Summary
Le présent protocole décrit une stratégie intégrée pour explorer les cibles et mécanismes clés de Fructus Phyllanthi contre l’hyperlipidémie basée sur la prédiction pharmacologique en réseau et la vérification métabolomique.
Abstract
L’hyperlipidémie est devenue l’un des principaux facteurs de risque de maladies cardiovasculaires et de lésions hépatiques dans le monde entier. Fructus Phyllanthi (FP) est un médicament efficace contre l’hyperlipidémie dans les théories de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) et de la médecine indienne, mais le mécanisme potentiel nécessite une exploration plus approfondie. La présente recherche vise à révéler le mécanisme de la PF contre l’hyperlipidémie en s’appuyant sur une stratégie intégrée combinant la prédiction de la pharmacologie des réseaux et la validation métabolomique. Un modèle de souris induites par un régime riche en graisses (HFD) a été établi en évaluant les taux de lipides plasmatiques, y compris le cholestérol total (TC), les triglycérides (TG), le cholestérol à lipoprotéines de basse densité (LDL-C) et le cholestérol à lipoprotéines de haute densité (HDL-C). La pharmacologie de réseau a été appliquée pour découvrir les ingrédients actifs de la PF et les cibles potentielles contre l’hyperlipidémie. La métabolomique du plasma et du foie a été réalisée pour identifier les métabolites différentiels et leurs voies correspondantes parmi le groupe normal, le groupe modèle et le groupe d’intervention. La relation entre la pharmacologie de réseau et la métabolomique a été construite pour obtenir une vue complète du processus de PF contre l’hyperlipidémie. Les protéines cibles clés obtenues ont été vérifiées par amarrage moléculaire. Ces résultats ont montré que la PF améliorait les taux de lipides plasmatiques et les lésions hépatiques de l’hyperlipidémie induite par une HFD. L’acide gallique, la quercétine et le bêta-sitostérol dans la PF ont été démontrés comme les composés actifs clés. Un total de 16 et six métabolites différentiels potentiels dans le plasma et le foie, respectivement, se sont révélés impliqués dans les effets thérapeutiques de la PF contre l’hyperlipidémie par métabolomique. En outre, l’analyse d’intégration a indiqué que les effets de l’intervention étaient associés au CYP1A1, à l’AChE et au MGAM, ainsi qu’à l’ajustement de la L-kynurénine, de la corticostérone, de l’acétylcholine et du raffinose, impliquant principalement la voie métabolique du tryptophane. L’amarrage moléculaire a permis de s’assurer que les ingrédients ci-dessus agissant sur les cibles protéiques liées à l’hyperlipidémie jouaient un rôle clé dans la réduction des lipides. En résumé, cette recherche a fourni une nouvelle possibilité pour prévenir et traiter l’hyperlipidémie.
Introduction
L’hyperlipidémie est une maladie métabolique courante ayant de graves répercussions sur la santé humaine et constitue également le principal facteur de risque de maladies cardiovasculaires1. Récemment, il y a eu une tendance à la baisse liée à l’âge pour cette maladie, et les jeunes sont devenus plus sensibles en raison de modes de vie irréguliers à long terme et d’habitudes alimentaires malsaines2. En clinique, divers médicaments ont été utilisés pour traiter l’hyperlipidémie. Par exemple, l’un des médicaments les plus couramment utilisés pour les patients atteints d’hyperlipidémie et de troubles athérosclérotiques connexes est les statines. Cependant, l’utilisation à long terme des statines a des effets secondaires qui ne peuvent pas être négligés, ce qui conduit à un mauvais pronostic, tels que l’intolérance, la résistance au traitement et les événements indésirables 3,4. Ces lacunes sont devenues des douleurs supplémentaires pour les patients hyperlipidémiques. Par conséquent, de nouveaux traitements pour une efficacité hypolipidémiante stable et moins d’effets secondaires devraient être proposés.
La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a été largement utilisée pour traiter les maladies en raison de sa bonne efficacité et de ses effets secondairespeu 5. Fructus Phyllanthi (FP), le fruit séché de Phyllanthus emblica Linn. (populairement connu sous le nom de baie d’amla ou groseille à maquereau indienne), est un médicament célèbre et un matériau homologue alimentaire des médecines traditionnelles chinoises et indiennes 6,7. Ce médicament a été utilisé pour éliminer la chaleur, refroidir le sang et favoriser la digestion, selon les théories de la MTC8. Des études pharmacologiques modernes ont montré que la PF est riche en composés bioactifs tels que les acides galliques, les acides ellagiques et la quercétine9, qui sont responsables d’une gamme de propriétés biologiques multiformes, en agissant comme antioxydant, anti-inflammatoire, protection du foie, antihypolipidémique, etc.10. Des recherches récentes ont également montré que la PF pouvait réguler efficacement les lipides sanguins des patients atteints d’hyperlipidémie. Par exemple, Variya et al.11 ont démontré que le jus de fruit FP et son principal ingrédient chimique de l’acide gallique peuvent diminuer le cholestérol plasmatique et réduire l’infiltration d’huile dans le foie et l’aorte. L’efficacité thérapeutique était liée à la régulation de la PF dans l’augmentation de l’expression du récepteur alpha activé par les proliférateurs de peroxysomes et la diminution de l’activité lipogénique hépatique. Cependant, le mécanisme sous-jacent de la PF dans l’amélioration de l’hyperlipidémie devrait être étudié plus avant, car ses ingrédients bioactifs sont assez étendus. Nous avons cherché à explorer le mécanisme potentiel de l’efficacité thérapeutique de la PF, qui pourrait être bénéfique pour le développement et l’utilisation ultérieurs de ce médicament.
Actuellement, la pharmacologie en réseau est considérée comme une technique holistique et efficace pour étudier le mécanisme thérapeutique de la MTC. Au lieu de rechercher des gènes et des médicaments uniques causant la maladie traitant uniquement une cible individuelle, un réseau complet médicament-ingrédients-gènes-maladies est construit pour trouver le mécanisme multi-cible du médicament multi-ingrédients concernant leur traitement complet12. Cette technique est particulièrement adaptée à la MTC, car leurs compositions chimiques sont massives. Malheureusement, la pharmacologie de réseau ne peut être utilisée que pour prévoir les cibles affectées par les ingrédients chimiques en théorie. Les métabolites endogènes dans le modèle de maladie doivent être observés pour valider l’efficacité de la pharmacologie en réseau. La méthode métabolomique, qui émerge avec le développement de la biologie des systèmes, est un outil important pour surveiller les changements dans les métabolites endogènes13. Les changements dans les métabolites reflètent les changements d’état stationnaire de l’hôte, ce qui est également un indicateur important pour étudier le mécanisme interne. Certains chercheurs ont intégré avec succès la pharmacologie et la métabolomique en réseau pour explorer le mécanisme d’interaction entre les médicaments et les maladies14,15.
Cet article explore les bases mécanistes de la PF contre l’hyperlipidémie en intégrant la pharmacologie en réseau et les techniques de métabolomique. La pharmacologie de réseau a été appliquée pour analyser la relation entre les principaux ingrédients actifs de la PF et les cibles moléculaires de l’hyperlipidémie. Par la suite, la métabolomique a été réalisée pour observer le changement des métabolites endogènes dans le modèle animal, ce qui peut expliquer les actions du médicament au niveau métabolique. Par rapport à l’application de la pharmacologie de réseau ou de la métabonomique seule, cette analyse intégrée a fourni un mécanisme de recherche plus spécifique et plus complet. De plus, la stratégie d’amarrage moléculaire a été utilisée pour analyser l’interaction entre les ingrédients actifs et les protéines clés. En général, cette approche intégrée pourrait compenser le manque de preuves expérimentales pour la pharmacologie des réseaux et l’absence d’un mécanisme endogène pour la méthode métabolomique, et peut être utilisée pour l’analyse du mécanisme thérapeutique de la médecine naturelle. L’organigramme schématique principal du protocole est illustré à la figure 1.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant la manipulation des animaux ont été menées conformément au Guide de soins et d’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu et ont été approuvées par le Comité d’éthique institutionnel de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (protocole numéro 2020-36). Des souris C57BL/6 mâles (20 ± 2 g) ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
1. Prédiction basée sur la pharmacologie en réseau
REMARQUE: La pharmacologie du réseau est utilisée pour prédire les ingrédients actifs et leurs principales cibles de PF contre l’hyperlipidémie.
- Sélection des ingrédients actifs et des cibles clés
- Recherchez le mot-clé « Phyllanthi Fructus » dans la base de données pharmacologiques du système de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) pour obtenir la liste des ingrédients actifs candidats et des cibles de la PF.
REMARQUE : Normalement, seuls les ingrédients ayant une biodisponibilité orale (BO) ≥30 % et des valeurs semblables à celles d’un médicament (DL) ≥0,18 dans la base de données sont inclus comme ingrédients actifs. - Recherchez le mot-clé « hyperlipidémie » dans la base de données GeneCards (https://www.genecards.org/), la base de données Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM; https://omim.org/) et la base de données de cibles thérapeutiques (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) pour obtenir les cibles candidates respectives de l’hyperlipidémie. Téléchargez les feuilles de calcul des cibles de la maladie. Supprimer les cibles répétées pour obtenir la liste des cibles d’hyperlipidémie.
- Copiez ces listes des étapes 1.1.1 et 1.1.2 dans une nouvelle feuille de calcul. Utilisez la fonction « Données - Identifier les doublons » de la barre d’outils pour obtenir des cibles d’intersection. Importez la liste des cibles d’intersection dans UniProtKB (http://www.uniprot.org/) pour normaliser les noms des gènes et des protéines.
REMARQUE: Ces cibles sont liées à la fois à la PF et à l’hyperlipidémie. Par conséquent, prédire ces cibles d’intersection comme cibles de la PF contre l’hyperlipidémie.
- Recherchez le mot-clé « Phyllanthi Fructus » dans la base de données pharmacologiques du système de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) pour obtenir la liste des ingrédients actifs candidats et des cibles de la PF.
- Construction d’un réseau d’interaction protéine-protéine
- Ouvrez la base de données STRING (https://string-db.org/) 11.5. Collez la liste des cibles d’intersection de FP contre l’hyperlipidémie dans la boîte de dialogue « Liste des noms ». Sélectionnez Homo sapiens dans « Organismes » et cliquez sur le bouton RECHERCHER > CONTINUER.
REMARQUE: Les humains et les souris ont des gènes très similaires. Par conséquent, une vérification expérimentale supplémentaire est effectuée avec des souris. - Lorsque les résultats sont disponibles, cochez la case Masquer les nœuds déconnectés du réseau dans « Paramètres avancés ». Définissez la confiance la plus élevée (0,900) dans le « score d’interaction minimum requis », puis cliquez sur le bouton METTRE À JOUR .
- Cliquez sur Exportations dans la barre de titre et téléchargez le court texte tabulaire du réseau d’interaction protéine-protéine (PPI) au format PNG et TSV.
- Ouvrez la base de données STRING (https://string-db.org/) 11.5. Collez la liste des cibles d’intersection de FP contre l’hyperlipidémie dans la boîte de dialogue « Liste des noms ». Sélectionnez Homo sapiens dans « Organismes » et cliquez sur le bouton RECHERCHER > CONTINUER.
- Construction d’un réseau médicament-composant-maladie-cible
- Ouvrez Cytoscape 3.9.1 (voir le tableau des matériaux). Importez le fichier au format TSV de l’étape 1.2.3. Optimisez la couleur, la police et le côté des nœuds réseau via la barre de style du panneau de configuration.
- Utilisez la fonction « Analyser le réseau » pour l’analyse de la topologie du réseau. Obtenir des gènes de hub par CytoHubba dans Cytoscape. Établir le réseau médicament-ingrédient-cible-maladie.
- Analyse d’enrichissement GO et KEGG
- Ouvrez DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Cliquez sur Démarrer l’analyse et collez la liste des cibles dans la boîte de dialogue de gauche. Sélectionnez SYMBOLE OFFICIEL DU GÈNE dans « Sélectionner l’identifiant ». Sélectionnez Homo sapiens dans « Sélectionner une espèce ». Liste des gènes de tiques dans « Type de liste ». Cliquez sur Soumettre la liste.
- Lorsque les résultats sont disponibles, cliquez sur Analyser la liste des gènes ci-dessus avec l’un des outils DAVID. Tick GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT dans « Gene Ontology » pour l’analyse de l’enrichissement de la fonction GO. Cochez KEGG_Pathway dans « Voies » pour l’analyse de l’enrichissement des voies KEGG.
- Cliquez sur Tableau d’annotation fonctionnel pour afficher les résultats.
REMARQUE : Définissez le seuil de signification statistique de l’analyse d’enrichissement à p < 0,05.
2. Conception expérimentale
- La préparation d’extrait aqueux FP
NOTE: La PF est traitée dans le laboratoire du professeur Lina Xia à l’Université de Chengdu de TCM8.- Faire tremper la poudre séchée de FP (90 g) dans 1 L d’eau pure dans une fiole jaugée propre de 2 L. Utilisez un traitement par ultrasons (au bain-marie à 4 °C, puissance: 250W, fréquence: 35 kHz) pour aider à dissoudre pendant 30 min. Filtrer la solution pour obtenir l’extrait avec une gaze médicale stérile à double couche de 1 mm x 1 mm. Répétez l’opération ci-dessus trois fois pour assurer la dissolution complète de FP.
- Utilisez la méthode d’évaporation rotative pour une concentration supplémentaire. Réglez la vitesse de rotation à 50 tr/min avec une température de 60 °C pendant 4 h. Concentrer l’extrait aqueux à 100 mL.
- Répartir uniformément l’extrait brut de PF (0,9 g/mL) en deux parties (50 mL). Une partie est utilisée comme liquide FP à forte dose (0,9 g/mL). Ajouter 50 mL d’eau pure dans une autre partie et la considérer comme le liquide FP à faible dose (0,45 g / mL). Utilisez les solutions aqueuses FP à forte et faible dose pour l’administration. Conserver le liquide à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Préparation des animaux
- Hébergez 50 souris C57BL/6 mâles (20 ± 2 g) dans une pièce bien ventilée à température ambiante, avec un cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès gratuit à la nourriture et à l’eau pure.
- Assignez au hasard les souris à deux groupes: nourrir 10 souris avec un régime alimentaire normal et 40 souris avec un régime riche en graisses (voir le tableau des matériaux) pour induire une hyperlipidémie.
REMARQUE: Après avoir nourri pendant 8 semaines, les souris ont été examinées pour une intervention médicamenteuse supplémentaire. - Au cours de la 8e semaine, prélevez environ 200 μL de sang de chaque orbite de souris. Centrifuger le sang pendant 10 min à 5 733 x g à 4 °C pour obtenir des échantillons de plasma. Déterminer les niveaux de CT et de TG à l’aide de trousses d’essai disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
- Sélectionnez six souris avec les niveaux de lipides les plus normaux comme groupe témoin sans traitement (NC). Sélectionnez 24 souris avec un taux de lipides significativement plus élevé comme groupe de régime riche en graisses et divisez-les au hasard en quatre groupes: groupe régime riche en graisses (HFD), groupe PF à faible dose (FP_L), groupe PF à forte dose (FP_H) et groupe témoin positif (PC).
- Administrer une irrigation gastrique aux groupes FP_L et FP_H avec deux doses de PF (faible dose, 4,5 g / kg et dose élevée, 9 g / kg), respectivement; irrigation gastrique vers le groupe PC avec des comprimés de simvastatine (5 mg/kg; voir tableau des matières); et l’irrigation gastrique vers les groupes NC et HFD avec le même volume de solution saline physiologique une fois par jour pendant 4 semaines.
NOTE: L’étude actuelle a utilisé les solutions aqueuses de PF et de simvastatine pour le traitement. - Dans la 12ème semaine, après anesthésie par 1% de pentobarbital sodique (30 mg / kg), sacrifiez les souris de tous les groupes. Prélever des échantillons de sang de ~400 μL dans la veine orbitaire de chaque souris.
REMARQUE: Stimulez les orteils et la plante des souris avec une pince à épiler. S’il n’y a pas de réaction, cela prouve une anesthésie adéquate. - Centrifuger le sang pendant 10 minutes à 5 733 x g à 4 °C pour obtenir des échantillons de plasma et déterminer les taux de TC, TG, LDL-C et HDL-C à l’aide de trousses de dosage disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Obtenir des échantillons de tissus hépatiques16 et les soumettre à une analyse histopathologique. Utilisez les échantillons de plasma et de foie restants pour l’analyse métabolomique (étape 3).
NOTE: Tous les échantillons sont conservés à -80 ° C jusqu’à utilisation.
- Examen histopathologique du foie
- Fixer les tissus frais du foie avec une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant plus de 24 h. Retirez le tissu du fixateur et lissez les tissus cibles avec un scalpel. Placez le mouchoir et l’étiquette correspondante dans le déshydrateur.
- Déshydrater dans un gradient d’éthanol : 75% d’alcool pendant 4 h, 85% d’alcool pendant 2 h, 90% d’alcool pendant 2 h, 95% d’alcool pendant 1 h, éthanol absolu pendant 1 h, xylène pendant 30 min. Placer la cassette de tissu dans un moule en tissu dans de la cire de paraffine pendant trois lavages, 30 min chacun16.
- Mettez les mouchoirs imbibés de cire dans l’encastrement de tissu (voir le tableau des matériaux). Avant que la cire ne se solidifie, retirez les tissus du déshydrateur, placez-les dans la boîte intégrée et collez l’étiquette correspondante.
- Refroidissez les blocs de cire dans une table de congélation à -20 °C, retirez-les du cadre encastré et coupez le bloc de cire.
- Couper les blocs de cire coupés en sections de 3 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome (voir le tableau des matériaux). Faire flotter les sections dans de l’eau à 40 °C, les retirer des lames et les cuire dans un four à 60 °C. Après avoir cuit avec de l’eau et de la cire sèche, sortez-le et conservez-le à température ambiante.
- Placer successivement les sections dans le xylène I pendant 10 min, le xylène II pendant 10 min, le xylène III pendant 10 min, l’éthanol absolu I pendant 5 min, l’éthanol absolu II pendant 5 min, l’alcool à 75% pendant 5 min, et laver à l’eau16.
- Colorer les sections avec une solution de coloration à l’hématoxyline pendant 4 min, une solution d’alcool d’acide chlorhydrique à 1% (alcool à 75%) pour la différenciation, une solution d’eau ammoniacale à 1% en bleu et les laver à l’eau.
- Colorer les sections avec une solution de coloration à l’éosine pendant 2 min et les laver à l’eau.
- Observez les coupes à l’aide d’un microscope optique avec un grossissement de 200x et 400x.
- Chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) analyse
- Identification des ingrédients de la PF
REMARQUE : L’analyse est effectuée à l’aide d’une chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à une spectrométrie de masse hybride quadripôle-orbitrap à haute résolution (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; voir le tableau des matériaux).- Mesurer précisément 1 g de poudre séchée de FP et la mettre dans une fiole jaugée propre de 50 mL.
- Ajouter 25 ml de méthanol à 70 % dans la fiole jaugée et peser avec précision. Utiliser un traitement par ultrasons (au bain-marie à 4 °C, puissance : 250 W, fréquence : 35 kHz) pendant 30 min pour faciliter la dissolution. Pesez à nouveau avec précision pour déterminer avec précision la perte après dissolution et utilisez 70% de méthanol pour compenser la perte.
NOTE: Ne mesurez pas le volume, car l’échelle de la fiole jaugée n’est pas précise, surtout après le bain-marie à 4 ° C. - Secouer pour bien mélanger. Utilisez une membrane microporeuse de 0,22 μm pour filtrer.
- Préparation d’échantillons de plasma
- Ajouter précisément 100 μL de plasma (étape 2.2.7) dans un double volume (200 μL) d’acétonitrile dans un tube centrifuge de 1,5 mL, et le vorter avec un vibrateur vortex pendant au moins 30 s. Suivez cette procédure pour tous les échantillons.
- Centrifuger tous les échantillons à 17 200 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférer les surnageants après centrifugation dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL. Sécher les surnageants sous azote. Reconstituer avec 200 μL de solvant d’extraction (acétonitrile:eau = 4:1 [v/v]).
- Faire tourbillonner la solution reconstituée pendant au moins 30 s et utiliser un traitement par ultrasons pendant 10 min (au bain-marie à 4 °C, puissance : 250 W, fréquence : 35 kHz). Centrifuger à 17 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Filtrer les surnageants avec des membranes filtrantes de 0,22 μm et les maintenir à 4 °C pour analyse.
- Préparation d’échantillons de foie
- Homogénéiser 90 mg de tissu hépatique (étape 2.2.7) pendant 1 min dans du méthanol-eau glacée (1:1, v/v, 1 mL) et les centrifuger à 21 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans des tubes centrifugés de 1,5 mL. Suivez cette procédure pour tous les échantillons.
- Extraire à nouveau les précipités en suivant la même procédure et regrouper les surnageants dans de nouveaux tubes à centrifuger de 1,5 mL. Sécher les surnageants sous azote. Reconstituer avec 300 μL du solvant d’extraction (méthanol:eau = 4:1 [v/v]).
- Faire tourbillonner la solution reconstituée pendant au moins 30 s et utiliser un traitement par ultrasons pendant 10 min (au bain-marie à 4 °C, puissance : 250 W, fréquence : 35 kHz). Centrifuger à 17 200 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Filtrer les surnageants avec des membranes filtrantes de 0,22 μm et les maintenir à 4 °C pour analyse.
REMARQUE : Les échantillons groupés de contrôle de la qualité (CQ) ont été préparés en mélangeant 10 μL d’aliquotes provenant de chaque échantillon de plasma et de foie (un échantillon pour six).
