Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מודלים אורגנואידים שמקורם בחולות סרטן השחלות לבדיקת תרופות פרה-קליניות

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65068
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Washington University of Medicine in St. Louis

Summary

אנו מציגים פרוטוקול שניתן להשתמש בו לביצוע בדיקות תרופתיות טיפוליות עם אורגנואידים מסרטן השחלות שמקורם במטופלות.

Abstract

סרטן השחלות הוא סרטן גינקולוגי קטלני והגורם החמישי למוות מסרטן בקרב נשים בארצות הברית. פיתוח טיפולים תרופתיים חדשים חיוני לקידום שירותי הבריאות ולשיפור תוצאות המטופלים. אורגנואידים הם איברים זעירים תלת-ממדיים תלת-ממדיים רב-תאיים. מודלים אורגנואידים שמקורם במטופלות (PDO) של סרטן השחלות עשויים להיות אופטימליים לבדיקת תרופות מכיוון שהם משחזרים בצורה מדויקת יותר רקמות מעניינות מאשר מודלים של תרביות תאים דו-ממדיות והם זולים בהשוואה לקסנוגרפטים שמקורם במטופל. בנוסף, PDOs של סרטן השחלות מחקים את המיקרו-סביבה המשתנה של הגידול ואת הרקע הגנטי שנצפה בדרך כלל בסרטן השחלות. כאן מתוארת שיטה שניתן להשתמש בה לבדיקת תרופות קונבנציונליות וחדשניות על PDOs שמקורם ברקמת סרטן השחלות ומיימת. בדיקת אדנוזין טריפוספט (ATP) מבוססת לומינסנציה משמשת למדידת כדאיות, קצב גדילה ורגישות לתרופות. ניתן להשלים בדיקות תרופתיות ב- PDO תוך 7-10 ימים, בהתאם לקצב היווצרות האורגנואידים והטיפולים התרופתיים.

Introduction

למרות נדיר, סרטן השחלות הוא אחד מסוגי הסרטן הגינקולוגיים הקטלניים ביותר 1,2. אתגר בפיתוח טיפולים חדשים הוא שסרטן השחלות הוא הטרוגני, והמיקרו-סביבה של הגידול שונה מאוד בין המטופלות. בנוסף, סרטני שחלות רבים מפתחים עמידות לכימותרפיה מבוססת פלטינום ולמעכבי פולימראז (ADP-ריבוז), המדגישים את הצורך באפשרויות טיפוליות גדולות יותר 3,4,5.

גישה אחת שעשויה להיות שימושית בזיהוי טיפולים חדשים היא שימוש באורגנואידים שמקורם במטופל (PDOs). אורגנואידים הם צבירים תלת-ממדיים של סוגי תאים מרובים המתארגנים בעצמם ויוצרים במבחנה "מיני-איברים"6,7,8,9,10. אורגנואידים יכולים לשחזר מורפולוגיה חשובה של רקמות ופרופילי ביטוי גנים11,12. חלק מהאורגנואידים הראשונים נגזרו מתאי סרטן המעיים, הקיבה והמעי הגס הן מעכברים והן מבני אדם 8,9,13. תרביות אורגנואידים ארוכות חיים הוקמו ממגוון רחב של רקמות שפירות וממאירות, כולל שלפוחית השתן, המעי הגס, הקיבה, הלבלב, המוח, הרשתית והכבד 14,15,16. בעבר הדגמנו שיטות לקביעת PDOs מגידולים סרטניים בשחלות ודגימות מיימת17. PDOs יכולים לשמש לחקר מאפיינים מולקולריים, מנגנונים תאיים וטיפולים תרופתיים חדשניים 18,19,20. ל-PDOs יש מספר יתרונות על פני תרביות תאים ראשוניים דו-ממדיות מסורתיות לבדיקת תרופות. למרות שתרביות דו-ממדיות ראשוניות הן שיטה זולה למסכי תרופות, תרביות תאים ראשוניות הן מסוג חד-תאי וחסרות את הארכיטקטורה התלת-ממדית של גידולים 21,22,23. עם זאת, PDOs הם משאב יקר, ויש צורך בפרוטוקולים חסכוניים כדי לייעל את השימוש בהם בסינון תרופות טיפוליות.

מאמר זה מתאר שיטה במבחנה לשימוש ב- PDO של סרטן השחלות כדי לבדוק את ההשפעות של תרופות ידועות או מועמדות. בעוד שמסכי תרופות בתפוקה בינונית וגבוהה המשתמשים ב-PDO דורשים מכשירי ניפוק אוטומטיים יקרים 24,25,26, שיטה חסכונית זו משתמשת בחומרי מעבדה בסיסיים זמינים ובבדיקת כדאיות תאים מבוססת ATP בתבנית צלחת סטנדרטית של 96 בארות (איור 1A). שיטה זו תאפשר בדיקות מקדימות של תרופות חדשות לסרטן השחלות לפני הרחבה למסכים גדולים יותר27,28. למרות PDOs סרטן השחלות משמשים כאן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מודלים אחרים אורגנואידים סרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אוסף הדגימות האנושיות למחקר זה אושר על ידי ועדת הסקירה המוסדית של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון. לכל המטופלות הזכאיות מעל גיל 18 הייתה אבחנה או אבחנה משוערת של סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה והן היו מוכנות ומסוגלות לספק הסכמה מדעת. רקמת הגידול מאתרים ראשוניים או גרורתיים, בנוסף למיימת ונוזל פלאורלי, התקבלו מחולים מוסכמים בזמן הטיפול.

1. בחירת PDOs מבוססים לבדיקת כדאיות

הערה: בדרך כלל, אורגנואידים אלה נמצאים בתוך חמשת הקטעים הראשונים. כפי שתואר קודם לכן, PDOs של סרטן השחלות נוצרים על ידי השעיה מחדש של תרחיף תאים ראשוני בתמצית קרום מרתף (BME) כגון Cultrex או Matrigel17 (ראה טבלת חומרים).

  1. PDOs צריכים להיות בעלי זמן הכפלה נתפס של 24-72 שעות לקבלת היעילות הטובה ביותר של הבדיקה. הערך את זמן ההכפלה הנתפס על ידי קביעה חזותית של מספר הימים שלוקח לאורגנואידים להיווצר לאחר העברה/ציפוי.
    הערה: מניסיוננו, אורגנואידים שלוקח להם יותר משלושה ימים להיווצר לא יכולים לשמש לבדיקת עיכוב גדילה זו.
  2. זהה תרופות ובחר טווח ריכוזים לבדיקה (לדוגמה, Carboplatin, 0-50 μM, ראה טבלת חומרים).
  3. קבע את הגדרת הצלחת. בדיקה זו תבוצע בשילוש, תוך הגבלת מספר התרופות והריכוזים שניתן לבדוק על צלחת אחת.
    הערה: יש להקפיד על קווי PDO נבחרים לפני ביצוע הבדיקה. PDOs מבוססים של סרטן השחלות יוצרים כדורים רב-תאיים, מוצקים וחלולים עם צורות ניצנים דמויות גידול (איור 1B). יש להשוות את המורפולוגיה של PDO, הפרופיל הגנומי וכו' לזה של דגימת המטופל (במידת האפשר) לפני ביצוע הבדיקה29-33. PDO של סרטן השחלות יכול להיווצר מדגימות גידול ראשוניות וגרורתיות ומיימת17.

2. הכנת מגיב לבדיקת הכדאיות

  1. מדיית בסיס: ל-DMEM/F12 מתקדם, יש להוסיף 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין, 1x גלוטמקס ו-1% (v/v)HEPES17 (ראה טבלת חומרים).
  2. הכינו מדיה אורגנואידית מתקדמת לאורגנואידים של סרטן השחלות בעקבות דו"ח17 שפורסם בעבר.

3. ציפוי אורגנואידים (~ יום -2)

הערה: שלב זה חייב להתבצע 1-3 ימים לפני הוספת התרופות. לפני שמתחילים, יש לחמם את כל הריאגנטים (Base Media, Advance Organoid Media ו-organoid dissociation reagent; ראו טבלת חומרים) ל-37°C באמבט מים. הפשיר BME באמבט מי קרח.

