Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Nettverksfarmakologi Prediksjon og metabolomikk Validering av mekanismen til Fructus Phyllanthi mot hyperlipidemi

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65071
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 2,3
1School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Regimen and Health, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Regimen and Health of Sichuan Province
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver en integrert strategi for å utforske de viktigste målene og mekanismene til Fructus Phyllanthi mot hyperlipidemi basert på nettverksfarmakologiprediksjon og metabolomikkverifikasjon.

Abstract

Hyperlipidemi har blitt en ledende risikofaktor for kardiovaskulære sykdommer og leverskade over hele verden. Fructus Phyllanthi (FP) er et effektivt stoff mot hyperlipidemi i tradisjonell kinesisk medisin (TCM) og indisk medisin teorier, men den potensielle mekanismen krever videre utforskning. Den nåværende forskningen tar sikte på å avdekke mekanismen for FP mot hyperlipidemi basert på en integrert strategi som kombinerer nettverksfarmakologiprediksjon med metabolomics-validering. En høy-fett diett (HFD)-indusert musmodell ble etablert ved å evaluere plasmalipidnivåene, inkludert totalt kolesterol (TC), triglyserid (TG), lipoproteinkolesterol med lav tetthet (LDL-C) og lipoproteinkolesterol med høy tetthet (HDL-C). Nettverksfarmakologi ble brukt for å finne ut de aktive ingrediensene i FP og potensielle mål mot hyperlipidemi. Metabolomikk av plasma og lever ble utført for å identifisere differensialmetabolitter og deres tilsvarende veier blant normalgruppen, modellgruppen og intervensjonsgruppen. Forholdet mellom nettverksfarmakologi og metabolomikk ble videre konstruert for å få en omfattende oversikt over prosessen med FP mot hyperlipidemi. De oppnådde nøkkelmålproteinene ble verifisert ved molekylær dokking. Disse resultatene reflekterte at FP forbedret plasmalipidnivåene og leverskade av hyperlipidemi indusert av en HFD. Gallinsyre, quercetin og beta-sitosterol i FP ble vist som de viktigste aktive forbindelsene. Totalt 16 og seks potensielle differensialmetabolitter i henholdsvis plasma og lever ble funnet å være involvert i de terapeutiske effektene av FP mot hyperlipidemi av metabolomics. Videre indikerte integrasjonsanalyse at intervensjonseffektene var assosiert med CYP1A1, AChE og MGAM, samt justering av L-kynurenin, kortikosteron, acetylkolin og raffinose, hovedsakelig med tryptofanmetabolismevei. Molekylær dokking sørget for at de ovennevnte ingrediensene som virker på hyperlipidemi-relaterte proteinmål, spilte en nøkkelrolle i å senke lipider. Oppsummert ga denne undersøkelsen en ny mulighet for å forebygge og behandle hyperlipidemi.

Introduction

Hyperlipidemi er en vanlig metabolsk sykdom med alvorlige konsekvenser for menneskers helse, og er også den primære risikofaktoren for kardiovaskulære sykdommer1. Nylig har det vært en nedadgående aldersrelatert trend for denne sykdommen, og yngre mennesker har blitt mer utsatt på grunn av langvarig uregelmessig livsstil og usunne matvaner2. I klinikken har ulike legemidler blitt brukt til å behandle hyperlipidemi. For eksempel er et av de mest brukte legemidlene for pasienter med hyperlipidemi og relaterte aterosklerotiske lidelser statiner. Imidlertid har langvarig bruk av statiner bivirkninger som ikke kan overses, noe som fører til dårlig prognose, som intoleranse, behandlingsresistens og bivirkninger 3,4. Disse manglene har blitt ytterligere smerter for pasienter med hyperlipidemi. Derfor bør nye behandlinger for stabil lipidsenkende effekt og færre bivirkninger foreslås.

Tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har vært mye brukt til å behandle sykdommer på grunn av sin gode effekt og få bivirkninger5. Fructus Phyllanthi (FP), den tørkede frukten av Phyllanthus emblica Linn. (populært kjent som amla bær eller indisk stikkelsbær), er et kjent medisin og mat homologt materiale av tradisjonelle kinesiske og indiske medisiner 6,7. Dette legemidlet har blitt brukt til å rydde varme, kjøle blod og fremme fordøyelsen, i henhold til TCM-teorier8. Moderne farmakologiske studier har vist at FP er rik på bioaktive forbindelser som gallinsyrer, ellaginsyrer og quercetin9, som er ansvarlige for en rekke mangefasetterte biologiske egenskaper, ved å fungere som en antioksidant, en antiinflammatorisk, leverbeskyttelse, en anti-hypolipidemisk, og så videre10. Nyere forskning har også vist at FP effektivt kunne regulere blodlipidene hos pasienter med hyperlipidemi. For eksempel har Variya et al.11 vist at FP fruktjuice og dens viktigste kjemiske ingrediens i gallinsyre kan redusere plasmakolesterol og redusere oljeinfiltrasjon i leveren og aorta. Den terapeutiske effekten var relatert til FPs regulering ved å øke ekspresjonen av peroksisomproliferatoraktivert reseptor-alfa og redusere hepatisk lipogen aktivitet. Imidlertid bør den underliggende mekanismen for FP for å forbedre hyperlipidemi undersøkes nærmere, fordi dets bioaktive ingredienser er ganske omfattende. Vi søkte å utforske den potensielle mekanismen for FPs terapeutiske effekt, noe som kan være gunstig for videre utvikling og bruk av dette legemidlet.

For tiden betraktes nettverksfarmakologi som en helhetlig og effektiv teknikk for å studere den terapeutiske mekanismen til TCM. I stedet for å lete etter enkeltsykdomsfremkallende gener og legemidler som utelukkende behandler et individuelt mål, er et komplett stoff-ingredienser-gener-sykdomsnettverk konstruert for å finne multi-målmekanismen til multi-ingrediens-stoffet angående deres omfattende behandling12. Denne teknikken er spesielt egnet for TCM, da deres kjemiske sammensetninger er massive. Dessverre kan nettverksfarmakologi bare brukes til å forutsi mål påvirket av kjemiske ingredienser i teorien. De endogene metabolittene i sykdomsmodellen bør observeres for å validere effekten av nettverksfarmakologi. Metabolomics-metoden, som fremkommer med utviklingen av systembiologi, er et viktig verktøy for å overvåke endringene i endogene metabolitter13. Endringene i metabolitter reflekterer vertens stabile tilstandsendringer, noe som også er en viktig indikator for å studere den interne mekanismen. Noen forskere har vellykket integrert nettverksfarmakologi og metabolomikk for å utforske samspillsmekanismen mellom narkotika og sykdommer14,15.

