام) والمظهر المورفولوجي (تكوين العديد من الكائنات العضوية الكبيرة). تم طلاء كل من PDO # 1 و PDO # 2 في اليوم -2 ، في المقطع الثاني ، وأضيف كاربوبلاتين في اليوم 0. اختبرنا تركيزات الكاربوبلاتين التالية المخففة في الوسائط العضوية المتقدمة: 1 و 5 و 10 و 25 و 50 و 75 ميكرومتر. في ختام التجربة في اليوم 7 ، تمت إضافة كاشف فحص الجدوى إلى اللوحة ، وتم تحليل النتائج. يوضح الشكل 2 أ النسبة المئوية للخلايا الحية بعد العلاج بالكاربوبلاتين.
بعد ذلك ، تم استخدام حاسبة الموارد الوراثية عبر الإنترنت لتحليل البيانات. في غياب بيانات عدد الخلايا ، تم استخدام قيم التلألؤ المقاسة في مقايسة الجدوى. بعد تصدير مقاييس الموارد الوراثية ، تم رسم قيم الموارد الوراثية بيانيا ، وهي النسب بين معدلات النمو المتصورة في الحالات المعالجة وغير المعالجة التي تم تطبيعها إلى انقسام خلية واحدة34. ثم تم رسم هذه القيم مقابل تركيزات الكاربوبلاتين (الشكل 2 ب). يلخص الجدول 1 مقاييس الموارد الوراثية ، بما في ذلك أوقات مضاعفة الخلايا الضابطة والمعالجة ذات الصلة ومنطقة GR فوق المنحنى (GRAOC) ، والتي تدمج منحنى الاستجابة للجرعة على نطاق من تركيزات الكاربوبلاتين التي تم اختبارها34. يمكن تحديد الحساسية لدواء معين من خلال تفسير قيمة GR50 ، المقابلة للتركيز الذي يكون فيه للدواء تأثير نصف الحد الأقصى. على سبيل المثال ، قيمة GR50 ل PDO #1 أعلى بكثير من قيمة PDO #2 (4.85 μMمقابل 0.97 μM) ، مما يشير إلى أن PDO #1 أكثر مقاومة للعلاج الكيميائي البلاتيني من PDO #2.
الشكل 1: المواد العضوية المشتقة من المريض قبل فحص الدواء. (أ) مخطط تجريبي لشاشة أدوية شركة تنمية نفط عمان. بالنظر إلى مضاعفة وقت خط PDO ووقت التعرض للأدوية ، قد تحتاج الخطة التجريبية إلى تعديل. (ب) صور برايتفيلد التمثيلية (40x) لخطي PDO لسرطان المبيض (# 1 و # 2). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: PDO = عضويات مشتقة من المريض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية لسرطان المبيض PDO بعد العلاج بالكاربوبلاتين. (أ) عولج خطان من شركة تنمية نفط عمان بتركيزات متزايدة من الكاربوبلاتين لمدة سبعة أيام. يظهر المحور X تركيز كاربوبلاتين. يعرض المحور Y النسبة المئوية للخلايا الحية الطبيعية للتحكم في المواد العضوية (بدون كاربوبلاتين). تم الانتهاء من المقايسات في ثلاث نسخ مع اثنين من النسخ البيولوجية المكررة. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. (B) رسم بياني لقيمة GR يمثل تركيز الكربوبلاتين اللوغاريتمي (المحور x) وقيمة GR (المحور Y). تم إنشاء هذه القيم في حاسبة الموارد الوراثية على الإنترنت. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| العلاج | وقت مضاعفة خلية التحكم | وقت مضاعفة الخلايا المعالجة | جي آر 50 | GR_AOC | |
| شركة تنمية نفط عمان #1 | كاربوبلاتين | 0.744 | 0.112 | 4.85 | 1.28 |
| شركة تنمية نفط عمان #2 | كاربوبلاتين | 0.972 | 0.0532 | 0.97 | 1.51 |
الجدول 1: جدول يصور وقت مضاعفة خلية التحكم ، ووقت مضاعفة الخلية المعالجة ، و GR50 ، وقيم GR_AOC التي تم إنشاؤها في حاسبة الموارد الوراثية. الاختصارات: PDO = المواد العضوية المشتقة من المريض ، GR = معدل النمو ، GR_AOC = منطقة معدل النمو فوق المنحنى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توضح هذه المقالة طريقة يمكن استخدامها لتقييم الآثار العلاجية للأدوية التقليدية أو الجديدة على PDOs لسرطان المبيض. يجب على الباحثين النظر في العديد من القضايا قبل إجراء مقايسة الجدوى في نموذج شركة تنمية نفط عمان.
أولا ، عند اختيار PDO لاستخدامه في فحص الجدوى ، يجب على المرء تحديد النوع العضوي المثالي (الورم مقابل الاستسقاء) ورقم المرور لاحتياجاتهم. في تجربتنا ، تنمو PDOs المشتقة من الاستسقاء بسرعة أكبر ويسهل توليدها من PDOs المشتقة من الورم. نظرا لأن هذا الفحص يعتمد على معدل النمو ، فقد يكون من الصعب استخدام المواد العضوية التي تستغرق وقتا طويلا لتكوينها / نموها. لقد استخدمنا بنجاح خطوط شركة تنمية نفط عمان فقط مع مضاعفة أوقات أقل من 4 أيام.
ثانيا ، تم استخدام ألواح سوداء غير شفافة من 96 بئرا في هذه الدراسة. نظرا لأن مقايسة جدوى ATP تعتمد على التلألؤ ، فإن الآبار الشفافة ستقلل من شدة الإشارة وتولد تلوث الإشارة. تسمح الألواح السفلية الشفافة ذات الجدران غير الشفافة بتصور المواد العضوية أثناء الفحص وقد تساعد في مراقبة التغيرات التي يسببها العلاج في مورفولوجيا الخلية. على الرغم من أنها قوة مرتبطة بالتكلفة ، إلا أن أحد قيود هذا الفحص يستخدم صفيحة 96 بئرا ، مما يحد من عدد العينات والأدوية التي يمكن تقييمها في وقت واحد.
ثالثا ، يجب النظر بعناية في عدد الخلايا المطلية وتحسينها لمقايسات الجدوى. هذا صحيح بشكل خاص بسبب معدل النمو المتغير لخطوط شركة تنمية نفط عمان. عدد قليل جدا من الخلايا لن تشكل عضويات ، والكثير من الخلايا سيؤدي إلى فرط نمو عضوي. لضمان التوزيع الموحد للخلايا ، تم استخدام عداد خلية أوتوماتيكي وحافظ على نفس نسبة BME إلى الوسائط (75:25). تضمن هذه النسبة العالية من BME بقاء القطرات صلبة طوال فترة الفحص. هنا ، تم وضع 3 قطرات ميكرولتر من BME في وسط البئر. على الرغم من أنه يمكن زيادة حجم القطرة ، إلا أننا نحذر من طلاء البئر بالكامل. سيؤدي طلاء البئر بالكامل إلى استقرار المواد العضوية في حواف البئر ، مما سيعيق نموها الإجمالي ويؤثر على نتائج فحص الجدوى. لا بأس من وضع القطرة خارج المركز طالما أنها لا تلمس حواف البئر.
رابعا ، يؤدي السحب الذاتي إلى حدوث خطأ بشري ، ولكن يمكن التغلب على ذلك من خلال الاهتمام بالتفاصيل وإدراج آبار تحكم إضافية.
أخيرا ، يجب اختيار طول الفحص بعناية. سيؤثر التعرض المطول للعقاقير على صلاحية PDOs ، بغض النظر عن آلية عمل الدواء. لهذا السبب ، من المهم اختبار مجموعة من تركيزات الدواء على مدى خمسة أيام على الأقل. من المهم أن نقرر ما إذا كانت وسائل الإعلام ستحتاج إلى التغيير لفترات أطول لأن انخفاض مستويات عوامل النمو سيعيق آثار الأدوية36. لفحص ما إذا كانت الوسائط ستحتاج إلى التغيير أثناء الفحص ، يحتاج المرء إلى مقارنة النتائج من عناصر التحكم في اليوم 0 واليوم 7. يجب أن تستمر ضوابط PDO غير المعالجة في النمو طوال فترة الفحص بشكل مستمر.