  1. השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לאשר אם אורגנואידים בעלי עניין הם 70%-90% חופפים.
    הערה: מומלץ לשמור תמונות של האורגנואידים לעיון עתידי.
  2. הוסף 1-2 מ"ל של מצע בסיס מחומם לבאר המכילה אורגנואידים ופיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק מכנית את האורגנואידים המכילים BME. מעבירים את התמיסה כולה לצינור חרוטי 15 מ"ל17.
    הערה: בדרך כלל, 1-2 מ"ל של מדיה מספיק כדי לדלל כראוי את BME. ניתן לשלב אורגנואידים של אותו חולה ומעבר.
  3. מערבולת במשך 5-10 שניות כדי לנתק עוד יותר את התאים, וצנטריפוגה ב 1107 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  4. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה חד-ערוצית ומשליכים. השהה אורגנואידים במגיב דיסוציאציה אורגנואידי 1 מ"ל (ראה טבלת חומרים) והעבר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. יש לדגור במשך 7 דקות ב-37°C.
    1. אם הגלולה עדיין ג'לטינית בגלל ה- BME הנותר, הוסף 1 מ"ל נוספים של מדיה בסיסית, מערבולת עבור 5-10 שניות, וצנטריפוגה חוזרת.
  5. צנטריפוגה ב 1107 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להסיר ולהשליך את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל של מדיה בסיסית.
  6. ספור את מספר התאים בכל תרבית PDO באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים) או המוציטומטר.
  7. תאי השהיה מחדש ב- 20,000 תאים לכל 10 מיקרוליטר של 25% מדיה בסיסית ו- 75% BME. עשה זאת על ידי השעיה מחדש של האורגנואידים בתקשורת וערבוב עם BME.
  8. לוחית אחת של 3 μL טיפות של תאי BME + PDO מרחפים לתוך באר אחת של צלחת אטומה שחורה בת 96 בארות (ראה טבלת חומרים). מניחים את הטיפות במרכז כל באר. צלחת ריכוז כל תרופה משולשת.
    הערה: מאחר שבדיקת הכדאיות של התא מבוססת על עוצמת האור, עדיף להשתמש בלוחות אטומים שחורים כדי להימנע מרקע. ניתן להשתמש בלוחות שקופים כדי לדמיין אורגנואידים במהלך הבדיקה, אך יש לכסות את תחתית הלוחות בסרט אטום לפני מדידת ההארה.
  9. דגירה על צלחת באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות.
  10. הוסף 100 μL של מדיה אורגנואידית מתקדמת לכל באר. צלחת הדגירה במשך 24-72 שעות (לקבוע על פי זמן הכפלת PDO נתפס). הוסף 100 μL של מדיה אורגנואידית מתקדמת לבאר ריקה לשימוש ריק.
    הערה: המטרה היא לאפשר לאורגנואידים להיווצר.
  11. אופציונלי: לניתוח קצב צמיחה, לוחית PDO משולש נוסף בלוח נפרד. זה ישמש לספירת תאים בזמן = 0 ויש לבדוק אותו ביום 0 באמצעות בדיקת הכדאיות המתוארת בסעיף 5.

4. הוספת תרופות לבדיקת הכדאיות ביום 0

הערה: יום 0 מתייחס ליום שבו התרופות מתווספות לאורגנואידים שנוצרו במלואם.

  1. יש לדלל תרופות נבחרות במצע אורגנואיד מתקדם לריכוזים הרצויים. דילולים יכולים להתבצע בצינורות 1.5 מ"ל או בצלחת 96 באר מוגדרת מראש, שתאפשר שימוש בפיפט רב ערוצי לחלוקת המדיה.
    הערה: תרופות חייבות להיות מושעות מחדש בממס המוצע על ידי היצרן, כגון dimethyl sulfoxide. במחקר זה נעשו הדילולים הבאים של קרבופלטין במדיה אורגנואידית מתקדמת: 1, 5, 10, 25, 50 ו-75 מיקרומטר.
  2. הסר מדיה מכל באר עם פיפטה אחת או רב ערוצית, תוך זהירות שלא לגעת או להפריע לטיפת PDO/BME.
  3. הוסף 100 μL של חומר אורגנואיד מתקדם ותרופות רצויות לכל באר. הקפד להוסיף מדיה טרייה לשלוש בארות הבקרה.
    הערה: ריכוזי התרופות ישתנו ויהיו תלויים בשאלה המדעית ובמנגנון הפעולה של התרופה. כאשר אנו מחליטים באילו ריכוזים להשתמש, אנו מתחילים עם ריכוזי תרופות שנקבעו בעבר בשורות תאים דו-ממדיות דומות (למשל, שורות תאים של סרטן שחלות אימורטלי). ייתכן שיהיה צורך להגדיל את הריכוזים אם לא נצפתה השפעה על אורגנואידים.
  4. רענן מדיה ותרופות לפי הצורך (חזור על שלבים 4.1-4.3). השאלה אם יהיה צורך לרענן את המדיה תלויה באורך הבדיקה, בפעילות הביולוגית של התרופה ובמחצית החיים של התרופה. עבור בדיקות במשך שבוע, יהיה צורך לרענן את המדיה לפחות פעם אחת.

5. סיום בדיקת הכדאיות לקריאה (~ יום 7)

הערה: ניתן לבצע שלב זה בימים 7-10. אורך הבדיקה חייב להיקבע על פי זמן מחצית החיים והפרמקודינמיקה של התרופות הנבדקות.

  1. אפשרו לריאגנטים של בדיקת הכדאיות להגיע לטמפרטורת החדר בחושך. אחסנו את הריאגנטים בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה (בחושך) כדי להפחית את זמן ההפשרה.
  2. מוציאים את צלחת הבדיקה מאינקובטור תרביות התאים ומאפשרים לה להתאקלם לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הצלחת לא צריכה להתאקלם בחושך.
  3. הוסף 100 μL של מגיב בדיקת כדאיות (ראה טבלת חומרים) לכל באר (לנפח כולל של 200 μL), ומניחים על שייקר צלחת למשך 5 דקות (80 סל"ד). מוציאים את הצלחת מהשייקר ודגרים 25 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. ודא שהצלחת תמיד מוגנת מפני אור על ידי כיסויה בנייר כסף או בקופסה אטומה.
  4. הפעל את קורא הלוחות bioluminescence ופתח את תוכנת i-control (ראה טבלת חומרים).
  5. תחת התחבר אל: שם מכשיר, בחר infinite 200Pro.
  6. בחר Luminescence וסקריפט ברירת מחדל.
  7. בתפריט הנפתח, בחר סוג צלחת [BD96fb_Falcon-BD] Falcon 96 Flat Black.
  8. קבע אילו בארות לקרוא והדגש את הבארות המתאימות תחת חלק מהצלחת.
  9. תחת 'מדידות' בצד שמאל של המסך, גררו ושחררו Luminescence מתחת לחלק של לוחית.
  10. בחר את פרמטרי ההארה: הנחתה: ללא; זמן אינטגרציה: 1000 אלפיות השנייה; זמן יישוב: 0 מטר/שניה.
  11. הסירו את המכסה מהצלחת והעמיסו אותו בקורא הלוחות. לחץ על התחל כדי להתחיל.
  12. בסיום, לייצא נתונים ולשמור.

6. ניתוח נתונים

  1. חשב את אחוז הכדאיות של התא.
    1. החסרו את ה"ריק" מכל באר עבור הקריאות המתוקנות של הריק. לאחר מכן, חשב ממוצע בקרה על ידי ממוצע שלוש בארות הבקרה.
    2. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את אחוז התאים בני קיימא בכל באר: (באר ניסוי / ממוצע בקרה) x 100
    3. צור גרף של הנתונים המתקבלים בתוכנת הניתוח (ראה טבלת חומרים).
  2. בחן את מדדי קצב הצמיחה (GR).
    1. חישוב ידני של מדדי GR על פי הדו"חשפורסם 34.
    2. לחלופין, השתמש במחשבון GR המקוון (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור את המדדים35. השתמש במדידות יום 0 כ"cell_count_time0", המשקפות את קצב הצמיחה של PDO שלא טופלו.
    3. ייצוא נתונים וגרף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות אלה ממחישות את התגובה של שני PDO לתרופה הכימותרפית קרבופלטין, המשמשת לטיפול בסרטן השחלות. אורגנואידים נגזרו מביופסיה של הגידול (PDO #1) וממיימת (PDO #2). אורגנואידים אלה נבחרו על סמך זמן ההכפלה הנתפס שלהם (1-2 ימים) והמראה המורפולוגי שלהם (היווצרות של אורגנואידים גדולים רבים). גם PDO #1 וגם PDO #2 צופו ביום -2, במעבר השני, וקרבופלטין נוסף ביום 0. בדקנו את ריכוזי הקרבופלטין הבאים המדוללים במדיה אורגנואידית מתקדמת: 1, 5, 10, 25, 50 ו-75 מיקרומטר. בסיום הניסוי ביום 7, נוסף לצלחת מגיב בדיקת הכדאיות, והתוצאות נותחו. איור 2A מתאר את אחוז התאים החיים לאחר טיפול בקרבופלטין.

לאחר מכן, מחשבון GR המקוון שימש לניתוח הנתונים. בהיעדר נתוני ספירת תאים, נעשה שימוש בערכי ההארה שנמדדו בבדיקת הכדאיות. לאחר ייצוא מדדי GR, ערכי GR היו גרפים, שהם היחסים בין שיעורי הצמיחה הנתפסים בתנאים מטופלים ולא מטופלים מנורמל לחלוקת תא בודד34. הערכים האלה הושוו לאחר מכן כנגד ריכוזי הקרבופלטין (איור 2B). טבלה 1 מסכמת את מדדי ה-GR, כולל זמני הבקרה והכפלת התאים המטופלים בהתאמה ו-GR Area Over the Curve (GRAOC), המשלב את עקומת המינון-תגובה על פני טווח ריכוזי קרבופלטין שנבדקו34. רגישות לתרופה מסוימת יכולה להיקבע על ידי פירוש ערך GR50 , המתאים לריכוז שבו התרופה יש השפעה חצי מקסימלית. לדוגמה, ערך GR50 עבור PDO #1 גבוה בהרבה מזה של PDO #2 (4.85 מיקרומטרלעומת 0.97 מיקרומטר), מה שמצביע על כך ש- PDO #1 עמיד יותר לכימותרפיה מפלטינה מאשר PDO #2.

Figure 1
איור 1: אורגנואידים שמקורם במטופלים לפני בדיקת תרופות. (A) מתווה ניסיוני לבדיקת תרופות PDO. בהתחשב בזמן ההכפלה של קו ה- PDO וזמן החשיפה לתרופה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את תוכנית הניסוי. (B) תמונות שדה בהיר מייצגות (40x) של שני קווי PDO של סרטן השחלות (#1 ו- #2). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: PDO = אורגנואידים שמקורם בחולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות מייצגות של PDO בסרטן השחלות לאחר טיפול בקרבופלטין. (A) שני קווי PDO טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של קרבופלטין במשך שבעה ימים. ציר ה-X מראה ריכוז קרבופלטין; ציר Y מציג את % התאים החיים המנורמלים לבקרת אורגנואידים (ללא קרבופלטין). הבדיקות הושלמו בשילוש עם שני שכפולים ביולוגיים. קווי השגיאה מציינים את סטיית התקן. (B) גרף ערך GR המייצג את ריכוז הקרבופלטין הלוגריתמי (ציר x) ואת ערך GR (ציר Y). ערכים אלה נוצרו במחשבון GR המקוון. קווי השגיאה מציינים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טיפול זמן הכפלת תא הבקרה זמן הכפלת תאים מטופלים GR50 GR_AOC
PDO #1 קרבופלטין 0.744 0.112 4.85 1.28
PDO #2 קרבופלטין 0.972 0.0532 0.97 1.51

טבלה 1: טבלה המתארת את זמן הכפלת תא הבקרה, זמן הכפלת התא שטופל, GR50 וערכי GR_AOC שנוצרו במחשבון GR. קיצורים: PDO = אורגנואידים שמקורם בחולה, GR = קצב צמיחה, GR_AOC = שטח קצב צמיחה מעל העקומה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה שניתן להשתמש בה כדי להעריך את ההשפעות הטיפוליות של תרופות קונבנציונליות או חדשניות על PDO של סרטן השחלות. על החוקרים לשקול מספר סוגיות לפני ביצוע בדיקת הכדאיות במודל PDO.

ראשית, בעת בחירת PDO לשימוש בבדיקת הכדאיות, יש לקבוע את סוג האורגנואיד האידיאלי (גידול לעומת מיימת) ומספר המעבר לצרכיהם. מניסיוננו, PDO שמקורו במיימת גדל מהר יותר וקל יותר לייצר אותו מאשר PDO שמקורו בגידול. מכיוון שבדיקה זו תלויה בקצב הגדילה, שימוש באורגנואידים שלוקח להם זמן רב להיווצר / לגדול עשוי להיות קשה. השתמשנו בהצלחה רק בקווי PDO עם זמני הכפלה של פחות מ- 4 ימים.

שנית, במחקר זה נעשה שימוש בלוחות שחורים אטומים בעלי 96 בארות. מכיוון שבדיקת הכדאיות של ATP מבוססת על הארה, בארות שקופות יפחיתו את עוצמת האות וייצרו זיהום אותות. לוחות תחתונים אטומים ושקופים מאפשרים הדמיה של אורגנואידים במהלך הבדיקה ועשויים לסייע במעקב אחר שינויים הנגרמים על ידי הטיפול במורפולוגיה של התא. למרות שמדובר בחוזק הקשור לעלות, מגבלה של בדיקה זו היא שימוש בצלחת 96 בארות, המגבילה את מספר הדגימות והתרופות שניתן להעריך בו זמנית.

שלישית, מספר התאים המצופים חייב להילקח בחשבון בקפידה ולהיות מותאם למבחני כדאיות. זה נכון במיוחד בגלל קצב הצמיחה המשתנה של קווי PDO; מעט מדי תאים לא ייצרו אורגנואידים, ויותר מדי תאים יובילו לצמיחת יתר של אורגנואידים. כדי להבטיח פיזור אחיד של תאים, נעשה שימוש במונה תאים אוטומטי ששמר על אותו יחס BME-to-media (75:25). אחוז גבוה זה של BME מבטיח שהטיפות יישארו מוצקות במשך כל הבדיקה. כאן, 3 טיפות μL של BME הונחו במרכז הבאר. למרות שניתן להגדיל את גודל הטיפה, אנו מזהירים מפני ציפוי הבאר כולה. ציפוי הבאר כולה יגרום לאורגנואידים להתיישב בשולי הבאר, מה שגם יעכב את צמיחתם הכוללת וגם ישפיע על תוצאות בדיקת הכדאיות. מיקום לא מרכזי של הטיפה הוא בסדר כל עוד היא לא נוגעת בשולי הבאר.

רביעית, צנרת עצמית מציגה טעויות אנוש, אך ניתן להתגבר על כך על ידי תשומת לב לפרטים והכללת בארות בקרה נוספות.

לבסוף, יש לבחור בקפידה את אורך הבדיקה. חשיפה ממושכת לתרופות תשפיע על הכדאיות של PDOs, ללא תלות במנגנון הפעולה התרופתי. מסיבה זו, חשוב לבדוק טווח של ריכוזי תרופות על פני מינימום של חמישה ימים. חשוב להחליט אם יהיה צורך לשנות את המדיה לתקופות ארוכות יותר מכיוון שרמות מופחתות של גורמי גדילה יעכבו את ההשפעות של התרופות36. כדי לבחון האם יהיה צורך לשנות את המדיה במהלך הבדיקה, יש להשוות את התוצאות מיום 0 ויום 7 לבקרות. בקרות PDO לא מטופלות אמורות להמשיך לגדול לאורך הבדיקה ברציפות.

ככל ש-PDOs ממשיכים להתקדם במורכבותם ולשחזר טוב יותר את רקמות המקור שלהם, השימוש בהם אמור לשפר את גילוי התרופות. עם זאת, PDOs צפויים להישאר משאב יקר ודורשים שיטות חסכוניות כדי לשמר ולייעל את השימוש בהם. שלא כמו טכניקות בעלות תפוקה בינונית וגבוהה, פרוטוקול זה יכול לשמש לבדיקת תרכובות ידועות וחדשניות בעלות נמוכה יותר עם חומרים וציוד זמינים. לבסוף, שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות למודלים שונים של אורגנואידים סרטניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01CA243511. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. המחברים מודים לדבורה פרנק על הערות העריכה שלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Plastic Tubes
15 mL Plastic Tubes
96 well Flat Black Plates MidSci 781968
Advance Organoid Media  see Graham et al 2022 (Jove)
Advanced DMEM/F12 Thermo Fisher 12634028
Automated Cell Counter Thermo Fisher AMQAX1000
Brightfield Microscope
Carboplatin  Teva Pharmaceuticals USA NDC 00703-4246-01
CellTiter-Glo 3D Viability  Promega G9681
Cultrex R & D Systems 3533-010-02
DMSO Sigma Aldrich D2650-100ML
Glutamax Life Technologies 35050061
GR Calculator  http://www.grcalculator.org Online calculator
GraphPad Prism GraphPad Software, Inc.
HEPES Life Technologies 15630080
Matrigel Corning 354230
Microsoft Excel Microsoft
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
Plate Rocker
Sterile P10, P200, and P1000 Barrier Sterile Pipette Tips
Sterile P10, P200, and P1000 Pipettes
Tecan Infinte 200Pro Plate Reader; i-Control Software Tecan
TrypLE Thermo Fisher 12605010 Organoid dissociation reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matulonis, U. A., Sood, A. K., Fallowfield, L., Howitt, B. E., Sehouli, J. m, Karlan, B. Y. Ovarian cancer. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16061 (2016).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  3. Christie, E. L., Bowtell, D. D. L. Acquired chemotherapy resistance in ovarian cancer. Annals of Oncology. 28 (suppl_8), viii13-viii15 (2017).
  4. Wang, L., Wang, Q., Xu, Y., Cui, M., Han, L. Advances in the treatment of ovarian cancer using PARP inhibitors and the underlying mechanism of resistance. Current Drug Targets. 21 (2), 167-178 (2020).
  5. Wang, Q., Peng, H., Qi, X., Wu, M., Zhao, X. Targeted therapies in gynecological cancers: a comprehensive review of clinical evidence. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 137 (2020).
  6. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).
  7. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  11. Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: Tools for understanding biology and treating diseases. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 211-234 (2020).
  12. Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
  13. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  14. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
  15. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  16. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  17. Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 191, e64878 (2023).
  18. Liu, C., Qin, T., Huang, Y., Li, Y., Chen, G., Sun, C. Drug screening model meets cancer organoid technology. Translational Oncology. 13 (11), 100840 (2020).
  19. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  20. Zhou, Z., Cong, L., Cong, X. Patient-derived organoids in precision medicine: drug screening, organoid-on-a-chip and living organoid biobank. Frontiers in Oncology. 11, 762184 (2021).
  21. Costa, E. C., Moreira, A. F., de Melo-Diogo, D., Gaspar, V. M., Carvalho, M. P., Correia, I. J. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  22. Foo, M. A., et al. Clinical translation of patient-derived tumour organoids- bottlenecks and strategies. Biomarker Research. 10 (1), 10 (2022).
  23. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  24. Bergdorf, K., et al. High-throughput drug screening of fine-needle aspiration-derived cancer organoids. STAR Protocols. 1 (3), 100212 (2020).
  25. Phan, N., et al. A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids. Communications Biology. 2 (1), 78 (2019).
  26. Putker, M., et al. Medium-throughput drug- and radiotherapy screening assay using patient-derived organoids. Journal of Visualized Experiments. 170, e62495 (2021).
  27. Dahlin, J. L., Inglese, J., Walters, M. A. Mitigating risk in academic preclinical drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 279-294 (2015).
  28. Honkala, A., Malhotra, S. V., Kummar, S., Junttila, M. R. Harnessing the predictive power of preclinical models for oncology drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 99-114 (2022).
  29. de Witte, C. J., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids mimic clinical response and exhibit heterogeneous inter- and intrapatient drug responses. Cell Reports. 31 (11), 107762 (2020).
  30. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  31. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  32. Maenhoudt, N., Vankelecom, H. Protocol for establishing organoids from human ovarian cancer biopsies. STAR Protocols. 2 (2), 100429 (2021).
  33. Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10 (1), 12581 (2020).
  34. Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 521-527 (2016).
  35. Clark, N. A., et al. GRcalculator: an online tool for calculating and mining dose-response data. BMC Cancer. 17 (1), 698 (2017).
  36. Senkowski, W., et al. A platform for efficient establishment and drug-response profiling of high-grade serous ovarian cancer organoids. Developmental Cell. 58 (12), 1106.e7-1121.e7 (2023).

Tags

סרטן השחלות מודלים אורגנואידים שמקורם בחולה בדיקות תרופות פרה-קליניות סרטן גינקולוגי טיפולים תרופתיים שירותי בריאות תוצאות המטופלים אורגנואידים מבחנה איברים זעירים רב-תאיים תלת-ממדיים מודלים של PDO בדיקת תרופות מודלים דו-ממדיים של תרביות תאים קסנוגרפטים שמקורם בחולה מיקרו-סביבה של גידולים רקע גנטי רקמת סרטן השחלות מיימת בדיקת אדנוזין טריפוספט (ATP) מבוססת לומינסצנטיות כדאיות קצב גדילה רגישות לתרופות
מודלים אורגנואידים שמקורם בחולות סרטן השחלות לבדיקת תרופות פרה-קליניות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fashemi, B. E., van Biljon, L.,… More

Fashemi, B. E., van Biljon, L., Rodriguez, J., Graham, O., Mullen, M., Khabele, D. Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing. J. Vis. Exp. (199), e65068, doi:10.3791/65068 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter