Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Nätverksfarmakologi Prediktion och metabolomik Validering av mekanismen för Fructus Phyllanthi mot hyperlipidemi

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65071
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 2,3
1School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Regimen and Health, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Regimen and Health of Sichuan Province
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver en integrerad strategi för att utforska de viktigaste målen och mekanismerna för Fructus Phyllanthi mot hyperlipidemi baserat på nätverksfarmakologisk prediktion och metabolomikverifiering.

Abstract

Hyperlipidemi har blivit en ledande riskfaktor för hjärt-kärlsjukdomar och leverskador över hela världen. Fructus Phyllanthi (FP) är ett effektivt läkemedel mot hyperlipidemi i traditionell kinesisk medicin (TCM) och indisk medicin teorier, men den potentiella mekanismen kräver ytterligare utforskning. Den aktuella forskningen syftar till att avslöja mekanismen för FP mot hyperlipidemi baserat på en integrerad strategi som kombinerar nätverksfarmakologisk prediktion med metabolomikvalidering. En fettrik diet (HFD)-inducerad mössmodell fastställdes genom att utvärdera plasmalipidnivåerna, inklusive totalt kolesterol (TC), triglycerid (TG), lågdensitetslipoproteinkolesterol (LDL-C) och högdensitetslipoproteinkolesterol (HDL-C). Nätverksfarmakologi tillämpades för att ta reda på de aktiva ingredienserna i FP och potentiella mål mot hyperlipidemi. Metabolomik av plasma och lever utfördes för att identifiera differentiella metaboliter och deras motsvarande vägar bland normalgruppen, modellgruppen och interventionsgruppen. Förhållandet mellan nätverksfarmakologi och metabolomik konstruerades ytterligare för att få en övergripande bild av processen med FP mot hyperlipidemi. De erhållna nyckelmålproteinerna verifierades genom molekylär dockning. Dessa resultat återspeglade att FP förbättrade plasmalipidnivåerna och leverskadan av hyperlipidemi inducerad av en HFD. Gallinsyra, quercetin och beta-sitosterol i FP visades som de viktigaste aktiva föreningarna. Totalt 16 respektive sex potentiella differentiella metaboliter i plasma respektive lever visade sig vara involverade i de terapeutiska effekterna av FP mot hyperlipidemi av metabolomik. Vidare indikerade integrationsanalys att interventionseffekterna var associerade med CYP1A1, AChE och MGAM, liksom justeringen av L-kynurenin, kortikosteron, acetylkolin och raffinos, huvudsakligen involverande tryptofanmetabolismväg. Molekylär dockning säkerställde att ovanstående ingredienser som verkar på hyperlipidemirelaterade proteinmål spelade en nyckelroll för att sänka lipider. Sammanfattningsvis gav denna forskning en ny möjlighet att förebygga och behandla hyperlipidemi.

Introduction

Hyperlipidemi är en vanlig metabolisk sjukdom med allvarliga effekter på människors hälsa, och är också den primära riskfaktorn för hjärt-kärlsjukdomar1. Nyligen har det skett en nedåtgående åldersrelaterad trend för denna sjukdom, och yngre människor har blivit mer mottagliga på grund av långvarig oregelbunden livsstil och ohälsosamma matvanor2. I kliniken har olika läkemedel använts för att behandla hyperlipidemi. Till exempel är ett av de vanligaste läkemedlen för patienter med hyperlipidemi och relaterade aterosklerotiska störningar statiner. Långvarig användning av statiner har dock biverkningar som inte kan försummas, vilket leder till en dålig prognos, såsom intolerans, behandlingsresistens och biverkningar 3,4. Dessa brister har blivit ytterligare smärtor för patienter med hyperlipidemi. Därför bör nya behandlingar för stabil lipidsänkande effekt och färre biverkningar föreslås.

Traditionell kinesisk medicin (TCM) har använts i stor utsträckning för att behandla sjukdomar på grund av dess goda effekt och få biverkningar5. Fructus Phyllanthi (FP), torkad frukt av Phyllanthus emblica Linn. (populärt känd som amla bär eller indiska krusbär), är en berömd medicin och mat homologt material av traditionella kinesiska och indiska läkemedel 6,7. Detta läkemedel har använts för att rensa värme, kyla blod, och främja matsmältningen, enligt TCM teorier8. Moderna farmakologiska studier har visat att FP är rik på bioaktiva föreningar såsom gallinsyror, ellaginsyror och quercetin9, som är ansvariga för en rad mångfacetterade biologiska egenskaper genom att fungera som en antioxidant, en antiinflammatorisk, leverskydd, en anti-hypolipidemisk och så vidare10. Ny forskning har också visat att FP effektivt kan reglera blodfetterna hos patienter med hyperlipidemi. Till exempel har Variya et al.11 visat att FP-fruktjuice och dess huvudsakliga kemiska ingrediens gallinsyra kan minska plasmakolesterol och minska oljeinfiltration i levern och aorta. Den terapeutiska effekten var relaterad till FP: s reglering för att öka uttrycket av peroxisomproliferatoraktiverad receptor-alfa och minska hepatisk lipogen aktivitet. Den underliggande mekanismen för FP för att förbättra hyperlipidemi bör dock undersökas ytterligare, eftersom dess bioaktiva ingredienser är ganska omfattande. Vi försökte utforska den potentiella mekanismen för FP: s terapeutiska effekt, vilket kan vara fördelaktigt för vidare utveckling och användning av detta läkemedel.

För närvarande betraktas nätverksfarmakologi som en holistisk och effektiv teknik för att studera den terapeutiska mekanismen för TCM. Istället för att leta efter enskilda sjukdomsframkallande gener och läkemedel som enbart behandlar ett individuellt mål, konstrueras ett komplett nätverk av läkemedel-ingredienser-gener-sjukdomar för att hitta multi-target-mekanismen för multi-ingrediensläkemedlet angående deras omfattande behandling12. Denna teknik är särskilt lämplig för TCM, eftersom deras kemiska kompositioner är massiva. Tyvärr kan nätverksfarmakologi endast användas för att förutsäga mål som påverkas av kemiska ingredienser i teorin. De endogena metaboliterna i sjukdomsmodellen bör observeras för att validera effektiviteten av nätverksfarmakologi. Metabolomikmetoden, som uppstår med utvecklingen av systembiologi, är ett viktigt verktyg för att övervaka förändringar i endogena metaboliter13. Förändringarna i metaboliter återspeglar värdens stadiga tillståndsförändringar, vilket också är en viktig indikator för att studera den interna mekanismen. Vissa forskare har framgångsrikt integrerat nätverksfarmakologi och metabolomik för att utforska interaktionsmekanismen mellan läkemedel och sjukdomar14,15.

Denna artikel utforskar den mekanistiska grunden för FP mot hyperlipidemi genom att integrera nätverksfarmakologi och metabolomiktekniker. Nätverksfarmakologi tillämpades för att analysera förhållandet mellan de viktigaste aktiva ingredienserna i FP och molekylära mål för hyperlipidemi. Därefter utfördes metabolomik för att observera förändringen av endogena metaboliter i djurmodellen, vilket kan förklara läkemedlets verkan på metabolisk nivå. Jämfört med tillämpningen av enbart nätverksfarmakologi eller metabonomik gav denna integrerade analys en mer specifik och omfattande forskningsmekanism. Dessutom användes den molekylära dockningsstrategin för att analysera interaktionen mellan aktiva ingredienser och nyckelproteiner. I allmänhet kan detta integrerade tillvägagångssätt kompensera för bristen på experimentella bevis för nätverksfarmakologi och bristen på en endogen mekanism för metabolomikmetoden och kan användas för terapeutisk mekanismanalys av naturmedicin. Det huvudsakliga schematiska flödesschemat för protokollet visas i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer som involverar hantering av djur utfördes i enlighet med Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkändes av den institutionella etikkommittén vid Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (protokollnummer 2020-36). Möss av hantyp C57BL/6 (20 ± 2 g) användes i denna studie. Mössen erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning).

1. Nätverksfarmakologibaserad prediktion

OBS: Nätverksfarmakologin används för att förutsäga de aktiva ingredienserna och deras viktigaste mål för FP mot hyperlipidemi.

  1. Urval av aktiva ingredienser och viktiga mål
    1. Sök på nyckelordet "Phyllanthi Fructus" i farmakologidatabasen för traditionell kinesisk medicin (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) för att få en lista över kandidatens aktiva ingredienser och mål för FP.
      OBS: Normalt ingår endast ingredienser med oral biotillgänglighet (OB) ≥30% och läkemedelsliknande (DL) värden ≥0,18 i databasen som aktiva ingredienser.
    2. Sök på nyckelordet "hyperlipidemi" i GeneCards databas (https://www.genecards.org/), Online Mendelian Inheritance in Man-databasen (OMIM; https://omim.org/) och den terapeutiska måldatabasen (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) för att få respektive kandidatmål för hyperlipidemi. Ladda ner kalkylblad med sjukdomsmål. Ta bort de upprepade målen för att hämta listan över hyperlipidemimål.
    3. Kopiera listorna från steg 1.1.1 och 1.1.2 till ett nytt kalkylblad. Använd funktionen "Data - Identifiera dubbletter" i verktygsfältet för att få korsningsmål. Importera skärningspunktlistan till UniProtKB (http://www.uniprot.org/) för att standardisera gen- och proteinnamnen.
      OBS: Dessa mål är relaterade till både FP och hyperlipidemi. Förutsäg därför dessa korsningsmål som målen för FP mot hyperlipidemi.
  2. Uppbyggnad av ett nätverk för interaktion mellan protein och protein
    1. Öppna STRING-databasen (https://string-db.org/) 11.5. Klistra in korsningsmållistan för FP mot hyperlipidemi i dialogrutan "Lista över namn". Välj Homo sapiens i "Organismer" och klicka på SÖK > FORTSÄTT.
      OBS: Människor och möss har mycket liknande gener. Därför utförs ytterligare experimentell verifiering med möss.
    2. När resultaten är tillgängliga markerar du dölj frånkopplade noder i nätverket i "Avancerade inställningar". Ställ in den högsta konfidensen (0,900) i "minsta nödvändiga interaktionspoäng" och klicka sedan på knappen UPPDATERA .
    3. Klicka på Exporter i namnlisten och ladda ner den korta tabelltexten för protein-proteininteraktionsnätverket (PPI) i PNG- och TSV-format.
  3. Uppbyggnad av ett nätverk av läkemedelskomponent-sjukdom-mål
    1. Öppna Cytoscape 3.9.1 (se Materialförteckning). Importera TSV-formatfilen i steg 1.2.3. Optimera färg, teckensnitt och sida av nätverksnoderna genom stilfältet på kontrollpanelen.
    2. Använd funktionen "Analysera nätverk" för analys av nätverkstopologi. Skaffa navgener genom CytoHubba i Cytoscape. Upprätta nätverket för läkemedel-ingrediens-mål-sjukdom.
  4. GO och KEGG anrikningsanalys
    1. Öppna DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Klicka på Starta analys och klistra in mållistan i den vänstra dialogrutan. Välj OFFICIELL GENSYMBOL i "Välj identifierare". Välj Homo sapiens i "Välj arter". Markera genlistan i "Listtyp ". Klicka på Skicka lista.
    2. När resultaten är tillgängliga, klicka på Analysera ovan genlista med ett av DAVID-verktygen. Markera GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT i "Genontologi" för GO-funktionsanrikningsanalys. Markera KEGG_Pathway i "Pathways" för KEGG-väganrikningsanalys.
    3. Klicka på Funktionellt anteckningsdiagram för att visa resultaten.
      OBS: Ställ in tröskelvärdet för statistisk signifikans för anrikningsanalysen på p < 0,05.

2. Experimentell design

  1. FP vattenhaltigt extraktpreparat
    OBS: FP bearbetas i professor Lina Xias laboratorium vid Chengdu University of TCM8.
    1. Blötlägg det torkade pulvret av FP (90 g) i 1 liter rent vatten i en ren 2 L mätkolv. Använd ultraljudsbehandling (i ett 4 ° C vattenbad, effekt: 250W, frekvens: 35 kHz) för att hjälpa till att lösa upp i 30 minuter. Filtrera lösningen för att erhålla extraktet med ett dubbelskikt, 1 mm x 1 mm sterilt medicinskt gasbind. Upprepa ovanstående operation tre gånger för att säkerställa fullständig upplösning av FP.
    2. Använd rotationsindunstningsmetoden för ytterligare koncentration. Ställ in rotationshastigheten på 50 rpm med en temperatur på 60 °C i 4 timmar. Koncentrera vattenextraktet till 100 ml.
    3. Dela råextraktet av FP (0,9 g/ml) jämnt i två delar (50 ml). En del används som högdos FP-vätska (0,9 g / ml). Tillsätt 50 ml rent vatten i en annan del och betrakta det som lågdos FP-vätska (0,45 g / ml). Använd hög- och lågdos FP vattenlösningar för administrering. Förvara vätskan vid -20 °C tills den används.
  2. Djurberedning
    1. Hus 50 manliga C57BL/6-möss (20 ± 2 g) i ett välventilerat rum vid rumstemperatur, med en 12 h ljus-mörk cykel och fri tillgång till mat och rent vatten.
    2. Tilldela mössen slumpmässigt till två grupper: mata 10 möss med normal diet och 40 möss med en fettrik diet (se materialtabell) för att inducera hyperlipidemi.
      OBS: Efter utfodring i 8 veckor screenades mössen för ytterligare läkemedelsintervention.
    3. Under den 8: e veckan, dra ut cirka 200 μL blod från varje musbana. Centrifugera blodet i 10 minuter vid 5,733 x g vid 4 °C för att ta plasmaprover. Bestäm TC- och TG-nivåerna med kommersiellt tillgängliga analyssatser (se materialtabell).
    4. Välj sex möss med de mest normala lipidnivåerna som kontrollgrupp utan behandling (NC). Välj 24 möss med en signifikant högre lipidnivå som dietgruppen med hög fetthalt och dela dem slumpmässigt i fyra grupper: fettrik diet (HFD) -grupp, lågdos FP (FP_L) -grupp, högdos FP (FP_H) -grupp och positiv kontrollgrupp (PC).
    5. Administrera gastrisk irrigation till FP_L- och FP_H-grupperna med två doser av FP (låg dos, 4,5 g / kg respektive hög dos, 9 g / kg); gastrisk irrigation till PC-gruppen med simvastatin tabletter (5 mg/kg; se Materialförteckning); och gastrisk bevattning till NC- och HFD-grupperna med samma volym fysiologisk saltlösning en gång om dagen i 4 veckor.
      OBS: I den aktuella studien användes vattenhaltiga lösningar av FP och simvastatin för behandling.
    6. Under den 12: e veckan, efter anestesi med 1% pentobarbitalnatrium (30 mg / kg), offra mössen i alla grupper. Samla ~ 400 μL blodprover från varje mus orbitalven.
      OBS: Stimulera mössens tår och sulor med pincett. Om det inte finns någon reaktion, visar det adekvat anestesi.
    7. Centrifugera blodet i 10 minuter vid 5 733 x g vid 4 °C för att erhålla plasmaprover och bestäm nivåerna TC, TG, LDL-C och HDL-C med kommersiellt tillgängliga analyssatser (se materialförteckning). Skaffa levervävnadsprover16 och utsätt dem för histopatologisk analys. Använd de återstående plasma- och leverproverna för metabolomikanalys (steg 3).
      OBS: Alla prover förvaras vid -80 °C fram till användning.
  3. Leverhistopatologisk undersökning
    1. Fixa färska levervävnader med 4% paraformaldehydlösning i mer än 24 timmar. Ta ut vävnaden från fixeringsmedlet och släta målvävnaderna med en skalpell. Placera vävnaden och motsvarande etikett i dehydratorn.
    2. Dehydrat i en etanolgradient: 75% alkohol i 4 timmar, 85% alkohol i 2 timmar, 90% alkohol i 2 timmar, 95% alkohol i 1 timme, absolut etanol i 1 timme, xylen i 30 min. Lägg vävnadskassetten i en mjukpappersform i paraffinvax i tre tvättar, 30 minvardera 16.
    3. Lägg de vaxindränkta vävnaderna i vävnadsinbäddaren (se materialförteckning). Innan vaxet stelnar, ta bort vävnaderna från dehydratorn, lägg dem i den inbäddade lådan och fäst motsvarande etikett.
    4. Kyl vaxblocken i ett frysbord på -20 °C, ta bort dem från den inbäddade ramen och trimma vaxblocket.
    5. Skär de trimmade vaxblocken i 3 μm tjocka sektioner med en mikrotom (se materialtabell). Häll sektionerna i 40 ° C vatten, ta bort dem från objektglasen och grädda i en 60 ° C ugn. Efter bakning med vatten och torrt vax, ta ut det och förvara det vid rumstemperatur.
    6. Placera sektionerna successivt i xylen I i 10 minuter, xylen II i 10 minuter, xylen III i 10 minuter, absolut etanol I i 5 min, absolut etanol II i 5 min, 75 % alkohol i 5 minuter och tvätt i vatten16.
    7. Färga sektionerna med hematoxylinfärgningslösning i 4 minuter, 1% saltsyraalkohollösning (75% alkohol) för differentiering, 1% ammoniakvattenlösning tillbaka blå och tvätta dem med vatten.
    8. Färga sektionerna med eosinfärgningslösning i 2 minuter och tvätta dem med vatten.
    9. Observera sektionerna med ett optiskt mikroskop med en förstoring på 200x och 400x.
  4. Vätskekromatografi-masspektrometri )LC-MS) analys
    1. Identifiering av beståndsdelar i ramprogrammet
      OBS: Analysen utförs med hjälp av vätskekromatografi med ultrahög prestanda i kombination med hybridkvadrupol-orbitrap högupplöst masspektrometri (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; se materialtabell).
      1. Mät exakt 1 g torkat pulver av FP och lägg det i en ren 50 ml mätkolv.
      2. Tillsätt 25 ml 70% metanol i mätkolven och väg noggrant. Använd ultraljudsbehandling (i ett 4 ° C vattenbad, effekt: 250 W, frekvens: 35 kHz) i 30 minuter för att hjälpa upplösningen. Väg noggrant igen för att exakt bestämma förlusten efter upplösning och använd 70% metanol för att kompensera förlusten.
        OBS: Mät inte volymen, eftersom volymkolvens skala inte är korrekt, särskilt efter vattenbadet på 4 °C.
      3. Skaka upp för att blanda helt. Använd ett 0,22 μm mikroporöst membran för att filtrera.
    2. Beredning av plasmaprov
      1. Tillsätt exakt 100 μL plasma (steg 2.2.7) i en dubbel volym (200 μL) acetonitril i ett 1,5 ml centrifugrör och virvla det med en virvelvibrator i minst 30 s. Följ den här proceduren för alla prover.
      2. Centrifugera alla prover vid 17 200 x g i 10 min vid 4 °C. Överför supernatanterna efter centrifugering till ett nytt 1,5 ml centrifugrör. Torka supernatanterna under kväve. Bered med 200 μl extraktionsmedel (acetonitril:vatten = 4:1 [v/v]).
      3. Virvla den beredda lösningen i minst 30 s och använd ultraljudsbehandling i 10 minuter (i ett 4 °C vattenbad, effekt: 250 W, frekvens: 35 kHz). Centrifugera vid 17 200 x g i 10 min vid 4 °C.
      4. Filtrera supernatanterna med 0,22 μm filtermembran och håll dem vid 4 °C för analys.
    3. Beredning av leverprov
      1. Homogenisera 90 mg levervävnad (steg 2.2.7) i 1 min i iskallt metanolvatten (1:1, v/v, 1 ml) och centrifugera dem vid 21 500 x g i 10 minuter vid 4 °C. Överför supernatanten till 1,5 ml centrifugrör. Följ den här proceduren för alla prover.
      2. Extrahera fällningarna igen enligt samma procedur och slå samman supernatanterna i nya 1,5 ml centrifugrör. Torka supernatanterna under kväve. Bered med 300 μL extraktionslösningsmedlet (metanol:vatten = 4:1 [v/v]).
      3. Virvla den beredda lösningen i minst 30 s och använd ultraljudsbehandling i 10 minuter (i ett 4 °C vattenbad, effekt: 250 W, frekvens: 35 kHz). Centrifugera vid 17 200 x g i 15 min vid 4 °C.
      4. Filtrera supernatanterna med 0,22 μm filtermembran och håll dem vid 4 °C för analys.
        OBS: De poolade kvalitetskontrollproverna (QC) bereddes genom att blanda 10 μL alikvoter från varje plasma- och leverprov (ett per sex prover).
    4. Analysparametrar för LC-MS
      OBS: Den mobila fasen består av 0,1% myrsyra (lösningsmedel A) och acetonitril (lösningsmedel B). Överför dessa lösningsmedel till en ren glasflaska och anslut dem till LC-MS-systemet.
      1. Ställ in gradientprogrammen för plasmaprover i LC-MS-systemets "inloppsfil" enligt följande: 1% B (0-1,5 min), 1% -60% B (1,5-13,0 min), 60% -99% B (13,0-20,0 min), behåll vid 99% B (20,0-25,0 min), 99% -1% B (25,0-25,1 min) och håll vid 1% B tills 27 min.
      2. Ställ in autosamplerförhållandena för plasmaproverna i LC-MS-systemets "inloppsfil" enligt följande: injektionsvolymen, 2 μl; och flödeshastigheten, 0,3 ml/min, för varje analys.
      3. Ställ in gradientprogrammet för leverprover i LC-MS-systemets "inloppsfil" enligt följande: 1% B (0-1 min), 1% -53% B (1-15 min), 53% -70% B (15-30 min), 70% -90% B (30-32 min), 90% -95% B (32-40 min), 95% -1% B (40-42 min) och håll vid 1% B tills 45 min.
      4. Ställ in autosamplerförhållandena för leverproverna i LC-MS-systemets "inloppsfil" enligt följande: injektionsvolym, 5 μl; och flödeshastigheten, 0,3 ml/min, för varje analys.
      5. Ställ in MS-detektionsförhållandena för både plasma- och leverproverna i "MS tune file" i LC-MS-systemet. Utför MS-förvärvet med både positiva och negativa joniseringslägen.
        OBS: De uppvärmda elektrosprayjoniseringsparametrarna är följande: sprayspänning: 3,5 kV för positiv jonisering och 3,8 kV för negativ jonisering; mantelgasflöde: 55 arb; hjälpgasflöde: 15 arb; sondvärmare temperatur: 300 °C; och kapillärtemperatur: 350 °C.
      6. Importera insamlade rådata till Compound Discoverer-programvaran och ställ in metodmallen enligt tillverkarens instruktioner (se Materialförteckning).

3. Metabolomisk validering

OBS: De metabolomiska profileringsdata för plasma- och levermetaboliter importeras till Compound Discoverer-programvaran för att utföra extraktion av metaboliska egenskaper genom att anta en algoritm för extraktion av molekylära egenskaper. Ställ in parametrarna enligt följande: massavvikelse, 5 x 10-6; massområde, 100-1 500; tröskelvärde för signal-brusförhållande (SNR), 3; och retentionstidsavvikelse, 0,05. Utvärdera stabilitet och repeterbarhet av metabolomik genom den relativa standardavvikelsen (RSD) för QC-toppområden.

  1. Använd SIMCA-P-programvara (se materialförteckning) för multivariat statistisk analys av integralvärdena erhållna från LC-MS-fynd. Använd ortogonal partiell minsta kvadratdiskriminantanalys (OPLS-DA) för medelcentrerade data och modellering av provklasser.
  2. Efter OPLS-DA-testet, överväga metaboliterna, med integral med variabel betydelse i projektionsvärdena (VIP) på >1 och ett p-värde på <0,05 från Students t-test som de potentiella differentialmetaboliterna.
  3. Identifiera störda metaboliter och metaboliska vägar genom öppna databaskällor, inklusive Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) och MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Visualisera resultatvyerna från MetaboAnalyst5.0 och plattformen "Wu Kong" (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Molekylär dockning

  1. Ladda ner 3D-strukturen för de valda FP-ingredienserna från TCMSP-databasen. Sök efter ingrediensnamnen i sökrutan "Kemiskt namn" och ladda ner motsvarande 3D-strukturfiler i mol2-format.
  2. Ladda ner kristallstrukturerna för de viktigaste målen från AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Sök i målnamnen i sökrutan och ladda ner motsvarande kristallstrukturfiler i pdb-format.
  3. Importera ingredienser och målstrukturfiler till AutoDockTools-programvaran. Klicka på Redigera > Ta bort vatten för att ta bort vattenmolekyler. Klicka på Redigera > väten > Lägg till för att lägga till väten. Ställ in ingredienserna som "ligand" och utför blinddockning genom att välja hela målen som "receptor"17.
  4. Ange ett värde i rutan bakom "center" och "size" för att justera det nyutvecklade utrymmet, vilket gör det möjligt att helt omfatta liganden och receptorn. Spara ligand- och receptorfilerna i pdbqt-format.
  5. Använd AutoDock Vina för att utföra molekylär dockning. Ställ in fältet "Receptor" till namnet på 'receptor.pdbqt' och fältet 'Ligand' till namnet på 'ligand.pdbqt'. Erhåll den optimala platsen för ligandbindning till receptorn. Registrera bindningsenergivärdet vid optimal position.
    OBS: Dockningsprocessen beräknades av den genetiska algoritmen14. Alla alternativ för dockningskörning var standardvärden. Dockningsramar rangordnas automatiskt från den högsta till den lägsta bindningsenergin.
  6. Importera dockningsfilerna till PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) för att få den visuella systemmodellen. Ladda ner modellfilerna i pse-format och importera dem till PyMOL-programvaran (se materialförteckning) för att konstruera ytterligare visualisering.

5. Statistisk analys

OBS: Använd SPSS statistisk programvara (se Materialförteckning) för dataanalys. Tänk på värdet av p < 0,05 som statistiskt signifikant.

  1. Uttryck värdena som medel ± standardavvikelse (SD).
  2. Utför en enkelriktad ANOVA följt av post hoc least significant difference (LSD), Dunnett (vid lika varians) eller Dunnetts T3 (vid ojämn varians) för att testa statistisk signifikans mellan grupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nätverkets farmakologi
Totalt 18 potentiella substanser i FP screenades enligt deras farmakokinetiska och farmakodynamiska egenskaper från databasen och LC-MS-analysen (de totala jonkromatogrammen visas i kompletterande figur 1). Genom relevant litteratur är innehållet av gallinsyra mycket högre än andra ingredienser och är effektivt för att sänka lipider 9,11. Därför ansågs denna ingrediens vara en potentiell ingrediens också. Totalt har 19 ingredienser och 134 ingrediensrelaterade mål i ramprogrammet grundats. Alla 19 ingredienser visas i tabell 1. För att välja de mest representativa ingredienserna för vidare analys importerades dessa ingredienser till Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine database (BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/). Enligt nätverket för ingrediens-målväg-sjukdom identifierades vissa bioaktiva ingredienser, såsom gallinsyra, quercetin och beta-sitosterol, som de viktigaste ingredienserna i FP relaterade till hyperkolesterolemi och koronar ateroskleros (kompletterande figur 2). Bland dessa är gallinsyra en av de mest studerade fenolsyrorna; Det är den viktigaste bioaktiva ingrediensen som presenteras i FP18. Under tiden är gallinsyra också den ingrediens med högsta innehåll i FP; Dess koncentration är vanligtvis 1% till 3%. El-Hussainy et al.19 har visat att gallinsyra kan begränsa hjärtskada, förbättra lipidprofilen och nedreglera hjärtinflammatoriska markörer. Innehållet av quercetin och beta-sitosterol är lägre, men vissa studier har visat sin effekt på att sänka lipider. Quercetin, som en viktig flavonoid som finns i stor utsträckning i växter, har olika egenskaper, såsom antioxidant, antiinflammatoriska och kardiovaskulära skyddseffekter20. Lu et al.21 har studerat att quercetinberikad juice kan dämpa TC-, LDL-C- och HDL-C-nivåer hos friska individer med mild hyperkolesterolemi. När det gäller beta-sitosterol har kliniska studier visat att växtsterol kan signifikant förhindra hyperkolesterolemi och hjärt-kärlsjukdom22,23. Althwab et al.24visade att beta-sitosterol kan förbättra lipidprofilen och aterogent index hos HFD-råttor. Det kan ses att den lipidsänkande effekten av FP kan vara relaterad till dessa tre ingredienser.

Dessutom samlades 1 552 mål för hyperlipidemi-relaterade från Genecards-, OMIM- och TTD-databaserna. Efter att ha matchat de 134 FP-relaterade målen med de hyperlipidemirelaterade målen identifierades 62 mål som potentiella mål för FP mot hyperlipidemi (figur 2A). Alla korsade mål normaliserades till sina officiella symboler, enligt UniProt-databasen. Därefter konstruerades PPI-nätverket av STRING (figur 2B) och Cytoscape (figur 2C). Genom att kombinera poängen för beräkningsmetoder var de 10 bästa målen ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 och MYC. Detaljerna presenteras i kompletterande figur 3. Alla dessa 62 mål ligger till grund för ytterligare analys, som är integrerad med resultaten av metabonomics.

GO- och KEGG-vägar utfördes genom anrikningsanalys. De 15 bästa vägarna, beroende på antalet mål, valdes ut för analys enligt p-värdet. GO-anrikningsresultaten föreslog att de biologiska processerna och den molekylära funktionen av FP mot hyperlipidemi huvudsakligen var relaterade till genuttryck och proteinbindning (figur 2D). KEGG-anrikningen visade att FP kunde ingripa i processen med lipidmetabolism och ateroskleros (figur 2E), vilket innebär att FP lindrar hyperlipidemi genom att påverka lipidmetabolismen.

Effekten av FP på plasmalipidnivåer och leverindex
För att testa den förbättrade effekten av FP på hyperlipidemi mättes först förändringarna i TC, TG, LDL-C, HDL-C och leverindex (förhållandet mellan levervikt och kroppsvikt). Jämfört med NC-gruppen visade möss i HFD-gruppen en signifikant ökning av plasmanivåerna av TC (p < 0,001), LDL-C (p < 0,001) och TG (p < 0,05), vilket indikerar att långvarig HFD-intervention kan öka lipidnivåerna och inducera hyperlipidemi (figur 3).

Efter administrering av FP-vattenextrakt minskade nivåerna av TC i FP_L- och FP_H-grupperna signifikant (p < 0,05) med 18,8 % respektive 12,4 % (figur 3A). Nivåerna av LDL-C i FP_L- och FP_H-grupperna minskade signifikant (p < 0,05) med 13,7 % respektive 21,8 % (figur 3B). När det gäller HDL-C-nivån ökade FP_H-gruppen signifikant (p < 0,01) från 1,81 ± 0,08 mmol/l till 2,65 ± 0,16 mmol/l, jämfört med HFD-gruppen (figur 3C). Även om TG-nivån förblev obetydlig efter FP-interventionen minskade den jämfört med HFD-gruppen (figur 3D). Nya studier har visat att indexet för LDL-C / HDL-C-förhållandet är ett bättre index än LDL-C eller HDL-C ensam för att förutsäga hjärt-kärlsjukdom25,26. Jämfört med HFD-gruppen minskade LDL-C / HDL-C-förhållandet signifikant (p < 0,01) med 46,3% i den FP_H gruppen (figur 3E), vilket innebär att FP-intervention minskade dåligt kolesterol och ökade goda kolesterolnivåer. Som det huvudsakliga fettmetaboliska organet återspeglar levervikten fettlagring hos möss till viss del27. Efter 12 veckor var leverindexen i FP_L-gruppen och FP_H-gruppen signifikant (p < 0,01) reducerade jämfört med HFD-gruppen (figur 3F). PC-gruppen visade också olika grader av reduktion i dessa indikatorer ovan, vilket visade att FP hade liknande effekter som statiner, och den skyddande effekten visade ett dos-responsförhållande.

Olika kliniska studier visade att, efter att ha tagit antingen extrakt eller hela FP ett tag, TC och LDL-C nivåer minskade signifikant. Samtidigt höjdes HDL-C-nivån anmärkningsvärt vid långvarig administrering av FP28,29. Nambiar och Shetty30 fann att FP-juice kan minska oxiderade lipoproteiner med låg densitet, vilket kraftigt minskar risken för åderförkalkning. Gopa et al.31 utvärderade den hypolidemiska effekten av FP hos patienter med hyperlipidemi och jämförde den med simvastatin. Behandling med FP resulterade i en avsevärd minskning av TC, LDL-C och TG, och en signifikant ökning av HDL-C-nivåer, liknande den för simvastatin. I denna forskning hade FP och simvastatin också liknande terapeutiska effekter, och den LDL-C-sänkande effekten och leverreparerande verkan av FP var överlägsen simvastatin.

Leverhistopatologisk observation
Effekten av FP på leversteatos hos HFD-möss visas i figur 4. De leverpatologiska sektionerna i NC-gruppen uttryckte regelbunden hepatocytmorfologi, tydligt definierade cellgränser och inga uppenbara fettvakuoler (figur 4A, B). Jämförelsevis hade HFD-gruppen fettvakuoler av olika storlekar runt blodkärlen och visade uppenbar leverskada, kännetecknad av cellsvullnad, fettdegeneration, förlust av cellulära gränser, cellulär sammandragning och hepatocytnekros (figur 4C, D). Som visas i figur 4E,F kan FP-intervention förbättra leversteatos, särskilt i FP_L-gruppen. Jämfört med HFD-gruppen hade FP_H (figur 4G,H) och PC-gruppen (figur 4I,J) en viss grad av återhämtning av levercellsstrukturen, fettdegeneration och fettvakuolreduktion. Detta innebär att FP-intervention kan skydda levervävnad från HFD-inducerad leverskada.

Profilering av metabolomik
Enligt plasmalipidnivå och leverhistopatologisk observation hade högdos FP en bättre effekt på hyperlipidemi än lågdos FP. Därför valdes NC-, HFD- och FP_H-grupper för att analysera deras förändring i metabolismnivån. De totala jonkromatogrammen för QC-prover visades i kompletterande figur 4. För att säkerställa noggrannheten i data togs funktionerna med RSD-värden >30% bort från alla QC-prover. PCA- och jonkromatogram återspeglade att QC-proverna var stabila under processen (kompletterande figur 5). Totalt 626 och 562 funktioner i plasma och lever bestämdes efter dataförbehandlingen. Bland dem identifierades 120 respektive 124 metaboliter i plasma respektive lever baserat på KEGG-databasen. OPLS-DA-analys användes för att undersöka separationen mellan NC-, HFD- och FP_H grupperna. OPLS-DA visade att samma gruppprover grupperade ihop och olika gruppprover utmärkte sig väl (figur 5A,B). Dessa resultat indikerade att HFD- och FP-interventionerna orsakade uppenbara metaboliska variationer.

För att identifiera de potentiella differentialmetaboliter som bidrog till den metaboliska distinktionen utfördes ytterligare OPLS-DA- och t-testanalyser av NC kontra HFD respektive HFD kontra FP_H. OPLS-DA-resultaten utmärkte sig väl och visade signifikanta skillnader mellan olika grupper av modeller14 (kompletterande figur 6). Baserat på VIP (variabel viktig i projektion) >1 och p < 0,05 visade 32 metaboliter i plasma differentiering mellan NC- och HFD-gruppen och 72 metaboliter visade differentiering mellan HFD- och FP_H gruppen. I levern visade 38 metaboliter differentiering mellan NC- och HFD-gruppen och 17 metaboliter visade differentiering mellan HFD- och FP_H gruppen. Slutligen identifierades totalt 16 och 6 metaboliter som differentiella metaboliter hos FP-påverkande HFD-möss i plasma respektive lever (kompletterande figur 7). Information om dessa metaboliter visas i tabell 2.

För att visualisera variationen i metaboliter mellan de tre grupperna plottades värmekartor av MetaboAnalyst 5.0. Alla differentialmetaboliter i plasma och lever förändrades i HFD-gruppen och de flesta av dem reverserades i FP-gruppen, vilket indikerar att FP-intervention kan förbättra metabolisk störning (figur 5C, D). Vidare importerades differentiella metaboliter till MetaboAnalyst 5.0 för att utforska de metaboliska vägarna för FP i HFD-möss. Baserat på p < 0,05 och en vägpåverkan >0,10 påverkades tryptofanmetabolismen signifikant i plasma och metaboliterna relaterade till denna väg var D-tryptofan och L-kynurenin (figur 5E). Jung et al.32 studerade att långvarig hyperlipidemi kan sänka serumnivåerna av kynurenin. Taurin och hypotaurinmetabolism påverkades signifikant i levern och den relaterade metaboliten var taurin (figur 5F). Taurin är en viktig och nödvändig aminosyra i djurkroppen; Dong et al.33 studerade att taurin milt kunde minska skadorna av blodfetter och sänka åderförkalkningsrisken orsakad av HFD. I denna forskning ökade FP-interventionen innehållet av L-kynurenin och taurin, vilket är positivt relaterat till minskningen av lipidnivåer, vilket stöder effektiviteten av FP mot hyperlipidemi.

Integrerad analys av nätverksfarmakologi och metabolomik
En integrerad strategi för nätverksfarmakologi i kombination med metabolomik har blivit mer och mer oumbärlig för att studera sjukdomsmekanismer och interventionsstrategier. Relevansen mellan nätverksfarmakologi och metabolomik med begränsad evidens fastställdes. För att få en heltäckande bild av FP:s mekanism mot hyperlipidemi konstruerades interaktionsnätverk baserade på nätverksfarmakologi och metabolomik. Differentiella metaboliter importerades till MetScape-plugin i Cytoscape och matchade navgenerna som identifierats i nätverksfarmakologi för att samla in nätverken för förening-reaktion-enzym-gen (figur 6). Som visas i tabell 3 var L-kynurenin och kortikosteron i plasmametaboliter relaterade till CYP1A1, vilket kan katalysera lipidperoxidation och inducera alkoholfri fettleversjukdom34,35; De påverkade vägarna var tryptofanmetabolism respektive steroidhormonbiosyntes. Acetylkolin var relaterad till AChE och påverkade glycerofosfolipidmetabolism. I levermetaboliter var MGAM och raffinos relaterade till galaktosmetabolism. Flera studier har visat att intag av raffinosfamiljeoligosackarider kan förbättra metaboliska störningar hos HFD-möss36.

Vidare har nätverket ingredienser-mål-metaboliter-vägar konstruerats (figur 7). I ingredienserna kopplade quercetin de flesta kanterna, vilket indikerar att quercetin av FP spelar den viktigaste rollen för att sänka lipider. Den ovan integrerade analysen avslöjade de viktigaste målen, metaboliterna och vägarna för FP mot hyperlipidemi, vilket kan ligga till grund för vidare studier av detta läkemedels terapeutiska mekanism och kliniska tillämpning.

Molekylär dockning
För att ytterligare undersöka möjligheten till interaktion mellan de valda ingredienserna och de viktigaste målen användes molekylär dockning för att analysera deras ligandaktiva platsinteraktioner. AutoDock Vina-programvaran (se materialtabell) användes för att utföra molekylär dockning, och den första dockningsställningen matades ut enligt poängfunktionens rangordning. Dockningsresultaten visas i figur 8.

I den integrerade analysen var CYP1A1, AChE och MGAM relaterade till differentiella metaboliter; De byggde broar mellan mål och metaboliter. Ytterligare molekylär dockning utfördes för att verifiera förhållandet mellan målet och ingredienserna. Resultaten av ingrediensdockning med CYP1A1 var följande: gallinsyra bildade fyra vätebindningar genom aminosyraresterna Asn-185, Tyr-187, Asn-219 och His-500 och bildade π-π staplingsinteraktion genom aminosyraresten Tyr-187 (figur 8A); quercetin bildade tre vätebindningar genom Asn-185, Asn-219 och His-500, hydrofob interaktion och π-π staplingsinteraktion genom Tyr-187 (figur 8B); beta-sitosterol bildade fyra vätebindningar genom Arg-362, Ser-363, Leu-365 och Arg-464 och hydrofob interaktion genom Glu-369 och Ile-439 (figur 8C). Bindningsenergierna var 5,3, 7,0 respektive 7,3 kcal/-mol. I interaktionen med AChE stabiliserades gallinsyra av vätebindningar med Arg-237, Arg-238 och Arg-480 (figur 8D); quercetin stabiliserades av vätebindningar med Arg-237 och Phe-474, genom hydrofob interaktion med Phe-157 och genom π-π staplingsinteraktion med Tyr-478 (figur 8E); beta-sitosterol stabiliserades genom hydrofob interaktion med Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 och TYR478 (figur 8F). Bindningsenergierna var 5,0, 6,5 respektive 8,0 kcal/- mol. I interaktionen med MGAM stabiliserades gallinsyra genom vätebindningar med Ile-1716, Gly-1747 och Trp-1749 och genom hydrofob interaktion med Tyr-1715 och Trp-1749 (figur 8G); quercetin stabiliserades av vätebindningar med Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 och Trp-1752, genom vätebindningar med Arg-1730 och genom π-π stapling med His-1727 (figur 8H); beta-sitosterol stabiliserades genom hydrofob interaktion med Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 och Phe-1560, Bindningsenergierna var 5,9, 8,1 respektive 6,9 kcal / mol. Detaljerad information om interaktioner och bindningsaffiniteter visas i tabell 4. Flera bindningsställen och höga bindningsenergier förklarar de höga affiniteterna mellan ingredienser och proteinmål, vilket verifierar att dessa ingredienser spelar rollen att sänka lipider genom att agera på hyperlipidemirelaterade mål.

Figure 1
Figur 1: Schematiskt flödesschema över den integrerade strategin. Hub-ingredienser och gener extraherades genom nätverksfarmakologi (del 1). Differentiella metaboliter av FP mot hyperlipidemi analyserades med plasma- och levermetabolomik (del 2). Viktiga mål, metaboliter och vägar identifierades och länkades baserat på en integrerad analys av del 1 och del 2 (del 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Målscreening, nätverkskonstruktion och anrikningsanalys av effekten av FP mot hyperlipidemi . (A) Venndiagram över FP-hyperlipidemimålen. (B) Potentiellt aktivt läkemedel-ingredienser-mål-sjukdomsnätverk: olika färgsymboler som nämns här: sjukdom (röd), läkemedel (blå), ingredienser (grön) och mål (gul). (C) PPI-nätverk av STRING. (D) Analys av anrikning av GO-vägar. (E) Analys av KEGG-väganrikning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Effekten av FP på plasmalipidnivåer och leverindex hos möss med HFD-inducerad hyperlipidemi (n = 6). a) TC-nivåer. b) Nivåer av LDL-C. (C) HDL-C-nivå. (D) TG-nivå. E) LDL-C/HDL-C-förhållandet. (F) Leverindex.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistiskt signifikanta skillnader utvärderades med hjälp av en enkelriktad ANOVA följt av Dunnetts multipla jämförelsetest eller post hoc-analys. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Effekten av FP på levervävnad hos möss med HFD-inducerad hyperlipidemi (H&E-färgning). (A,B) NC-grupp, (C,D) HFD-grupp, (E,F) FP_L-grupp, (G,H) FP_H-grupp, (I,J) PC-grupp (n = 6). Skalstapel: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: OPLS-DA-poängdiagram, värmekartor och metaboliska vägar för differentiella metaboliter. OPLS-DA-poängplottarna för FP på HFD-möss i plasma (A) och lever (B). Värmekartorna för differentiella metaboliter i plasma (C) och lever (D). De metaboliska vägarna för differentiella metaboliter i plasma (E) och lever (F). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Nätverk av föreningar-reaktion-enzym-gener för nyckelmetaboliter och mål. Låggradiga noder har tagits bort. De röda hexagonerna, blå cirklar, runda gröna rektanglar och grå diamanter representerar de aktiva föreningarna, generna, proteinerna respektive reaktionerna. De viktigaste målen och metaboliterna förstorades. Vägarna med den vita bakgrunden regleras signifikant i plasma. Vägen med den grå bakgrunden regleras signifikant i levern. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Nätverket ingredienser-mål-metaboliter-vägar. Ju mörkare färg, desto mer anslutna kanter, vilket betyder att noden är viktigare i detta nätverk. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Interaktionsdiagram över FP-ingredienser och de viktigaste målen . a) Gallinsyra med verkan på CYP1A1. b) Quercetin som verkar på CYP1A1. c) Betasitosterol med verkan på CYP1A1. d) Gallinsyra som verkar på AChE. (E) Quercetin som agerar på AChE. (F) Beta-sitosteroling agera på AChE. g) Gallinsyra med verkan på MGAM. h) Quercetin som agerar på MGAM. (I) Beta-sitosterol som verkar på MGAM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Översikt över FP mot hyperlipidemi resultat. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: De utvalda ingredienserna i FP vattenhaltigt extrakt. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Differentialmetaboliterna mellan de tre grupperna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Information om viktiga mål, metaboliter och spridningsvägar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Bindningsställen och verkningskrafter mellan FP-ingredienser och målproteiner. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande figur 1: Positiva och negativa jonkromatogram av FP-vattenextrakt. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: FP-nätverket för ingrediens-mål-väg-sjukdom av BATMAN-TCM. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: Frekvensanalys av navgener i nätverksfarmakologi. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: Jonkromatogram av plasma- och lever-QC-prover. De representativa positiva (A) och negativa (B) jonkromatogrammen i QC-prover i plasma. De representativa positiva (C) och negativa (D) jonkromatogrammen för lever-QC-prover. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5: PCA-poängdiagrammen för plasma (A) och lever (B) QC-prover. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 6: OPLS-DA-poängdiagrammen för plasma (A och B) och lever (C och D) prover. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 7: Venndiagram över differentialmetaboliterna i plasma (A) och lever (B) prover. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under de senaste åren har förekomsten av hyperlipidemi ökat, främst på grund av långvariga ohälsosamma matvanor. TCM och dess kemiska ingredienser har olika farmakologiska aktiviteter, som har studerats allmänt de senaste åren37,38. FP är en slags fruktresurs, som används både som medicin och mat, och har en viktig potential för behandling av hyperlipidemi. Den potentiella terapeutiska mekanismen för FP mot hyperlipidemi behöver dock studeras ytterligare.

Nätverksfarmakologi utvärderar läkemedelspolyfarmakologiska effekter på molekylär nivå och förutsäger interaktionen mellan naturliga produkter och proteiner för att bestämma huvudmekanismen39. Det första steget är att välja de aktiva ingredienserna och nyckelmålen för läkemedlet. I denna forskning hittades nio aktiva ingredienser och 62 navgener. För att ytterligare förstå den molekylära mekanismen för FP på hyperlipidemi etablerades PPI och ingrediens-målnätverk baserat på nätverksfarmakologisk analys. För att begränsa omfattningen av viktiga ingredienser och mål har tre viktiga ingredienser (gallinsyra, quercetin och beta-sitosterol) relaterade till hyperkolesterolemi och koronar ateroskleros grundats av BATMAN-TCM. Alla dessa ingredienser kan minska LDL-C-nivåer eller öka HDL-C-nivåer, validera de specifika effekterna av FP på hyperlipidemi. Dessutom, enligt KEGG-anrikningsanalys, är FP: s funktion på hyperlipidemi relaterad till aktiviteten hos lipid- och aterosklerosvägen. Även om denna metod beror för mycket på databasen och saknar experimentell verifiering, har den teoretiskt värde och ger idéer för efterföljande experimentell verifieringsforskning.

För ytterligare experimentell validering matades möss med en fettkompletterad diet i 8 veckor för att inducera hyperlipidemi. Resultaten visade att plasmanivåerna av TC, LDL-C och TG ökade signifikant. Även om nivån av HDL-C minskade signifikant, ökade förhållandet mellan LDL-C och HDL-C signifikant. De histopatologiska observationerna visade att levervävnaden hos HFD-möss var allvarligt skadad, men det fanns ingen signifikant ökning av leverindex; Det kan vara så att förändringar i kroppsvikt och visceral vikt tar längre tid. Lipiderna och leverförändringarna visade adekvat interventionseffekten av FP på hyperlipidemi. Den interna mekanismen för interventionseffekten behöver dock fortfarande undersökas ytterligare.

Metabolomik ger en lista över potentiella metaboliter och relaterade vägar, som syftar till att utforska mekanismen för metaboliska sjukdomar och verkan av terapeutiska läkemedel40. Resultatet av metabolomik kan påverkas av typen av prov. Med tanke på de patogena egenskaperna hos hyperlipidemi valdes plasma- och leverprover för metabonomisk analys i denna forskning. Enligt OPLS-DA-resultaten diskriminerades NC-, HFD- och FP_H-gruppernas metaboliter väl. Totalt 16 differentiella metaboliter hittades i plasma och 6 differentiella metaboliter hittades i levern. Det fanns fler påverkade metaboliter i plasma än i levern, vilket bevisar att blod är den huvudsakliga platsen för metabolisk störning inducerad av hyperlipidemi. FP-intervention kan vända förändringen av dessa metaboliter under påverkan av HFD. Dessutom importerades dessa differentiella metaboliter till KEGG-databasen. De signifikanta metaboliska vägarna för differentiella metaboliter i plasma var tryptofanmetabolism och i levern var taurin och hypotaurinmetabolism. I denna forskning ökade FP-interventionen innehållet av L-kynurenin av tryptofanmetabolism och taurininnehåll i taurin och hypotaurinmetabolism, vilket innebär att FP kan vara effektivt för att positivt justera metaboliska störningar och hyperlipidemi. Metabolomikanalysen avslöjade vilka metaboliter som var relaterade till hyperlipidemi eller FP-intervention och bestämde nedströmsmekanismen för FP-effekten.

Genom att kombinera resultatet av nätverksfarmakologi med metabolomik identifierades tre viktiga mål (CYP1A1, AChE och MGAM) i nätverken för substans-reaktion-enzym-gen. Enligt molekylär dockningsanalys visade dessa mål höga affiniteter med FP-ingredienser (gallinsyra, quercetin och beta-sitosterol). Fyra metaboliter (L-kynurenin, kortikosteron, acetylkolin och raffinos) och fyra relaterade vägar (tryptofanmetabolism, steroidhormonbiosyntes, glycerofosfolipidmetabolism och galaktosmetabolism) identifierades som nyckelmetaboliter och metaboliska vägar. Bland dessa var quercetin associerat med de flesta målen, och tryptofanmetabolism uppträdde i både metabonomik och integrerade resultat. De spelar den viktigaste rollen i den terapeutiska effekten av FP mot hyperlipidemi. Molekylära dockningsresultat visade att CYP1A1, AChE och MGAM har hög affinitet med ingredienser. Ovanstående resultat visar att dessa screenade mål är nära relaterade till den terapeutiska effekten av FP.

I den aktuella forskningen identifierades gallinsyra, quercetin och beta-sitosterol som FP-aktiva ingredienser mot antihyperlipidemi, och tryptofanmetabolism är den huvudsakliga metaboliska vägen för FP-terapi hos HFD-möss. Översikten över resultatet visas i figur 9. Denna forskning erbjöd data och teoretiskt stöd för vidare studier av mekanismer och gav en grund för klinisk tillämpning av FP-medicin. Det visade sig också att naturlig mat kan vara ett lovande alternativ med stora utsikter i klinisk praxis. Det finns dock fortfarande vissa brister i denna forskning. Den terapeutiska effekten av den aktiva ingrediensen ensam på hyperlipidemi har inte verifierats. Dessutom har vägen för viktiga mål inte studerats. Det behöver också ytterligare systematiska molekylärbiologiska experiment för att verifiera den exakta mekanismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författare förklarar att de inte har någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av produktutvecklings- och innovationsteamet för TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) och Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
101-3B Oven Luyue Instrument and Equipment Factory \
80312/80302 Glass Slide Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD \
80340-1630 Cover Slip Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD \
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) Thermo Fisher Scientific \
Acetonitrile Fisher Chemical A998 Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) Thermo Fisher Scientific \
Aethanol Fisher Chemical A995 Version 3.0
Ammonia Solution Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1336-21-6 Version 3.9.1
AutoDockTools Scripps Institution of Oceanography \
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. \
Compound Discoverer Thermo Fisher Scientific \
Cytoscape Cytoscape Consortium \
DM500 Optical Microscope Leica \
DV215CD Electronic Balance Ohaus Corporation ., Ltd T15A63
Ethyl Alcohol Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 64-17-5
Formic Acid Fisher Chemical A118
HDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A112-1-1
Hematoxylin Staining Solution Biosharp BL700B
High Fat Diet ENSIWEIER 202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge Hitachi., Ltd. \
Homogenizer Oulaibo Technology Co., Ltd \
Hydrochloric Acid Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 7647-01-0
Image-forming System LIOO \
JB-L5 Freezer Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JB-L5 Tissue Embedder Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JK-5/6 Microtome Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
JT-12S Hydroextractor Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd \
KQ3200E Ultrasonic Cleaner Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd \
LDL-C Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A113-1-1
Male C57BL/6 Mice  SBF Biotechnology Co., Ltd. \ Version 2.3.2
Neutral Balsam Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd 10021190865934
Pure Water Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd GB19298
PyMOL DeLano Scientific LLC \ Version 14.1
RE-3000 Rotary Evaporator Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd \
RM2016 Pathological Microtome Shanghai Leica Instruments Co., Ltd \ Version 26.0
SIMCA-P Umetrics AB \
Simvastatin Merck Sharp & Dohme., Ltd 14202220051
SPSS International Business Machines Corporation \
TC Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A111-1-1
TG Assay Kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry Thermo Fisher Scientific \
Vortex Vibrator Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. LC-Vortex-P1
Xylene Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504 (2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).

Tags

Indragning utgåva 194
Nätverksfarmakologi Prediktion och metabolomik Validering av mekanismen för Fructus Phyllanthi mot hyperlipidemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N.,… More

Zeng, B., Qi, L., Wu, S., Liu, N., Wang, J., Nie, K., Xia, L., Yu, S. Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia. J. Vis. Exp. (194), e65071, doi:10.3791/65071 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter