Summary
本协议描述了一种简单有效的方法来鉴定植物中的2,4-二溴苯酚代谢物。
Abstract
作物可能广泛暴露于有机污染物，因为土壤是污染物丢弃到环境中的主要汇。这通过食用污染物积聚的食物创造了潜在的人类暴露。阐明作物中异生素的吸收和代谢对于评估人类饮食暴露风险至关重要。然而，对于此类实验，使用完整的植物需要长期实验和复杂的样品制备方案，这些方案可能受到各种因素的影响。植物愈伤组织培养结合高分辨率质谱（HRMS）可为准确、省时地鉴定植物异生素代谢物提供解决方案，避免微生物或真菌微环境的干扰，缩短处理时间，简化完整植物的基质效应。2,4-二溴苯酚是一种典型的阻燃剂和内分泌干扰剂，因其在土壤中的广泛存在及其被植物吸收的潜力而被选为模式物质。本文中，从无菌种子中生成植物愈伤组织并暴露于无菌的含2,4-二溴苯酚的培养基中。结果表明，孵育120 h后，在植物愈伤组织中鉴定出8种2,4-二溴苯酚代谢物。这表明2,4-二溴苯酚在植物愈伤组织中迅速代谢。因此，植物愈伤组织培养平台是评价植物异生素吸收代谢的有效方法。
Introduction
由于人为活动，越来越多的有机污染物被丢弃到环境中1,2，土壤被认为是这些污染物的主要汇3,4。土壤中的污染物可以被植物吸收，并可能通过作物消费直接进入人体，从而沿着食物链转移到更高的营养级生物中，从而导致意外暴露5,6。植物利用不同的途径代谢异生素进行解毒7;阐明异生素的代谢很重要，因为它控制着植物中污染物的实际命运。由于代谢物可以通过叶子（到大气）或根部排泄，因此在暴露的早期阶段确定代谢物提供了测试更多代谢物的可能性8。然而，使用完整植物的研究需要长期实验和复杂的样品制备方案，这些方案可能会受到各种因素的影响。
因此，植物愈伤组织培养是研究植物中异生素代谢的良好选择，因为它们可以大大缩短治疗时间。这些培养物排除了微生物干扰和光化学降解，简化了完整植物的基质效应，标准化了培养条件，并且需要更少的实验工作。植物愈伤组织培养已成功作为三氯生9、壬基酚10 和戊唑醇8 代谢研究的替代方法应用。这些研究表明，愈伤组织培养物中的代谢模式与完整植物中的代谢模式相似。本研究提出了一种无需复杂和耗时的方案即可有效准确地鉴定植物中异生素代谢物的方法。在这里，我们使用植物愈伤组织培养物与高分辨率质谱法相结合，以分析具有低强度信号的代谢物11,12。
为此，将胡萝卜（胡萝卜变种）愈伤组织悬浮液在130rpm和26°C的摇床中暴露于100μg/ L的2,4-二溴苯酚120小时。 选择2,4-二溴苯酚是由于其破坏性的内分泌活性13 和在土壤中广泛存在14。采用高分辨率质谱法提取并分析代谢物。这里提出的协议可以研究植物 中 可以电离的其他类型的有机化合物的代谢。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.胡萝卜愈伤组织的分化
注意：高压灭菌此处使用的所有设备，并在紫外线灭菌的超净工作台中执行所有操作。
- 通过将均匀的胡萝卜种子（胡萝卜种子）浸入4°C的去离子水中16小时来春化种子。
- 用75%乙醇对春化的种子进行表面消毒20分钟，然后在无菌条件下用无菌去离子水冲洗三次。
- 进一步用20%H2O2对种子灭菌20分钟，并在无菌条件下用灭菌的去离子水洗涤六次。
- 通过在含有1%琼脂凝胶的无激素MS培养基（pH 5.8，在121°C高压灭菌20分钟）上播种，并在26°C下以16小时光周期（350μmol/ m2秒）孵育15天，无菌发芽种子。
- 通过将幼苗的下胚轴和子叶切成小块（0.5厘米）来获得外植体。
- 在无菌条件下，将外植体转化为含有 15-20 mL 无菌 MS 培养基的培养皿（每培养皿 2-4 个外植体），并补充有生长酮（2,4-二氯苯氧乙酸;1 mg/L）和植物激肽（6-苄氨基嘌呤;0.5 mg/L）。
- 将外植体在26°C的黑暗中孵育3-4周以诱导愈伤组织。
- 使用无菌手术刀和镊子分离由初始外植体形成的愈伤组织（直径约1厘米）。
注意：新形成的愈伤组织呈白色至乳黄色，松散地附着在初始外植体上。
2. 2,4-二溴苯酚处理
- 将 1 μg 2,4-二溴苯酚溶解在 10 mL 无菌液体 MS 培养基中（2,4-二溴苯酚的最终浓度为 100 ppb，pH 5.6-7.0）。
- 在无菌条件下，将3g新鲜胡萝卜愈伤组织（步骤1.8）加入含有制备的2,4-二溴苯酚溶液（来自步骤2.1）的玻璃烧瓶中。将其视为2,4-二溴苯酚处理。
注意：玻璃烧瓶用石蜡膜高压灭菌并密封。 - 包括仅含有2,4-二溴苯酚溶液（在步骤2.1中制备）的培养基对照，以评估2,4-二溴苯酚的非生物降解。
- 包括仅包含胡萝卜愈伤组织（无2,4-二溴苯酚溶液）的空白对照，以检查是否有任何潜在的污染。
- 通过将 3 g 新鲜收集的胡萝卜愈伤组织仅添加到 10 mL 无菌 MS 培养基中来制备含有胡萝卜的空白对照。
- 将2,4-二溴苯酚处理和培养基和空白对照在130rpm和26°C下在孵育箱中孵育120小时。
- 孵育120小时后，从培养箱中取出玻璃烧瓶以收集来自2,4-二溴苯酚处理和对照的样品。
注意：所有样品一式三份制备。
3. 样品制备
- 用玻璃纤维过滤器（0.45μm）过滤，将愈伤组织与MS培养基小心地分离，以进行2,4-二溴苯酚处理和对照。用超纯水洗涤三次后收集愈伤组织。
- 用液氮冷冻干燥收集的愈伤组织，随后用高通量组织研磨机以70Hz的速度均质收集的愈伤组织（0.2g）3分钟。
- 用玻璃微量注射器加入 50 μL 25 mg/L 替代物 4-n-NP-d4 ，然后涡旋 1 分钟，加标均质愈伤组织。
- 在充满冰水的超声仪（150 W，40 kHz）中用5 mL甲醇/水（1：1，v / v）超声处理样品30分钟，以提取2,4-二溴苯酚和代谢物。
- 将悬浮液在4°C下以8,000× g 离心10分钟，并通过移液收集上清液。
- 对愈伤组织样品重复提取过程三次，并合并提取物。
- 将提取物以 1 mL/min 的流速通过亲水性亲脂性平衡固相萃取 （HLB SPE） 柱。
注意：HLB SPE滤芯依次用6 mL甲醇和6 mL水预处理，以去除任何干扰。 - 通过将 6 mL 甲醇通过 HLB SPE 小柱洗脱分析物。然后，将获得的洗脱液在温和的氮气流下浓缩至 1 mL 进行仪器分析。
- 将10 μL所得淋洗液注入UPLC-Q-TOF-MS中，用于2,4-二溴苯酚及其代谢物分析15.
- 在仪器分析之前，用0.22μm尼龙膜过滤所有样品。
4. 仪器分析
注意：2,4-二溴苯酚及其代谢物的分析是在超高效液相色谱仪（UPLC）上与配备电喷雾电离（ESI）的micrOTOF-QII质谱仪结合使用的，在正离子和负离子模式下操作。
- 打开色谱柱加热器门，通过将色谱柱入口连接到进样阀，将色谱柱出口连接到质谱仪的入口来安装UPLC色谱柱。
注意：使用C18色谱柱（50 mm x 2.1 mm;1.7 μm粒径）在40°C下分离分析物。 - 通过将溶剂管A和B的末端分别插入相应的溶剂瓶中，将流动相A（超纯水）和流动相B（色谱级甲醇）连接到仪器。
- 通过0.22 μm过滤器过滤所有流动相（每个500 mL），超声处理30分钟以上。
- 在软件窗口中，单击 仪器 |进样法 编辑液相色谱图的条件。
- 流动相B的梯度条件设置如下：流速为1.0 mL/min;0-0.5分钟，5%;0.5-3.5分钟，5%至50%;3.5-6.5分钟，50%至100%;6.5-7分钟，100%;7-10分钟，100%至5%。
- 将样品注入UPLC-Q-TOF-MS的速率设置为0.2 mL/min。
注意：样品的进样使用全自动进样器进行编程。
- 在软件窗口中，选择MS 方法 ，然后设置Q-TOF-MS的参数：干燥气体（N 2）流速为8升/分钟，温度为300-350°C;毛细管电压为 4,500 V;碰撞能量为5-45 V;以及 40-800 Da 的完整扫描范围。
- 按序列号将样品瓶放置在样品盘的相应位置，然后将样品盘重新插入样品室。
注意：保持样品盘平放，并确保样品室的门已关闭。 - 在软件窗口中，选择 “文件”|”新建 以创建数据库。为数据库命名。
- 通过选择 MS 文件 |入口文件 |注入体积。
- 通过单击“ 文件”|”保存。
- 选择 “运行”|” 在软件主窗口中启动，然后选择 获取示例数据 ，并在启动示例列表运行以收集数据的窗口中单击 确定 。
注意：实时色谱图可通过单击 色谱图| 数据采集过程中的实时更新。 - 通过选择目标数据行并单击色谱图窗口查看MS扫描 色谱图， 在软件中处理数据。
- 在色谱 图中 ，单击 显示 |议会 |扫描波DS |添加跟踪 |确定 获得女儿扫描质谱。
- 通过比较2,4-二溴苯酚处理和对照的色谱图来鉴定代谢物。
- 通过保留时间、质量数和片段模式阐明候选代谢物16,17。
注意：候选代谢物母离子的实验m / z值与其相应的理论m / z之间的质量精度误差应小于10 ppm。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议的步骤如图 1所示。按照实验方案，我们将2,4-二溴苯酚处理的胡萝卜愈伤组织提取物的色谱图与对照组进行了比较，发现2,4-二溴苯酚处理中存在八个不同的峰，但在对照中不存在（图2）。这表明在2,4-二溴苯酚处理的胡萝卜愈伤组织中成功检测到2,4-二溴苯酚的8种代谢物（M562，M545，M661，M413，M339，M380，M424和M187）。此外，在2,4-二溴苯酚处理的色谱图中未发现母体2,4-二溴苯酚的峰（保留时间= 0.85分钟）（图2），表明2,4-二溴苯酚在实验条件下在胡萝卜愈伤组织中快速代谢。
表1总结了用于鉴定胡萝卜愈伤组织中2,4-二溴苯酚代谢物的色谱和质量信息。在胡萝卜愈伤组织中孵育的2,4-二溴苯酚通过与葡萄糖（M562，M545，M661和M413）和氨基酸（M339，M380和M424）直接结合导致代谢物的形成。例如，M413在m / z 250.8954和163.1485处产生片段，对应于邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和葡萄糖（C6H11O5）。M413通过加入戊糖或己糖进一步代谢形成二糖缀合代谢物M661、M545和M562。推测M339、M380和M424是2,4-二溴苯酚丙氨酸、2,4-二溴苯酚乙酰氨基氨酸和2,4-二溴苯酚乙酰天冬氨酸，因为它们具有氨基酸（C 3 H 6 NO2）、乙酰拉兰碱（C5H 8 NO3）和乙酰天冬氨酸（C6H8NO5）的特征性中性损失，在m/z 89.0932处产生相应的片段， 分别为 129.1140 和 173.123515。所提出的结果表明，植物愈伤组织培养物可用作阐明作物中异生素代谢的有效可靠工具。
图 1：方法原理图。 请点击此处查看此图的大图。
图2：2,4-二溴苯酚（插入图片）和2,4-二溴苯酚代谢物的色谱图。该图经Sun等人许可改编15。版权所有 （2018） 美国化学学会。请点击此处查看此图的大图。
| 代谢 产物 | 室温（分钟） | ESI 模式 | 观察 米/兹 |
计算 米/兹 |
谓词公式 | 碎片（米/z） | 置信水平 | |||
| M562系列 | 0.7 | -H | 562.201 | 562.201 | C18小时26卧室2O10 | 250.8954（-DBP） | 2b 级 | |||
| 170.9914（-溴） | 质谱，质谱2 | |||||||||
| M545型 | 1.6 | -H | 545.151 | 545.1506 | C17H22卧室2O10 | 250.8954（-DBP） | 2b 级 | |||
| 170.9914（-溴） | ||||||||||
| 528.1433（-OH） | 质谱，质谱2 | |||||||||
| M661 | 2.9 | -H | 661.222 | 661.2228 | C21H26卧室2O14 | 250.8954（-DBP） | 2b 级 | |||
| 410.3274（-C15H23O13） | 质谱，质谱2 | |||||||||
| M413 | 4.1 | -H | 413.036 | 413.036 | C12小时14卧室2O6 | 250.8954（-DBP） | 级别 1 | |||
| 163.1485（-C6H11O5） | ||||||||||
| 207.8938（250-CO2） | 合成标准品，室温、质谱、质谱2 | |||||||||
| M339 | 5.2 | +H | 339.994 | 339.9886 | C9 H9Br2NO3 | 250.8954（-DBP） | 2b 级 | |||
| 87.0773（-C3小时6没有2） | 质谱，质谱2 | |||||||||
| M380 | 5.5 | -H | 380.01 | 380.0094 | C 11 H11Br2NO4 | 250.8954（-DBP） | 2b 级 | |||
| 129.1140（-C5小时8号3） | 质谱，质谱2 | |||||||||
| M424系列 | 5.8 | -H | 424.012 | 424.0189 | C12H11卧室2NO6 | 250.8954（-DBP） | 2b 级 | |||
| 173.1235（-C6H8NO5） | 质谱，质谱2 | |||||||||
| M187 | 6.1 | -H | 187.995 | 187.9988 | C6H5BrO2 | 109.1027（-溴） | 级别 1 | |||
| 170.9914（-OH） | 正宗标准，RT，MS，MS2 | |||||||||
表1：胡萝卜愈伤组织提取物中发现的2,4-二溴苯酚及其代谢物的摘要。 本表经 Sun 等人许可改编 15.版权所有 （2018） 美国化学学会。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议旨在有效识别植物中异生素的生物转化。该协议的关键步骤是植物愈伤组织的培养。最困难的部分是植物愈伤组织的分化和维持，因为植物愈伤组织容易感染并发育成植物组织。因此，重要的是要确保使用的所有设备都经过高压灭菌，并且所有操作都在无菌条件下进行。植物愈伤组织的分化和维持应在黑暗中进行，以避免自养生长和过度发育。此外，补充到MS培养基中的植物激素的剂量和类型对于植物愈伤组织的差异至关重要，这应考虑植物物种。过量的植物激素导致愈伤组织形成血管系统，但植物激素不足限制了植物愈伤组织18的分化。MS培养基和植物激素原液应新鲜制备。强烈建议在引入植物激素和无菌下胚轴之前高压灭菌MS培养基。
完整植物中的叶绿素等色素是LC-HRMS测量中的普遍问题19,20。植物愈伤组织来源于无菌下胚轴，透明无叶绿素。这意味着植物愈伤组织培养可以优化完整植物的基质效应，并提供一种简单而有效的样品制备技术，无需去除色素步骤。用LC-HRMS以非靶向方式分析植物愈伤组织中异生素的代谢物15。植物愈伤组织培养与非靶向分析相结合，可以有效地鉴定代谢化合物的大规模分析。这些优点使该方法成为植物中异生素代谢机制理解的理想选择。但是，该协议仍然存在一些限制。例如，由于复杂的环境条件，该协议只能作为现场工厂中发生的实际情况的参考。此外，由于不同的植物愈伤组织表现出不同的代谢能力，因此鉴定的异生素代谢物可能因愈伤组织类型而异。
了解植物中化学物质的代谢转化对于其安全开发和应用非常重要。这里提出的方法对于筛选植物中产生的代谢物是有效和可靠的，并且可以支持通过食物链转移或直接摄入作物来评估对生态系统和人类健康的相关风险。该协议可以研究植物中异生素的持久性，并帮助筛选新兴污染物。考虑到其完整的代谢能力，成本更低，时间和精力更少，植物愈伤组织培养是比较许多化合物代谢行为并建立预测异生素可能代谢物的数据库的良好工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究得到了国家自然科学基金（21976160）和浙江省公益性技术应用研究项目（LGF21B070006）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
References
- Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
- Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
- Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
- Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
- Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
- Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
- Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
- Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
- Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
- Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
- Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
- Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
- Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
- de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
- Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
- Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
- Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
- Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al.