مع استمرار PDOs في التقدم في التعقيد وتلخيص أنسجتها الأصلية بشكل أفضل ، يجب أن يؤدي استخدامها إلى تحسين اكتشاف الأدوية. ومع ذلك ، من المرجح أن تظل PDOs موردا ثمينا وتتطلب طرقا فعالة من حيث التكلفة للحفاظ على استخدامها وتحسينه. على عكس التقنيات المتوسطة والعالية الإنتاجية ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار المركبات المعروفة والجديدة بتكلفة أقل باستخدام المواد والمعدات المتاحة بسهولة. أخيرا ، يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة مع نماذج السرطان العضوية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R01CA243511. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. يشكر المؤلفون ديبورا فرانك على تعليقاتها التحريرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Plastic Tubes | |||
| 15 mL Plastic Tubes | |||
| 96 well Flat Black Plates | MidSci | 781968 | |
| Advance Organoid Media | see Graham et al 2022 (Jove) | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher | 12634028 | |
| Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | |
| Brightfield Microscope | |||
| Carboplatin | Teva Pharmaceuticals USA | NDC 00703-4246-01 | |
| CellTiter-Glo 3D Viability | Promega | G9681 | |
| Cultrex | R & D Systems | 3533-010-02 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| GR Calculator | http://www.grcalculator.org | Online calculator | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Plate Rocker | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips | |||
| Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes | |||
| Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software | Tecan | ||
| TrypLE | Thermo Fisher | 12605010 | Organoid dissociation reagent |
References
- Matulonis, U. A., Sood, A. K., Fallowfield, L., Howitt, B. E., Sehouli, J. m, Karlan, B. Y.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Christie, E. L., Bowtell, D. D. L. Acquired chemotherapy resistance in ovarian cancer. Annals of Oncology. 28 (suppl_8), viii13-viii15 (2017).
- Wang, L., Wang, Q., Xu, Y., Cui, M., Han, L. Advances in the treatment of ovarian cancer using PARP inhibitors and the underlying mechanism of resistance. Current Drug Targets. 21 (2), 167-178 (2020).
- Wang, Q., Peng, H., Qi, X., Wu, M., Zhao, X. Targeted therapies in gynecological cancers: a comprehensive review of clinical evidence. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 137 (2020).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: Tools for understanding biology and treating diseases. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 211-234 (2020).
- Zhao, Z., et al.
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W.
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 191, e64878 (2023).
- Liu, C., Qin, T., Huang, Y., Li, Y., Chen, G., Sun, C. Drug screening model meets cancer organoid technology. Translational Oncology. 13 (11), 100840 (2020).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
- Zhou, Z., Cong, L., Cong, X. Patient-derived organoids in precision medicine: drug screening, organoid-on-a-chip and living organoid biobank. Frontiers in Oncology. 11, 762184 (2021).
- Costa, E. C., Moreira, A. F., de Melo-Diogo, D., Gaspar, V. M., Carvalho, M. P., Correia, I. J. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Foo, M. A., et al. Clinical translation of patient-derived tumour organoids- bottlenecks and strategies. Biomarker Research. 10 (1), 10 (2022).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Bergdorf, K., et al. High-throughput drug screening of fine-needle aspiration-derived cancer organoids. STAR Protocols. 1 (3), 100212 (2020).
- Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Communications Biology. 2 (1), 78 (2019).
- Putker, M., et al. Medium-throughput drug- and radiotherapy screening assay using patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 170, e62495 (2021).
- Dahlin, J. L., Inglese, J., Walters, M. A. Mitigating risk in academic preclinical drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 279-294 (2015).
- Honkala, A., Malhotra, S. V., Kummar, S., Junttila, M. R. Harnessing the predictive power of preclinical models for oncology drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 99-114 (2022).
- de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Reports. 31 (11), 107762 (2020).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Maenhoudt, N., Vankelecom, H. Protocol for establishing organoids from human ovarian cancer biopsies. STAR Protocols. 2 (2), 100429 (2021).
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10 (1), 12581 (2020).
- Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
- Clark, N. A., et al. GRcalculator: an online tool for calculating and mining dose-response data. BMC Cancer. 17 (1), 698 (2017).
- Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Developmental Cell. 58 (12), 1106.e7-1121.e7 (2023).