- Paramètres d’analyse de LC-MS
NOTE: La phase mobile se compose de 0,1% d’acide formique (solvant A) et d’acétonitrile (solvant B). Transférez ces solvants dans une bouteille en verre propre et connectez-les au système LC-MS.- Réglez les programmes de gradient des échantillons de plasma dans le « fichier d’entrée » du système LC-MS comme suit : 1 % B (0-1,5 min), 1 %-60 % B (1,5-13,0 min), 60 %-99 % B (13,0-20,0 min), maintenir à 99 % B (20,0-25,0 min), 99 %-1 % B (25,0-25,1 min) et maintenir à 1 % B jusqu’à 27 min.
- Réglez les conditions de l’échantillonneur automatique des échantillons de plasma dans le « fichier d’entrée » du système LC-MS comme suit : le volume d’injection, 2 μL ; et le débit, 0,3 mL/min, pour chaque analyse.
- Définir le programme de gradient des échantillons de foie dans le « fichier d’entrée » du système LC-MS comme suit : 1 % B (0-1 min), 1 %-53 % B (1-15 min), 53 %-70 % B (15-30 min), 70 %-90 % B (30-32 min), 90 %-95 % B (32-40 min), 95 %-1 % B (40-42 min), et maintenir à 1 % B jusqu’à 45 min.
- Réglez les conditions de l’échantillonneur automatique des échantillons de foie dans le « fichier d’entrée » du système LC-MS comme suit : volume d’injection, 5 μL; et le débit, 0,3 mL/min, pour chaque analyse.
- Réglez les conditions de détection de la SEP des échantillons de plasma et de foie dans le « fichier de réglage MS » du système LC-MS. Effectuez l’acquisition MS en utilisant les modes d’ionisation positive et négative.
NOTE: Les paramètres d’ionisation par électropulvérisation chauffée sont les suivants: tension de pulvérisation: 3,5 kV pour l’ionisation positive et 3,8 kV pour l’ionisation négative; Débit de gaz de gaine: 55 arb; débit de gaz auxiliaire: 15 arb; température du chauffage de la sonde: 300 °C; et température capillaire : 350 °C. - Importez les données brutes collectées dans le logiciel Compound Discoverer et définissez le modèle de méthode en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Identification des ingrédients de la PF
3. Validation métabolomique
REMARQUE: Les données de profilage métabolomique des métabolites plasmatiques et hépatiques sont importées dans le logiciel Compound Discoverer pour effectuer l’extraction des caractéristiques métaboliques en adoptant un algorithme d’extraction de caractéristiques moléculaires. Réglez les paramètres comme suit: écart de masse, 5 x 10-6; gamme de masse, 100-1 500; seuil du rapport signal sur bruit (SNR), 3; et écart de temps de rétention, 0,05. Évaluer la stabilité et la répétabilité de la métabolomique par l’écart-type relatif (DSR) des zones de pics de CQ.
- Utiliser le logiciel SIMCA-P (voir le tableau des matières) pour l’analyse statistique multivariée des valeurs intégrales obtenues à partir des résultats de la LC-MS. Utiliser l’analyse discriminante des moindres carrés partiels orthogonaux (OPLS-DA) pour les données centrées sur la moyenne et la modélisation des classes d’échantillons.
- Après le test OPLS-DA, considérez les métabolites, avec une importance intégrale variable dans les valeurs de projection (VIP) de >1 et une valeur p de <0,05 du test t de Student comme métabolites différentiels potentiels.
- Identifier les métabolites perturbés et les voies métaboliques par des sources de bases de données ouvertes, y compris Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) et MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
- Visualisez les vues des résultats par MetaboAnalyst5.0 et la plateforme 'Wu Kong' (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).
4. Amarrage moléculaire
- Téléchargez la structure 3D des ingrédients PF sélectionnés à partir de la base de données TCMSP, respectivement. Recherchez les noms des ingrédients dans le champ de recherche « Nom chimique » et téléchargez les fichiers de structure 3D correspondants au format mol2.
- Téléchargez les structures cristallines des cibles clés à partir de la base de données AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Recherchez les noms des cibles dans la zone de recherche et téléchargez les fichiers de structures cristallines correspondants au format pdb.
- Importez le fichier des ingrédients et des structures cibles dans le logiciel AutoDockTools. Cliquez sur Modifier > Supprimer l’eau pour supprimer les molécules d’eau. Cliquez sur Modifier > Hydrogènes > Ajouter pour ajouter des hydrogène. Définissez les ingrédients comme « ligand » et effectuez un amarrage aveugle en sélectionnant les cibles entières comme « récepteur »17.
- Entrez une valeur dans la case derrière « centre » et « taille » pour ajuster l’espace nouvellement développé, ce qui permet d’englober complètement le ligand et le récepteur. Enregistrez les fichiers de ligand et de récepteur au format pdbqt.
- Utilisez AutoDock Vina pour effectuer un amarrage moléculaire. Définissez la barre « Receptor » sur le nom du 'receptor.pdbqt', et la barre « Ligand » sur le nom du 'ligand.pdbqt'. Obtenir l’emplacement optimal pour la liaison du ligand au récepteur. Enregistrez la valeur de l’énergie de liaison à la position optimale.
REMARQUE: Le processus d’amarrage a été calculé par l’algorithme génétique14. Toutes les options d’exécution de l’ancrage étaient des valeurs par défaut. Les cadres d’amarrage seront automatiquement classés de l’énergie de liaison la plus élevée à la plus faible. - Importez les fichiers d’ancrage dans PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) pour obtenir le modèle visuel du système. Téléchargez les fichiers de modèle au format pse et importez-les dans le logiciel PyMOL (voir le tableau des matériaux) pour construire une visualisation plus poussée.
5. Analyse statistique
REMARQUE : Utilisez le logiciel statistique SPSS (voir le tableau des matières) pour l’analyse des données. Considérez la valeur de p < 0,05 comme statistiquement significative.
- Exprimer les valeurs sous forme de moyennes ±écart type (ET).
- Effectuer une ANOVA unidirectionnelle suivie de la différence la moins significative (LSD) post-hoc, de Dunnett (en cas de variance égale) ou de la T3 de Dunnett (en cas de variance inégale) pour tester la signification statistique entre les groupes.
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Representative Results
Pharmacologie de réseau
Au total, 18 ingrédients potentiels dans la PF ont été examinés en fonction de leurs propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques à partir de la base de données et de l’analyse LC-MS (les chromatogrammes ioniques totaux sont présentés dans la figure supplémentaire 1). Grâce à la littérature pertinente, la teneur en acide gallique est beaucoup plus élevée que les autres ingrédients et est efficace pour abaisser les lipides 9,11. Par conséquent, cet ingrédient a également été considéré comme un ingrédient potentiel. Au total, 19 ingrédients et 134 cibles liées aux ingrédients de la PF ont été fondés. Les 19 ingrédients sont présentés dans le tableau 1. Pour sélectionner les ingrédients les plus représentatifs pour une analyse plus approfondie, ces ingrédients ont été importés dans la base de données Bioinformatics Analysis Tool for Molecular MechANism of Traditional Chinese Medicine (BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/). Selon le réseau ingrédient-voie-cible-maladie, certains ingrédients bioactifs, tels que l’acide gallique, la quercétine et le bêta-sitostérol, ont été identifiés comme les ingrédients les plus importants de la PF liée à l’hypercholestérolémie et à l’athérosclérose coronarienne (Figure supplémentaire 2). Parmi ceux-ci, l’acide gallique est l’un des acides phénoliques les plus étudiés; c’est le principal ingrédient bioactif présenté dans le18e PC. Pendant ce temps, l’acide gallique est également l’ingrédient le plus riche en FP; Sa concentration est généralement de 1% à 3%. El-Hussainy et al.19 ont révélé que l’acide gallique peut limiter les lésions cardiaques, améliorer le profil lipidique et réguler à la baisse les marqueurs inflammatoires cardiaques. Les teneurs en quercétine et en bêta-sitostérol sont plus faibles, mais certaines études ont prouvé leur effet sur la réduction des lipides. La quercétine, en tant que flavonoïde important qui existe largement dans les plantes, possède diverses propriétés, telles que des effets antioxydants, anti-inflammatoires et de protection cardiovasculaire20. Lu et coll.21 ont étudié que le jus enrichi en quercétine peut atténuer les taux de TC, LDL-C et HDL-C chez les personnes en bonne santé atteintes d’hypercholestérolémie légère. En ce qui concerne le bêta-sitostérol, des études cliniques ont montré que le stérol végétal peut prévenir de manière significative l’hypercholestérolémie et les maladies cardiovasculaires22,23. Althwab et coll.24ont prouvé que le bêta-sitostérol pouvait améliorer le profil lipidique et l’indice athérogène chez les rats HFD. On peut voir que l’effet hypolipidémiant de la PF peut être lié à ces trois ingrédients.
De plus, 1 552 cibles liées à l’hyperlipidémie à partir des bases de données Genecards, OMIM et TTD ont été collectées. Après avoir apparié les 134 cibles liées à la PF avec les cibles liées à l’hyperlipidémie, 62 cibles ont été identifiées comme cibles potentielles de PF contre l’hyperlipidémie (Figure 2A). Toutes les cibles croisées ont été normalisées à leurs symboles officiels, selon la base de données UniProt. Par la suite, le réseau PPI a été construit par STRING (Figure 2B) et Cytoscape (Figure 2C). En combinant les scores des méthodes de calcul, les 10 principales cibles étaient ESR1, RELA, FOS, EGFR, HIF1A, AR, CCND1, IL6, MAPK8 et MYC. Les détails sont présentés dans la figure supplémentaire 3. Toutes ces 62 cibles sont la base d’une analyse plus approfondie, qui est intégrée aux résultats de la métabonomique.
Les voies GO et KEGG ont été réalisées par analyse d’enrichissement. Les 15 principales voies, en fonction du nombre de cibles, ont été sélectionnées pour l’analyse en fonction de la valeur p. Les résultats de l’enrichissement en GO suggèrent que les processus biologiques et la fonction moléculaire de la PF contre l’hyperlipidémie étaient principalement liés à l’expression génique et à la liaison aux protéines (Figure 2D). L’enrichissement de KEGG a prouvé que la PF pouvait intervenir dans le processus du métabolisme des lipides et de l’athérosclérose (Figure 2E), ce qui signifie que la PF soulage l’hyperlipidémie en affectant le métabolisme des lipides.
L’effet de la PF sur les taux de lipides plasmatiques et l’indice hépatique
Pour tester l’effet amélioré de la PF sur l’hyperlipidémie, les changements dans TC, TG, LDL-C, HDL-C et l’indice hépatique (le rapport entre le poids du foie et le poids corporel) ont d’abord été mesurés. Par rapport au groupe NC, les souris du groupe HFD ont montré une augmentation significative des taux plasmatiques de TC (p < 0,001), LDL-C (p < 0,001) et TG (p < 0,05), indiquant qu’une intervention HFD à long terme peut augmenter les taux de lipides et induire une hyperlipidémie (Figure 3).
Après administration d’extrait aqueux de PF, les niveaux de CT dans les groupes FP_L et FP_H ont été significativement réduits (p < 0,05) de 18,8% et 12,4%, respectivement (Figure 3A). Les niveaux de LDL-C dans les groupes FP_L et FP_H ont été significativement réduits (p < 0,05) de 13,7% et 21,8%, respectivement (Figure 3B). En ce qui concerne le taux de HDL-C, le groupe FP_H a augmenté significativement (p < 0,01) de 1,81 ± 0,08 mmol / L à 2,65 ± 0,16 mmol / L, par rapport au groupe HFD (Figure 3C). Bien que le taux de TG soit resté insignifiant après l’intervention de PF, il a été réduit par rapport au groupe HFD (Figure 3D). Des études récentes ont indiqué que l’indice du rapport LDL-C/HDL-C est un meilleur indice que le LDL-C ou le HDL-C seuls pour prédire les maladies cardiovasculaires25,26. Par rapport au groupe HFD, le rapport LDL-C/HDL-C a été significativement réduit (p < 0,01) de 46,3% dans le groupe FP_H (Figure 3E), ce qui signifie que l’intervention de PF a réduit le mauvais cholestérol et augmenté le taux de bon cholestérol. En tant que principal organe métabolique des graisses, le poids du foie reflète le stockage des graisses chez la souris dans une certaine mesure27. Après 12 semaines, les indices hépatiques dans le groupe FP_L et le groupe FP_H étaient significativement réduits (p < 0,01) par rapport au groupe HFD (Figure 3F). Le groupe PC a également montré différents degrés de réduction de ces indicateurs ci-dessus, démontrant que la PF avait des effets similaires aux statines, et l’effet protecteur a montré une relation dose-réponse.
Diverses études cliniques ont révélé que, après avoir pris de l’extrait ou de la PF entière pendant un certain temps, les taux de TC et de LDL-C ont été significativement diminués. Pendant ce temps, le taux de HDL-C a été remarquablement augmenté lors de l’administration à long terme de FP28,29. Nambiar et Shetty30 ont constaté que le jus FP pouvait réduire les lipoprotéines oxydées de basse densité, réduisant ainsi considérablement le risque d’athérosclérose. Gopa et al.31 ont évalué l’effet hypolipidémique de la PF chez les patients atteints d’hyperlipidémie et l’ont comparé à la simvastatine. Le traitement par PF a entraîné une réduction considérable de la TC, du LDL-C et de la TG, ainsi qu’une augmentation significative des taux de HDL-C, similaire à celle de la simvastatine. Dans cette recherche, la PF et la simvastatine avaient également des effets thérapeutiques similaires, et l’effet abaissant le LDL-C et l’action réparatrice hépatique de la PF étaient supérieurs à la simvastatine.
Observation histopathologique du foie
L’effet de la PF sur la stéatose hépatique chez les souris HFD est illustré à la figure 4. Les coupes pathologiques hépatiques du groupe NC exprimaient une morphologie hépatocytes régulière, des bordures cellulaires clairement définies et aucune vacuole graisseuse évidente (Figure 4A,B). Comparativement, le groupe HFD avait des vacuoles graisseuses de différentes tailles autour des vaisseaux sanguins et présentait des lésions hépatiques évidentes, caractérisées par un gonflement cellulaire, une dégénérescence graisseuse, une perte de limites cellulaires, une contraction cellulaire et une nécrose hépatocytaire (Figure 4C, D). Comme le montre la figure 4E,F, l’intervention de PF pourrait améliorer la stéatose hépatique, en particulier dans le groupe FP_L. Par rapport au groupe HFD, le groupe FP_H (Figure 4G,H) et le groupe PC (Figure 4I,J) ont eu un certain degré de récupération de la structure des cellules hépatiques, de dégénérescence graisseuse et de réduction de la vacuole graisseuse. Cela signifie que l’intervention de PF peut protéger le tissu hépatique contre les lésions hépatiques induites par HFD.
Profilage métabolomique
Selon le taux de lipides plasmatiques et l’observation histopathologique hépatique, la PF à forte dose a eu un meilleur effet sur l’hyperlipidémie que la PF à faible dose. Par conséquent, les groupes NC, HFD et FP_H ont été choisis pour analyser leur changement dans le niveau du métabolisme. Les chromatogrammes ioniques totaux des échantillons de CQ ont été présentés à la figure supplémentaire 4. Pour assurer l’exactitude des données, les caractéristiques avec des valeurs RSD >30% ont été supprimées de tous les échantillons de CQ. Les chromatogrammes de l’ACP et des ions indiquaient que les échantillons de CQ étaient stables pendant le procédé (figure supplémentaire 5). Au total, 626 et 562 caractéristiques du plasma et du foie ont été déterminées après le prétraitement des données. Parmi eux, 120 et 124 métabolites dans le plasma et le foie, respectivement, ont été identifiés sur la base de la base de données KEGG. L’analyse OPLS-DA a été utilisée pour explorer la séparation entre les groupes NC, HFD et FP_H. L’OPLS-DA a montré que les mêmes échantillons de groupe étaient regroupés et que différents échantillons de groupe se distinguaient bien (figure 5A, B). Ces résultats ont indiqué que les interventions HFD et PF provoquaient des variations métaboliques évidentes.
Pour identifier les métabolites différentiels potentiels qui ont contribué à la distinction métabolique, d’autres analyses OPLS-DA et t-test de NC par rapport à HFD et HFD par rapport à FP_H ont été effectuées, respectivement. Les résultats de l’OPLS-DA ont bien distingué et ont montré des différences significatives entre les différents groupes de modèles14 (figure supplémentaire 6). Sur la base de VIP (Variable importante dans la projection) >1 et p < 0,05, 32 métabolites dans le plasma ont montré une différenciation entre le groupe NC et HFD, et 72 métabolites ont montré une différenciation entre le groupe HFD et FP_H groupe. Dans le foie, 38 métabolites ont montré une différenciation entre le groupe NC et HFD, et 17 métabolites ont montré une différenciation entre le groupe HFD et FP_H groupe. Enfin, un total de 16 et 6 métabolites ont été identifiés comme métabolites différentiels chez les souris HFD affectant la PF dans le plasma et le foie, respectivement (Figure supplémentaire 7). Les informations sur ces métabolites sont présentées dans le tableau 2.
Pour visualiser la variation des métabolites entre les trois groupes, des cartes thermiques ont été tracées par MetaboAnalyst 5.0. Tous les métabolites différentiels dans le plasma et le foie ont été modifiés dans le groupe HFD et la plupart d’entre eux ont été inversés dans le groupe PF, indiquant que l’intervention PF peut améliorer le trouble métabolique (Figure 5C, D). De plus, des métabolites différentiels ont été importés dans MetaboAnalyst 5.0 pour explorer les voies métaboliques de la PF chez les souris HFD. Sur la base d’un p < 0,05 et d’un impact de voie >0,10, le métabolisme du tryptophane a été affecté de manière significative dans le plasma, et les métabolites liés à cette voie étaient le D-tryptophane et la L-kynurénine (Figure 5E). Jung et coll.32 ont étudié qu’une hyperlipidémie prolongée peut abaisser les taux sériques de kynurénine. Le métabolisme de la taurine et de l’hypotaurine a été affecté de manière significative dans le foie, et le métabolite apparenté était la taurine (Figure 5F). La taurine est un acide aminé important et nécessaire dans le corps animal; Dong et al.33 ont étudié que la taurine pouvait réduire légèrement les dommages aux lipides sanguins et réduire le risque d’athérosclérose causée par HFD. Dans cette recherche, l’intervention de PF a augmenté la teneur en L-kynurénine et en taurine, ce qui est positivement lié à la réduction des taux de lipides, soutenant l’efficacité de la PF contre l’hyperlipidémie.
Analyse intégrée de la pharmacologie et de la métabolomique des réseaux
Une stratégie intégrée de pharmacologie en réseau combinée à la métabolomique est devenue de plus en plus indispensable dans l’étude des mécanismes de la maladie et des stratégies d’intervention. La pertinence entre la pharmacologie en réseau et la métabolomique avec des preuves limitées a été établie. Pour obtenir une vue complète du mécanisme de la PF contre l’hyperlipidémie, les réseaux d’interaction basés sur la pharmacologie des réseaux et la métabolomique ont été construits. Les métabolites différentiels ont été importés dans le plug-in MetScape dans Cytoscape et correspondaient aux gènes concentrateurs identifiés en pharmacologie de réseau pour collecter les réseaux composé-réaction-enzyme-gène (Figure 6). Comme le montre le tableau 3, dans les métabolites plasmatiques, la L-kynurénine et la corticostérone étaient apparentées au CYP1A1, qui peut catalyser la peroxydation lipidique et induire une stéatose hépatique non alcoolique34,35 ; Les voies affectées étaient le métabolisme du tryptophane et la biosynthèse des hormones stéroïdes, respectivement. L’acétylcholine était liée à l’AChE et affectait le métabolisme des glycérophospholipides. Dans les métabolites hépatiques, MGAM et raffinose étaient liés au métabolisme du galactose. Plusieurs études ont démontré que la prise d’oligosaccharides de la famille des raffinose pourrait améliorer les troubles métaboliques chez les souris HFD36.
De plus, le réseau ingrédients-cibles-métabolites-voies a été construit (figure 7). Dans les ingrédients, la quercétine a connecté le plus de bords, indiquant que la quercétine de FP joue le rôle le plus important dans la réduction des lipides. L’analyse intégrée ci-dessus a révélé les cibles, les métabolites et les voies clés de la PF contre l’hyperlipidémie, ce qui pourrait constituer le fondement d’une étude plus approfondie du mécanisme thérapeutique et de l’application clinique de ce médicament.
Amarrage moléculaire
Pour étudier plus avant la possibilité d’interaction entre les ingrédients sélectionnés et les cibles clés, l’amarrage moléculaire a été utilisé pour analyser leurs interactions ligand-site actif. Le logiciel AutoDock Vina (voir Tableau des matériaux) a été utilisé pour effectuer l’amarrage moléculaire, et la première pose d’amarrage a été produite en fonction du rang de la fonction de notation. Les résultats de l’amarrage sont illustrés à la figure 8.
Dans l’analyse intégrée, le CYP1A1, l’AChE et le MGAM étaient liés aux métabolites différentiels; Ils ont construit des ponts entre les cibles et les métabolites. D’autres amarrages moléculaires ont été effectués pour vérifier la relation entre la cible et les ingrédients. Les résultats de l’amarrage des ingrédients au CYP1A1 étaient les suivants : l’acide gallique a formé quatre liaisons hydrogène à travers les résidus d’acides aminés Asn-185, Tyr-187, Asn-219 et His-500, et a formé une interaction d’empilement π-π à travers le résidu d’acides aminés Tyr-187 (Figure 8A); la quercétine a formé trois liaisons hydrogène à travers Asn-185, Asn-219 et His-500, interaction hydrophobe et interaction d’empilement π-π à travers Tyr-187 (Figure 8B); le bêta-sitostérol a formé quatre liaisons hydrogène à travers Arg-362, Ser-363, Leu-365 et Arg-464, et une interaction hydrophobe à travers Glu-369 et Ile-439 (Figure 8C). Les énergies de liaison étaient respectivement de 5,3, 7,0 et 7,3 kcal/-mol. Dans l’interaction avec l’AChE, l’acide gallique a été stabilisé par des liaisons hydrogène avec Arg-237, Arg-238 et Arg-480 (Figure 8D); la quercétine a été stabilisée par des liaisons hydrogène avec Arg-237 et Phe-474, par interaction hydrophobe avec Phe-157 et par empilement π-π avec Tyr-478 (Figure 8E); Le bêta-sitostérol a été stabilisé par interaction hydrophobe avec Phe-157, Val-244, Ile-248, Phe-474, Ala477 et TYR478 (Figure 8F). Les énergies de liaison étaient respectivement de 5,0, 6,5 et 8,0 kcal/- mol. Dans l’interaction avec MGAM, l’acide gallique a été stabilisé par des liaisons hydrogène avec Ile-1716, Gly-1747 et Trp-1749, et par une interaction hydrophobe avec Tyr-1715 et Trp-1749 (Figure 8G); la quercétine a été stabilisée par des liaisons hydrogène avec Arg-1311, Thr-1726, Gln-1731 et Trp-1752, par des liaisons hydrogène avec Arg-1730 et par empilement π-π avec His-1727 (Figure 8H); Le bêta-sitostérol a été stabilisé par interaction hydrophobe avec Pro-1159, Trp-1355, Phe-1427 et Phe-1560, Les énergies de liaison étaient respectivement de 5,9, 8,1 et 6,9 kcal / mol. Des informations détaillées sur les interactions et les affinités de liaison sont présentées dans le tableau 4. Des sites de liaison multiples et des énergies de liaison élevées expliquent les affinités élevées entre les ingrédients et les cibles protéiques, vérifiant que ces ingrédients jouent le rôle de réduire les lipides en agissant sur les cibles liées à l’hyperlipidémie.
Figure 1 : Organigramme schématique de la stratégie intégrée. Les ingrédients et les gènes du carrefour ont été extraits par pharmacologie de réseau (partie 1). Les métabolites différentiels de la PF contre l’hyperlipidémie ont été analysés par métabolomique plasmatique et hépatique (partie 2). Les cibles, les métabolites et les voies clés ont été déterminés et reliés en fonction d’une analyse intégrée de la partie 1 et de la partie 2 (partie 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Criblage des cibles, construction du réseau et analyse de l’enrichissement de l’effet de la PF contre l’hyperlipidémie. (A) Diagramme de Venn des cibles de l’hyperlipidémie FP. (B) Réseau potentiel d’ingrédients actifs et de cibles de la maladie : différents symboles de couleur mentionnés ici : maladie (rouge), médicament (bleu), ingrédients (vert) et cibles (jaune). (C) Réseau PPI par STRING. D) Analyse de l’enrichissement des voies GO. E) Analyse de l’enrichissement de la voie KEGG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Effet de la PF sur les taux de lipides plasmatiques et l’indice hépatique chez les souris atteintes d’hyperlipidémie induite par HFD (n = 6). (A) Niveaux de CT. b) Niveaux de LDL-C. (C) Niveau HDL-C. (D) Niveau TG. (E) Le rapport LDL-C/HDL-C. (F) Indices hépatiques.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Les différences statistiquement significatives ont été évaluées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett ou d’une analyse post hoc. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effet de la PF sur le tissu hépatique chez les souris atteintes d’hyperlipidémie induite par HFD (coloration H&E). (A,B) groupe NC, (C,D) groupe HFD, (E,F) groupe FP_L, (G,H) groupe FP_H, (I,J) groupe PC (n = 6). Barre d’échelle: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Les diagrammes de score OPLS-DA, les cartes thermiques et les voies métaboliques des métabolites différentiels. Les diagrammes de score OPLS-DA de la PF sur des souris HFD dans le plasma (A) et le foie (B). Les cartes thermiques des métabolites différentiels dans le plasma (C) et le foie (D). Les voies métaboliques des métabolites différentiels dans le plasma (E) et le foie (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Les réseaux composé-réaction-enzyme-gène des principaux métabolites et cibles. Les nœuds de faible degré ont été supprimés. Les hexagones rouges, les cercles bleus, les rectangles ronds verts et les diamants gris représentent respectivement les composés actifs, les gènes, les protéines et les réactions. Les cibles clés et les métabolites ont été amplifiés. Les voies avec le fond blanc sont significativement régulées dans le plasma. La voie avec le fond gris est régulée de manière significative dans le foie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Réseau ingrédients-cibles-métabolites-voies. Plus la couleur est foncée, plus les bords connectés sont nombreux, ce qui signifie que le nœud est plus important dans ce réseau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Les diagrammes d’interaction des ingrédients de PF et les cibles clés. (A) Acide gallique agissant sur le CYP1A1. (B) Quercétine agissant sur le CYP1A1. (C) Bêta-sitostérol agissant sur le CYP1A1. (D) Acide gallique agissant sur AChE. (E) Quercétine agissant sur AChE. (F) Bêta-sitostéroling agir sur AChE. (G) Acide gallique agissant sur MGAM. H) Quercétine agissant sur MGAM. (I) Bêta-sitostérol agissant sur MGAM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Vue d’ensemble du résultat de la PF contre l’hyperlipidémie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Les ingrédients sélectionnés de l’extrait aqueux de PF. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Les métabolites différentiels entre les trois groupes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Informations sur les cibles, les métabolites et les voies clés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 4 : Sites de liaison et forces d’action entre les ingrédients de PF et les protéines cibles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Figure supplémentaire 1 : Les chromatogrammes ioniques positifs et négatifs de l’extrait aqueux de PF. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Le réseau de maladies de l’ingrédient cible-voie cible de la PF par BATMAN-TCM. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Analyse de fréquence des gènes du hub en pharmacologie des réseaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 4 : Chromatogrammes ioniques d’échantillons de CQ plasmatiques et hépatiques. Les chromatogrammes ioniques positifs (A) et négatifs (B) représentatifs des échantillons plasmatiques de CQ. Les chromatogrammes ioniques positifs (C) et négatifs (D) représentatifs des échantillons de CQ hépatique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 5 : Les diagrammes de score PCA des échantillons de CQ plasmatiques (A) et hépatiques (B). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 6 : Les diagrammes de score OPLS-DA des échantillons de plasma (A et B) et de foie (C et D). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 7 : Diagrammes de Venn des métabolites différentiels dans les échantillons de plasma (A) et de foie (B). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Au cours des dernières années, le taux d’incidence de l’hyperlipidémie a augmenté, principalement en raison d’habitudes alimentaires malsaines à long terme. La MTC et ses ingrédients chimiques ont diverses activités pharmacologiques, qui ont été largement étudiées ces dernières années37,38. La PF est une sorte de ressource fruitière, utilisée à la fois comme médicament et comme aliment, et a un potentiel important pour traiter l’hyperlipidémie. Cependant, le mécanisme thérapeutique potentiel de la PF contre l’hyperlipidémie nécessite une étude plus approfondie.
La pharmacologie en réseau évalue les effets polypharmacologiques des médicaments au niveau moléculaire et prédit l’interaction des produits naturels et des protéines pour déterminer le mécanisme majeur39. La première étape consiste à sélectionner les ingrédients actifs et les cibles clés du médicament. Dans cette recherche, neuf ingrédients actifs et 62 gènes de moyeu ont été trouvés. Pour mieux comprendre le mécanisme moléculaire de la PF sur l’hyperlipidémie, des IPP et des réseaux ingrédients-cibles ont été établis sur la base d’une analyse pharmacologique en réseau. Pour réduire la portée des ingrédients et des cibles clés, trois ingrédients clés (acide gallique, quercétine et bêta-sitostérol) liés à l’hypercholestérolémie et à l’athérosclérose coronarienne ont été fondés par BATMAN-TCM. Tous ces ingrédients pourraient réduire les niveaux de LDL-C ou augmenter les niveaux de HDL-C, validant les effets spécifiques de la PF sur l’hyperlipidémie. En outre, selon l’analyse d’enrichissement KEGG, la fonction de la PF sur l’hyperlipidémie est liée à l’activité de la voie lipidique et de l’athérosclérose. Bien que cette méthode dépende trop de la base de données et manque de vérification expérimentale, elle a une valeur théorique et fournit des idées pour la recherche de vérification expérimentale ultérieure.
Pour une validation expérimentale plus poussée, les souris ont été nourries avec un régime supplémenté en graisses pendant 8 semaines pour induire une hyperlipidémie. Les résultats ont montré que les taux plasmatiques de TC, LDL-C et TG étaient significativement augmentés. Bien que le niveau de HDL-C ait diminué de manière significative, le rapport LDL-C / HDL-C a augmenté de manière significative. Les observations histopathologiques ont montré que le tissu hépatique des souris HFD était gravement endommagé, mais il n’y avait pas d’augmentation significative de l’indice hépatique; Il se peut que les changements de poids corporel et de poids viscéral prennent plus de temps. Les lipides et les modifications hépatiques ont montré de manière adéquate l’effet d’intervention de la PF sur l’hyperlipidémie. Toutefois, le mécanisme interne de l’effet d’intervention doit encore être exploré.
La métabolomique fournit une liste de métabolites potentiels et de voies connexes, qui visent à explorer le mécanisme des maladies métaboliques et l’action des médicaments thérapeutiques40. Le résultat de la métabolomique peut être affecté par le type d’échantillon. Compte tenu des caractéristiques pathogènes de l’hyperlipidémie, des échantillons de plasma et de foie ont été choisis pour l’analyse métabonomique dans cette recherche. Selon les résultats de l’OPLS-DA, les métabolites des groupes NC, HFD et FP_H ont été bien discriminés. Au total, 16 métabolites différentiels ont été trouvés dans le plasma et 6 métabolites différentiels dans le foie. Il y avait plus de métabolites affectés dans le plasma que dans le foie, prouvant que le sang est le principal lieu de perturbation métabolique induite par l’hyperlipidémie. L’intervention de PF peut inverser le changement de ces métabolites sous l’influence de HFD. De plus, ces métabolites différentiels ont été importés dans la base de données KEGG. Les voies métaboliques significatives des métabolites différentiels dans le plasma étaient le métabolisme du tryptophane et, dans le foie, le métabolisme de la taurine et de l’hypotaurine. Dans cette recherche, l’intervention de PF a augmenté la teneur en L-kynurénine du métabolisme du tryptophane et la teneur en taurine du métabolisme de la taurine et de l’hypotaurine, ce qui signifie que la PF pourrait être efficace pour ajuster favorablement les troubles métaboliques et l’hyperlipidémie. L’analyse métabolomique a révélé quels métabolites étaient liés à l’hyperlipidémie ou à l’intervention de PF et a déterminé le mécanisme en aval de l’effet PF.
En combinant le résultat de la pharmacologie des réseaux avec la métabolomique, trois cibles clés (CYP1A1, AChE et MGAM) ont été identifiées dans les réseaux composé-réaction-enzyme-gène. Selon l’analyse d’amarrage moléculaire, ces cibles ont montré de fortes affinités avec les ingrédients de PF (acide gallique, quercétine et bêta-sitostérol). Quatre métabolites (L-kynurénine, corticostérone, acétylcholine et raffinose) et quatre voies connexes (métabolisme du tryptophane, biosynthèse des hormones stéroïdes, métabolisme des glycérophospholipides et métabolisme du galactose) ont été identifiés comme les métabolites clés et les voies métaboliques. Parmi ceux-ci, la quercétine était associée à la plupart des cibles, et le métabolisme du tryptophane est apparu à la fois dans les résultats métabonomiques et intégrés. Ils jouent le rôle le plus essentiel dans l’effet thérapeutique de la PF contre l’hyperlipidémie. Le résultat de l’amarrage moléculaire a montré que le CYP1A1, l’AChE et le MGAM ont de fortes affinités avec les ingrédients. Les résultats ci-dessus prouvent que ces cibles dépistées sont étroitement liées à l’effet thérapeutique de la PF.
Dans la présente recherche, l’acide gallique, la quercétine et le bêta-sitostérol ont été identifiés comme des ingrédients actifs de PF pour l’anti-hyperlipidémie, et le métabolisme du tryptophane est la principale voie métabolique du traitement de la PF chez les souris HFD. La figure 9 donne un aperçu du résultat. Cette recherche a offert des données et un soutien théorique pour d’autres études des mécanismes et a fourni une base pour l’application clinique de la médecine de la PF. Il a également prouvé que les aliments naturels pourraient être une option prometteuse avec de grandes perspectives dans la pratique clinique. Cependant, il y a encore quelques lacunes dans cette recherche. L’effet thérapeutique du principe actif seul sur l’hyperlipidémie n’a pas été vérifié. De plus, la trajectoire des cibles clés n’a pas été étudiée; Il faut également d’autres expériences systématiques de biologie moléculaire pour vérifier le mécanisme précis.
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Disclosures
Tous les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par l’équipe de développement de produits et d’innovation de TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) et Research on New Business Cross-border Integration of « Health Preservation and Rehabilitation + ».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 101-3B Oven | Luyue Instrument and Equipment Factory | \ | |
| 80312/80302 Glass Slide | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| 80340-1630 Cover Slip | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A998 | Version 1.5.6 |
| ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Aethanol | Fisher Chemical | A995 | Version 3.0 |
| Ammonia Solution | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1336-21-6 | Version 3.9.1 |
| AutoDockTools | Scripps Institution of Oceanography | \ | |
| BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | \ | |
| Compound Discoverer | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | \ | |
| DM500 Optical Microscope | Leica | \ | |
| DV215CD Electronic Balance | Ohaus Corporation ., Ltd | T15A63 | |
| Ethyl Alcohol | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 64-17-5 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A118 | |
| HDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A112-1-1 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL700B | |
| High Fat Diet | ENSIWEIER | 202211091031 | |
| Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge | Hitachi., Ltd. | \ | |
| Homogenizer | Oulaibo Technology Co., Ltd | \ | |
| Hydrochloric Acid | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 7647-01-0 | |
| Image-forming System | LIOO | \ | |
| JB-L5 Freezer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JB-L5 Tissue Embedder | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JK-5/6 Microtome | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JT-12S Hydroextractor | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| KQ3200E Ultrasonic Cleaner | Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd | \ | |
| LDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| Male C57BL/6 Mice | SBF Biotechnology Co., Ltd. | \ | Version 2.3.2 |
| Neutral Balsam | Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd | 10021190865934 | |
| Pure Water | Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd | GB19298 | |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | \ | Version 14.1 |
| RE-3000 Rotary Evaporator | Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd | \ | |
| RM2016 Pathological Microtome | Shanghai Leica Instruments Co., Ltd | \ | Version 26.0 |
| SIMCA-P | Umetrics AB | \ | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme., Ltd | 14202220051 | |
| SPSS | International Business Machines Corporation | \ | |
| TC Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| TG Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Vortex Vibrator | Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. | LC-Vortex-P1 | |
| Xylene | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1330-20-7 |
References
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