Summary
La funzione del muscolo scheletrico può essere valutata quantificando la contrattilità delle fibre muscolari isolate, tradizionalmente utilizzando approcci laboriosi e a basso rendimento. Qui, descriviamo un metodo basato sull'ottica e ad alto rendimento per quantificare la contrattilità delle fibre muscolari incorporate nell'idrogel. Questo approccio ha applicazioni per lo screening dei farmaci e lo sviluppo terapeutico.
Abstract
La coltura cellulare in vitro è un potente strumento per valutare i processi cellulari e testare strategie terapeutiche. Per il muscolo scheletrico, gli approcci più comuni prevedono la differenziazione delle cellule progenitrici miogeniche in miotubi immaturi o la coltura ex vivo a breve termine di singole fibre muscolari isolate. Un vantaggio chiave della coltura ex vivo rispetto a quella in vitro è il mantenimento della complessa architettura cellulare e delle caratteristiche contrattili. Qui, dettagliamo un protocollo sperimentale per l'isolamento di fibre muscolari flessori digitorum brevis intatte dai topi e la loro successiva coltura ex vivo. In questo protocollo, le fibre muscolari sono incorporate in un idrogel a matrice di membrana a base di fibrina e basale per immobilizzare le fibre e mantenere la loro funzione contrattile. Descriviamo quindi i metodi per valutare la funzione contrattile delle fibre muscolari utilizzando un sistema di contrattilità basato sull'ottica e ad alto rendimento. Le fibre muscolari incorporate sono stimolate elettricamente per indurre contrazioni, dopo di che le loro proprietà funzionali, come l'accorciamento del sarcomero e la velocità contrattile, vengono valutate utilizzando la quantificazione basata sull'ottica. L'accoppiamento della coltura di fibre muscolari con questo sistema consente di testare ad alta produttività gli effetti degli agenti farmacologici sulla funzione contrattile e studi ex vivo di disturbi muscolari genetici. Infine, questo protocollo può anche essere adattato per studiare i processi cellulari dinamici nelle fibre muscolari utilizzando la microscopia a cellule vive.
Introduction
I progressi nelle tecniche di coltura cellulare in vitro hanno aperto nuove possibilità per studiare le capacità rigenerative dei tessuti, i meccanismi cellulari fisiopatologici e le successive strategie terapeutiche, il tutto utilizzando tessuti di mammifero in condizioni ben controllate 1,2,3. L'uso di sistemi di coltura in vitro è ben consolidato nel campo della ricerca muscolare 4,5. In generale, in vitro vengono utilizzati miotubi immaturi differenziati da cellule progenitrici miogeniche 2,6,7,8. Sebbene siano stati compiuti progressi nel protocollo di differenziazione per generare fibre muscolari più mature9, la loro immaturità limita ancora la traduzione dei risultati in un setting in vivo 1,10. Un problema centrale nel campo della biologia muscolare è l'incapacità dei miotubi differenziati in vitro di incarnare pienamente le complesse strutture intracellulari, i processi di segnalazione cellulare e le interazioni extracellulari osservate nel tessuto muscolare nativo e, soprattutto, ricapitolare le forze contrattili prodotte dalle fibre muscolari 1,2,10,11,12 . Inoltre, la contrazione non coordinata dei miotubi durante il processo di differenziazione spesso provoca il distacco spontaneo dai piatti di coltura, rendendo la valutazione contrattile dei miotubi differenziati in vitro impegnativa e limitata alla valutazione qualitativa o semi-quantitativa 8,11,12,13. Queste limitazioni spesso richiedono regolari esperimenti in vivo con animali, in particolare se la contrattilità muscolare è un risultato sperimentale primario1.
Un'alternativa alla coltura in miotubi differenziati in vitro è la coltura ex vivo di fibre muscolari mature isolate 1,14. Durante la coltura ex vivo, il tessuto muscolare maturo dal punto di vista dello sviluppo viene asportato dal corpo, seguito dall'isolamento unicellulare per la coltivazione in condizioni di laboratorio 1,14. Le fibre muscolari mature isolate mantengono le loro complesse strutture cellulari osservate all'interno del tessuto nativo14,15, e questo metodo apre la possibilità di interventi diretti, come la manipolazione genetica e lo screening farmacologico, in un ambiente di coltura ben definito e controllabile. Uno dei primi rapporti riguardanti l'isolamento delle fibre muscolari scheletriche e la coltura ex vivo risale al 1930; Tuttavia, la resa di fibre vitali da questo protocollo era bassa16. Con la continua ottimizzazione della procedura di isolamento e delle condizioni di coltura, è ora possibile un significativo miglioramento della quantità di fibre muscolari vitali e funzionali 14,15,17,18,19. Uno di questi miglioramenti nelle condizioni di coltura comporta il rivestimento di piatti di coltura con proteine della matrice extracellulare per promuovere l'aderenza delle fibre muscolari isolate sul piatto di coltura15,18,20. Di solito, viene utilizzato il rivestimento di laminina, poiché la laminina è uno degli elementi più abbondanti all'interno della matrice extracellulare dei muscoli20,21. L'ottimizzazione della procedura di isolamento combinata con il rivestimento delle piastre di coltura hanno permesso al campo di ricerca muscolare di mantenere isolate fibre muscolari vitali con architettura cellulare intatta e funzionalità contrattile in coltura per brevi periodi di tempo 1,15,18,22.
L'approccio più convenzionale utilizzato nel campo muscolare per misurare la forza e le capacità contrattili è quello di montare singole fibre muscolari tra un motore driver di lunghezza e un trasduttore di forza23,24. In generale, le fibre muscolari utilizzate per queste configurazioni motorizzate, vengono sezionate da tessuto congelato o fresco, seguito da permeabilizzazione o "scuoiatura", che consente l'attivazione esterna del calcio, in cui vengono utilizzate concentrazioni variabili di calcio per indurre la contrazione delle fibre muscolari24. Mentre questo metodo è il gold standard per le misurazioni contrattili delle fibre muscolari, solo una singola fibra muscolare può essere misurata alla volta, rendendo questa tecnica una procedura laboriosa e dispendiosa in termini di tempo25. Inoltre, la procedura di isolamento e scuoiatura delle fibre muscolari sconvolge le varie strutture coinvolte nell'accoppiamento eccitazione-contrazione (cioè rilascio di calcio e successiva ricaptazione nel reticolo sarcoplasmatico), non consentendo quindi lo studio della cinetica di rilassamento e di eventuali malattie che potrebbero influenzare questo processo26,27. Un'alternativa alla preparazione delle fibre scuoiate è l'uso della dissezione meccanica per isolare le fibre muscolari intatte, dove le forze contrattili possono essere misurate in risposta all'attivazione elettrica28; Tuttavia, questo approccio è tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo, con conseguenti misurazioni a bassa produttività. Infine, sia nelle preparazioni spellate che intatte, le cellule muscolari vengono completamente rimosse dall'ambiente extracellulare durante le misurazioni contrattili 24, rendendo impossibile l'indagine dell'effetto della composizione/rigidità della matrice extracellulare sulla contrazione delle fibre muscolari24. Di conseguenza, è necessario lo sviluppo di metodi alternativi per consentire misurazioni della contrattilità delle fibre muscolari isolate intatte in modo ad alto rendimento, ricreando al contempo la connessione tra fibre muscolari e matrice extracellulare.
Recentemente, è stato sviluppato un nuovo approccio basato sull'ottica per misurazioni della contrattilità delle fibre muscolari ad alto rendimento29. Questo sistema basato sull'ottica misura la periodicità dei sarcomeri per valutare la lunghezza del sarcomero durante la contrazione utilizzando l'imaging ad alta velocità. All'interno di questo sistema, le cellule rimangono in posizione nel piatto di coltura mentre l'ottica viene spostata, riducendo così al minimo il tempo necessario tra le misurazioni di più cellule29. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo di questo approccio basato sull'ottica ad alto rendimento è che consente di sviluppare condizioni di coltura simili a quelle del tessuto nativo. Un approccio utilizzato per imitare le condizioni native in vivo è l'incorporazione delle cellule negli idrogel30. Tipicamente, un idrogel è un materiale viscoelastico in grado di mantenere il suo volume e la sua forma, e gli idrogel hanno le proprietà di materiali sia solidi che liquidi31. La parte solida è costituita da catene polimeriche reticolate tra loro, creando una struttura che sembra simile a una rete30,31. Le proprietà del materiale degli idrogel possono essere sintonizzate per imitare la deposizione della matrice dei muscoli30,31. Pertanto, la combinazione di un sistema ottico ad alto rendimento con cellule incorporate negli idrogel apre nuove possibilità per valutare gli effetti della composizione della matrice extracellulare e delle proprietà meccaniche sulla funzionalità delle fibre muscolari.
L'obiettivo generale di questo articolo è quello di 1) descrivere la metodologia per l'isolamento enzimatico e la coltura ex vivo di fibre muscolari in condizioni che imitano l'ambiente tissutale nativo e 2) valutare la contrattilità delle fibre muscolari utilizzando un approccio ad alto rendimento. Descriviamo una metodologia dettagliata per isolare facilmente un gran numero di singole fibre muscolari dal muscolo flessore digitorum brevis (FDB) utilizzando la digestione enzimatica. Inoltre, descriviamo una tecnica per incorporare le fibre muscolari isolate in un idrogel a base di fibrina per imitare l'ambiente nativo dei muscoli e migliorare la vitalità e la contrattilità delle fibre muscolari. Descriviamo quindi un metodo ad alto rendimento per misurare le contrazioni delle fibre muscolari vive in vitro utilizzando questo sistema recentemente sviluppato. Un ulteriore vantaggio di questa procedura di incorporamento è l'immobilizzazione delle fibre durante la contrazione, che può migliorare il rapporto segnale-rumore di queste misurazioni. Questo metodo di incorporamento del gel è applicabile sia per le procedure di incapsulamento di singoli polimeri che di gel composito, facilitando la valutazione degli effetti della composizione della matrice extracellulare sulla contrattilità delle fibre muscolari.
Protocol
Per gli studi di contrazione ex vivo , il tessuto post-mortem è stato ottenuto da animali sacrificati per altri progetti di ricerca approvati e / o surplus di allevamento dell'Università VU in conformità con la direttiva del Consiglio europeo (2010/63 / UE) con il permesso della legge sulla ricerca animale dei Paesi Bassi.
1. Preparazione del materiale
- Preparare le pipette per la triturazione (conservare in etanolo al 70% in una cabina di flusso fino all'uso). Tagliare le estremità di due punte P1.000 per creare fori di diverse dimensioni; Assicurati che il foro sia abbastanza grande da consentire al muscolo di passare attraverso senza bloccare il pipet. Far passare le estremità tagliate attraverso una fiamma in modo che diventino lisce.
- Preparare i piatti Sylgard come descritto altrove32 e sterilizzare con etanolo al 70% in anticipo per l'uso nel fissare la zampa e il muscolo durante l'isolamento.
NOTA: I piatti Sylgard possono essere riutilizzati dopo un'accurata pulizia con acqua deionizzata e etanolo al 70%. - Preparare le seguenti soluzioni prima della procedura di isolamento: terreno di dissezione, terreno di coltura della fibrina e mezzo di digestione muscolare (vedere Tabella 1).
NOTA: Il mezzo di digestione muscolare deve essere sterilizzato con filtro utilizzando un filtro da 0,22 μm. Tutte le soluzioni preparate devono essere equilibrate in un incubatore di coltura cellulare standard a 37 °C e al 5% di CO2 per almeno 30 minuti prima dell'uso. - Dopo la digestione muscolare, preparare le seguenti soluzioni per lanciare l'idrogel: miscela cellulare e miscela di matrice (vedere Tabella 2). Combinare la miscela cellulare e la miscela di matrice in un rapporto di 1:1 per una concentrazione finale di fibrina di 2,5 mg/ml.
NOTA: Preparare la matrice su ghiaccio e utilizzare punte per pipette prerefrigerate per evitare la polimerizzazione prematura della matrice della membrana basale. Il rapporto trombina:fibrinogeno di 1:10 (unità per mg di fibrinogeno) qui utilizzato è stato ottimizzato per un tempo di polimerizzazione di 30 min. Se il gel polimerizza entro 30 minuti, deve essere utilizzata una concentrazione di trombina inferiore. Per ulteriori informazioni, vedere la discussione.
2. Dissezione muscolare FDB
- Eutanasia del topo per dislocazione cervicale. Disinfettare l'arto posteriore con alcool al 70%.
- Tagliare la zampa posteriore inferiore sopra la caviglia. Tagliare la pelle sul lato dorsale del piede verso le dita dei piedi.
NOTA: Tagliare la zampa posteriore inferiore all'articolazione della caviglia per evitare danni ai muscoli degli arti inferiori e alla tibia se sono necessari in seguito. - Sbucciare con cura la pelle verso le dita dei piedi. Fare attenzione a non danneggiare il muscolo. L'FDB è il muscolo più superficiale sul lato ventrale del piede.
- Porre il piede sezionato in una capsula Sylgard con 10 ml di mezzo di dissezione preriscaldato a 37 °C. Blocca il piede attraverso la pelle che è ancora attaccata alle dita dei piedi e appunta la parte inferiore della gamba oltre la caviglia.
- Rimuovere con attenzione il tessuto connettivo sulla parte superiore del muscolo. Tagliare il tendine al tallone e sollevare il muscolo dal suo tendine.
- Tagliare accanto e sotto il muscolo attraverso il tessuto connettivo. Continuare a tagliare fino a quando i tendini dei piedi sono esposti.
- Quando metà della lunghezza dei tre tendini sono esposti, tagliare i tendini e rilasciare il muscolo dal piede. OPZIONALE: Tagliare il quarto tendine laterale e le sue fibre muscolari.
- Pulire il tessuto connettivo dal muscolo e trasferirlo in un tubo contenente un mezzo di dissezione preriscaldato.
3. Digestione muscolare FDB
- Preparare il mezzo di digestione muscolare secondo la Tabella 1.
- Trasferire i muscoli FDB al mezzo di digestione muscolare utilizzando una pipetta sierologica. Incubare in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C e 5% CO2 per 80 min.
NOTA: Questo tempo dovrebbe essere ottimizzato per ogni lotto di collagenasi. La digestione è completa quando il muscolo inizia a sfilacciarsi e sembra ingrandito. Vedi la discussione per l'ottimizzazione del tempo di digestione. - Dopo la digestione, trasferire il muscolo in un tubo da 15 ml contenente 3 ml di terreno di dissezione e incubare per 30 minuti prima della triturazione.
4. Triturazione muscolare FDB e sedimentazione per gravità
- Triturare il muscolo utilizzando le punte di triturazione precedentemente preparate (passo 1.1) pipettando il muscolo, passando dalla dimensione più grande a quella più piccola. Se questo passaggio richiede più di 5 minuti, posizionare il muscolo nell'incubatrice per 5 minuti per consentirgli di riposare.
- Triturare fino a quando le fibre muscolari si sono staccate principalmente dal tendine e il tendine può passare attraverso una punta P200. Rimuovere i tendini.
- Aggiungere le fibre FDB dissociate in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di mezzo di dissezione e lasciare che le fibre si depositino nell'incubatore per 20 minuti. Osservare il pellet formato.
- Facoltativo: rimuovere 10 ml di terreno dall'alto e ripetere il passaggio 4.3. Questo passaggio facilita la rimozione dei detriti in eccesso e delle cellule mononucleate associate.
5. Incorporamento delle fibre FDB
- Rimuovere con attenzione tutto il mezzo dalla parte superiore del pellet di fibra. Risospendere le cellule in 875 μL di mix cellulare per muscolo FDB (su ghiaccio).
NOTA: Un muscolo FDB produce abbastanza fibre per sette pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Questa densità può essere regolata in base alle esigenze dell'esperimento. Il seguente volume di gel (250 μL) è ottimizzato per un formato a 24 pozzetti, ma può essere scalato di conseguenza per altri formati. - Aliquote 125 μL della miscela cellulare in provette singole per microcentrifuga.
- Un pozzetto alla volta, aggiungere 125 μL di miscela di matrice a un'aliquota di sospensione cellulare e mescolare pipettando su e giù con attenzione, evitando la formazione di bolle.
- Trasferire immediatamente la miscela finale in un pozzo.
NOTA: Assicurarsi di infilare la miscela nel mezzo del pozzetto. Ripetere i passaggi 5.3 e 5.4 per ogni pozzetto. - Solidificare i gel in un'incubatrice per 30-45 minuti. Dopo la solidificazione, aggiungere con attenzione il terreno di coltura ai pozzetti.
NOTA: il pipettaggio rapido può staccare l'idrogel dal pozzetto. Da questo punto in poi, le fibre possono essere stimolate e misurate. Tuttavia, nella nostra esperienza, lasciare che le fibre si adattino alle condizioni di coltura per 24 ore può migliorare la contrattilità delle fibre. - Per una coltura più lunga, ricostituire il terreno di coltura di un mezzo cambio ogni 2 giorni. Per fare ciò, rimuovere metà del terreno di coltura e sostituirlo con una quantità uguale di terreno fresco.
6. Misurazioni contrattili basate sull'ottica
- Accendere il sistema di misurazione contrattile basato su ottica (vedere la tabella dei materiali), la lampada a fluorescenza, il pacer della cella elettrica e il computer. Impostare lo stimolatore elettrico su 1,0 Hz, 10,0 V e una durata dell'impulso di 5,00 ms per stimolare le fibre muscolari isolate.
- Inserire la piastra nel sistema di misurazione. Collegare il pacer all'inserto di stimolazione e inserirlo nella piastra di coltura.
- Apri il programma IonWizard e apri un nuovo file facendo clic su File (in alto a sinistra dello schermo) | Nuovo.
- Controlla se il programma è sull'esperimento corretto, Sarcomero scheletrico, cliccando su Nuovo | Raccogli esperimento. Per modificare l'esperimento, fai clic sull'esperimento desiderato e premi Aggiungi. Per l'esperimento Sarcomero scheletrico , applicare le seguenti impostazioni: Sarc 20x, linee medie, FFT singolo, frequenza di campionamento di 250 Hz e un tempo di acquisizione di 10 s.
NOTA: le impostazioni sperimentali devono essere preparate prima dell'esperimento. Le impostazioni possono essere adattate alle esigenze dell'esperimento. - Regolare la temperatura del sistema di misura a 25 °C. Fai clic su apri cell finder sotto la barra degli strumenti e attendi che venga visualizzata una nuova schermata. In alto a destra di questa schermata, selezionare il tipo di piastra e i pozzetti attivi.
NOTA: Le misurazioni vengono eseguite a 25 °C per ridurre la velocità di contrazione delle fibre muscolari FDB a contrazione rapida, prevenendo così il sottocampionamento dell'evento contrattile. - Metti a fuoco le fibre regolando la barra di scorrimento della messa a fuoco. In alternativa, utilizzare i tasti W e S per questa funzione di messa a fuoco.
- Abilita la stimolazione per avviare la stimolazione elettrica. Osserva che le fibre ora iniziano a contrarsi.
NOTA: se non ci sono fibre che si contraggono, assicurarsi che tutti i fili siano collegati e che il pacer sia completamente sommerso. Se dopo questo non c'è ancora movimento, le fibre potrebbero non rispondere a causa di sovradigestione o danni eccessivi durante la triturazione. - Focalizzare l'area di misurazione sull'estremità di una fibra in modo tale che i sarcomeri corrano verticalmente. Assicurati che i sarcomeri siano a fuoco. Se i sarcomeri sono a fuoco, un singolo picco è visibile nella barra degli strumenti. Durante la contrazione, questo picco si sposterà verso destra mentre il sarcomero si accorcia.
NOTA: l'area di misurazione viola può essere regolata prima di iniziare l'esperimento. Per garantire una misurazione corretta, includere ~ 20 sarcomeri. Se questo picco cambia forma durante la contrazione, ciò può indicare che il sarcomero è oscurato o fuori fuoco durante la contrazione, che introduce rumore. - Avvia l'esperimento facendo clic su Start nella barra degli strumenti. Premere il tasto Q per avviare una misurazione e attendere che il programma misuri 10 transitori di contrazione. Se più di quattro transitori sembrano privi di rumore, accettare la misurazione premendo il tasto Z . Se i transienti hanno troppo rumore, rifiutare la misurazione premendo il tasto X .
- Misurare tra 10 fibre e 20 fibre per condizione. Le posizioni delle fibre precedentemente misurate vengono mantenute.
- Facoltativo: aggiungere composti, dopo di che le fibre possono essere rimisurate a questo punto.
- Al termine dell'esperimento, premi il pulsante di arresto nella barra degli strumenti inferiore per chiudere la finestra del cercatore di celle. Salvare il file e avviare un nuovo file.
- Per analizzare i dati, aprire il programma "Cytosolver desktop". Fare clic su importa e selezionare i file da analizzare.
- Dopo che il programma ha terminato l'analisi, cercare i picchi blu, rossi e grigi. I picchi blu sono transitori che sono accettati dal programma. I picchi rossi sono temporanei rifiutati dal programma, mentre i picchi grigi sono temporanei rifiutati dall'utente.
NOTA: I criteri di rifiuto possono essere regolati nel software di analisi. In generale, i valori vengono rifiutati se superano un limite massimo di derivata e i transitori vengono rifiutati in base a valori di adattamento della curva R2 di <0,95. - Clicca su esporta. Spuntare le seguenti caselle: Media dei dati transitori ed esportazione in Excel.
- Al termine, spegnere tutte le macchine. Tirare fuori il piatto di coltura e smaltirlo. Pulire gli elettrodi pacer con acqua deionizzata e etanolo al 70%.
Representative Results
Utilizzando questo protocollo, singole fibre muscolari FDB sono state isolate e incorporate nell'idrogel. Una panoramica della procedura di dissezione muscolare è mostrata nella Figura 1. Il muscolo FDB è esposto con tendini intatti e tagliato dalla fascia. Mantenere i tendini dei muscoli come punti di fissazione riduce al minimo i potenziali danni alle fibre muscolari durante la procedura di isolamento. Il tessuto connettivo in eccesso può essere tagliato per ridurre i detriti e la crescita di tipi di cellule secondarie. Una volta che il muscolo è stato asportato e pulito a sufficienza, il muscolo viene digerito enzimaticamente usando la collagenasi e le singole fibre muscolari vengono rilasciate dalla triturazione prima di incorporare le cellule isolate negli idrogel. L'isolamento delle fibre muscolari FDB fornisce fibre muscolari relativamente corte, che hanno il vantaggio di essere facilmente manipolabili. A causa delle loro dimensioni, le fibre muscolari FDB possono essere pipettate in modo sicuro senza danni indotti dal groviglio e sono facilmente incorporate in un idrogel. Poiché le singole fibre muscolari non aderiscono molto bene alle piastre di coltura, l'incorporazione delle fibre nell'idrogel assicura che le fibre rimangano ferme durante la coltura cellulare e le misurazioni contrattili. Inoltre, l'aggiunta di una matrice di membrana basale al gel di fibrina consente interazioni tra le fibre muscolari e la matrice, imitando l'ambiente nativo in vivo . Le singole fibre muscolari isolate possono essere manipolate e mantenute in coltura per diversi giorni dopo l'isolamento. Nella Figura 2 viene mostrato un esempio di fibre FDB isolate incorporate in una matrice di idrogel. Le fibre sane hanno sarcomeri visibili e sono distese dritte (freccia blu), mentre le fibre curve sono tipicamente danneggiate o non vitali (freccia gialla) e dovrebbero essere escluse dalle misurazioni. Le fibre ipercontratte appaiono come oggetti scuri nella matrice (freccia rossa). Se la procedura di isolamento ha avuto successo, la proporzione di fibre sane dovrebbe essere ~ 75%. Una percentuale maggiore di fibre ipercontratte di solito indica danni durante la procedura di isolamento. La membrana delle fibre muscolari può essere danneggiata da una sovradigestione del muscolo o da danni alle fibre durante la triturazione. Il danno da triturazione si verifica principalmente se il muscolo è sottodigerito e, quindi, non si stacca facilmente.
La funzionalità e la vitalità delle fibre sono state valutate attraverso misurazioni contrattili delle fibre muscolari utilizzando un sistema di misurazione contrattile basato sull'ottica e ad alto rendimento. Il sistema genera diversi parametri, come la lunghezza del sarcomero, la percentuale di accorciamento del sarcomero, la velocità contrattile e la velocità di rilassamento. Utilizzando il sistema di misurazione contrattile, la contrazione del sarcomero può essere misurata per fibra muscolare. La figura 3 mostra esempi di contrazioni delle fibre muscolari misurate utilizzando il sistema di misurazione. Da un singolo transitorio di contrazione, si ottengono i seguenti parametri: lunghezza del sarcomero al basale, durata della contrazione, lunghezza del sarcomero alla massima contrazione e durata del rilassamento (Figura 3A). Questi parametri vengono utilizzati per calcolare la percentuale di accorciamento del sarcomero, contrazione e velocità di rilassamento. I valori medi di velocità possono anche essere calcolati in base alla durata e ai valori assoluti di accorciamento, se necessario. Una misurazione di contrazione valida presenta una linea di base diritta, seguita da un tuffo al picco e un ritorno alla linea di base (Figura 3A). Rumore, sarcomeri non focalizzati o movimento aberrante della fibra possono influenzare il transitorio di misura (Figura 3B, C) e queste misurazioni possono essere scartate manualmente o saranno rifiutate dal programma di analisi. In questo approccio, la chiara visualizzazione dei sarcomeri è importante per misurare le contrazioni; Pertanto, tutto ciò che riduce la visibilità dei sarcomeri può introdurre rumore. Ciò potrebbe verificarsi se c'è movimento del sarcomero al di fuori del piano focale durante la contrazione. Anche le misurazioni in cui una serie di contrazioni differiscono in velocità o profondità dovrebbero essere escluse dall'insieme di dati.
I dati contrattili delle singole fibre muscolari ottenuti con questo sistema possono essere utilizzati per confrontare diverse condizioni di coltura. L'efficacia del sistema è illustrata nella figura 4. Qui, abbiamo misurato le contrazioni delle fibre muscolari FDB in entrambi i formati di coltura 2D (piastre di coltura rivestite di laminina) e 3D (idrogel di fibrina). Una percentuale più elevata di misurazioni utilizzabili è stata ottenuta in 3D, poiché l'incorporazione delle fibre nel gel ha impedito al movimento laterale e ad altri artefatti di movimento di influenzare la misurazione (Figura 4A). L'incorporazione delle fibre non ha avuto alcun effetto significativo sull'accorciamento del sarcomero o sui valori della velocità massima di contrazione rispetto alle fibre coltivate in 2D (Figura 4B). Per illustrare come diverse matrici influenzano la contrazione delle fibre muscolari FDB, abbiamo anche confrontato questo idrogel di fibrina con una matrice di membrana basale pura (4 mg / ml) (Figura 4C). La ridotta contrattilità osservata nella matrice basale pura della membrana basale era probabilmente dovuta alla rigidità del gel o all'aumento delle interazioni cellula-matrice. Sono state testate anche concentrazioni di fibrina fino a 7 mg/ml, senza alcun effetto significativo sulla velocità contrattile e sull'accorciamento (dati non pubblicati). L'utilizzo di questo idrogel a base di fibrina garantisce interferenze minime con i parametri contrattili.
Figura 1: Una panoramica della procedura di dissezione muscolare FDB. (A) L'arto posteriore viene tagliato sopra la caviglia (linea tratteggiata rossa) e (B) la pelle viene rimossa tagliando lungo la parte superiore del piede lungo la linea tratteggiata blu. (C) Il piede è bloccato attraverso la caviglia e la pelle in corrispondenza delle dita dei piedi. (D) Vista microscopica del muscolo esposto e del tessuto connettivo circostante. La fascia è visibile come uno strato opaco bianco attraverso il quale scorre la vascolarizzazione. (E) La fascia viene rimossa dal muscolo e il tendine viene tagliato lungo la linea tratteggiata rossa. (F) Il muscolo FDB viene separato dal tessuto sottostante sollevando e tagliando sotto e accanto al muscolo. (G) Quando i tendini delle dita dei piedi sono chiaramente visibili, l'FDB viene tagliato lungo la linea tratteggiata rossa. (H) L'FDB è assicurato dai tendini e il quarto tendine laterale e le sue fibre possono essere rimossi tagliando lungo la linea tratteggiata rossa. La fascia in eccesso può ora essere tagliata. (I) Dopo la pulizia, il muscolo FDB viene trasferito alla soluzione di collagenasi. Barre della scala = (D-I) 2 mm. Abbreviazione: FDB = flessore digitorum brevis. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagine microscopica delle fibre muscolari FDB incorporate nell'idrogel dopo 24 ore di coltura. Freccia blu: Esempio di fibra muscolare FDB vitale. Freccia gialla: Esempio di fibra muscolare FDB ritorta. Le fibre muscolari attorcigliate possono avere una ridotta vitalità e contrazioni compromesse e, quindi, dovrebbero essere escluse dalle misurazioni. Freccia rossa: Esempio di fibra muscolare FDB ipercontratta. L'ipercontrazione eccessiva si verifica quando la triturazione viene eseguita troppo vigorosamente o può essere causata da una sovradigestione della collagenasi o dall'uso di terreno di coltura non equilibrato. Barra di scala = 100 μm. Abbreviazione: FDB = flessore digitorum brevis. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Esempio di transitori di contrazione delle fibre misurati utilizzando il sistema contrattile ad alta produttività basato sull'ottica. (A) Esempio di transitorio di contrazione normale. Questo transitorio è ottenuto dai sarcomeri racchiusi dal quadrato viola mostrato nella barra degli strumenti inferiore. Il transitorio è costituito dai seguenti componenti: lunghezza del sarcomero al basale (verde), durata della contrazione (blu), lunghezza del sarcomero alla massima contrazione (viola) e durata del rilassamento (rosso). Parametri come la velocità e la percentuale di contrazione sono calcolati da questi valori. (B) Esempio di un transitorio di contrazione inadeguato. Queste misurazioni si verificano quando il segnale del sarcomero non viene rilevato a causa del rumore (vedi frecce rosse). (C) Esempio di un transitorio di contrazione che ha un artefatto di movimento (vedi frecce verdi). Gli artefatti del movimento si verificano quando la fibra muscolare si muove al di fuori del fuoco durante la contrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Dati rappresentativi ottenuti utilizzando il sistema contrattile ad alta produttività basato sull'ottica quando si confrontano condizioni 2D rispetto a condizioni 3D e diversi idrogel . (A) Percentuale di misurazioni di contrazione accettate e rifiutate trovate dal programma di analisi dei dati in coltura 2D e in coltura 3D basate su 30 misurazioni. (B) Confronto della velocità massima di contrazione in fibre muscolari coltivate in 2D e in coltura 3D isolate da tre topi dopo 24 ore di coltura. (C) Confronto dell'accorciamento del sarcomero in fibre muscolari coltivate in 2D e in coltura 3D isolate da tre topi dopo 24 ore di coltura. (D) Confronto della velocità massima di contrazione delle fibre muscolari incorporate nella matrice basale pura della membrana basale (Matrigel) e delle fibre muscolari incorporate in fibrina idrogel isolate da tre topi dopo 24 ore di coltura. (E) Confronto tra l'accorciamento del sarcomero delle fibre muscolari incorporate nella matrice basale pura (Matrigel) e delle fibre muscolari incorporate in fibrina idrogel isolate da tre topi dopo 24 ore di coltura. I dati sono stati analizzati utilizzando un t-test di Student e sono mostrati come media ± SD. Ogni punto dati è una fibra muscolare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Composizione del mezzo di dissezione utilizzato per sezionare il muscolo, il terreno di coltura della fibrina utilizzato per coltivare le fibre muscolari isolate e il mezzo di digestione muscolare utilizzato per digerire enzimaticamente i muscoli isolati. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Composizione della miscela di cellule utilizzata per colare gli idrogel e della miscela di matrice utilizzata per colare gli idrogel. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Discussion
Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo per eseguire l'isolamento enzimatico e la coltura delle fibre muscolari FDB in un formato di coltura 3D, seguito da misurazioni contrattili utilizzando un sistema di misurazione contrattile basato su ottica. Questo protocollo ha una serie di vantaggi, tra cui il 1) isolamento diretto e tempestivo di molte fibre muscolari intatte da un singolo muscolo; 2) l'incorporazione delle fibre muscolari in una matrice idrogel sintonizzabile; 3) l'esecuzione di misure di contrattilità ad alta produttività utilizzando il sistema basato sull'ottica; e 4) la capacità di effettuare misurazioni ripetute delle stesse fibre muscolari a seguito di un intervento. L'isolamento di singole fibre muscolari vive fornisce cellule muscolari mature che mantengono la loro funzione contrattile. Poiché le fibre muscolari ottenute dal topo FDB sono relativamente piccole, sono facilmente manipolabili durante l'isolamento e mantengono la loro forma diritta, consentendo misurazioni contrattili a valle. Sebbene il sistema sia stato sviluppato principalmente per studiare la contrazione dei cardiomiociti, le fibre muscolari scheletriche contengono lo stesso meccanismo contrattile con pattern sarcomero facilmente distinguibile e, quindi, possono anche essere misurati utilizzando questo sistema29. L'accoppiamento di misurazioni contrattili a singola cellula con colture di fibre muscolari ex vivo è un potente strumento per valutare la salute e la funzione delle fibre muscolari mature in risposta all'attivazione elettrica.
Una limitazione dell'uso di fibre muscolari dissociate è la mancanza di forze esterne (cioè allungamento passivo) applicate alle fibre, che si traduce in lunghezze del sarcomero a riposo inferiori rispetto a quelle trovate in vivo. Sebbene una lunghezza del sarcomero di 2,4-2,5 μm garantisca una produzione ottimale di forza, la lunghezza del sarcomero a riposo può variare notevolmente33. Mentre la lunghezza del sarcomero a riposo in vivo dell'FDB non è stata ancora descritta, i nostri dati non pubblicati suggeriscono una lunghezza media di 2,2 μm. I risultati attuali mostrano una lunghezza media del sarcomero a riposo di ~ 1,95 μm nelle fibre FDB scaricate dopo 24 ore in coltura (Figura 3). Sebbene questa minore lunghezza del sarcomero a riposo comporterebbe una minore produzione di forza, una lunghezza di ~ 1,95 μm dovrebbe comunque produrre il >90% della forza massima34. Pertanto, queste lunghezze del sarcomero dovrebbero essere sufficienti a determinare le differenze nella funzione delle fibre tra diversi modelli genetici o dopo trattamenti farmacologici. Inoltre, l'incorporazione delle fibre in un idrogel fornisce molti punti aggiuntivi per l'adesione rispetto alle fibre coltivate 2D fluttuanti, che limiterebbero l'ulteriore accorciamento del sarcomero nel tempo.
Un vantaggio di questo protocollo di isolamento delle fibre muscolari è l'uso di un muscolo a contrazione rapida facilmente sezionato costituito da fibre muscolari relativamente piccole rispetto ad altri muscoli, come l'estensore digitorum longus (EDL). Le loro dimensioni ridotte rendono l'isolamento muscolare più adatto alla separazione basata sulla triturazione, riducendo così la possibilità di danni indotti da pipet o grovigli alle fibre muscolari. La matrice extracellulare dei muscoli FDB può essere facilmente digerita enzimaticamente con collagenasi, consentendo l'isolamento di centinaia di fibre muscolari in un breve periodo di tempo. Tuttavia, la sovradigestione può portare a danni alle fibre muscolari. La sovradigestione delle fibre muscolari può essere riconosciuta quando il muscolo cade a pezzi quasi istantaneamente durante la triturazione del muscolo o quando una grande percentuale del volume cellulare è ipercontratta durante la procedura di semina cellulare. Per prevenire la sovradigestione del muscolo, il tempo di digestione deve essere ottimizzato per ogni lotto di collagenasi. Per testare questo, due muscoli FDB dovrebbero essere digeriti in parallelo con un tempo di digestione scaglionato di 5 minuti tra di loro. Dovrebbe essere scelto il tempo di digestione con la più alta resa di fibre muscolari vitali. Questa ottimizzazione dovrebbe quindi essere eseguita una seconda volta, sempre con 5 minuti di separazione nel tempo di digestione. Il tempo di digestione che produce le fibre muscolari vitali più elevate dovrebbe essere utilizzato come tempo di digestione ottimale per l'attuale lotto di collagenasi. Un altro modo per limitare la variabilità da lotto a lotto della collagenasi sarebbe quello di calcolare direttamente le unità di attività per millilitro di soluzione madre e quindi ricostituire i successivi lotti di collagenasi alla stessa quantità. Infine, potrebbe essere necessario ottimizzare i tempi di digestione su diversi ceppi murini, ad esempio se si studiano animali anziani o malati che presentano un aumento della deposizione di matrice extracellulare35,36.
La possibilità di pipettare fibre muscolari isolate vitali apre possibilità alla coltura di fibre muscolari FDB in varie condizioni di coltura. Una di queste opzioni è la coltura di queste fibre in idrogel per imitare l'ambiente di coltura dei tessuti nativi. Questo protocollo di incorporamento assicura che le fibre rimangano in posizione durante le misurazioni contrattili ed è stato ottimizzato per consentire alle fibre di depositarsi sul fondo della piastra prima che il gel si stabilizzi. Tuttavia, potrebbe essere necessario adeguare questo protocollo per tener conto delle differenze nelle scorte di trombina e fibrinogeno. Se l'attività della trombina è troppo alta, il gel si fisserà prematuramente e le fibre potrebbero rimanere sospese in posizioni più alte al di fuori del piano focale del microscopio. Se ciò accade, il rapporto trombina:fibrinogeno deve essere regolato. Questo può essere testato placcando le fibre in concentrazioni di trombina sempre più basse e prendendo nota di quanto tempo richiede la polimerizzazione. In genere, questo non dovrebbe accadere più velocemente di 30 minuti. Tuttavia, avere una concentrazione di trombina troppo bassa può anche compromettere il processo di polimerizzazione. Un altro metodo per garantire che le fibre siano nel piano focale corretto è quello di seminarle prima utilizzando un protocollo 2D e quindi aggiungere uno strato di idrogel sulle fibre dopo che hanno aderito alla piastra di coltura. Tuttavia, si dovrebbe essere consapevoli che la rimozione del mezzo dalle fibre può indurre ipercontrazione, poiché sono sensibili all'essiccazione. Inoltre, non è chiaro se l'idrogel si attaccherà completamente alla piastra di coltura e potrebbe staccarsi più facilmente. Pertanto, questa procedura di incorporamento è preferibile per mantenere le fibre vitali e in posizione per le misurazioni della contrazione.
L'utilizzo di questo protocollo consente lo studio della dinamica contrattile delle fibre muscolari mature ex vivo e può essere applicato sia a topi sani che a quelli portatori di mutazioni genetiche per malattie muscolari. Allo stesso modo, consente di testare come le condizioni di coltura o l'aggiunta di composti influenzano la funzione delle fibre muscolari. I dati contrattili ottenuti utilizzando il sistema basato sull'ottica forniscono un'indicazione della capacità contrattile delle singole fibre muscolari vive e i cambiamenti in questa capacità possono essere correlati alla salute delle fibre. Questi dati da soli, tuttavia, non sono sufficienti per determinare se questi cambiamenti si verificano nelle fasi di ponte incrociato actina-miosina o di rilascio del calcio della contrazione muscolare. Sebbene non descriviamo i metodi per misurare la segnalazione del calcio in questo protocollo, questa configurazione è anche in grado di misurare i transitori di calcio a base di Frua nelle cellule muscolari contratte29. Uno svantaggio di questo sistema è che il muscolo FDB contiene solo fibre muscolari di tipo IIa/IIx a contrazione rapida e i muscoli contenenti fibre di tipo I a contrazione lenta di queste dimensioni non sono ancora stati descritti37. Ciò elimina la capacità di studiare il funzionamento specifico del tipo di fibra utilizzando questo metodo. Il protocollo che proponiamo qui potrebbe potenzialmente essere adattato per altri muscoli come l'EDL o il soleo per studiare le differenze di tipo di fibra. A causa delle loro dimensioni maggiori, questo protocollo dovrebbe essere ulteriormente ottimizzato per questi muscoli. Le fibre più lunghe tendono ad aggrovigliarsi durante la fase di sedimentazione gravitazionale e si rompono se manipolate mediante pipettaggio, il che porterebbe a una minore resa. A causa della loro incompatibilità con il pipettaggio, le fibre più lunghe sono, quindi, anche meno compatibili con la tecnica di incorporamento del gel. Le misurazioni di queste fibre possono ancora essere eseguite in un formato di coltura 2D, ma le fibre possono muoversi di più durante la contrazione a causa delle loro dimensioni, influenzando così il rapporto segnale-rumore. Un'altra limitazione di questo sistema è l'incapacità di eseguire misurazioni della forza accanto alle misurazioni contrattili, come quelle misurazioni della forza che possono essere ottenute utilizzando altri preparati di fibre muscolari intatte28. Tuttavia, questa limitazione può essere aggirata stimando la forza generata dalla fibra muscolare. La forza generata delle fibre muscolari può essere stimata se la forma della fibra muscolare durante gli stati contratti e rilassati e il modulo di Young della matrice sono noti25. Tuttavia, questo sistema basato sull'ottica fornisce un approccio facile da usare e ad alto rendimento per lo studio della funzione contrattile muscolare e apre una serie di nuove possibilità per lo studio delle malattie muscolari genetiche e degli interventi terapeutici.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes ed Emmy Manders per la loro competenza tecnica nello sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato da premi della Muscular Dystrophy Association (Development Award MDA603238 a T.J.K), della Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) e del National Health and Medical Research Council (NHMRC, Australia; Fellowship APP1121651 a M.Y).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
References
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