Summary
A função muscular esquelética pode ser avaliada pela quantificação da contratilidade de fibras musculares isoladas, tradicionalmente utilizando abordagens trabalhosas e de baixo rendimento. Aqui, descrevemos um método óptico de alto rendimento para quantificar a contratilidade de fibras musculares emblocadas em hidrogel. Essa abordagem tem aplicações na triagem de fármacos e no desenvolvimento terapêutico.
Abstract
A cultura de células in vitro é uma ferramenta poderosa para avaliar processos celulares e testar estratégias terapêuticas. Para o músculo esquelético, as abordagens mais comuns envolvem a diferenciação de células progenitoras miogênicas em miotubos imaturos ou a cultura ex vivo de curto prazo de fibras musculares individuais isoladas. Um dos principais benefícios da cultura ex vivo sobre a in vitro é a retenção da arquitetura celular complexa e das características contráteis. Aqui, detalhamos um protocolo experimental para o isolamento de fibras musculares flexoras curtas intactas de camundongos e sua subsequente cultura ex vivo. Nesse protocolo, as fibras musculares são embutidas em hidrogel à base de fibrina e matriz de membrana basal para imobilizar as fibras e manter sua função contrátil. Em seguida, descrevemos métodos para avaliar a função contrátil da fibra muscular usando um sistema óptico de contratilidade de alto rendimento. As fibras musculares emblocadas são estimuladas eletricamente para induzir contrações, após o que suas propriedades funcionais, como encurtamento do sarcômero e velocidade contrátil, são avaliadas por meio de quantificação óptica. O acoplamento da cultura de fibras musculares com esse sistema permite testes de alto rendimento dos efeitos dos agentes farmacológicos na função contrátil e estudos ex vivo de distúrbios musculares genéticos. Finalmente, este protocolo também pode ser adaptado para estudar processos celulares dinâmicos em fibras musculares usando microscopia de células vivas.
Introduction
Os avanços nas técnicas de cultura de células in vitro abriram novas possibilidades para o estudo da capacidade regenerativa tecidual, dos mecanismos fisiopatológicos celulares e das estratégias terapêuticas subsequentes, utilizando tecidos de mamíferos em condições bem controladas 1,2,3. O uso de sistemas de cultivo in vitro está bem estabelecido no campo da pesquisa muscular 4,5. Em geral, utilizam-se miotubos imaturos diferenciados in vitro a partir de células progenitoras miogênicas 2,6,7,8. Embora tenham sido feitos progressos no protocolo de diferenciação para gerar fibras musculares maismaduras9, sua imaturidade ainda limita a tradução dos achados para um cenário in vivo1,10. Uma questão central no campo da biologia muscular é a incapacidade dos miotubos in vitro diferenciados em sintetizar completamente as complexas estruturas intracelulares, processos de sinalização celular e interações extracelulares observadas no tecido muscular nativo e, importante, recapitular as forças contráteis produzidas pelas fibras musculares 1,2,10,11,12 . Além disso, a contração incoordenada dos miotubos durante o processo de diferenciação muitas vezes resulta em descolamento espontâneo das placas de cultura, tornando a avaliação contrátil dos miotubos diferenciados in vitro desafiadora e restrita à avaliação qualitativa ou semiquantitativa8,11,12,13. Essas limitações frequentemente requerem experimentos in vivo regulares com animais, particularmente se a contratilidade muscular for um resultado experimental primário1.
Uma alternativa à cultura em miotubos diferenciados in vitro é a cultura ex vivo de fibras musculares maduras isoladas 1,14. Durante o cultivo ex vivo, o tecido muscular maduro em desenvolvimento é retirado do corpo, seguido de isolamento unicelular para cultivo em condições de laboratório 1,14. As fibras musculares maduras isoladas mantêm suas complexas estruturas celulares observadas no interior do tecido nativo14,15, e esse método abre a possibilidade de intervenções diretas, como manipulação genética e triagem de drogas, em um ambiente de cultura bem definido e controlável. Um dos primeiros relatos sobre isolamento de fibras musculares esqueléticas e cultura ex vivo data da década de 1930; entretanto, o rendimento das fibras viáveis desse protocolo foi baixo16. Com a otimização contínua do procedimento de isolamento e das condições de cultura, é possível uma melhora significativa na quantidade de fibras musculares viáveis e funcionais14,15,17,18,19. Uma dessas melhorias nas condições de cultura envolve o revestimento de placas de cultura com proteínas da matriz extracelular para promover a aderência das fibras musculares isoladas na placa de cultura15,18,20. Usualmente, utiliza-se o revestimento de laminina, uma vez que a laminina é um dos elementos mais abundantes dentro da matriz extracelular dos músculos20,21. A otimização do procedimento de isolamento, aliada ao revestimento das placas de cultura, permitiu ao campo de pesquisa muscular manter isoladas fibras musculares viáveis com arquitetura celular intacta e funcionalidade contrátil em cultura por curtos períodos de tempo 1,15,18,22.
A abordagem mais convencional utilizada dentro do campo muscular para medir a força e as capacidades contráteis é montar fibras musculares individuais entre um motor condutor de comprimento e um transdutor de força23,24. Em geral, as fibras musculares utilizadas para essas montagens motoras são dissecadas a partir de tecido fresco ou congelado por encaixe, seguido de permeabilização ou "skinning", que permite a ativação externa do cálcio, onde concentrações variáveis de cálcio são usadas para induzir a contração das fibras musculares24. Embora esse método seja o padrão-ouro para medidas contráteis das fibras musculares, apenas uma única fibra muscular pode ser medida por vez, tornando essa técnica um procedimento trabalhoso edemorado25. Além disso, o procedimento de isolamento e esfolamento das fibras musculares rompe as diversas estruturas envolvidas no acoplamento excitação-contração (ou seja, liberação de cálcio e posterior recaptação para o retículo sarcoplasmático), não permitindo o estudo da cinética de relaxamento e de quaisquer doenças que possam afetar esse processo26,27. Uma alternativa ao preparo das fibras esfoladas é o uso da dissecção mecânica para isolar as fibras musculares intactas, onde as forças contráteis podem ser medidas em resposta à ativação elétrica28; no entanto, essa abordagem é tecnicamente desafiadora e muito demorada, resultando em medições de baixo rendimento. Por fim, tanto na preparação esfolada quanto na íntegra, as células musculares são completamente removidas do meio extracelular durante as medidas contráteis 24, impossibilitando a investigação do efeito da composição/rigidez da matriz extracelular na contração das fibras musculares24. Como resultado, o desenvolvimento de métodos alternativos é necessário para permitir medidas de contratilidade das fibras musculares intactas isoladas de uma maneira de alto rendimento, recriando a conexão entre as fibras musculares e a matriz extracelular.
Recentemente, uma nova abordagem óptica para medidas de contratilidade de fibras musculares de alto rendimento foi desenvolvida29. Este sistema óptico mede a periodicidade dos sarcômeros para avaliar o comprimento dos sarcômeros durante a contração usando imagens de alta velocidade. Dentro desse sistema, as células permanecem na placa de cultura enquanto a ótica é movimentada, minimizando o tempo necessário entre as medidas de múltiplas células29. Uma grande vantagem do uso dessa abordagem óptica de alto rendimento é que ela permite o desenvolvimento de condições de cultura semelhantes às do tecido nativo. Uma abordagem utilizada para mimetizar condições nativas in vivo é a incorporação de células em hidrogéis30. Tipicamente, um hidrogel é um material viscoelástico capaz de manter seu volume e forma, e os hidrogéis têm as propriedades de materiais sólidos e líquidos31. A parte sólida consiste em cadeias poliméricas reticuladas entre si, criando uma estrutura que se parece com uma rede30,31. As propriedades materiais dos hidrogéis podem ser ajustadas para mimetizar a deposição da matriz dos músculos30,31. Assim, a combinação de um sistema óptico de alto rendimento com células embutidas em hidrogéis abre novas possibilidades para avaliar os efeitos da composição da matriz extracelular e das propriedades mecânicas sobre a funcionalidade das fibras musculares.
O objetivo geral deste trabalho é 1) descrever a metodologia para o isolamento enzimático e cultura ex vivo de fibras musculares em condições que mimetizam o ambiente do tecido nativo e 2) avaliar a contratilidade das fibras musculares usando uma abordagem de alto rendimento. Descrevemos uma metodologia detalhada para isolar facilmente um grande número de fibras musculares únicas do músculo flexor curto dos dedos (FDB) usando digestão enzimática. Além disso, descrevemos uma técnica para incorporar as fibras musculares isoladas em um hidrogel à base de fibrina com o objetivo de mimetizar o ambiente nativo dos músculos e melhorar a viabilidade e contratilidade das fibras musculares. Em seguida, descrevemos um método de alto rendimento para medir as contrações de fibras musculares vivas in vitro usando este sistema recentemente desenvolvido. Uma vantagem adicional desse procedimento de incorporação é a imobilização das fibras durante a contração, o que pode melhorar a relação sinal-ruído dessas medidas. Este método de incorporação em gel é aplicável tanto para procedimentos de encapsulação de gel monopolimérico quanto compósito, facilitando a avaliação dos efeitos da composição da matriz extracelular na contratilidade das fibras musculares.
Protocol
Para os estudos de contração ex vivo , o tecido post-mortem foi obtido de animais sacrificados para outros projetos de pesquisa aprovados e/ou excedentes reprodutivos da Universidade VU de acordo com a Diretiva do Conselho Europeu (2010/63/UE) por permissão da Lei de Pesquisa Animal dos Países Baixos.
1. Preparação do material
- Preparar pipetas para trituração (armazenar em etanol 70% em um gabinete de fluxo até o uso). Corte as extremidades de duas pontas P1.000 para criar diferentes tamanhos de furos; Certifique-se de que o orifício é grande o suficiente para o músculo passar sem bloquear a pipeta. Passe as pontas cortadas através de uma chama para que fiquem lisas.
- Preparar pratos Sylgard conforme descrito em outra parte32 e esterilizar com etanol 70% com antecedência para uso na fixação da pata e do músculo durante o isolamento.
OBS: As placas Sylgard podem ser reutilizadas após limpeza completa com água deionizada e etanol 70%. - Preparar as seguintes soluções antes do procedimento de isolamento: meio de dissecção, meio de cultura de fibrina e meio de digestão muscular (ver Tabela 1).
NOTA: O meio de digestão muscular deve ser esterilizado por filtro usando um filtro de 0,22 μm. Todas as soluções preparadas devem ser equilibradas numa incubadora de cultura celular padrão a 37 °C e 5% de CO2 durante, pelo menos, 30 minutos antes da utilização. - Após a digestão muscular, preparar as seguintes soluções para fundir o hidrogel: mistura celular e mistura de matriz (ver Tabela 2). Combinar a mistura celular e a mistura de matriz numa proporção de 1:1 para uma concentração final de fibrina de 2,5 mg/ml.
NOTA: Prepare a matriz sobre gelo e use pontas de pipeta pré-resfriadas para evitar a polimerização prematura da matriz da membrana basal. A relação trombina:fibrinogênio de 1:10 (unidades por mg de fibrinogênio) utilizada aqui foi otimizada para um tempo de polimerização de 30 min. Se o gel polimerizar dentro de 30 min, uma concentração menor de trombina deve ser usada. Consulte a discussão para obter mais informações.
2. Dissecção do músculo FDB
- Eutanásia do camundongo por luxação cervical. Desinfetar o membro posterior com álcool a 70%.
- Corte a parte inferior da perna traseira acima do tornozelo. Abra a pele no lado dorsal do pé em direção aos dedos dos pés.
NOTA: Corte a perna traseira inferior na articulação do tornozelo para evitar danos aos músculos dos membros inferiores e tíbia, se forem necessários mais tarde. - Descasque cuidadosamente a pele em direção aos dedos dos pés. Tenha cuidado para não danificar o músculo. O FDB é o músculo mais superficial do lado ventral do pé.
- Colocar o pé dissecado numa placa Sylgard com 10 ml de meio de dissecção pré-aquecido a 37 °C. Fixe o pé através da pele que ainda está presa aos dedos dos pés e fixe a perna além do tornozelo.
- Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo em cima do músculo. Corte o tendão no calcanhar e levante o músculo pelo tendão.
- Corte ao lado e por baixo do músculo através do tecido conjuntivo. Continue cortando até que os tendões dos dedos dos pés estejam expostos.
- Quando metade do comprimento dos três tendões estiver exposta, corte os tendões e libere o músculo do pé. OPCIONAL: Aparar o quarto tendão lateral e suas fibras musculares.
- Limpe o tecido conjuntivo do músculo e transfira para um tubo contendo meio de dissecção pré-aquecido.
3. FDB digestão muscular
- Preparar o meio de digestão muscular de acordo com a Tabela 1.
- Transfira os músculos FDB para o meio de digestão muscular usando uma pipeta sorológica. Incubar em incubadora de cultura de tecidos a 37 °C e 5% CO2 por 80 min.
NOTA: Este tempo deve ser otimizado para cada lote de colagenase. A digestão é completa quando o músculo começa a se desgastar e parece aumentado. Veja a discussão para a otimização do tempo de digestão. - Após a digestão, transferir o músculo para um tubo de 15 mL contendo 3 mL de meio de dissecção e incubar por 30 min antes da trituração.
4. Trituração muscular FDB e sedimentação por gravidade
- Triturar o músculo usando as pontas de trituração previamente preparadas (passo 1.1) pipetando o músculo, passando do maior para o menor tamanho. Se esta etapa demorar mais de 5 min, coloque o músculo na incubadora por 5 min para permitir que ele descanse.
- Triturar até que as fibras musculares tenham saído principalmente do tendão e o tendão possa passar por uma ponta P200. Remova os tendões.
- Adicionar as fibras FDB dissociadas a um tubo de 15 mL contendo 10 mL de meio de dissecção e deixar as fibras se depositarem na incubadora por 20 min. Observe a pelota formada.
- Opcional: Retire 10 ml de meio da parte superior e repita o passo 4.3. Esta etapa facilita a remoção do excesso de detritos e células mononucleadas associadas.
5. Incorporação de fibra FDB
- Retire cuidadosamente todo o meio da parte superior do pellet de fibra. Ressuspender as células em 875 μL de mistura celular por músculo FDB (sobre gelo).
NOTA: Um músculo FDB produz fibras suficientes para sete poços de uma placa de 24 poços. Essa densidade pode ser ajustada de acordo com as necessidades do experimento. O seguinte volume de gel (250 μL) é otimizado para um formato de 24 poços, mas pode ser dimensionado de acordo com outros formatos. - Alíquota 125 μL da mistura celular em tubos de microcentrífuga simples.
- Um poço de cada vez, adicione 125 μL de mistura de matriz a uma alíquota de suspensão de células e misture pipetando para cima e para baixo cuidadosamente, evitando a formação de bolhas.
- Transfira imediatamente a mistura final para um poço.
NOTA: Certifique-se de pipetar a mistura para o meio do poço. Repita as etapas 5.3 e 5.4 para cada poço. - Solidificar os géis em uma incubadora por 30-45 min. Após a solidificação, adicionar cuidadosamente o meio de cultura aos poços.
NOTA: A pipetagem rápida pode separar o hidrogel do poço. A partir deste ponto, as fibras podem ser estimuladas e medidas. No entanto, em nossa experiência, deixar que as fibras se ajustem às condições de cultura por 24 h pode melhorar a contratilidade das fibras. - Para uma cultura mais longa, reabasteça o meio de cultura pela metade a cada 2 dias. Para fazer isso, remova metade do meio de cultura e substitua-o por uma quantidade igual de meio fresco.
6. Medidas contráteis baseadas em óptica
- Ligue o sistema de medição contrátil baseado em óptica (consulte a Tabela de Materiais), a lâmpada de fluorescência, o pacer de célula elétrica e o computador. Ajuste o estimulador elétrico para 1,0 Hz, 10,0 V e duração de pulso de 5,00 ms para estimular as fibras musculares isoladas.
- Insira a placa no sistema de medição. Conecte o pacer ao inserto de estimulação e insira-o na placa de cultura.
- Abra o programa IonWizard, e abra um novo arquivo clicando em Arquivo (canto superior esquerdo da tela) | Novo.
- Verifique se o programa está no experimento correto, Skeletal Sarcomere, clicando em Novo | Colete Experimento. Para alterar o experimento, clique no experimento desejado e pressione adicionar. Para o experimento de sarcômero esquelético , aplicar as seguintes configurações: Sarc 20x, linhas médias, FFT simples, taxa de amostragem de 250 Hz e tempo de aquisição de 10 s.
NOTA: Os cenários experimentais devem ser preparados antes do experimento. As configurações podem ser ajustadas às necessidades do experimento. - Ajustar a temperatura do sistema de medição para 25 °C. Clique em abrir o localizador de células sob a barra de ferramentas e aguarde até que uma nova tela apareça. No canto superior direito desta tela, selecione o tipo de placa e os poços ativos.
NOTA: As medidas são realizadas a 25 °C para reduzir a velocidade de contração das fibras musculares FDB de contração rápida, evitando assim a subamostragem do evento contrátil. - Coloque as fibras em foco ajustando a barra deslizante de foco. Como alternativa, use a tecla W e a tecla S para essa função de foco.
- Ative o ritmo para iniciar a estimulação elétrica. Observe que as fibras agora começam a se contrair.
NOTA: Se nenhuma fibra estiver se contraindo, certifique-se de que todos os fios estejam conectados e que o pacer esteja completamente submerso. Se depois disso ainda não houver movimento, as fibras podem não estar respondendo devido à digestão excessiva ou danos excessivos durante a trituração. - Concentre a área de medição na extremidade de uma fibra de tal forma que os sarcômeros corram verticalmente. Certifique-se de que os sarcômeros estão em foco. Se os sarcômeros estiverem em foco, um único pico será visível na barra de ferramentas. Durante a contração, esse pico se moverá para a direita à medida que o sarcômero encurta.
NOTA: A área de medição roxa pode ser ajustada antes de iniciar o experimento. Para garantir uma medição adequada, inclua ~20 sarcômeros. Se esse pico muda de forma durante a contração, isso pode indicar que o sarcômero está obscurecido ou fora de foco durante a contração, o que introduz ruído. - Inicie o experimento clicando em Iniciar na barra de ferramentas. Pressione a tecla Q para iniciar uma medição e aguarde até que o programa meça 10 transientes de contração. Se mais de quatro transientes parecerem livres de ruído, aceite a medição pressionando a tecla Z . Se os transientes tiverem muito ruído, rejeite a medição pressionando a tecla X .
- Meça entre 10 fibras e 20 fibras por condição. Os locais das fibras previamente medidas são mantidos.
- Opcional: Adicione compostos, após o que as fibras podem ser remedidas neste ponto.
- Quando o experimento terminar, pressione o botão parar na barra de ferramentas inferior para fechar a janela do localizador de células. Salve o arquivo e inicie um novo arquivo.
- Para analisar os dados, abra o programa "Cytosolver desktop". Clique em importar e selecione o(s) arquivo(s) a ser analisado(s).
- Depois que o programa terminar a análise, procure por picos azuis, vermelhos e cinzas. Os picos azuis são transitórios que são aceitos pelo programa. Os picos vermelhos são transitórios que são rejeitados pelo programa, e os picos cinzas são transitórios rejeitados pelo usuário.
NOTA: Os critérios de rejeição podem ser ajustados no software de análise. Em geral, os valores são rejeitados se excederem um limite máximo de derivada, e os transientes são rejeitados com base em valores de ajuste de curva R2 de <0,95. - Clique em exportar. Marque as seguintes caixas: Dados transitórios médios e exporte para o Excel.
- Quando terminar, desligue todas as máquinas. Retire a placa de cultura e descarte-a. Limpe os eletrodos do pacer com água deionizada e etanol 70%.
Representative Results
Por meio desse protocolo, fibras musculares únicas de FDB foram isoladas e incluídas em hidrogel. Uma visão geral do procedimento de dissecção muscular é mostrada na Figura 1. O músculo FDB é exposto com tendões intactos e cortado da fáscia. A manutenção dos tendões dos músculos como pontos de fixação minimiza possíveis danos às fibras musculares durante o procedimento de isolamento. O excesso de tecido conjuntivo pode ser cortado para reduzir os detritos e o crescimento de tipos celulares secundários. Uma vez que o músculo tenha sido excisado e limpo suficientemente, o músculo é digerido enzimaticamente usando colagenase, e fibras musculares únicas são liberadas por trituração antes de incorporar as células isoladas em hidrogéis. O isolamento das fibras musculares FDB fornece fibras musculares relativamente curtas, que têm a vantagem de serem facilmente manipuladas. Devido ao seu tamanho, as fibras musculares FDB podem ser pipetadas com segurança sem danos induzidos por emaranhado e são facilmente embutidas dentro de um hidrogel. Como as fibras musculares individuais não aderem muito bem às placas de cultura, a incorporação das fibras em hidrogel garante que as fibras permaneçam colocadas durante a cultura celular e as medidas contráteis. Além disso, a adição de uma matriz de membrana basal ao gel de fibrina permite interações entre as fibras musculares e a matriz, mimetizando o ambiente nativo in vivo . Fibras musculares isoladas podem ser manipuladas e mantidas em cultura por vários dias após o isolamento. Na Figura 2, um exemplo de fibras FDB isoladas embutidas em uma matriz de hidrogel é mostrado. As fibras sadias têm sarcômeros visíveis e são esticadas retas (seta azul), enquanto as fibras curvas são tipicamente danificadas ou inviáveis (seta amarela) e devem ser excluídas das medidas. As fibras hipercontraídas aparecem como objetos escuros na matriz (seta vermelha). Se o procedimento de isolamento foi bem-sucedido, a proporção de fibras saudáveis deve ser de ~75%. Uma proporção maior de fibras hipercontraídas geralmente indica danos durante o procedimento de isolamento. A membrana das fibras musculares pode ser danificada por superdigestão do músculo ou danos às fibras durante a trituração. O dano da trituração ocorre principalmente se o músculo é subdigerido e, portanto, não se desfaz facilmente.
A funcionalidade e viabilidade das fibras foram avaliadas através de medidas contráteis das fibras musculares utilizando um sistema óptico de medição contrátil de alto rendimento. O sistema produz vários parâmetros, como o comprimento do sarcômero, porcentagem de encurtamento do sarcômero, velocidade contrátil e velocidade de relaxamento. Usando o sistema de medida contrátil, a contração do sarcômero pode ser medida por fibra muscular. A Figura 3 mostra exemplos de contrações de fibras musculares medidas por meio do sistema de mensuração. A partir de um único transiente de contração, obtêm-se os seguintes parâmetros: comprimento do sarcômero basal, duração da contração, comprimento do sarcômero na contração máxima e duração do relaxamento (Figura 3A). Esses parâmetros são usados para calcular a porcentagem de velocidades de encurtamento, contração e relaxamento do sarcômero. Os valores de velocidade média também podem ser calculados a partir dos valores de duração e encurtamento absoluto, se necessário. Uma medida de contração válida apresenta uma linha de base reta, seguida por um mergulho até o pico e um retorno à linha de base (Figura 3A). Ruído, sarcômeros sem foco ou movimento aberrante da fibra podem influenciar a medida transitória (Figura 3B,C), e essas medidas podem ser descartadas manualmente ou serão rejeitadas pelo programa de análise. Nessa abordagem, a visualização clara dos sarcômeros é importante para medir as contrações; assim, qualquer coisa que reduza a visibilidade dos sarcômeros pode introduzir ruído. Isso pode ocorrer se houver movimento do sarcômero fora do plano focal durante a contração. Medidas em que uma série de contrações diferem em velocidade ou profundidade também devem ser excluídas do conjunto de dados.
Os dados contráteis de fibras musculares isoladas obtidos com esse sistema podem ser usados para comparar diferentes condições de cultura. A eficácia do sistema está ilustrada na Figura 4. Aqui, medimos as contrações das fibras musculares FDB em ambos os formatos de cultura 2D (placas de cultura revestidas com laminina) e 3D (hidrogel de fibrina). Uma maior porcentagem de medidas utilizáveis foi obtida em 3D, pois a incorporação das fibras no gel impediu que o movimento lateral e outros artefatos de movimento influenciassem a medida (Figura 4A). A incorporação das fibras não teve efeito significativo nos valores de encurtamento e velocidade máxima de contração do sarcômero em relação às fibras cultivadas em 2D (Figura 4B). Para ilustrar como diferentes matrizes influenciam a contração das fibras musculares FDB, também comparamos esse hidrogel de fibrina com uma matriz pura de membrana basal (4 mg/mL) (Figura 4C). A redução da contratilidade observada na matriz pura da membrana basal foi provavelmente devida à rigidez do gel ou ao aumento das interações célula-matriz. Concentrações de fibrina de até 7 mg/mL também foram testadas, sem efeito significativo sobre a velocidade contrátil e o encurtamento (dados não publicados). O uso deste hidrogel à base de fibrina garante interferência mínima com os parâmetros contráteis.
Figura 1: Visão geral do procedimento de dissecção muscular do DFB. (A) O membro posterior é cortado acima do tornozelo (linha tracejada vermelha), e (B) a pele é removida cortando-se ao longo da parte superior do pé ao longo da linha tracejada azul. (C) O pé é fixado através do tornozelo e a pele nos dedos dos pés. (D) Visão microscópica do músculo exposto e do tecido conjuntivo circundante. A fáscia é visível como uma camada branca opaca através da qual a vasculatura corre. (E) A fáscia é removida do músculo, e o tendão é cortado ao longo da linha tracejada vermelha. (F) O músculo FDB é separado do tecido subjacente levantando e cortando abaixo e ao lado do músculo. (G) Quando os tendões dos dedos dos pés são claramente visíveis, o FDB é cortado ao longo da linha tracejada vermelha. (H) O FDB é fixado pelos tendões, e o quarto tendão lateral e suas fibras podem ser removidos cortando-se ao longo da linha tracejada vermelha. O excesso de fáscia agora pode ser cortado.(I) Após a limpeza, o músculo FDB é transferido para a solução de colagenase. Barras de escala = (D-I) 2 mm. Abreviação: FDB = flexor digitorum brevis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem microscópica das fibras musculares FDB embebidas em hidrogel após 24 h de cultura. Seta azul: Exemplo de fibra muscular FDB viável. Seta amarela: Exemplo de uma fibra muscular FDB torcida. Fibras musculares torcidas podem apresentar viabilidade reduzida e contrações prejudicadas e, portanto, devem ser excluídas das medidas. Seta vermelha: Exemplo de uma fibra muscular FDB hipercontraída. A hipercontração excessiva ocorre quando a trituração é realizada com muito vigor ou pode ser causada por superdigestão de colagenase ou pelo uso de meio de cultura não equilibrado. Barra de escala = 100 μm. Abreviação: FDB = flexor digitorum brevis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de transientes de contração de fibras medidos usando o sistema contrátil de alto rendimento baseado em óptica. (A) Exemplo de contração normal transitória. Este transiente é obtido a partir dos sarcômeros fechados pelo quadrado roxo mostrado na barra de ferramentas inferior. O transitório consiste nos seguintes componentes: comprimento do sarcômero na linha de base (verde), duração da contração (azul), comprimento do sarcômero na contração máxima (roxo) e duração do relaxamento (vermelho). A partir desses valores, são calculados parâmetros como velocidade e porcentagem de contração. (B) Exemplo de contração inadequada transitória. Essas medições ocorrem quando o sinal do sarcômero não é captado devido ao ruído (veja setas vermelhas). (C) Exemplo de um transiente de contração que possui um artefato de movimento (ver setas verdes). Os artefatos de movimento ocorrem quando a fibra muscular se move para fora do foco durante a contração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dados representativos obtidos usando o sistema contrátil de alto rendimento baseado em óptica ao comparar condições 2D versus 3D e diferentes hidrogéis . (A) Porcentagem de medidas de contração aceitas e rejeitadas encontradas pelo programa de análise de dados em cultura 2D e em cultura 3D com base em 30 medidas. (B) Comparação da velocidade máxima de contração em culturas 2D e 3D de fibras musculares isoladas de três camundongos após 24 h de cultura. (C) Comparação do encurtamento do sarcômero em fibras musculares cultivadas em 2D e 3D isoladas de três camundongos após 24 h de cultura. (D) Comparação da velocidade máxima de contração de fibras musculares emblocadas em matriz de membrana basal pura (Matrigel) e fibrina hidrogel isoladas de três camundongos após 24 h de cultura. (E) Comparação do encurtamento do sarcômero de fibras musculares emblocadas em matriz de membrana basal pura (Matrigel) e hidrogel de fibrina isoladas de três camundongos após 24 h de cultura. Os dados foram analisados por meio do teste t de Student e apresentados como média ± DP. Cada ponto de dados é uma fibra muscular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Composição do meio de dissecção utilizado para dissecar o músculo, do meio de cultura de fibrina utilizado para cultura das fibras musculares isoladas e do meio de digestão muscular utilizado para digerir enzimaticamente os músculos isolados. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Composição da mistura celular utilizada para fundir os hidrogéis e da matriz utilizada para fundir os hidrogéis. Clique aqui para baixar esta tabela.
Discussion
Aqui, detalhamos um protocolo para realizar o isolamento enzimático e cultura de fibras musculares FDB em um formato de cultura 3D, seguido de medidas contráteis usando um sistema de medição contrátil baseado em óptica. Este protocolo tem uma série de vantagens, incluindo o 1) isolamento direto e oportuno de muitas fibras musculares intactas de um único músculo; 2) a incorporação das fibras musculares em uma matriz de hidrogel ajustável; 3) a realização de medidas de contratilidade de alto rendimento utilizando o sistema baseado em óptica; e 4) a capacidade de realizar medidas repetidas das mesmas fibras musculares após uma intervenção. O isolamento de fibras musculares vivas únicas fornece células musculares maduras que mantêm sua função contrátil. Como as fibras musculares obtidas do FDB de camundongos são relativamente pequenas, elas são facilmente manipuladas durante o isolamento e mantêm sua forma reta, permitindo medidas contráteis a jusante. Embora o sistema tenha sido desenvolvido primariamente para estudar a contração dos cardiomiócitos, as fibras musculares esqueléticas contêm a mesma maquinaria contrátil com padrões de sarcômeros facilmente distinguíveis e, portanto, também podem ser medidas por meio desse sistema29. O acoplamento de medidas contráteis unicelulares com cultura de fibra muscular viva ex vivo é uma ferramenta poderosa para avaliar a saúde e a função da fibra muscular madura em resposta à ativação elétrica.
Uma limitação do uso de fibras musculares dissociadas é a falta de forças externas (isto é, alongamento passivo) aplicadas às fibras, o que resulta em menores comprimentos de sarcômeros em repouso em comparação com aqueles encontrados in vivo. Embora um comprimento de sarcômero de 2,4-2,5 μm garanta uma produção de força ideal, o comprimento do sarcômero em repouso pode variar muito33. Embora o comprimento do sarcômero em repouso in vivo do FDB ainda não tenha sido descrito, nossos próprios dados não publicados sugerem um comprimento médio de 2,2 μm. Os resultados atuais mostram um comprimento médio do sarcômero em repouso de ~1,95 μm em fibras FDB descarregadas após 24 h em cultura (Figura 3). Embora esse menor comprimento do sarcômero em repouso resulte em menor produção de força, um comprimento de ~1,95 μm ainda deve produzir >90% da força máxima34. Como tal, esses comprimentos de sarcômero devem ser suficientes para determinar diferenças na função da fibra entre diferentes modelos genéticos ou após tratamentos medicamentosos. Além disso, a incorporação de fibras em um hidrogel fornece muitos pontos adicionais para adesão em comparação com fibras cultivadas 2D flutuantes, o que limitaria o encurtamento adicional do sarcômero ao longo do tempo.
Uma vantagem desse protocolo de isolamento das fibras musculares é a utilização de um músculo de contração rápida facilmente dissecado, constituído por fibras musculares relativamente pequenas, quando comparado a outros músculos, como o extensor longo dos dedos (EDL). Seu tamanho menor torna o isolamento muscular mais adequado para a separação baseada em trituração, reduzindo assim a chance de danos induzidos por pipetas ou emaranhados nas fibras musculares. A matriz extracelular dos músculos FDB pode ser facilmente digerida enzimaticamente com colagenase, permitindo o isolamento de centenas de fibras musculares em um curto período de tempo. No entanto, a digestão excessiva pode levar a danos às fibras musculares. A superdigestão das fibras musculares pode ser reconhecida quando o músculo se desfaz quase instantaneamente ao triturar o músculo ou quando uma grande proporção do volume celular é hipercontraída durante o procedimento de semeadura celular. Para evitar a digestão excessiva do músculo, o tempo de digestão precisa ser otimizado para cada lote de colagenase. Para testar isso, dois músculos FDB devem ser digeridos em paralelo com um tempo de digestão escalonado de 5 min entre eles. O tempo de digestão com maior rendimento de fibras musculares viáveis deve ser escolhido. Esta otimização deve então ser realizada uma segunda vez, novamente com 5 min de separação no tempo de digestão. O tempo de digestão que produz as maiores fibras musculares viáveis deve ser usado como o tempo ideal de digestão para o lote atual de colagenase. Outra maneira de limitar a variabilidade lote a lote da colagenase seria calcular diretamente as unidades de atividade por mililitro de solução estoque e, em seguida, reconstituir os lotes subsequentes de colagenase na mesma quantidade. Por fim, os tempos de digestão podem precisar ser otimizados em diferentes linhagens de camundongos, por exemplo, se estudarmos animais idosos ou doentes que apresentam aumento da deposição de matriz extracelular35,36.
A possibilidade de pipetagem de fibras musculares isoladas viáveis abre possibilidades para o cultivo de fibras musculares FDB em diversas condições de cultura. Uma dessas opções é a cultura dessas fibras em hidrogéis para mimetizar o ambiente de cultura de tecidos nativos. Este protocolo de incorporação garante que as fibras permaneçam no lugar durante as medições contráteis e foi otimizado para permitir que as fibras se depositem no fundo da placa antes que o gel se fixe. No entanto, esse protocolo pode precisar ser ajustado para acomodar diferenças nos estoques de trombina e fibrinogênio. Se a atividade da trombina for muito alta, o gel se fixará prematuramente, e as fibras podem ficar suspensas em locais mais altos fora do plano focal do microscópio. Se isso acontecer, a relação trombina:fibrinogênio precisa ser ajustada. Isso pode ser testado plaqueando fibras em concentrações cada vez mais baixas de trombina e anotando quanto tempo leva a polimerização. Normalmente, isso não deve acontecer mais rápido do que 30 min. No entanto, ter uma concentração de trombina muito baixa também pode prejudicar o processo de polimerização. Outro método para garantir que as fibras estejam no plano focal correto é primeiro semeá-las usando um protocolo 2D e, em seguida, adicionar uma camada de hidrogel sobre as fibras depois que elas aderiram à placa de cultura. No entanto, deve-se estar ciente de que a remoção do meio das fibras pode induzir hipercontração, pois elas são sensíveis ao ressecamento. Também não está claro se o hidrogel se fixará totalmente à placa de cultura, e ele pode se soltar mais facilmente. Portanto, esse procedimento de incorporação é preferível para manter as fibras viáveis e no lugar para medidas de contração.
O uso deste protocolo possibilita o estudo da dinâmica contrátil de fibras musculares maduras ex vivo e pode ser aplicado tanto em camundongos sadios quanto naqueles portadores de mutações genéticas para doenças musculares. Da mesma forma, permite testar como as condições de cultura ou a adição de compostos afetam a função das fibras musculares. Os dados contráteis obtidos usando o sistema baseado em óptica fornecem uma indicação da capacidade contrátil de fibras musculares únicas vivas, e mudanças nessa habilidade podem ser correlacionadas com a saúde das fibras. Esses dados, por si só, não são, no entanto, suficientes para determinar se essas alterações ocorrem na ponte cruzada actina-miosina ou nos estágios de liberação de cálcio da contração muscular. Embora não tenhamos descrito métodos para medir a sinalização do cálcio nesse protocolo, essa configuração também é capaz de medir transientes de cálcio à base de Fura em células musculares em contração29. Uma desvantagem desse sistema é que o músculo FDB contém apenas fibras musculares de contração rápida tipo IIa/IIx, e músculos contendo fibras de contração lenta tipo I desse tamanho ainda não foramdescritos37. Isso elimina a capacidade de estudar o funcionamento específico do tipo de fibra usando esse método. O protocolo que propomos aqui poderia ser potencialmente adaptado para outros músculos, como o EDL ou o sóleo, para estudar diferenças de tipo de fibra. Devido ao seu tamanho maior, esse protocolo precisaria ser otimizado ainda mais para esses músculos. Fibras mais longas tendem a se emaranhar durante a etapa de sedimentação por gravidade e se rompem se manipuladas por pipetagem, o que levaria a um menor rendimento. Devido à sua incompatibilidade com a pipetagem, fibras mais longas são, portanto, também menos compatíveis com a técnica de inclusão em gel. As medidas dessas fibras ainda podem ser feitas em formato de cultura 2D, mas as fibras podem se mover mais durante a contração devido ao seu tamanho, afetando a relação sinal-ruído. Outra limitação desse sistema é a incapacidade de realizar medidas de força ao lado das medidas contráteis, como aquelas medidas de força que podem ser obtidas usando outras preparações de fibras musculares intactas28. No entanto, essa limitação pode ser contornada estimando-se a força gerada pela fibra muscular. A força gerada pelas fibras musculares pode ser estimada se a forma da fibra muscular durante os estados contraído e relaxado, bem como o módulo de Young da matriz, são conhecidos25. No entanto, este sistema óptico fornece uma abordagem fácil de usar e de alto rendimento para estudar a função contrátil muscular e abre um leque de novas possibilidades para o estudo de doenças musculares genéticas e intervenções terapêuticas.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes e Emmy Manders por sua experiência técnica em ajudar a desenvolver este protocolo. Este trabalho foi apoiado por prêmios da Muscular Dystrophy Association (Development Award MDA603238 to T.J.K), da Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) e do National Health and Medical Research Council (NHMRC, Austrália; Fellowship APP1121651 para M.Y).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
References
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