Denne artikkelen utforsker det mekanistiske grunnlaget for FP mot hyperlipidemi ved å integrere nettverksfarmakologi og metabolomics teknikker. Nettverksfarmakologi ble anvendt for å analysere forholdet mellom de viktigste aktive ingrediensene i FP og molekylære mål for hyperlipidemi. Deretter ble metabolomics utført for å observere endringen av endogene metabolitter i dyremodellen, noe som kan forklare medisinvirkningene på metabolsk nivå. Sammenlignet med anvendelsen av nettverksfarmakologi eller metabonomikk alene, ga denne integrerte analysen en mer spesifikk og omfattende forskningsmekanisme. I tillegg ble den molekylære dokkingstrategien brukt til å analysere samspillet mellom aktive ingredienser og nøkkelproteiner. Generelt kan denne integrerte tilnærmingen kompensere for mangelen på eksperimentelle bevis for nettverksfarmakologi og mangelen på en endogen mekanisme for metabolomics-metoden, og kan brukes til terapeutisk mekanismeanalyse av naturmedisin. Hovedskjematisk flytskjema for protokollen er vist i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer håndtering av dyr ble utført i samsvar med Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og ble godkjent av den institusjonelle etiske komiteen ved Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (protokollnummer 2020-36). Hannmus C57BL/6 (20 ± 2 g) ble brukt i denne studien. Musene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell).

1. Nettverksfarmakologibasert prediksjon

MERK: Nettverksfarmakologien brukes til å forutsi de aktive ingrediensene og deres nøkkelmål for FP mot hyperlipidemi.

  1. Utvalg av aktive ingredienser og hovedmål
    1. Søk på nøkkelordet "Phyllanthi Fructus" på det tradisjonelle kinesiske medisinsystemets farmakologidatabase (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) for å få listen over kandidataktive ingredienser og mål for FP.
      MERK: Normalt er bare ingredienser med oral biotilgjengelighet (OB) ≥30% og narkotikalignende (DL) verdier ≥0,18 i databasen inkludert som aktive ingredienser.
    2. Søk på nøkkelordet "hyperlipidemi" i GeneCards-databasen (https://www.genecards.org/), Online Mendelian Inheritance in Man-databasen (OMIM; https://omim.org/) og den terapeutiske måldatabasen (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) for å få de respektive kandidatmålene for hyperlipidemi. Last ned regnearkene over sykdomsmål. Slett de gjentatte målene for å få listen over mål for hyperlipidemi.
    3. Kopier disse listene fra trinn 1.1.1 og 1.1.2 til et nytt regneark. Bruk funksjonen "Data - Identifiser duplikater" i verktøylinjen for å få kryssmål. Importer skjæringsmållisten til UniProtKB (http://www.uniprot.org/) for å standardisere gen- og proteinnavnene.
      MERK: Disse målene er relatert til både FP og hyperlipidemi. Forutsi derfor disse skjæringsmålene som målene for FP mot hyperlipidemi.
  2. Bygging av et protein-protein interaksjonsnettverk
    1. Åpne STRING-databasen (https://string-db.org/) 11.5. Lim inn skjæringsmållisten for FP mot hyperlipidemi i dialogboksen "Liste over navn". Velg Homo sapiens i "Organismer" og klikk på SØK > FORTSETT.
      MERK: Mennesker og mus har svært like gener. Derfor utføres ytterligere eksperimentell verifisering med mus.
    2. Når resultatene er tilgjengelige, merk av for skjul frakoblede noder i nettverket i "Avanserte innstillinger". Angi høyeste konfidensialitet (0.900) i "minimum nødvendig interaksjonspoengsum", og klikk deretter på UPDATE-knappen .
    3. Klikk på Eksporter i tittellinjen, og last ned den korte tabellteksten til protein-proteininteraksjonsnettverket (PPI) i PNG- og TSV-format.
  3. Bygging av et nettverk av målnettverk for narkotika-komponent-sykdom
    1. Åpne Cytoscape 3.9.1 (se materialfortegnelse). Importer filen i TSV-format i trinn 1.2.3. Optimaliser fargen, skriften og siden av nettverksnodene via stillinjen i kontrollpanelet.
    2. Bruk funksjonen "Analyser nettverk" for nettverkstopologianalyse. Få navgener av CytoHubba i Cytoscape. Etablere stoffet-ingrediens-mål-sykdom nettverk.
  4. GO og KEGG berikelse analyse
    1. Åpne DAVID Bioinformatikk Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Klikk på Start analyse og lim inn mållisten i venstre dialogboks. Velg OFFISIELT GENSYMBOL i "Velg identifikator". Velg Homo sapiens i "Velg arter". Kryss av for Genliste i "Listetype". Klikk på Send liste.
    2. Når resultatene foreligger, klikk på Analyser over genlisten med et av DAVIDs verktøy. Tick GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT i "Gene Ontology" for GO-funksjonsberikelsesanalyse. Kryss av KEGG_Pathway i "Pathways" for KEGGs analyse av berikelse av veier.
    3. Klikk på Functional Annotation Chart for å vise resultatene.
      MERK: Sett den statistiske signifikansterskelen for anrikningsanalysen til p < 0,05.

2. Eksperimentell design

  1. FP vandig ekstrakt forberedelse
    MERK: FP behandles i laboratoriet til professor Lina Xia ved Chengdu-universitetet i TCM8.
    1. Bløtlegg det tørkede pulveret av FP (90 g) i 1 liter rent vann i en ren 2 L volumetrisk kolbe. Bruk ultralydbehandling (i et 4 ° C vannbad, effekt: 250W, frekvens: 35 kHz) for å bidra til å oppløse i 30 minutter. Filtrer oppløsningen for å oppnå ekstraktet med et dobbeltlags, 1 mm x 1 mm sterilt medisinsk gasbind. Gjenta operasjonen ovenfor tre ganger for å sikre fullstendig oppløsning av FP.
    2. Bruk den roterende fordampningsmetoden for ytterligere konsentrasjon. Sett rotasjonshastigheten til 50 o / min med en temperatur på 60 ° C i 4 timer. Konsentrer det vandige ekstraktet til 100 ml.
    3. Del råekstrakten av FP (0,9 g/ml) jevnt i to deler (50 ml). En del brukes som høydose FP-væske (0,9 g / ml). Tilsett 50 ml rent vann i en annen del, og betrakt det som lavdose FP-væske (0,45 g / ml). Bruk de vandige løsningene med høy og lav dose FP til administrering. Oppbevar væsken ved -20 °C inntil bruk.
  2. Dyr forberedelse
    1. Hus 50 mannlige C57BL / 6 mus (20 ± 2 g) i et godt ventilert rom ved romtemperatur, med en 12 timers lys-mørk syklus og fri tilgang til mat og rent vann.
    2. Tilfeldig tilordne musene til to grupper: mate 10 mus med et normalt kosthold og 40 mus med et fettfattig kosthold (se materialtabell) for å indusere hyperlipidemi.
      MERK: Etter fôring i 8 uker ble musene screenet for videre legemiddelintervensjon.
    3. I den 8. uken trekker du omtrent 200 μL blod fra hver musebane. Sentrifuger blodet i 10 minutter ved 5 733 x g ved 4 °C for å ta plasmaprøver. Bestem TC- og TG-nivåene med kommersielt tilgjengelige analysesett (se Materialfortegnelse).
    4. Velg seks mus med de mest normale lipidnivåene som NC-gruppen (ikke-behandlingskontroll). Velg 24 mus med et betydelig høyere lipidnivå som fettfattig diettgruppe, og del dem tilfeldig i fire grupper: høyfett diett (HFD) -gruppe, lavdose FP (FP_L) -gruppe, høydose FP (FP_H) -gruppe og positiv kontroll (PC) -gruppe.
    5. Administrer gastrisk irrigasjon til FP_L og FP_H grupper med to doser FP (lav dose, 4,5 g / kg og høy dose, 9 g / kg), henholdsvis; gastrisk irrigasjon til PC-gruppen med simvastatin tabletter (5 mg/kg; se materialfortegnelse); og gastrisk irrigasjon til NC- og HFD-gruppene med samme volum fysiologisk saltvann en gang daglig i 4 uker.
      MERK: Den nåværende studien brukte de vandige løsningene av FP og simvastatin til behandling.
    6. I den 12. uken, etter anestesi med 1% pentobarbitalnatrium (30 mg / kg), ofre musene i alle gruppene. Samle ~ 400 μL blodprøver fra hver muss orbitalvene.
      MERK: Stimuler tærne og sålene til musene med pinsett. Hvis det ikke er noen reaksjon, viser det tilstrekkelig anestesi.
    7. Sentrifuger blodet i 10 minutter ved 5 733 x g ved 4 °C for å oppnå plasmaprøver, og bestem TC-, TG-, LDL-C- og HDL-C-nivåene med kommersielt tilgjengelige analysesett (se materialfortegnelse). Få levervevsprøver16 og utsett dem for histopatologisk analyse. Bruk de resterende plasma- og leverprøvene til metabolomics-analyse (trinn 3).
      MERK: Alle prøver lagres ved -80 °C inntil bruk.
  3. Leverhistopatologisk undersøkelse
    1. Fest friskt levervev med 4% paraformaldehydoppløsning i mer enn 24 timer. Ta ut vevet fra fikseringsmiddelet og glatt målvevet med en skalpell. Plasser vevet og den tilsvarende etiketten i dehydratoren.
    2. Dehydrer i en etanolgradient: 75% alkohol i 4 timer, 85% alkohol i 2 timer, 90% alkohol i 2 timer, 95% alkohol i 1 time, absolutt etanol i 1 time, xylen i 30 minutter. Legg vevskassetten i en vevsform i parafinvoks i tre vasker, 30 min hver16.
    3. Sett voks-gjennomvåt vev inn i vevet embedder (se tabell over materialer). Før voksen størkner, fjern vevet fra dehydratoren, legg dem inn i den innebygde boksen og fest den tilsvarende etiketten.
    4. Avkjøl voksblokkene i et frysebord på -20 °C, fjern dem fra den innebygde rammen og trim voksblokken.
    5. Klipp de trimmede voksblokkene i 3 μm tykke seksjoner ved hjelp av en mikrotome (se materialfortegnelse). Flyt seksjonene i 40 °C vann, fjern dem fra skliene og stek i en ovn på 60 °C. Etter baking med vann og tørr voks, ta den ut og hold den ved romtemperatur.
    6. Plasser seksjonene i xylen I i 10 minutter, xylen II i 10 minutter, xylen III i 10 minutter, absolutt etanol I i 5 minutter, absolutt etanol II i 5 minutter, 75 % alkohol i 5 minutter og vask i vann16.
    7. Farg seksjonene med hematoksylinfargeløsning i 4 minutter, 1% saltsyrealkoholoppløsning (75% alkohol) for differensiering, 1% ammoniakkvannoppløsning tilbake blå, og vask dem med vann.
    8. Flekk seksjonene med eosinfargeløsning i 2 min og vask dem med vann.
    9. Observer seksjonene ved hjelp av et optisk mikroskop med en forstørrelse på 200x og 400x.
  4. Væskekromatografi-massespektrometri )LC-MS) analyse
    1. Ingrediens identifisering av FP
      MERK: Analysen utføres ved hjelp av væskekromatografi med ultrahøy ytelse kombinert med hybrid quadrupole-orbitrap høyoppløselig massespektrometri (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; se materialfortegnelse).
      1. Mål nøyaktig 1 g tørket pulver av FP og sett det i en ren 50 ml volumetrisk kolbe.
      2. Tilsett 25 ml 70% metanol i den volumetriske kolben og vei nøyaktig. Bruk ultralydbehandling (i et 4 ° C vannbad, effekt: 250 W, frekvens: 35 kHz) i 30 minutter for å hjelpe oppløsningen. Nøyaktig veie igjen for å nøyaktig bestemme tapet etter oppløsning, og bruk 70% metanol for å gjøre opp for tapet.
        MERK: Ikke mål volumet, da skalaen på den volumetriske kolben ikke er nøyaktig, spesielt etter vannbadet på 4 °C.
      3. Rist opp for å blande helt. Bruk en 0,22 μm mikroporøs membran for å filtrere.
    2. Klargjøring av plasmaprøver
      1. Tilsett nøyaktig 100 μL plasma (trinn 2.2.7) i et dobbeltvolum (200 μL) acetonitril i et 1,5 ml sentrifugerør, og virvle det med en hvirvelvibrator i minst 30 s. Følg denne fremgangsmåten for alle prøver.
      2. Sentrifuger alle prøver ved 17 200 x g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør supernatantene etter sentrifugering til et nytt 1,5 ml sentrifugerør. Tørk supernatantene under nitrogen. Rekonstituer med 200 mikrol ekstraksjonsvæske (acetonitril:vann = 4:1 [v/v]).
      3. Vortex den rekonstituerte løsningen i minst 30 s og bruk ultralydbehandling i 10 minutter (i et 4 ° C vannbad, effekt: 250 W, frekvens: 35 kHz). Sentrifuge ved 17 200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
      4. Filtrer supernatantene med 0,22 μm filtermembraner og hold dem ved 4 °C for analyse.
    3. Forberedelse av leverprøve
      1. Homogeniser 90 mg levervev (trinn 2.2.7) i 1 min i iskaldt metanolvann (1: 1, v / v, 1 ml) og sentrifuge dem ved 21 500 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten til 1,5 ml sentrifugerør. Følg denne fremgangsmåten for alle prøver.
      2. Trekk ut utfellingene igjen etter samme prosedyre, og slå supernatantene sammen til nye 1,5 ml sentrifugerør. Tørk supernatantene under nitrogen. Rekonstituer med 300 mikrol ekstraksjonsvæske (metanol:vann = 4:1 [v/v]).
      3. Vortex den rekonstituerte løsningen i minst 30 s og bruk ultralydbehandling i 10 minutter (i et 4 ° C vannbad, effekt: 250 W, frekvens: 35 kHz). Sentrifuge ved 17 200 x g i 15 minutter ved 4 °C.
      4. Filtrer supernatantene med 0,22 μm filtermembraner og hold dem ved 4 °C for analyse.
        MERK: De samlede kvalitetskontrollprøvene (QC) ble fremstilt ved å blande 10 μL alikoter fra hver plasma- og leverprøve (en per seks prøver).
    4. Analyseparametere for LC-MS
      MERK: Den mobile fasen består av 0,1% maursyre (løsningsmiddel A) og acetonitril (løsningsmiddel B). Overfør disse løsemidlene til en ren glassflaske og koble dem til LC-MS-systemet.
      1. Sett gradientprogrammene for plasmaprøver i "innløpsfilen" til LC-MS-systemet som følger: 1% B (0-1,5 min), 1% -60% B (1,5-13,0 min), 60% -99% B (13,0-20,0 min), oppretthold ved 99% B (20,0-25,0 min), 99% -1% B (25,0-25,1 min), og oppretthold ved 1% B til 27 min.
      2. Still inn de automatiske prøvebetingelsene for plasmaprøvene i "innløpsfilen" til LC-MS-systemet som følger: injeksjonsvolumet, 2 μL; og strømningshastigheten, 0,3 ml/min, for hver analyse.
      3. Sett gradientprogrammet for leverprøver i "innløpsfilen" til LC-MS-systemet som følger: 1% B (0-1 min), 1% -53% B (1-15 min), 53% -70% B (15-30 min), 70% -90% B (30-32 min), 90% -95% B (32-40 min), 95% -1% B (40-42 min), og oppretthold ved 1% B til 45 min.
      4. Sett de automatiske prøvetakerbetingelsene for leverprøvene i "innløpsfilen" til LC-MS-systemet som følger: injeksjonsvolum, 5 μL; og strømningshastigheten, 0,3 ml/min, for hver analyse.
      5. Still inn MS-deteksjonsbetingelsene for både plasma- og leverprøver i "MS-tunefilen" til LC-MS-systemet. Utfør MS-oppkjøpet ved hjelp av både positive og negative ioniseringsmoduser.
        MERK: De oppvarmede elektrosprayioniseringsparametrene er som følger: sprøytespenning: 3,5 kV for positiv ionisering og 3,8 kV for negativ ionisering; kappe gassstrøm: 55 arb; hjelpegassstrøm: 15 arb; sondevarmer temperatur: 300 °C; og kapillærtemperatur: 350 °C.
      6. Importer de innsamlede rådataene til Compound Discoverer-programvaren, og angi metodemalen i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialfortegnelse).

3. Metabolomisk validering

MERK: De metabolomiske profileringsdataene for plasma- og levermetabolitter importeres til Compound Discoverer-programvaren for å utføre ekstraksjonen av metabolske funksjoner ved å ta i bruk en molekylær funksjonsekstraksjonsalgoritme. Sett parametrene som følger: masseavvik, 5 x 10-6; masseområde, 100-1,500; signal / støyforhold (SNR) terskel, 3; og avvik for retensjonstid, 0,05. Evaluere stabiliteten og repeterbarheten av metabolomics ved det relative standardavviket (RSD) for QC-toppområder.

  1. Bruk SIMCA-P-programvare (se materialfortegnelse) for multivariat statistisk analyse av integralverdiene hentet fra LC-MS-funn. Bruk ortogonal partiell minste kvadraters diskriminantanalyse (OPLS-DA) for middelsentrerte data og modellering av utvalgsklasser.
  2. Etter OPLS-DA-testen, vurder metabolittene, med integral med variabel betydning i projeksjonsverdiene (VIP) på >1 og en p-verdi på <0,05 fra Student t-test som potensielle differensialmetabolitter.
  3. Identifiser forstyrrede metabolitter og metabolske veier ved hjelp av åpne databasekilder, inkludert Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) og MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Visualiser resultatvisningene fra MetaboAnalyst5.0 og 'Wu Kong'-plattformen (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Molekylær dokking

  1. Last ned 3D-strukturen til de valgte FP-ingrediensene fra henholdsvis TCMSP-databasen. Søk etter ingrediensnavnene i søkeboksen 'Kjemisk navn' og last ned de tilsvarende 3D-strukturfilene i mol2-format.
  2. Last ned krystallstrukturene til nøkkelmålene fra AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Søk i målnavnene i søkeboksen og last ned de tilsvarende krystallstrukturfilene i pdb-format.
  3. Importer ingredienser og målstrukturer fil til AutoDockTools programvare. Klikk på Rediger > Slett vann for å slette vannmolekyler. Klikk på Rediger > Hydrogener > Legg til for å legge til hydrogener. Sett ingrediensene som 'ligand' og utfør blinddokking ved å velge hele målene som 'reseptor'17.
  4. Skriv inn en verdi i boksen bak "senter" og "størrelse" for å justere det nyutviklede rommet, noe som gjør det mulig å omfatte liganden og reseptoren fullt ut. Lagre ligand- og reseptorfilene i pdbqt-format.
  5. Bruk AutoDock Vina til å utføre molekylær dokking. Sett "Receptor" -linjen til navnet 'receptor.pdbqt', og "Ligand" -linjen til navnet 'ligand.pdbqt'. Oppnå den optimale plasseringen for ligandbinding til reseptoren. Registrer bindingsenergiværdien i optimal posisjon.
    MERK: Dokkingprosessen ble beregnet av den genetiske algoritmen14. Alle alternativer for forankringskjøring var standardverdier. Dokkingrammer blir automatisk rangert fra høyeste til laveste bindingsenergi.
  6. Importer dokkingfilene til PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) for å få den visuelle systemmodellen. Last ned modellfilene i pse-format, og importer dem til PyMOL-programvare (se Materialfortegnelse) for å konstruere videre visualisering.

5. Statistisk analyse

MERK: Bruk SPSS statistisk programvare (se Materialfortegnelse) for dataanalyse. Vurder verdien av p < 0,05 som statistisk signifikant.

  1. Uttrykke verdiene som midler ± standardavvik (SD).
  2. Utfør en enveis ANOVA etterfulgt av post hoc minst signifikant forskjell (LSD), Dunnett (i tilfelle lik varians) eller Dunnetts T3 (i tilfelle ulik varians) for å teste statistisk signifikans blant grupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nettverksfarmakologi
Totalt 18 potensielle ingredienser i FP ble screenet i henhold til deres farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaper fra databasen og LC-MS-analysen (de totale ionekromatogrammene er vist i tilleggsfigur 1). Gjennom relevant litteratur er innholdet av gallinsyre mye høyere enn andre ingredienser og er effektivt for å senke lipider 9,11. Derfor ble denne ingrediensen ansett som en potensiell ingrediens også. Totalt har 19 ingredienser og 134 ingrediensrelaterte mål for FP blitt grunnlagt. Alle de 19 ingrediensene er vist i tabell 1. For å velge de mest representative ingrediensene for videre analyse, ble disse ingrediensene importert til Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine database (BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/). Ifølge ingrediens-mål-vei-sykdomsnettverket ble noen bioaktive ingredienser, som gallinsyre, quercetin og beta-sitosterol, identifisert som de viktigste ingrediensene i FP relatert til hyperkolesterolemi og koronar aterosklerose (tilleggsfigur 2). Blant disse er gallinsyre en av de mest studerte fenoliske syrer; det er den viktigste bioaktive ingrediensen som presenteres i FP18. I mellomtiden er gallinsyre også den høyeste innholdsingrediensen i FP; Konsentrasjonen er vanligvis 1% til 3%. El-Hussainy et al.19 har avslørt at gallinsyre kan begrense hjerteskade, forbedre lipidprofilen og nedregulere hjerteinflammatoriske markører. Innholdet av quercetin og beta-sitosterol er lavere, men noen studier har vist sin effekt på å senke lipider. Quercetin, som et viktig flavonoid som finnes mye i planter, har forskjellige egenskaper, for eksempel antioksidanter, antiinflammatoriske og kardiovaskulære beskyttelseseffekter20. Lu et al.21 har studert at quercetin-beriket juice kan dempe TC-, LDL-C- og HDL-C-nivåer hos friske personer med mild hyperkolesterolemi. Når det gjelder beta-sitosterol, har kliniske studier vist at plantesterol kan forhindre hyperkolesterolemi og kardiovaskulær sykdom22,23. Althwab et al.24viste at beta-sitosterol kunne forbedre lipidprofilen og atherogen indeks hos HFD-rotter. Det kan sees at den lipidsenkende effekten av FP kan være relatert til disse tre ingrediensene.

I tillegg ble 1.552 mål for hyperlipidemi-relaterte fra genkort-, OMIM- og TTD-databasene samlet. Etter å ha matchet de 134 FP-relaterte målene med hyperlipidemi-relaterte mål, ble 62 mål identifisert som potensielle mål for FP mot hyperlipidemi (figur 2A). Alle de kryssede målene ble normalisert til deres offisielle symboler, ifølge UniProt-databasen. Deretter ble PPI-nettverket konstruert av STRING (figur 2B) og Cytoscape (figur 2C). Ved å kombinere poengsummene til beregningsmetoder var de 10 beste målene ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 og MYC. Detaljene er presentert i tilleggsfigur 3. Alle disse 62 målene er grunnlaget for videre analyse, som er integrert med resultatene av metabonomikk.

GO- og KEGG-baner ble utført ved anrikningsanalyse. De 15 øverste banene, i henhold til antall mål, ble valgt for analyse i henhold til p-verdien. GO-anrikningsresultatene antydet at de biologiske prosessene og den molekylære funksjonen til FP mot hyperlipidemi hovedsakelig var relatert til genuttrykk og proteinbinding (figur 2D). KEGG-berikelsen beviste at FP kunne gripe inn i prosessen med lipidmetabolisme og aterosklerose (figur 2E), noe som betyr at FP lindrer hyperlipidemi ved å påvirke lipidmetabolismen.

Effekten av FP på plasmalipidnivåer og leverindeks
For å teste den forbedrede effekten av FP på hyperlipidemi ble endringene i TC, TG, LDL-C, HDL-C og leverindeks (forholdet mellom levervekt og kroppsvekt) først målt. Sammenlignet med NC-gruppen viste mus i HFD-gruppen en signifikant økning i plasmanivåene av TC (p < 0,001), LDL-C (p < 0,001) og TG (p < 0,05), noe som indikerer at langvarig HFD-intervensjon kan øke lipidnivåene og indusere hyperlipidemi (figur 3).

Etter administrering av FP vandig ekstrakt ble nivåene av TC i FP_L og FP_H gruppene signifikant (p < 0,05) redusert med henholdsvis 18,8 % og 12,4 % (figur 3A). Nivåene av LDL-C i FP_L og FP_H gruppene var signifikant (p < 0,05) redusert med henholdsvis 13,7 % og 21,8 % (figur 3B). For HDL-C-nivå var FP_H gruppen signifikant (p < 0,01) økt fra 1,81 ± 0,08 mmol/l til 2,65 ± 0,16 mmol/l, sammenlignet med HFD-gruppen (figur 3C). Selv om TG-nivået forble ubetydelig etter FP-intervensjon, ble det redusert sammenlignet med HFD-gruppen (figur 3D). Nylige studier har indikert at indeksen for LDL-C / HDL-C-forholdet er en bedre indeks enn LDL-C eller HDL-C alene for å forutsi kardiovaskulær sykdom25,26. Sammenlignet med HFD-gruppen ble LDL-C/HDL-C-forholdet signifikant (p < 0,01) redusert med 46,3 % i FP_H gruppen (figur 3E), noe som betyr at FP-intervensjon reduserte dårlig kolesterol og økte gode kolesterolnivåer. Som det viktigste fettmetabolske organet reflekterer levervekten fettlagring hos mus til en viss grad27. Etter 12 uker var leverindeksene i FP_L gruppen og FP_H gruppen signifikant (p < 0,01) redusert sammenlignet med HFD-gruppen (figur 3F). PC-gruppen viste også forskjellige grader av reduksjon i disse indikatorene ovenfor, noe som viste at FP hadde lignende effekter som statiner, og den beskyttende effekten viste et dose-responsforhold.

Ulike kliniske studier viste at etter å ha tatt enten ekstrakt eller hele FP en stund, ble TC- og LDL-C-nivåene signifikant redusert. I mellomtiden ble HDL-C-nivået bemerkelsesverdig hevet ved langvarig administrasjon av FP28,29. Nambiar og Shetty30 fant at FP-juice kunne redusere oksiderte lipoproteiner med lav tetthet, og dermed redusere risikoen for aterosklerose. Gopa et al.31 evaluerte den hypolipidemiske effekten av FP hos pasienter med hyperlipidemi og sammenlignet den med simvastatin. Behandling med FP resulterte i en betydelig reduksjon i TC, LDL-C og TG, og en signifikant økning i HDL-C-nivåer, tilsvarende som for simvastatin. I denne undersøkelsen hadde FP og simvastatin også lignende terapeutiske effekter, og den LDL-C-senkende effekten og den hepatiske reparasjonsvirkningen av FP var bedre enn simvastatin.

Leverhistopatologisk observasjon
Effekten av FP på hepatisk steatose hos HFD-mus er vist i figur 4. De leverpatologiske snittene i NC-gruppen uttrykte regelmessig hepatocyttmorfologi, klart definerte cellegrenser og ingen åpenbare fettvakuoler (figur 4A,B). Til sammenligning hadde HFD-gruppen fettvakuoler av forskjellige størrelser rundt blodkarene og viste åpenbar leverskade, som preget av cellehevelse, fettdegenerasjon, tap av cellulære grenser, cellulær sammentrekning og hepatocyttnekrose (figur 4C,D). Som vist i figur 4E,F, kan FP-intervensjon forbedre leverstatose, spesielt i FP_L-gruppen. Sammenlignet med HFD-gruppen hadde FP_H (figur 4G,H) og PC-gruppen (figur 4I,J) en viss grad av gjenoppretting av levercellestrukturen, fettdegenerasjon og fettvakuolreduksjon. Dette betyr at FP-intervensjon kan beskytte levervev fra HFD-indusert leverskade.

Metabolomics profilering
Ifølge plasmalipidnivå og leverhistopatologisk observasjon hadde høydose FP bedre effekt på hyperlipidemi enn lavdose FP. Derfor ble NC, HFD og FP_H grupper valgt for å analysere deres endring i metabolismenivået. De totale ionekromatogrammene i QC-prøver er vist i tilleggsfigur 4. For å sikre nøyaktigheten av dataene ble funksjonene med RSD-verdier >30% fjernet fra alle QC-prøvene. PCA- og ionekromatogrammer reflekterte at QC-prøvene var stabile under prosessen (tilleggsfigur 5). Totalt 626 og 562 egenskaper i plasma og lever ble bestemt etter forbehandling av data. Blant dem ble henholdsvis 120 og 124 metabolitter i plasma og lever identifisert basert på KEGG-databasen. OPLS-DA-analyse ble brukt til å undersøke separasjonen mellom NC-, HFD- og FP_H gruppene. OPLS-DA viste at de samme gruppeprøvene klynget seg sammen og ulike gruppeprøver skilte seg godt ut (figur 5A,B). Disse resultatene indikerte at HFD- og FP-intervensjonene forårsaket åpenbare metabolske variasjoner.

For å identifisere potensielle differensialmetabolitter som bidro til det metabolske skillet, ble det utført ytterligere OPLS-DA- og t-testanalyser av NC versus HFD og HFD versus FP_H. OPLS-DA-resultatene skilte seg godt ut, og viste signifikante forskjeller mellom ulike grupper av modeller14 (tilleggsfigur 6). Basert på VIP (variabel viktig i projeksjon) >1 og p < 0,05, viste 32 metabolitter i plasma differensiering mellom NC- og HFD-gruppen, og 72 metabolitter viste differensiering mellom HFD og FP_H gruppen. I leveren viste 38 metabolitter differensiering mellom NC- og HFD-gruppen, og 17 metabolitter viste differensiering mellom HFD- og FP_H gruppen. Til slutt ble totalt 16 og 6 metabolitter identifisert som differensialmetabolitter i FP-påvirkede HFD-mus i henholdsvis plasma og lever (tilleggsfigur 7). Informasjonen om disse metabolittene er vist i tabell 2.

For å visualisere variasjonen i metabolitter blant de tre gruppene ble varmekart plottet av MetaboAnalyst 5.0. Alle differensialmetabolittene i plasma og lever ble endret i HFD-gruppen, og de fleste av dem ble reversert i FP-gruppen, noe som indikerer at FP-intervensjon kan forbedre metabolsk forstyrrelse (figur 5C, D). Videre ble differensialmetabolitter importert til MetaboAnalyst 5.0 for å utforske de metabolske veiene til FP i HFD-mus. Basert på p < 0,05 og en påvirkningsvei >0,10 ble tryptofanmetabolismen signifikant påvirket i plasma, og metabolittene relatert til denne banen var D-tryptofan og L-kynurenin (figur 5E). Jung et al.32 studerte at langvarig hyperlipidemi kan senke serumnivåene av kynurenin. Taurin- og hypotaurinmetabolismen ble signifikant påvirket i leveren, og den relaterte metabolitten relatert var taurin (figur 5F). Taurin er en viktig og nødvendig aminosyre i dyrekroppen; Dong et al.33 studerte at taurin mildt kunne redusere skaden av blodlipider og redusere ateroskleroserisikoen forårsaket av HFD. I denne undersøkelsen økte FP-intervensjon innholdet av L-kynurenin og taurin, noe som er positivt relatert til reduksjonen av lipidnivåer, og støtter effektiviteten av FP mot hyperlipidemi.

Integrert analyse av nettverksfarmakologi og metabolomikk
En integrert strategi for nettverksfarmakologi kombinert med metabolomics har blitt mer og mer uunnværlig for å studere sykdomsmekanismer og intervensjonsstrategier. Relevansen mellom nettverksfarmakologi og metabolomikk med begrenset evidens ble etablert. For å få en omfattende oversikt over mekanismen for FP mot hyperlipidemi ble interaksjonsnettverkene basert på nettverksfarmakologi og metabolomikk konstruert. Differensialmetabolitter ble importert til MetScape-plugin i Cytoscape og matchet navgenene identifisert i nettverksfarmakologi for å samle forbindelse-reaksjon-enzym-gen-nettverkene (figur 6). Som vist i tabell 3 var L-kynurenin og kortikosteron i plasmametabolitter relatert til CYP1A1, som kan katalysere lipidperoksidasjon og indusere ikke-alkoholholdig fettleversykdom34,35; De berørte veiene var henholdsvis tryptofanmetabolisme og steroidhormonbiosyntese. Acetylkolin var relatert til AChE og påvirket glycerofosfolipidmetabolismen. I levermetabolitter var MGAM og raffinose relatert til galaktosemetabolisme. Flere studier har vist at inntak av oligosakkarider i raffinosefamilien kan forbedre metabolske forstyrrelser hos HFD-mus36.

Videre er nettverket ingredients-targets-metabolites-pathways konstruert (figur 7). I ingrediensene koblet quercetin de fleste kantene, noe som indikerer at quercetin av FP spiller den viktigste rollen i å senke lipider. Den ovenfor integrerte analysen avslørte nøkkelmålene, metabolittene og veiene til FP mot hyperlipidemi, noe som kan være grunnlaget for videre studier av dette legemidlets terapeutiske mekanisme og kliniske anvendelse.

Molekylær dokking
For ytterligere å undersøke muligheten for interaksjon mellom de valgte ingrediensene og nøkkelmålene, ble molekylær docking brukt til å analysere deres ligandaktive interaksjoner. AutoDock Vina-programvare (se materialfortegnelse) ble brukt til å utføre molekylær dokking, og den første dokkingstillingen ble sendt ut i henhold til rangeringen av scoringsfunksjonen. Dokkingresultatene er vist i figur 8.

I den integrerte analysen var CYP1A1, AChE og MGAM relatert til differensialmetabolitter. De bygde broer mellom mål og metabolitter. Ytterligere molekylær dokking ble utført for å verifisere forholdet mellom målet og ingrediensene. Resultatene av ingrediensdokking med CYP1A1 var som følger: gallinsyre dannet fire hydrogenbindinger gjennom aminosyrerestene Asn-185, Tyr-187, Asn-219 og His-500, og dannet π-π stablingsinteraksjon gjennom aminosyreresten Tyr-187 (figur 8A); quercetin dannet tre hydrogenbindinger gjennom Asn-185, Asn-219 og His-500, hydrofob interaksjon og π-π stablingsinteraksjon gjennom Tyr-187 (figur 8B); beta-sitosterol dannet fire hydrogenbindinger gjennom Arg-362, Ser-363, Leu-365 og Arg-464, og hydrofob interaksjon gjennom Glu-369 og Ile-439 (figur 8C). Bindingsenergiene var henholdsvis 5,3, 7,0 og 7,3 kcal/-mol. I samspillet med AChE ble gallinsyre stabilisert av hydrogenbindinger med Arg-237, Arg-238 og Arg-480 (figur 8D); quercetin ble stabilisert av hydrogenbindinger med Arg-237 og Phe-474, ved hydrofob interaksjon med Phe-157, og ved π-π stablingsinteraksjon med Tyr-478 (figur 8E); beta-sitosterol ble stabilisert ved hydrofob interaksjon med Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 og TYR478 (figur 8F). Bindingsenergiene var henholdsvis 5,0, 6,5 og 8,0 kcal/- mol. I samspillet med MGAM ble gallinsyre stabilisert av hydrogenbindinger med Ile-1716, Gly-1747 og Trp-1749, og ved hydrofob interaksjon med Tyr-1715 og Trp-1749 (figur 8G); quercetin ble stabilisert av hydrogenbindinger med Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 og Trp-1752, ved hydrogenbindinger med Arg-1730, og ved π-π stabling med His-1727 (figur 8H); beta-sitosterol ble stabilisert ved hydrofob interaksjon med Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 og Phe-1560, Bindingsenergiene var henholdsvis 5,9, 8,1 og 6,9 kcal / mol. Detaljert informasjon om interaksjoner og bindingsaffiniteter er vist i tabell 4. Flere bindingssteder og høye bindingsenergier forklarer de høye affinitetene mellom ingredienser og proteinmål, og bekrefter at disse ingrediensene spiller rollen som å senke lipider ved å virke på hyperlipidemi-relaterte mål.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk flytskjema for den integrerte strategien. Hub-ingredienser og gener ble ekstrahert av nettverksfarmakologi (del 1). Differensialmetabolitter av FP mot hyperlipidemi ble analysert av plasma- og levermetabolomika (del 2). Nøkkelmål, metabolitter og veier ble identifisert og koblet sammen basert på en integrert analyse av del 1 og del 2 (del 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Målscreening, nettverkskonstruksjon og berikelsesanalyse av effekten av FP mot hyperlipidemi. (A) Venn-diagram over FP-hyperlipidemi-målene. (B) Potensielt aktivt stoff-ingredienser-mål-sykdomsnettverk: forskjellige fargesymboler som nevnt her: sykdom (rød), stoff (blå), ingredienser (grønn) og mål (gul). (C) PPI-nettverk av STRING. (D) GO baneberikelsesanalyse. (E) KEGG berikelse av veier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Effekten av FP på plasmalipidnivåer og leverindeks hos mus med HFD-indusert hyperlipidemi (n = 6). (A) Nivåer av TC. (B) Nivåer av LDL-C. (C) HDL-C nivå. (D) TG-nivå. (E) LDL-C/HDL-C-forholdet. (F) Leverindekser.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistisk signifikante forskjeller ble evaluert ved hjelp av en enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts multiple comparisons test eller post hoc analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Effekten av FP på levervev hos mus med HFD-indusert hyperlipidemi (H&E-farging). (A,B) NC-gruppe, (C,D) HFD-gruppe, (E,F) FP_L gruppe, (G,H) FP_H gruppe, (I,J) PC-gruppe (n = 6). Skala bar: (A, C, E = 200 μm; B,D,F = 50 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: OPLS-DA score plott, varmekart og metabolske veier for differensialmetabolitter. OPLS-DA-skårplottene av FP på HFD-mus i plasma (A) og lever (B). Varmekartene for differensialmetabolitter i plasma (C) og lever (D). De metabolske veiene til differensialmetabolitter i plasma (E) og lever (F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Forbindelse-reaksjon-enzym-gen-nettverkene til nøkkelmetabolittene og målene. Lavgradsnoder er fjernet. De røde sekskantene, blå sirkler, runde grønne rektangler og grå diamanter representerer henholdsvis de aktive forbindelsene, genene, proteinene og reaksjonene. De viktigste målene og metabolittene ble forstørret. Veiene med den hvite bakgrunnen er betydelig regulert i plasma. Banen med den grå bakgrunnen er betydelig regulert i leveren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Ingrediensmål-metabolitter-veier-nettverket. Jo mørkere fargen, jo mer tilkoblede kanter, som betyr at noden er viktigere i dette nettverket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Interaksjonsdiagrammene til FP-ingredienser og de viktigste målene. (A) Gallinsyre som virker på CYP1A1. (B) Quercetin virker på CYP1A1. (C) Beta-sitosterol som virker på CYP1A1. (D) Gallinsyre som virker på AChE. (E) Quercetin som virker på AChE. (F) Beta-sitosteroling handling på AChE. (G) Gallinsyre som virker på MGAM. (H) Quercetin virker på MGAM. (I) Beta-sitosterol som virker på MGAM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Oversikt over FP mot hyperlipidemi resultat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: De utvalgte ingrediensene i FP vandig ekstrakt. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Differensialmetabolittene mellom de tre gruppene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Informasjon om nøkkelmål, metabolitter og reaksjonsveier. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Bindingssteder og virkningskrefter mellom FP-ingredienser og målproteiner. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfigur 1: De positive og negative ionekromatogrammene til FP vandig ekstrakt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: FP ingrediens-mål-vei-sykdomsnettverk av BATMAN-TCM. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: Frekvensanalyse av navgener i nettverksfarmakologi. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 4: Ionekromatogrammer av plasma- og lever-QC-prøver. De representative positive (A) og negative (B) ionekromatogrammene av plasma QC-prøver. De representative positive (C) og negative (D) ionekromatogrammene av QC-prøver fra leveren. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 5: PCA-skårplottene av plasma (A) og lever (B) QC-prøver. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 6: OPLS-DA-skårplottene av plasma- (A- og B)- og leverprøver (C og D). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 7: Venn-diagrammer over differensialmetabolittene i plasma- (A)- og leverprøver (B). Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I de senere år har forekomsten av hyperlipidemi økt, hovedsakelig på grunn av langsiktige usunne matvaner. TCM og dets kjemiske ingredienser har ulike farmakologiske aktiviteter, som har blitt mye studert de siste årene37,38. FP er en slags fruktressurs, brukt både som medisin og mat, og har et viktig potensial for behandling av hyperlipidemi. Imidlertid trenger den potensielle terapeutiske mekanismen for FP mot hyperlipidemi videre studier.

Nettverksfarmakologi evaluerer farmakologiske effekter på molekylært nivå, og forutsier samspillet mellom naturlige produkter og proteiner for å bestemme hovedmekanismen39. Det første trinnet er å velge de aktive ingrediensene og hovedmålene for stoffet. I denne undersøkelsen ble det funnet ni aktive ingredienser og 62 navgener. For ytterligere å forstå den molekylære mekanismen til FP på hyperlipidemi, ble PPI og ingrediensmålnettverk etablert basert på nettverksfarmakologianalyse. For å begrense omfanget av viktige ingredienser og mål, har tre viktige ingredienser (gallinsyre, quercetin og beta-sitosterol) relatert til hyperkolesterolemi og koronar aterosklerose blitt grunnlagt av BATMAN-TCM. Alle disse ingrediensene kan redusere LDL-C-nivåer eller øke HDL-C-nivåer, validere de spesifikke effektene av FP på hyperlipidemi. Dessuten, ifølge KEGG-berikelsesanalyse, er FPs funksjon på hyperlipidemi relatert til aktiviteten til lipid- og ateroskleroseveien. Selv om denne metoden avhenger for mye av databasen og mangler eksperimentell verifisering, har den teoretisk verdi og gir ideer for etterfølgende eksperimentell verifikasjonsforskning.

For ytterligere eksperimentell validering ble mus matet med et fettsupplert diett i 8 uker for å indusere hyperlipidemi. Resultatene viste at plasma TC, LDL-C og TG nivåer ble signifikant økt. Selv om nivået av HDL-C reduserte betydelig, økte forholdet mellom LDL-C og HDL-C betydelig. De histopatologiske observasjonene viste at levervevet til HFD-mus var alvorlig skadet, men det var ingen signifikant økning i leverindeksen; Det kan være at endringer i kroppsvekt og visceral vekt tar lengre tid. Lipidene og leverforandringene viste tilstrekkelig intervensjonseffekten av FP på hyperlipidemi. Imidlertid trenger den interne mekanismen for intervensjonseffekten fortsatt ytterligere utforskning.

Metabolomics gir en liste over potensielle metabolitter og relaterte veier, som tar sikte på å utforske mekanismen for metabolske sykdommer og virkningen av terapeutiske legemidler40. Resultatet av metabolomics kan påvirkes av prøvetypen. Med tanke på de patogene egenskapene til hyperlipidemi ble plasma- og leverprøver valgt for metabonomisk analyse i denne undersøkelsen. Ifølge OPLS-DA-resultatene ble NC-, HFD- og FP_H-gruppenes metabolitter diskriminert godt. Totalt 16 differensialmetabolitter ble funnet i plasma, og 6 differensialmetabolitter ble funnet i leveren. Det var flere berørte metabolitter i plasma enn i leveren, noe som viser at blod er det viktigste stedet for metabolske forstyrrelser indusert av hyperlipidemi. FP-intervensjon kan reversere endringen av disse metabolittene under påvirkning av HFD. Videre ble disse differensialmetabolittene importert til KEGG-databasen. De signifikante metabolske veiene for differensialmetabolitter i plasma var tryptofanmetabolisme, og i leveren var taurin- og hypotaurinmetabolisme. I denne undersøkelsen økte FP-intervensjon innholdet av L-kynurenin av tryptofanmetabolisme og taurininnhold i taurin- og hypotaurinmetabolismen, noe som betyr at FP kunne være effektivt for gunstig justering av metabolske forstyrrelser og hyperlipidemi. Metabolomics-analysen avslørte hvilke metabolitter som var relatert til hyperlipidemi eller FP-intervensjon, og bestemte nedstrømsmekanismen for FP-effekten.

Ved å kombinere resultatet av nettverksfarmakologi med metabolomikk ble tre nøkkelmål (CYP1A1, AChE og MGAM) identifisert i forbindelse-reaksjon-enzym-gen-nettverkene. Ifølge molekylær dokkinganalyse viste disse målene høye affiniteter med FP-ingredienser (gallinsyre, quercetin og beta-sitosterol). Fire metabolitter (L-kynurenin, kortikosteron, acetylkolin og raffinose) og fire relaterte veier (tryptofanmetabolisme, steroidhormonbiosyntese, glycerofosfolipidmetabolisme og galaktosemetabolisme) ble identifisert som nøkkelmetabolitter og metabolske veier. Blant disse var quercetin assosiert med flest mål, og tryptofanmetabolisme dukket opp i både metabonomikk og integrerte resultater. De spiller den viktigste rollen i den terapeutiske effekten av FP mot hyperlipidemi. Molekylært dokkingresultat viste at CYP1A1, AChE og MGAM har høye affiniteter med ingredienser. Resultatene ovenfor viser at disse screenede målene er nært knyttet til den terapeutiske effekten av FP.

I denne undersøkelsen ble gallinsyre, quercetin og beta-sitosterol identifisert som FP-aktive ingredienser mot antihyperlipidemi, og tryptofanmetabolisme er den viktigste metabolske veien for FP-terapi hos HFD-mus. Oversikten over resultatet er vist i figur 9. Denne forskningen tilbød data og teoretisk støtte for videre studier av mekanismer og ga grunnlag for klinisk anvendelse av FP-medisin. Det viste seg også at naturlig mat kan være et lovende alternativ med gode utsikter i klinisk praksis. Det er imidlertid fortsatt noen mangler i denne forskningen. Den terapeutiske effekten av virkestoffet alene på hyperlipidemi er ikke verifisert. I tillegg er forløpet til nøkkelmål ikke studert; Det trenger også ytterligere systematiske molekylærbiologiske eksperimenter for å verifisere den nøyaktige mekanismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av produktutviklings- og innovasjonsteamet til TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) og Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
101-3B Oven Luyue Instrument and Equipment Factory \
80312/80302 Glass Slide Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD \
80340-1630 Cover Slip Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD \
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) Thermo Fisher Scientific \
Acetonitrile Fisher Chemical A998 Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) Thermo Fisher Scientific \
Aethanol Fisher Chemical A995 Version 3.0
Ammonia Solution Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1336-21-6 Version 3.9.1
AutoDockTools Scripps Institution of Oceanography \
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. \
Compound Discoverer Thermo Fisher Scientific \
Cytoscape Cytoscape Consortium \
DM500 Optical Microscope Leica \
DV215CD Electronic Balance Ohaus Corporation ., Ltd T15A63
Ethyl Alcohol Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 64-17-5
Formic Acid Fisher Chemical A118
HDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A112-1-1
Hematoxylin Staining Solution Biosharp BL700B
High Fat Diet ENSIWEIER 202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge Hitachi., Ltd. \
Homogenizer Oulaibo Technology Co., Ltd \
Hydrochloric Acid Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 7647-01-0
Image-forming System LIOO \
JB-L5 Freezer Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JB-L5 Tissue Embedder Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JK-5/6 Microtome Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JT-12S Hydroextractor Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
KQ3200E Ultrasonic Cleaner Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd \
LDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A113-1-1
Male C57BL/6 Mice  SBF Biotechnology Co., Ltd. \ Version 2.3.2
Neutral Balsam Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd 10021190865934
Pure Water Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd GB19298
PyMOL DeLano Scientific LLC \ Version 14.1
RE-3000 Rotary Evaporator Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd \
RM2016 Pathological Microtome Shanghai Leica Instruments Co., Ltd \ Version 26.0
SIMCA-P Umetrics AB \
Simvastatin Merck Sharp & Dohme., Ltd 14202220051
SPSS International Business Machines Corporation \
TC Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A111-1-1
TG Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry Thermo Fisher Scientific \
Vortex Vibrator Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. LC-Vortex-P1
Xylene Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504 (2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).

Tags

Tilbaketrekking utgave 194
Nettverksfarmakologi Prediksjon og metabolomikk Validering av mekanismen til Fructus Phyllanthi mot hyperlipidemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N.,… More

Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N., Wang, J., Nie, K., Xia, L., Yu, S. Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia. J. Vis. Exp. (194), e65071, doi:10.3791/65071 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter