Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Predição de Farmacologia de Rede e Validação Metabolômica do Mecanismo de Fructus Phyllanthi contra Hiperlipidemia

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65071
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 2,3
1School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Regimen and Health, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Regimen and Health of Sichuan Province
* These authors contributed equally

Summary

O presente protocolo descreve uma estratégia integrada para explorar os principais alvos e mecanismos de Fructus Phyllanthi contra hiperlipidemia baseada na predição de farmacologia de rede e verificação metabolômica.

Abstract

A hiperlipidemia tornou-se um dos principais fatores de risco para doenças cardiovasculares e lesões hepáticas em todo o mundo. Fructus Phyllanthi (FP) é uma droga eficaz contra a hiperlipidemia nas teorias da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) e da Medicina Indiana, porém o mecanismo potencial requer maior exploração. A presente pesquisa tem como objetivo revelar o mecanismo do PF contra hiperlipidemia a partir de uma estratégia integrada combinando predição farmacológica de rede com validação metabolômica. Um modelo de camundongos induzidos por dieta hiperlipídica (DHL) foi estabelecido avaliando os níveis de lipídios plasmáticos, incluindo colesterol total (CT), triglicérides (TG), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C). A farmacologia de rede foi aplicada para descobrir os princípios ativos do PF e potenciais alvos contra a hiperlipidemia. Metabolômica do plasma e fígado foi realizada para identificar metabólitos diferenciais e suas vias correspondentes entre o grupo normal, grupo modelo e grupo intervenção. A relação entre farmacologia de rede e metabolômica foi construída para obter uma visão abrangente do processo de PF contra hiperlipidemia. As proteínas-alvo obtidas foram verificadas por acoplamento molecular. Esses resultados refletiram que o PF melhorou os níveis de lipídios plasmáticos e a lesão hepática da hiperlipidemia induzida por uma DH. Ácido gálico, quercetina e beta-sitosterol em FP foram demonstrados como os principais compostos ativos. Um total de 16 e seis potenciais metabólitos diferenciais no plasma e fígado, respectivamente, foram encontrados envolvidos nos efeitos terapêuticos do PF contra a hiperlipidemia por metabolômica. Além disso, a análise de integração indicou que os efeitos da intervenção estavam associados com CYP1A1, AChE e MGAM, bem como o ajuste de L-quinurenina, corticosterona, acetilcolina e rafinose, envolvendo principalmente a via do metabolismo do triptofano. O acoplamento molecular garantiu que os ingredientes acima atuando em alvos proteicos relacionados à hiperlipidemia desempenhassem um papel fundamental na redução de lipídios. Em síntese, esta pesquisa proporcionou uma nova possibilidade para a prevenção e tratamento da hiperlipidemia.

Introduction

A hiperlipidemia é uma doença metabólica comum e de sérios impactos na saúde humana, sendo também o principal fator de risco para doençascardiovasculares1. Recentemente, tem havido uma tendência de queda relacionada à idade para essa doença, e pessoas mais jovens tornaram-se mais suscetíveis devido a estilos de vida irregulares de longo prazo e hábitos alimentares não saudáveis2. Na clínica, vários medicamentos têm sido utilizados para tratar a hiperlipidemia. Por exemplo, uma das drogas mais comumente usadas para pacientes com hiperlipidemia e distúrbios ateroscleróticos relacionados são as estatinas. Entretanto, o uso prolongado de estatinas apresenta efeitos colaterais que não podem ser negligenciados, os quais levam a um prognóstico ruim, como intolerância, resistência ao tratamento e eventos adversos 3,4. Essas deficiências tornaram-se dores adicionais para pacientes com hiperlipidemia. Portanto, novos tratamentos para eficácia hipolipemiante estável e menos efeitos colaterais devem ser propostos.

A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem sido amplamente utilizada no tratamento de doenças devido à sua boa eficácia e poucos efeitos colaterais5. Fructus Phyllanthi (FP), fruto seco de Phyllanthus emblica Linn. (popularmente conhecida como amla berry ou groselha indiana), é um famoso medicamento e material homólogo alimentar dos medicamentos tradicionais chineses e indianos 6,7. Este medicamento tem sido utilizado para limpar o calor, resfriar o sangue e promover a digestão, de acordo com as teorias da MTC8. Estudos farmacológicos modernos têm demonstrado que o FP é rico em compostos bioativos como ácidos gálicos, ácidos elágicos e quercetina9, que são responsáveis por uma gama de propriedades biológicas multifacetadas, atuando como antioxidante, anti-inflamatório, proteção hepática, anti-hipolipidaemic, e assim por diante10. Pesquisas recentes também mostraram que o PF poderia efetivamente regular os lipídios sanguíneos de pacientes com hiperlipidemia. Por exemplo, Variya et al.11 demonstraram que o suco de fruta FP e seu principal ingrediente químico ácido gálico podem diminuir o colesterol plasmático e reduzir a infiltração de óleo no fígado e na aorta. A eficácia terapêutica foi relacionada à regulação do PF em aumentar a expressão do receptor alfa ativado por proliferadores de peroxissoma e diminuir a atividade lipogênica hepática. No entanto, o mecanismo subjacente do PF na melhora da hiperlipidemia deve ser mais investigado, pois seus ingredientes bioativos são bastante extensos. Procuramos explorar o mecanismo potencial da eficácia terapêutica do FP, que pode ser benéfico para o desenvolvimento e utilização deste medicamento.

Atualmente, a farmacologia de redes é considerada uma técnica holística e eficiente para estudar o mecanismo terapêutico da MTC. Em vez de procurar genes causadores de doenças únicas e drogas que tratam apenas um alvo individual, uma rede completa de fármacos-ingredientes-genes-doenças é construída para encontrar o mecanismo multi-alvo do medicamento multiingrediente em relação ao seu tratamento abrangente12. Esta técnica é especialmente adequada para MTC, pois suas composições químicas são maciças. Infelizmente, a farmacologia de rede só pode ser usada para prever alvos afetados por ingredientes químicos em teoria. Os metabólitos endógenos no modelo de doença devem ser observados para validar a eficácia da farmacologia da rede. O método metabolômico, que surge com o desenvolvimento da biologia de sistemas, é uma importante ferramenta para o monitoramento das alterações nos metabólitosendógenos13. As mudanças nos metabólitos refletem as mudanças no estado estacionário do hospedeiro, o que também é um indicador importante para o estudo do mecanismo interno. Alguns pesquisadores conseguiram integrar farmacologia e metabolômica de redes para explorar o mecanismo de interação entre drogas e doenças14,15.

Este artigo explora as bases mecanicistas do PF contra a hiperlipidemia integrando farmacologia de rede e técnicas metabolômicas. A farmacologia de rede foi aplicada para analisar a relação entre os principais princípios ativos do PF e alvos moleculares para hiperlipidemia. Posteriormente, foi realizada metabolômica para observar a alteração de metabólitos endógenos no modelo animal, o que pode explicar as ações da medicina em nível metabólico. Em comparação com a aplicação da farmacologia de rede ou metabonômica isoladamente, esta análise integrada forneceu um mecanismo de pesquisa mais específico e abrangente. Adicionalmente, a estratégia de acoplamento molecular foi utilizada para analisar a interação entre ingredientes ativos e proteínas-chave. Em geral, essa abordagem integrada poderia compensar a falta de evidências experimentais para farmacologia de rede e a falta de um mecanismo endógeno para o método metabolômico, e pode ser usada para a análise do mecanismo terapêutico da medicina natural. O fluxograma esquemático principal do protocolo é mostrado na Figura 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo o manuseio de animais foram conduzidos de acordo com o Guia de Medicina Tradicional Chinesa da Universidade de Chengdu para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Ética Institucional da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Protocolo número 2020-36). Camundongos C57BL/6 machos (20 ± 2 g) foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Predição baseada em farmacologia de rede

NOTA: A farmacologia de rede é usada para prever os ingredientes ativos e seus principais alvos de FP contra hiperlipidemia.

  1. Seleção de ingredientes ativos e alvos-chave
    1. Pesquise a palavra-chave "Phyllanthi Fructus" no banco de dados de farmacologia do sistema de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) para obter a lista dos ingredientes ativos candidatos e alvos do PF.
      NOTA: Normalmente, apenas ingredientes com biodisponibilidade oral (OB) ≥30% e valores semelhantes a medicamentos (DL) ≥0,18 na base de dados são incluídos como ingredientes ativos.
    2. Pesquise a palavra-chave "hyperlipidemia" na base de dados GeneCards (https://www.genecards.org/), na base de dados Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM; https://omim.org/) e na base de dados de alvos terapêuticos (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) para obter os respectivos alvos candidatos de hiperlipidemia. Faça o download das planilhas de alvos da doença. Exclua os alvos repetidos para obter a lista de alvos de hiperlipidemia.
    3. Copie essas listas das etapas 1.1.1 e 1.1.2 para uma nova planilha. Use a função "Dados - Identificar duplicatas" na barra de ferramentas para obter destinos de interseção. Importe a lista de destino de interseção para UniProtKB (http://www.uniprot.org/) para padronizar os nomes de genes e proteínas.
      NOTA: Esses alvos estão relacionados tanto ao FP quanto à hiperlipidemia. Portanto, predizer esses alvos de intersecção como alvos de PF contra hiperlipidemia.
  2. Construção de uma rede de interação proteína-proteína
    1. Abra o banco de dados STRING (https://string-db.org/) 11.5. Cole a lista de destino de interseção de PF contra hiperlipidemia na caixa de diálogo "Lista de nomes". Selecione Homo sapiens em "Organismos" e clique no botão PESQUISAR > CONTINUAR.
      NOTA: Humanos e camundongos têm genes muito semelhantes. Portanto, novas verificações experimentais são realizadas com camundongos.
    2. Quando os resultados estiverem disponíveis, marque a opção ocultar nós desconectados na rede em "Configurações avançadas". Defina a maior confiança (0,900) em "pontuação mínima de interação necessária" e clique no botão ATUALIZAR .
    3. Clique em Exportações na barra de título e baixe o pequeno texto tabular da rede de interação proteína-proteína (PPI) nos formatos PNG e TSV.
  3. Construção de uma rede droga-componente-doença-alvo
    1. Abra o Cytoscape 3.9.1 (ver Tabela de Materiais). Importe o arquivo de formato TSV da etapa 1.2.3. Otimize a cor, a fonte e o lado dos nós de rede por meio da barra de estilos no painel de controle.
    2. Use a função "Analisar rede" para análise de topologia de rede. Obter genes hub pelo CytoHubba no Cytoscape. Estabelecer a rede medicamento-ingrediente-doença-alvo.
  4. Análise de enriquecimento GO e KEGG
    1. Abra os Recursos de Bioinformática DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Clique em Iniciar análise e cole a lista de destino na caixa de diálogo à esquerda. Selecione SÍMBOLO OFICIAL DO GENE em "Selecionar identificador". Selecione Homo sapiens em "Selecionar espécies". Lista de Genes de Carrapato em "Tipo de Lista". Clique em Enviar lista.
    2. Quando os resultados estiverem disponíveis, clique em Analisar acima da lista de genes com uma das ferramentas DAVID. Tick GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT em "Gene Ontology" para análise de enriquecimento da função GO. Tick KEGG_Pathway em "Pathways" para análise de enriquecimento da via KEGG.
    3. Clique em Gráfico de Anotação Funcional para exibir os resultados.
      NOTA: Defina o limiar de significância estatística da análise de enriquecimento em p < 0,05.

2. Delineamento experimental

  1. A preparação do extrato aquoso FP
    NOTA: FP é processado no laboratório da professora Lina Xia na Universidade de Chengdu de TCM8.
    1. Mergulhe o pó seco de FP (90 g) em 1 L de água pura num balão volumétrico limpo de 2 L. Use tratamento ultra-sônico (em banho-maria de 4 °C, potência: 250W, frequência: 35 kHz) para ajudar a dissolver por 30 min. Filtrar a solução para obter o extracto com uma gaze médica estéril de camada dupla, 1 mm x 1 mm. Repita a operação acima três vezes para garantir a dissolução completa do FP.
    2. Use o método de evaporação rotativa para maior concentração. Ajuste a velocidade de rotação para 50 rpm com uma temperatura de 60 °C durante 4 horas. Concentrar o extracto aquoso a 100 ml.
    3. Divida o extrato bruto de FP (0,9 g/mL) uniformemente em duas partes (50 mL). Uma parte é usada como líquido de alta dose de FP (0,9 g/mL). Adicionar 50 mL de água pura em outra parte e considerá-la como o líquido FP de baixa dose (0,45 g/mL). Use as soluções aquosas FP de alta e baixa dose para administração. Conservar o líquido a -20 °C até à utilização.
  2. Preparo animal
    1. Abrigar 50 camundongos C57BL/6 machos (20 ± 2 g) em uma sala bem ventilada à temperatura ambiente, com um ciclo claro-escuro de 12 h e livre acesso a alimentos e água pura.
    2. Atribua aleatoriamente os camundongos a dois grupos: alimente 10 camundongos com uma dieta normal e 40 camundongos com uma dieta rica em gordura (veja Tabela de Materiais) para induzir hiperlipidemia.
      NOTA: Após a alimentação por 8 semanas, os camundongos foram triados para posterior intervenção medicamentosa.
    3. Na 8ª semana, retirar cerca de 200 μL de sangue de cada órbita de camundongo. Centrifugar o sangue durante 10 min a 5,733 x g a 4 °C para obter amostras de plasma. Determine os níveis de CT e TG com kits de ensaio disponíveis comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
    4. Selecionar seis camundongos com os níveis lipídicos mais normais como o grupo controle sem tratamento (NC). Selecione 24 camundongos com um nível lipídico significativamente mais alto como o grupo de dieta rica em gordura e divida aleatoriamente em quatro grupos: grupo dieta rica em gordura (HFD), grupo FP (FP_L em baixas doses, grupo FP em altas doses (FP_H) e grupo controle positivo (PC).
    5. Administrar irrigação gástrica aos grupos FP_L e FP_H com duas doses de PF (dose baixa, 4,5 g/kg e dose alta, 9 g/kg), respectivamente; irrigação gástrica para o grupo PC com comprimidos de sinvastatina (5 mg/kg; ver Tabela de Materiais); e irrigação gástrica para os grupos CP e DHL com o mesmo volume de soro fisiológico uma vez ao dia durante 4 semanas.
      OBS: O presente estudo utilizou as soluções aquosas de FP e sinvastatina para o tratamento.
    6. Na 12ª semana, após anestesia com pentobarbital sódico a 1% (30 mg/kg), sacrificar os camundongos de todos os grupos. Coletar ~400 μL de amostras de sangue da veia orbital de cada camundongo.
      NOTA: Estimule os dedos dos pés e as solas dos ratos com uma pinça. Se não houver reação, a anestesia é adequada.
    7. Centrifugar o sangue por 10 min a 5.733 x g a 4 °C para obter amostras de plasma e determinar os níveis de CT, TG, LDL-C e HDL-C com kits de ensaio disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais). Obter amostras de tecido hepático16 e submetê-las à análise histopatológica. Utilizar as restantes amostras de plasma e fígado para análise metabolómica (passo 3).
      NOTA: Todas as amostras são armazenadas a -80 °C até à utilização.
  3. Exame histopatológico do fígado
    1. Fixar os tecidos hepáticos frescos com solução de paraformaldeído a 4% durante mais de 24 horas. Retire o tecido do fixador e alise os tecidos alvo com um bisturi. Coloque o tecido e a etiqueta correspondente no desidratador.
    2. Desidratar em um gradiente de etanol: álcool 75% por 4 h, álcool 85% por 2 h, álcool 90% por 2 h, álcool 95% por 1 h, etanol absoluto por 1 h, xileno por 30 min. Coloque o de tecido em um molde de tecido em cera de parafina por três lavagens, 30 min cada16.
    3. Coloque os tecidos embebidos em cera no embutidor de tecidos (ver Tabela de Materiais). Antes que a cera se solidifique, remova os tecidos do desidratador, coloque-os na caixa embutida e fixe a etiqueta correspondente.
    4. Resfriar os blocos de cera em uma mesa de congelamento de -20 °C, removê-los da estrutura embutida e aparar o bloco de cera.
    5. Corte os blocos de cera aparados em seções de 3 μm de espessura usando um micrótomo (ver Tabela de Materiais). Flutue as seções em água a 40 °C, retire-as das lâminas e leve ao forno a 60 °C. Depois de assar com água e cera seca, retire-o e mantenha-o em temperatura ambiente.
    6. Colocar sucessivamente os cortes em xileno I por 10 min, xileno II por 10 min, xileno III por 10 min, etanol absoluto I por 5 min, etanol absoluto II por 5 min, álcool 75% por 5 min e lavar em água16.
    7. Manchar os cortes com solução corante de hematoxilina por 4 min, solução de álcool de ácido clorídrico a 1% (álcool a 75%) para diferenciação, solução de água de amônia a 1% de volta azul, e lavá-los com água.
    8. Manchar os cortes com solução corante de eosina por 2 min e lavá-los com água.
    9. Observe os cortes em microscópio óptico com aumento de 200x e 400x.
  4. Análise por cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS)
    1. Identificação do ingrediente do PF
      NOTA: A análise é realizada usando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas híbrida quadrupolo-orbitrap de alta resolução (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; ver Tabela de Materiais).
      1. Meça com precisão 1 g de pó seco de FP e coloque-o num balão volumétrico limpo de 50 ml.
      2. Adicionar 25 ml de metanol a 70% no balão volumétrico e pesar com precisão. Use tratamento ultra-sônico (em banho-maria de 4 °C, potência: 250 W, frequência: 35 kHz) por 30 min para ajudar na dissolução. Pese novamente com precisão para determinar com precisão a perda após a dissolução e use metanol a 70% para compensar a perda.
        NOTA: Não meça o volume, pois a escala do frasco volumétrico não é precisa, especialmente após o banho-maria de 4 °C.
      3. Agite para misturar totalmente. Use uma membrana microporosa de 0,22 μm para filtrar.
    2. Preparação da amostra de plasma
      1. Adicionar precisamente 100 μL de plasma (passo 2.2.7) num volume duplo (200 μL) de acetonitrila num tubo de centrífuga de 1,5 ml e agitá-lo com um vibrador de vórtice durante, pelo menos, 30 s. Siga este procedimento para todas as amostras.
      2. Centrifugar todas as amostras a 17.200 x g durante 10 min a 4 °C. Transfira os sobrenadantes após a centrifugação para um novo tubo centrífugo de 1,5 mL. Secar os sobrenadantes sob nitrogênio. Reconstituir com 200 μL de solvente de extração (acetonitrila:água = 4:1 [v/v]).
      3. Vórtice a solução reconstituída durante, pelo menos, 30 s e utilizar tratamento ultra-sónico durante 10 minutos (em banho-maria a 4 °C, potência: 250 W, frequência: 35 kHz). Centrifugar a 17.200 x g por 10 min a 4 °C.
      4. Filtrar os sobrenadantes com membranas filtrantes de 0,22 μm e mantê-los a 4 °C para análise.
    3. Preparação da amostra de fígado
      1. Homogeneizar 90 mg de tecido hepático (passo 2.2.7) durante 1 min em água de metanol gelada (1:1, v/v, 1 ml) e centrifugar-os a 21.500 x g durante 10 minutos a 4 °C. Transfira o sobrenadante para tubos de centrífuga de 1,5 mL. Siga este procedimento para todas as amostras.
      2. Extrair os precipitados novamente seguindo o mesmo procedimento e agrupar os sobrenadantes em novos tubos de centrífuga de 1,5 mL. Secar os sobrenadantes sob nitrogênio. Reconstituir com 300 μL do solvente de extracção (metanol:água = 4:1 [v/v]).
      3. Vórtice a solução reconstituída durante, pelo menos, 30 s e utilizar tratamento ultra-sónico durante 10 minutos (em banho-maria a 4 °C, potência: 250 W, frequência: 35 kHz). Centrifugar a 17.200 x g por 15 min a 4 °C.
      4. Filtrar os sobrenadantes com membranas filtrantes de 0,22 μm e mantê-los a 4 °C para análise.
        NOTA: As amostras de controle de qualidade agrupadas (CQ) foram preparadas misturando alíquotas de 10 μL de cada amostra de plasma e fígado (uma para cada seis amostras).
    4. Parâmetros de análise da LC-MS
      NOTA: A fase móvel é constituída por 0,1% de ácido fórmico (solvente A) e acetonitrila (solvente B). Transfira esses solventes para uma garrafa de vidro limpa e conecte-os ao sistema LC-MS.
      1. Definir os programas de gradiente das amostras de plasma no "arquivo de entrada" do sistema LC-MS da seguinte forma: 1% B (0-1,5 min), 1%-60% B (1,5-13,0 min), 60%-99% B (13,0-20,0 min), manter em 99% B (20,0-25,0 min), 99%-1% B (25,0-25,1 min) e manter em 1% B até 27 min.
      2. Definir as condições do amostrador automático das amostras de plasma no "arquivo de entrada" do sistema LC-MS da seguinte forma: o volume de injeção, 2 μL; e fluxo, 0,3 mL/min, para cada análise.
      3. Defina o programa de gradiente das amostras de fígado no "arquivo de entrada" do sistema LC-MS da seguinte forma: 1% B (0-1 min), 1%-53% B (1-15 min), 53%-70% B (15-30 min), 70%-90% B (30-32 min), 90%-95% B (32-40 min), 95%-1% B (40-42 min), e mantenha em 1% B até 45 min.
      4. Defina as condições do amostrador automático das amostras de fígado no "arquivo de entrada" do sistema LC-MS da seguinte forma: volume de injeção, 5 μL; e fluxo, 0,3 mL/min, para cada análise.
      5. Defina as condições de detecção de MS das amostras de plasma e fígado no "arquivo de ajuste MS" do sistema LC-MS. Realizar a aquisição de MS utilizando os modos de ionização positivo e negativo.
        NOTA: Os parâmetros de ionização por eletrospray aquecido são os seguintes: tensão de pulverização: 3,5 kV para ionização positiva e 3,8 kV para ionização negativa; fluxo de gás da bainha: 55 arb; fluxo de gás auxiliar: 15 arb; temperatura do aquecedor de sonda: 300 °C; e temperatura capilar: 350 °C.
      6. Importe os dados brutos coletados para o software Compound Discoverer e defina o modelo de método seguindo as instruções do fabricante (consulte Tabela de materiais).

3. Validação metabolômica

NOTA: Os dados de perfil metabolômico de metabólitos de plasma e fígado são importados para o software Compound Discoverer para executar a extração de características metabólicas adotando um algoritmo de extração de características moleculares. Defina os parâmetros da seguinte forma: desvio de massa, 5 x 10-6; faixa de massa, 100-1.500; limiar da relação sinal/ruído (S/R), 3; e desvio no tempo de retenção, 0,05. Avaliar a estabilidade e repetibilidade da metabolômica pelo desvio padrão relativo (RSD) das áreas dos picos de QC.

  1. Utilizar o software SIMCA-P (ver Tabela de Materiais) para análise estatística multivariada dos valores integrais obtidos a partir dos achados do LC-MS. Utilizar a análise discriminante ortogonal de mínimos quadrados parciais (OPLS-DA) para os dados centrados na média e a modelagem das classes amostrais.
  2. Após o teste OPLS-DA, considere-se os metabólitos, com integral com importância variável na projeção (VIP) valores de >1 e p-valor de <0,05 do teste t de Student como potenciais metabólitos diferenciais.
  3. Identificar os metabólitos perturbados e vias metabólicas por fontes de banco de dados abertas, incluindo Metaboloma Humano (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG; https://www.kegg.jp/) e MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Visualize as visualizações dos resultados pelo MetaboAnalyst5.0 e pela plataforma 'Wu Kong' (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Acoplamento molecular

  1. Faça o download da estrutura 3D dos ingredientes FP selecionados do banco de dados TCMSP, respectivamente. Pesquise os nomes dos ingredientes na caixa de pesquisa 'Nome químico' e baixe os arquivos de estrutura 3D correspondentes no formato mol2.
  2. Faça o download das estruturas cristalinas dos principais alvos do AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Pesquise os nomes de destino na caixa de pesquisa e baixe os arquivos de estruturas de cristal correspondentes no formato pdb.
  3. Importe ingredientes e arquivos de estruturas de destino para o software AutoDockTools. Clique em Editar > Excluir Água para excluir moléculas de água. Clique em Editar > Hidrogênios > Adicionar para adicionar hidrogênios. Defina os ingredientes como o 'ligante' e realize o acoplamento cego selecionando todos os alvos como o 'receptor'17.
  4. Digite um valor na caixa atrás de "centro" e "tamanho" para ajustar o espaço recém-desenvolvido, tornando possível abranger totalmente o ligante e o receptor. Salve os arquivos ligante e receptor no formato pdbqt.
  5. Use o AutoDock Vina para realizar o encaixe molecular. Defina a barra "Receptor" para o nome do 'receptor.pdbqt', e a barra "Ligand" para o nome do 'ligand.pdbqt'. Obter o local ideal para a ligação do ligante ao receptor. Registre o valor de energia de ligação na posição ideal.
    OBS: O processo de atracação foi calculado pelo Algoritmo Genético14. Todas as opções de execução de encaixe eram valores padrão. Os quadros de encaixe serão automaticamente classificados da energia de ligação mais alta para a mais baixa.
  6. Importe os arquivos de encaixe para o PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) para obter o modelo visual do sistema. Baixe os arquivos de modelo no formato pse e importe-os para o software PyMOL (consulte Tabela de Materiais) para construir uma visualização adicional.

5. Análise estatística

NOTA: Use o software estatístico SPSS (consulte a Tabela de Materiais) para análise de dados. Considere-se estatisticamente significante o valor de p < 0,05.

  1. Expresse os valores como média ± desvio padrão (DP).
  2. Realizar uma ANOVA one-way seguida de post hoc least significant difference (LSD), Dunnett (em caso de variância igual) ou T3 de Dunnett (em caso de variância desigual) para testar a significância estatística entre os grupos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Farmacologia de rede
Um total de 18 ingredientes potenciais em FP foram triados de acordo com suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas a partir do banco de dados e análise de LC-MS (os cromatogramas de íons totais são mostrados na Figura Suplementar 1). Através da literatura pertinente, o teor de ácido gálico é muito superior ao de outros ingredientes e é eficaz na redução de lipídios 9,11. Portanto, este ingrediente foi considerado um ingrediente potencial também. No total, foram encontrados 19 ingredientes e 134 alvos relacionados a ingredientes do PF. Todos os 19 ingredientes são mostrados na Tabela 1. Para selecionar os ingredientes mais representativos para análise posterior, esses ingredientes foram importados para a base de dados da Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine (BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/). De acordo com a rede ingrediente-alvo-via-doença, alguns ingredientes bioativos, como ácido gálico, quercetina e beta-sitosterol, foram identificados como os ingredientes mais importantes do PF relacionados à hipercolesterolemia e aterosclerose coronariana (Figura 2 suplementar). Dentre estes, o ácido gálico é um dos ácidos fenólicos mais estudados; é o principal ingrediente bioativo apresentado no FP18. Enquanto isso, o ácido gálico também é o ingrediente de maior teor em FP; sua concentração é geralmente de 1% a 3%. El-Hussainy et al.19 revelaram que o ácido gálico pode limitar a lesão cardíaca, melhorar o perfil lipídico e diminuir os marcadores inflamatórios cardíacos. Os teores de quercetina e beta-sitosterol são mais baixos, Mas alguns estudos provaram o seu efeito na redução de lipídios. A quercetina, como importante flavonoide amplamente existente em plantas, possui diversas propriedades, como efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e de proteçãocardiovascular20. Lu et al.21 estudaram que o suco enriquecido com quercetina pode atenuar os níveis de CT, LDL-C e HDL-C em indivíduos saudáveis com hipercolesterolemia leve. Quanto ao beta-sitosterol, estudos clínicos têm demonstrado que o esterol vegetal pode prevenir significativamente a hipercolesterolemia e doenças cardiovasculares22,23. Althwab et al.24provaram que o beta-sitosterol pode melhorar o perfil lipídico e o índice aterogênico em ratos com DH. Pode-se observar que o efeito hipolipemiante do PF pode estar relacionado a esses três ingredientes.

Adicionalmente, foram coletados 1.552 alvos de hiperlipidemia relacionados aos bancos de dados Genecards, OMIM e TTD. Após o pareamento dos 134 alvos relacionados ao PF com os alvos relacionados à hiperlipidemia, 62 alvos foram identificados como potenciais alvos do PF contra hiperlipidemia (Figura 2A). Todos os alvos cruzados foram normalizados para seus símbolos oficiais, de acordo com o banco de dados UniProt. Posteriormente, a rede PPI foi construída por STRING (Figura 2B) e Cytoscape (Figura 2C). Combinando as pontuações dos métodos computacionais, os 10 principais alvos foram ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 e MYC. Os detalhes são apresentados na Figura Suplementar 3. Todos esses 62 alvos são a base de uma análise mais aprofundada, que é integrada com os resultados da metabinômica.

As vias GO e KEGG foram realizadas por análise de enriquecimento. As 15 principais vias, de acordo com o número de alvos, foram selecionadas para análise de acordo com o valor de p. Os resultados do enriquecimento com GO sugeriram que os processos biológicos e a função molecular do PF contra hiperlipidemia estavam relacionados principalmente à expressão gênica e à ligação às proteínas (Figura 2D). O enriquecimento de KEGG provou que o PF poderia intervir no processo de metabolismo lipídico e aterosclerose (Figura 2E), o que significa que o PF alivia a hiperlipidemia por afetar o metabolismo lipídico.

Efeito do PF sobre os níveis lipídicos plasmáticos e índice hepático
Para testar o efeito melhorado do PF sobre a hiperlipidemia, as alterações no CT, TG, LDL-C, HDL-C e índice hepático (a relação entre o peso do fígado e o peso corporal) foram primeiramente medidas. Em comparação com o grupo NC, os camundongos do grupo DH apresentaram um aumento significativo nos níveis plasmáticos de CT (p < 0,001), LDL-C (p < 0,001) e TG (p < 0,05), indicando que a intervenção prolongada com DH pode aumentar os níveis lipídicos e induzir hiperlipidemia (Figura 3).

Após a administração do extrato aquoso FP, os níveis de CT nos grupos FP_L e FP_H foram significativamente (p < 0,05) reduzidos em 18,8% e 12,4%, respectivamente (Figura 3A). Os níveis de LDL-C nos grupos FP_L e FP_H foram significativamente reduzidos (p < 0,05) em 13,7% e 21,8%, respectivamente (Figura 3B). Em relação ao nível de HDL-C, o grupo FP_H foi significativamente (p < 0,01) aumentado de 1,81 ± 0,08 mmol/L para 2,65 ± 0,16 mmol/L, em comparação com o grupo HFD (Figura 3C). Embora o nível de TG tenha permanecido insignificante após a intervenção do PF, ele foi reduzido em comparação com o grupo HFD (Figura 3D). Estudos recentes têm indicado que o índice da razão LDL-C/HDL-C é um índice melhor do que o LDL-C ou HDL-C isoladamente na predição de doençacardiovascular25,26. Em comparação com o grupo HFD, a razão LDL-C/HDL-C foi significativamente (p < 0,01) reduzida em 46,3% no grupo FP_H (Figura 3E), o que significa que a intervenção FP reduziu o colesterol ruim e aumentou os níveis de colesterol bom. Como principal órgão metabólico da gordura, o peso do fígado reflete, até certo ponto, o armazenamento de gordura em camundongos27. Após 12 semanas, os índices hepáticos no grupo FP_L e no grupo FP_H estavam significativamente (p < 0,01) reduzidos em comparação com o grupo DH (Figura 3F). O grupo PC também apresentou diferentes graus de redução nesses indicadores acima, demonstrando que o PF teve efeitos semelhantes aos das estatinas, e o efeito protetor mostrou uma relação dose-resposta.

Vários estudos clínicos revelaram que, depois de tomar extrato ou FP inteiro por um tempo, os níveis de TC e LDL-C foram significativamente diminuídos. Enquanto isso, o nível de HDL-C foi notavelmente elevado com a administração prolongada de FP28,29. Nambiar e Shetty30 descobriram que o suco FP poderia reduzir as lipoproteínas oxidadas de baixa densidade, reduzindo assim muito o risco de aterosclerose. Gopa et al.31 avaliaram o efeito hipolipidêmico do PF em pacientes com hiperlipidemia e o compararam com a sinvastatina. O tratamento com FP resultou em considerável redução de CT, LDL-C e TG e aumento significativo dos níveis de HDL-C, semelhante ao da sinvastatina. Nesta pesquisa, o PF e a sinvastatina também tiveram efeitos terapêuticos semelhantes, e o efeito redutor do LDL-C e a ação reparadora hepática do PF foram superiores à sinvastatina.

Observação histopatológica hepática
O efeito do PF na esteatose hepática em camundongos HFD é mostrado na Figura 4. Os cortes hepatopatológicos no grupo NC expressaram morfologia regular dos hepatócitos, bordas celulares claramente definidas e vacúolos gordurosos evidentes (Figura 4A,B). Comparativamente, o grupo DH apresentava vacúolos de gordura de diferentes tamanhos ao redor dos vasos sanguíneos e apresentava evidente dano hepático, caracterizado por edema celular, degeneração gordurosa, perda dos limites celulares, contração celular e necrose de hepatócitos (Figura 4C,D). Como mostrado na Figura 4E,F, a intervenção do FP poderia melhorar a esteatose hepática, especialmente no grupo FP_L. Em comparação com o grupo HFD, o grupo FP_H (Figura 4G,H) e PC (Figura 4I,J) teve certo grau de recuperação da estrutura celular hepática, degeneração de gordura e redução do vacúolo de gordura. Isso significa que a intervenção FP pode proteger o tecido hepático da lesão hepática induzida por HFD.

Perfil metabolômico
De acordo com o nível de lipídios plasmáticos e a observação histopatológica hepática, a PF em altas doses teve um efeito melhor sobre a hiperlipidemia do que as FP em baixas doses. Portanto, os grupos NC, HFD e FP_H foram escolhidos para analisar sua mudança no nível de metabolismo. Os cromatogramas iônicos totais das amostras de CQ foram mostrados na Figura 4 Suplementar. Para garantir a precisão dos dados, as características com valores de RSD >30% foram removidas de todas as amostras de CQ. Os cromatogramas de PCA e de íons refletiram que as amostras de CQ foram estáveis durante o processo (Figura 5 Suplementar). Um total de 626 e 562 características no plasma e fígado foram determinadas após o pré-processamento dos dados. Entre eles, 120 e 124 metabólitos no plasma e fígado, respectivamente, foram identificados com base no banco de dados KEGG. A análise OPLS-DA foi utilizada para explorar a separação entre os grupos NC, HFD e FP_H. O OPLS-DA mostrou que as amostras do mesmo grupo se agruparam e amostras de grupos diferentes se diferenciaram bem (Figura 5A,B). Esses resultados indicaram que as intervenções de DH e PF causaram variações metabólicas óbvias.

Para identificar os potenciais metabólitos diferenciais que contribuíram para a distinção metabólica, análises adicionais de OPLS-DA e teste t de NC versus DH e DH versus FP_H foram realizadas, respectivamente. Os resultados do OPLS-AD diferenciaram-se bem e mostraram diferenças significativas entre os diferentes grupos demodelos14 (Figura 6 Suplementar). Com base no VIP (Variável importante na projeção) >1 e p < 0,05, 32 metabólitos no plasma mostraram diferenciação entre o grupo NC e HFD, e 72 metabólitos mostraram diferenciação entre o grupo HFD e FP_H. No fígado, 38 metabólitos mostraram diferenciação entre o grupo NC e HFD, e 17 metabólitos mostraram diferenciação entre o grupo HFD e FP_H grupo. Finalmente, um total de 16 e 6 metabólitos foram identificados como metabólitos diferenciais em camundongos HFD que afetam FP no plasma e fígado, respectivamente (Figura 7 Suplementar). As informações sobre esses metabólitos são mostradas na Tabela 2.

Para visualizar a variação dos metabólitos entre os três grupos, mapas de calor foram plotados pelo MetaboAnalyst 5.0. Todos os metabólitos diferenciais no plasma e fígado estavam alterados no grupo DH e a maioria deles foi revertida no grupo FP, indicando que a intervenção FP pode melhorar o distúrbio metabólico (Figura 5C,D). Além disso, metabólitos diferenciais foram importados para o MetaboAnalyst 5.0 para explorar as vias metabólicas do FP em camundongos HFD. Com base em p < 0,05 e impacto da via >0,10, o metabolismo do triptofano foi afetado significativamente no plasma, e os metabólitos relacionados a essa via foram D-triptofano e L-quinurenina (Figura 5E). Jung et al.32 estudaram que a hiperlipidemia prolongada pode diminuir os níveis séricos de quinurenina. O metabolismo da taurina e hipotaurina foi afetado significativamente no fígado, e o metabólito relacionado foi a taurina (Figura 5F). A taurina é um aminoácido importante e necessário no corpo animal; Dong et al.33 estudaram que a taurina poderia reduzir levemente os danos dos lipídios sanguíneos e diminuir o risco de aterosclerose causada pela DH. Nesta pesquisa, a intervenção em PF aumentou o conteúdo de L-quinurenina e taurina, o que está positivamente relacionado à redução dos níveis lipídicos, apoiando a efetividade do PF contra a hiperlipidemia.

Análise integrada de farmacologia e metabolômica de redes
Uma estratégia integrada de farmacologia de rede combinada com metabolômica tem se tornado cada vez mais indispensável no estudo de mecanismos de doença e estratégias de intervenção. A relevância entre farmacologia de rede e metabolômica com evidências limitadas foi estabelecida. Para obter uma visão abrangente do mecanismo do PF contra a hiperlipidemia, foram construídas as redes de interação baseadas na farmacologia e metabolômica de redes. Metabólitos diferenciais foram importados para o plugin MetScape no Cytoscape e combinados com os genes hub identificados na farmacologia de rede para coletar as redes composto-reação-enzima-gene (Figura 6). Como mostrado na Tabela 3, nos metabólitos plasmáticos, a L-quinurenina e a corticosterona foram relacionadas ao CYP1A1, que pode catalisar a peroxidação lipídica e induzir doença hepática gordurosa não alcoólica34,35; As vias afetadas foram o metabolismo do triptofano e a biossíntese do hormônio esteroide, respectivamente. A acetilcolina foi relacionada à AChE e afetou o metabolismo glicerofosfolipídico. Nos metabólitos hepáticos, MGAM e rafinose foram relacionados ao metabolismo da galactose. Vários estudos têm demonstrado que a ingestão de oligossacarídeos da família das rafinoses poderia melhorar os distúrbios metabólicos em camundongos HFD36.

Além disso, a rede ingredientes-alvos-metabólitos-vias foi construída (Figura 7). Nos ingredientes, a quercetina conectou a maioria das bordas, indicando que a quercetina de FP desempenha o papel mais importante na redução de lipídios. A análise supra-integrada revelou os principais alvos, metabólitos e vias do PF contra a hiperlipidemia, o que poderia ser a base de um estudo mais aprofundado do mecanismo terapêutico e da aplicação clínica deste medicamento.

Docagem molecular
Para investigar melhor a possibilidade de interação entre os ingredientes selecionados e os alvos-chave, o acoplamento molecular foi usado para analisar suas interações ligante-sítio ativo. O software AutoDock Vina (ver Tabela de Materiais) foi usado para realizar o encaixe molecular, e a primeira pose de encaixe foi emitida de acordo com a classificação da função de pontuação. Os resultados do encaixe são mostrados na Figura 8.

Na análise integrada, CYP1A1, AChE e MGAM foram relacionados a metabólitos diferenciais; Eles construíram pontes entre alvos e metabólitos. Posterior acoplamento molecular foi realizado para verificar a relação entre o alvo e os ingredientes. Os resultados do acoplamento dos ingredientes com o CYP1A1 foram os seguintes: o ácido gálico formou quatro ligações de hidrogênio através dos resíduos de aminoácidos Asn-185, Tyr-187, Asn-219 e His-500, e formou interação de empilhamento π-π através do resíduo de aminoácidos Tyr-187 (Figura 8A); quercetina formou três ligações de hidrogênio através de Asn-185, Asn-219 e His-500, interação hidrofóbica e interação de empilhamento π-π através de Tyr-187 (Figura 8B); beta-sitosterol formou quatro ligações de hidrogênio através de Arg-362, Ser-363, Leu-365 e Arg-464, e interação hidrofóbica através de Glu-369 e Ile-439 (Figura 8C). As energias de ligação foram 5,3, 7,0 e 7,3 kcal/mol, respectivamente. Na interação com AChE, o ácido gálico foi estabilizado por ligações de hidrogênio com Arg-237, Arg-238 e Arg-480 (Figura 8D); quercetina foi estabilizada por ligações de hidrogênio com Arg-237 e Phe-474, por interação hidrofóbica com Phe-157 e por interação de empilhamento de π-π com Tyr-478 (Figura 8E); beta-sitosterol foi estabilizado por interação hidrofóbica com Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 e TYR478 (Figura 8F). As energias de ligação foram 5,0, 6,5 e 8,0 kcal/- mol, respectivamente. Na interação com MGAM, o ácido gálico foi estabilizado por ligações de hidrogênio com Ile-1716, Gly-1747 e Trp-1749, e por interação hidrofóbica com Tyr-1715 e Trp-1749 (Figura 8G); quercetina foi estabilizada por ligações de hidrogênio com Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 e Trp-1752, por ligações de hidrogênio com Arg-1730 e por empilhamento de π-π com His-1727 (Figura 8H); beta-sitosterol foi estabilizado por interação hidrofóbica com Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 e Phe-1560, As energias de ligação foram 5,9, 8,1 e 6,9 kcal/mol, respectivamente. Informações detalhadas sobre as interações e afinidades de ligação são exibidas na Tabela 4. Múltiplos sítios de ligação e altas energias de ligação explicam as altas afinidades entre ingredientes e alvos proteicos, verificando-se que esses ingredientes desempenham o papel de reduzir os lipídios, atuando em alvos relacionados à hiperlipidemia.

Figure 1
Figura 1: Fluxograma esquemático da estratégia integrada. Os ingredientes e genes do hub foram extraídos por farmacologia de rede (Parte 1). Metabólitos diferenciais do PF contra hiperlipidemia foram analisados por metabolômica plasmática e hepática (Parte 2). Os principais alvos, metabólitos e vias foram identificados e vinculados com base em uma análise integrada da Parte 1 e da Parte 2 (Parte 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Triagem de alvos, construção de redes e análise de enriquecimento do efeito do PF contra hiperlipidemia . (A) Diagrama de Venn das metas de FP-hiperlipidemia. (B) Rede potencial fármaco-ingredientes-alvos-doença: diferentes símbolos de cor, como mencionado aqui: doença (vermelho), medicamento (azul), ingredientes (verde) e alvos (amarelo). (C) Rede PPI por STRING. (D) Análise de enriquecimento da via GO. (E) Análise do enriquecimento da via de KEGG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Efeito do PF sobre os níveis plasmáticos de lipídios e índice hepático em camundongos com hiperlipidemia induzida por DH (n = 6). (A) Níveis de CT. (B) Níveis de LDL-C. (C) HDL-C. (D) nível TG. (E) A relação LDL-C/HDL-C. (F) Índices hepáticos.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Diferenças estatisticamente significativas foram avaliadas por meio de ANOVA one-way seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett ou análise post hoc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Efeito do PF no tecido hepático de camundongos com hiperlipidemia induzida por HFD (coloração H&E). (A,B) grupo NC, (C,D) grupo HFD, (E,F) grupo FP_L, (G,H) grupo FP_H, (I,J) grupo CP (n = 6). Barra de escala: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Gráficos do escore OPLS-DA, mapas de calor e vias metabólicas de metabólitos diferenciais. Os gráficos do escore OPLS-DA de FP em camundongos HFD no plasma (A) e fígado (B). Os mapas de calor de metabólitos diferenciais no plasma (C) e fígado (D). As vias metabólicas dos metabólitos diferenciais no plasma (E) e fígado (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: As redes composto-reação-enzima-gene dos principais metabólitos e alvos. Os nós de baixo grau foram removidos. Os hexágonos vermelhos, círculos azuis, retângulos verdes redondos e diamantes cinzentos representam os compostos ativos, genes, proteínas e reações, respectivamente. Os principais alvos e metabólitos foram ampliados. As vias com o fundo branco são significativamente reguladas no plasma. A via com o fundo cinzento é significativamente regulada no fígado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: A rede ingredientes-alvos-metabólitos-caminhos. Quanto mais escura a cor, mais as bordas conectadas, significando que o nó é mais importante nessa rede. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Os diagramas de interação dos ingredientes FP e os principais alvos . (A) Ácido gálico agindo sobre o CYP1A1. B) Quercetina actuando no CYP1A1. (C) Beta-sitosterol agindo no CYP1A1. (D) Ácido gálico atuando sobre a AChE. (E) Quercetina atuando sobre AChE. (F) Ação beta-sitosteroling sobre AChE. (G) Ácido gálico atuando sobre MGAM. (H) Quercetina atuando na MGAM. (I) Beta-sitosterol atuando sobre MGAM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Visão geral do PF em relação ao resultado da hiperlipidemia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Os ingredientes selecionados do extrato aquoso FP. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Metabólitos diferenciais entre os três grupos. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Informações sobre os principais alvos, metabólitos e caminhos. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Sítios de ligação e forças de ação entre os ingredientes FP e as proteínas-alvo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura suplementar 1: Cromatogramas iónicos positivos e negativos do extracto aquoso FP. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: A rede FP ingrediente-alvo-caminho-doença por BATMAN-TCM. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Análise de frequência de genes hub em farmacologia de redes. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Cromatogramas iónicos de amostras de CQ de plasma e fígado. Cromatogramas de íons positivos (A) e negativos (B) representativos de amostras de QC de plasma. Cromatogramas de íons positivos (C) e negativos (D) representativos de amostras de CQ de fígado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 5: Os gráficos de pontuação PCA de amostras de QC de plasma (A) e fígado (B). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 6: Gráficos de pontuação OPLS-DA de amostras de plasma (A e B) e fígado (C e D). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 7: Diagramas de Venn dos metabólitos diferenciais em amostras de plasma (A) e fígado (B). Clique aqui para baixar este arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nos últimos anos, a taxa de incidência de hiperlipidemia vem aumentando, principalmente devido a hábitos alimentares não saudáveis a longo prazo. A MTC e seus ingredientes químicos possuem diversas atividades farmacológicas, as quais têm sido amplamente estudadas nos últimos anos37,38. O PF é um tipo de recurso frutífero, utilizado tanto como medicamento quanto como alimento, e tem um importante potencial para o tratamento da hiperlipidemia. Entretanto, o potencial mecanismo terapêutico do PF contra a hiperlipidemia necessita de mais estudos.

A farmacologia de rede avalia os efeitos polifarmacológicos de fármacos em nível molecular e prediz a interação de produtos naturais e proteínas para determinar o mecanismo principal39. O primeiro passo é selecionar os ingredientes ativos e os principais alvos da droga. Nesta pesquisa, foram encontrados nove princípios ativos e 62 genes hub. Para entender melhor o mecanismo molecular do PF na hiperlipidemia, IBP e redes ingrediente-alvo foram estabelecidas com base na análise farmacológica da rede. Para restringir o escopo de ingredientes-chave e alvos, três ingredientes-chave (ácido gálico, quercetina e beta-sitosterol) relacionados à hipercolesterolemia e aterosclerose coronariana foram fundados pela BATMAN-TCM. Todos esses ingredientes poderiam reduzir os níveis de LDL-C ou aumentar os níveis de HDL-C, validando os efeitos específicos do PF sobre a hiperlipidemia. Além disso, de acordo com a análise de enriquecimento de KEGG, a função do PF na hiperlipidemia está relacionada à atividade da via lipídica e aterosclerótica. Embora esse método dependa muito da base de dados e careça de verificação experimental, ele tem valor teórico e fornece ideias para pesquisas de verificação experimental subsequentes.

Para posterior validação experimental, camundongos foram alimentados com dieta suplementada com gordura por 8 semanas para induzir hiperlipidemia. Os resultados mostraram que os níveis plasmáticos de CT, LDL-C e TG estavam significativamente aumentados. Embora o nível de HDL-C tenha diminuído significativamente, a relação de LDL-C para HDL-C aumentou significativamente. As observações histopatológicas mostraram que o tecido hepático de camundongos HFD foi severamente danificado, mas não houve aumento significativo no índice hepático; Pode ser que as mudanças no peso corporal e no peso visceral demorem mais. As alterações lipídicas e hepáticas mostraram adequadamente o efeito de intervenção do PF sobre a hiperlipidemia. No entanto, o mecanismo interno do efeito de intervenção ainda precisa ser mais explorado.

A metabolômica fornece uma lista de potenciais metabólitos e vias relacionadas, que visam explorar o mecanismo de doenças metabólicas e a ação de drogas terapêuticas40. O resultado da metabolômica pode ser afetado pelo tipo de amostra. Considerando as características patogênicas da hiperlipidemia, amostras de plasma e fígado foram escolhidas para análise metabenômica nesta pesquisa. De acordo com os resultados do OPLS-AD, os metabólitos dos grupos NC, HFD e FP_H foram bem discriminados. Um total de 16 metabólitos diferenciais foram encontrados no plasma, e 6 metabólitos diferenciais foram encontrados no fígado. Houve mais metabólitos afetados no plasma do que no fígado, comprovando que o sangue é o principal local de distúrbio metabólico induzido pela hiperlipidemia. A intervenção do FP pode reverter a alteração desses metabólitos sob a influência da DH. Além disso, esses metabólitos diferenciais foram importados para o banco de dados do KEGG. As vias metabólicas significativas dos metabólitos diferenciais no plasma foram o metabolismo do triptofano e no fígado foram o metabolismo da taurina e da hipotaurina. Nesta pesquisa, a intervenção FP aumentou o conteúdo de L-quinurenina do metabolismo do triptofano e o conteúdo de taurina do metabolismo da taurina e hipotaurina, o que significa que o FP poderia ser eficaz em ajustar favoravelmente distúrbios metabólicos e hiperlipidemia. A análise metabolômica revelou quais metabólitos estavam relacionados à hiperlipidemia ou intervenção do FP e determinou o mecanismo a jusante do efeito FP.

Combinando o resultado da farmacologia da rede com a metabolômica, três alvos chave (CYP1A1, AChE e MGAM) foram identificados nas redes composto-reação-enzima-gene. De acordo com a análise de docking molecular, esses alvos mostraram alta afinidade com ingredientes FP (ácido gálico, quercetina e beta-sitosterol). Quatro metabólitos (L-quinurenina, corticosterona, acetilcolina e rafinose) e quatro vias relacionadas (metabolismo do triptofano, biossíntese de hormônios esteroides, metabolismo glicerofosfolipídeo e metabolismo da galactose) foram identificados como os principais metabólitos e vias metabólicas. Dentre estes, a quercetina foi associada com a maioria dos alvos, e o metabolismo do triptofano apareceu tanto em metabonômicos quanto em resultados integrados. Eles desempenham o papel mais essencial no efeito terapêutico do PF contra a hiperlipidemia. O resultado do acoplamento molecular mostrou que CYP1A1, AChE e MGAM têm alta afinidade com os ingredientes. Os resultados acima comprovam que esses alvos triados estão intimamente relacionados ao efeito terapêutico da PF.

Na presente pesquisa, ácido gálico, quercetina e beta-sitosterol foram identificados como ingredientes ativos do PF para anti-hiperlipidemia, e o metabolismo do triptofano é a principal via metabólica da terapia com FP em camundongos HFD. A visão geral do resultado é mostrada na Figura 9. Esta pesquisa ofereceu dados e suporte teórico para novos estudos de mecanismos e forneceu uma base para a aplicação clínica da medicina FP. Também comprovou que a alimentação natural pode ser uma opção promissora e com grandes perspectivas na prática clínica. No entanto, ainda existem algumas deficiências nesta pesquisa. O efeito terapêutico isolado do princípio ativo sobre a hiperlipidemia não foi verificado. Além disso, o caminho dos alvos-chave não foi estudado; Também necessita de mais experimentos sistemáticos de biologia molecular para verificar o mecanismo exato.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pela Equipe de Desenvolvimento e Inovação de Produtos da TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) e Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
101-3B Oven Luyue Instrument and Equipment Factory \
80312/80302 Glass Slide Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD \
80340-1630 Cover Slip Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD \
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) Thermo Fisher Scientific \
Acetonitrile Fisher Chemical A998 Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) Thermo Fisher Scientific \
Aethanol Fisher Chemical A995 Version 3.0
Ammonia Solution Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1336-21-6 Version 3.9.1
AutoDockTools Scripps Institution of Oceanography \
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. \
Compound Discoverer Thermo Fisher Scientific \
Cytoscape Cytoscape Consortium \
DM500 Optical Microscope Leica \
DV215CD Electronic Balance Ohaus Corporation ., Ltd T15A63
Ethyl Alcohol Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 64-17-5
Formic Acid Fisher Chemical A118
HDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A112-1-1
Hematoxylin Staining Solution Biosharp BL700B
High Fat Diet ENSIWEIER 202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge Hitachi., Ltd. \
Homogenizer Oulaibo Technology Co., Ltd \
Hydrochloric Acid Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 7647-01-0
Image-forming System LIOO \
JB-L5 Freezer Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JB-L5 Tissue Embedder Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JK-5/6 Microtome Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JT-12S Hydroextractor Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
KQ3200E Ultrasonic Cleaner Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd \
LDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A113-1-1
Male C57BL/6 Mice  SBF Biotechnology Co., Ltd. \ Version 2.3.2
Neutral Balsam Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd 10021190865934
Pure Water Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd GB19298
PyMOL DeLano Scientific LLC \ Version 14.1
RE-3000 Rotary Evaporator Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd \
RM2016 Pathological Microtome Shanghai Leica Instruments Co., Ltd \ Version 26.0
SIMCA-P Umetrics AB \
Simvastatin Merck Sharp & Dohme., Ltd 14202220051
SPSS International Business Machines Corporation \
TC Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A111-1-1
TG Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry Thermo Fisher Scientific \
Vortex Vibrator Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. LC-Vortex-P1
Xylene Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504 (2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).

Tags

Retratação Edição 194
Predição de Farmacologia de Rede e Validação Metabolômica do Mecanismo de Fructus Phyllanthi contra Hiperlipidemia
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N.,… More

Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N., Wang, J., Nie, K., Xia, L., Yu, S. Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia. J. Vis. Exp. (194), e65071, doi:10.3791/65071 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter