Summary
Skelettmuskelfunktionen kan bedömas genom att kvantifiera kontraktiliteten hos isolerade muskelfibrer, traditionellt med hjälp av mödosamma, låggenomströmningsmetoder. Här beskriver vi en optikbaserad metod med hög genomströmning för att kvantifiera kontraktiliteten hos hydrogelinbäddade muskelfibrer. Detta tillvägagångssätt har tillämpningar för läkemedelsscreening och terapeutisk utveckling.
Abstract
In vitro cellodling är ett kraftfullt verktyg för att bedöma cellulära processer och testa terapeutiska strategier. För skelettmuskulatur innebär de vanligaste metoderna antingen differentiering av myogena stamceller i omogna myorör eller kortvarig ex vivo-kultur av isolerade enskilda muskelfibrer. En viktig fördel med ex vivo-odling jämfört med in vitro är bibehållandet av den komplexa cellulära arkitekturen och kontraktila egenskaper. Här beskriver vi ett experimentellt protokoll för isolering av intakta flexor digitorum brevis muskelfibrer från möss och deras efterföljande ex vivo-kultur . I detta protokoll är muskelfibrer inbäddade i en fibrinbaserad och basalmembranmatrishydrogel för att immobilisera fibrerna och bibehålla deras kontraktila funktion. Vi beskriver sedan metoder för att bedöma muskelfiberkontraktilfunktionen med hjälp av ett optikbaserat kontraktilitetssystem med hög genomströmning. De inbäddade muskelfibrerna stimuleras elektriskt för att inducera sammandragningar, varefter deras funktionella egenskaper, såsom sarkomerförkortning och kontraktilhastighet, bedöms med hjälp av optikbaserad kvantifiering. Koppling av muskelfiberodling med detta system möjliggör testning med hög genomströmning av effekterna av farmakologiska medel på kontraktil funktion och ex vivo-studier av genetiska muskelsjukdomar. Slutligen kan detta protokoll också anpassas för att studera dynamiska cellulära processer i muskelfibrer med hjälp av levande cellmikroskopi.
Introduction
Framsteg inom in vitro-cellodlingstekniker har öppnat nya möjligheter att studera vävnadsregenerativa förmågor, patofysiologiska cellulära mekanismer och efterföljande terapeutiska strategier, samtidigt som däggdjursvävnader används under välkontrollerade förhållanden 1,2,3. Användningen av in vitro-odlingssystem är väl etablerad inom muskelforskningsområdet 4,5. I allmänhet används in vitro-differentierade omogna myorör från myogena stamceller 2,6,7,8. Även om framsteg har gjorts i differentieringsprotokollet för att generera mer mogna muskelfibrer9, begränsar deras omogenhet fortfarande översättningen av resultaten till en in vivo-inställning 1,10. En central fråga inom muskelbiologifältet är oförmågan hos in vitro-differentierade myorör att fullständigt sammanfatta de komplexa intracellulära strukturerna, cellsignaleringsprocesserna och extracellulära interaktioner som observerats i inhemsk muskelvävnad och, viktigare, rekapitulera kontraktilkrafterna som produceras av muskelfibrer 1,2,10,11,12 . Dessutom resulterar den okoordinerade sammandragningen av myorör under differentieringsprocessen ofta i spontan frigöring från odlingsrätterna, vilket gör den kontraktila bedömningen av in vitro-differentierade myorör utmanande och begränsad till kvalitativ eller semikvantitativ utvärdering 8,11,12,13. Dessa begränsningar kräver ofta regelbundna in vivo-experiment med djur, särskilt om muskelkontraktilitet är ett primärt experimentellt resultat1.
Ett alternativ till odling i in vitro-differentierade myorör är ex vivo-kulturen av isolerade mogna muskelfibrer 1,14. Under ex vivo-odling skärs utvecklingsmässigt mogen muskelvävnad ut ur kroppen, följt av encellsisolering för odling under laboratorieförhållanden 1,14. De isolerade mogna muskelfibrerna bibehåller sina komplexa cellulära strukturer observerade i den ursprungliga vävnaden14,15, och denna metod öppnar möjligheten för direkta ingrepp, såsom genetisk manipulation och läkemedelsscreening, i en väldefinierad och kontrollerbar odlingsmiljö. En av de första rapporterna om skelettmuskelfiberisolering och ex vivo-kultur går tillbaka till 1930-talet; Utbytet av livskraftiga fibrer från detta protokoll var dock lågt16. Med kontinuerlig optimering av isoleringsproceduren och odlingsförhållandena är en signifikant förbättring av mängden livskraftiga och funktionella muskelfibrer nu möjlig 14,15,17,18,19. En sådan förbättring av odlingsförhållandena innefattar beläggning av odlingsrätter med extracellulära matrisproteiner för att främja vidhäftningen av de isolerade muskelfibrerna på odlingsskålen15,18,20. Vanligtvis används lamininbeläggning, eftersom laminin är ett av de vanligaste elementen i den extracellulära matrisen av muskler20,21. Optimeringen av isoleringsproceduren i kombination med beläggningen av odlingsskålarna har gjort det möjligt för muskelforskningsfältet att hålla isolerade livskraftiga muskelfibrer med intakt cellulär arkitektur och kontraktil funktionalitet i kulturen under korta tidsperioder 1,15,18,22.
Det mest konventionella tillvägagångssättet som används inom muskelfältet för att mäta kraft och kontraktil förmåga är att montera enskilda muskelfibrer mellan en längd drivmotor och en kraftgivare23,24. I allmänhet dissekeras muskelfibrerna som används för dessa motordrivna uppställningar från antingen snapfryst eller färsk vävnad, följt av permeabilisering eller "flåsning", vilket möjliggör extern kalciumaktivering, där varierande kalciumkoncentrationer används för att inducera muskelfiberkontraktion24. Även om denna metod är guldstandarden för muskelfiberkontraktila mätningar, kan endast en enda muskelfiber mätas åt gången, vilket gör denna teknik till en mödosam och tidskrävande procedur25. Vidare stör isolerings- och flåsproceduren hos muskelfibrerna de olika strukturerna som är involverade i excitations-kontraktionskoppling (dvs. kalciumfrisättning och efterföljande återupptag i sarkoplasmatisk retikulum), vilket inte möjliggör studier av avslappningskinetik och eventuella sjukdomar som kan påverka denna process26,27. Ett alternativ till den skinnade fiberberedningen använder mekanisk dissektion för att isolera intakta muskelfibrer, där kontraktila krafter kan mätas som svar på elektrisk aktivering28; Detta tillvägagångssätt är dock tekniskt utmanande och mycket tidskrävande, vilket resulterar i mätningar med låg genomströmning. Slutligen, i både skinnade och intakta preparat, avlägsnas muskelcellerna helt från den extracellulära miljön under kontraktila mätningar 24, vilket gör undersökningen av effekten av den extracellulära matrissammansättningen / styvheten på muskelfiberkontraktion omöjlig24. Som ett resultat behövs utveckling av alternativa metoder för att möjliggöra muskelfiberkontraktilitetsmätningar av isolerade intakta muskelfibrer på ett högt genomströmningssätt samtidigt som sambandet mellan muskelfibrer och den extracellulära matrisen återskapas.
Nyligen utvecklades ett nytt optikbaserat tillvägagångssätt för mätningar av muskelfiberkontraktilitet med hög genomströmning29. Detta optikbaserade system mäter sarkomerernas periodicitet för att bedöma sarkomerlängden under sammandragning med hjälp av höghastighetsavbildning. Inom detta system förblir cellerna på plats i odlingsskålen medan optiken flyttas, vilket minimerar den tid som behövs mellan mätningarna av flera celler29. En stor fördel med att använda detta optikbaserade tillvägagångssätt med hög genomströmning är att det gör det möjligt att utveckla odlingsförhållanden som liknar den inhemska vävnadens. Ett tillvägagångssätt som används för att efterlikna inhemska in vivo-förhållanden är att bädda in celler i hydrogeler30. Typiskt är en hydrogel ett viskoelastiskt material som kan bibehålla sin volym och form, och hydrogeler har egenskaperna hos både fasta och flytande material31. Den fasta delen består av polymerkedjor tvärbundna till varandra, vilket skapar en struktur som liknar ett netto30,31. Materialegenskaperna hos hydrogeler kan ställas in för att efterlikna matrisavsättningen av muskler30,31. Således öppnar kombinationen av ett optikbaserat system med hög genomströmning med celler inbäddade i hydrogeler nya möjligheter att bedöma effekterna av extracellulär matrissammansättning och mekaniska egenskaper på muskelfiberfunktionalitet.
Det övergripande syftet med denna uppsats är att 1) beskriva metodiken för enzymatisk isolering och ex vivo-odling av muskelfibrer under förhållanden som efterliknar den naturliga vävnadsmiljön och 2) bedöma muskelfiberkontraktilitet med hjälp av en high-throughput-metod. Vi beskriver en detaljerad metod för att enkelt isolera ett stort antal enskilda muskelfibrer från flexor digitorum brevis (FDB) muskeln med hjälp av enzymatisk nedbrytning. Dessutom beskriver vi en teknik för att bädda in de isolerade muskelfibrerna i en fibrinbaserad hydrogel för att efterlikna musklernas naturliga miljö och förbättra muskelfibrernas livskraft och kontraktilitet. Vi skisserar sedan en metod med hög genomströmning för att mäta levande muskelfiberkontraktioner in vitro med hjälp av detta nyligen utvecklade system. En ytterligare fördel med denna inbäddningsprocedur är immobiliseringen av fibrer under sammandragning, vilket kan förbättra signal-brusförhållandet för dessa mätningar. Denna gelinbäddningsmetod är tillämplig för både enstaka polymer- och kompositgelinkapslingsprocedurer, vilket underlättar bedömningen av effekterna av extracellulär matriskomposition på muskelfiberkontraktilitet.
Protocol
För ex vivo-kontraktionsstudierna erhölls postmortemvävnad från djur som avlivats för andra godkända forskningsprojekt och / eller avelsöverskott från VU-universitetet i enlighet med Europeiska rådets direktiv (2010/63 / EU) med tillstånd från Nederländernas djurförsökslag.
1. Förberedelse av material
- Förbered pipetter för trituration (förvara i 70% etanol i ett flödesskåp tills användning). Klipp ändarna på två P1 000-spetsar för att skapa olika hålstorlekar; Se till att hålet är precis tillräckligt stort för att muskeln ska passera utan att blockera pipeten. Kör de skurna ändarna genom en låga så att de blir släta.
- Förbered Sylgard-rätter enligt beskrivningen på annan plats32 och sterilisera med 70% etanol i förväg för användning för att säkra tassen och muskeln under isolering.
OBS: Sylgard diskar kan återanvändas efter noggrann rengöring med avjoniserat vatten och 70% etanol. - Bered följande lösningar före isoleringsproceduren: dissektionsmedium, fibrinodlingsmedium och muskeluppslutningsmedium (se tabell 1).
OBS: Muskeluppslutningsmediet bör filtersteriliseras med ett 0,22 μm filter. Alla beredda lösningar bör balanseras i en standardinkubator för cellodling vid 37 °C och 5 % CO2 i minst 30 minuter före användning. - Efter muskeluppslutningen, förbered följande lösningar för att gjuta hydrogelen: cellblandning och matrisblandning (se tabell 2). Kombinera cellblandningen och matrisblandningen i förhållandet 1:1 för en slutlig fibrinkoncentration på 2,5 mg/ml.
OBS: Förbered matrisen på is och använd förkylda pipettspetsar för att förhindra för tidig polymerisation av basalmembranmatrisen. Trombin:fibrinogen-förhållandet 1:10 (enheter per mg fibrinogen) som används här har optimerats för en polymerisationstid på 30 min. Om gelen polymeriseras inom 30 minuter bör en lägre trombinkoncentration användas. Se diskussionen för mer information.
2. FDB muskeldissektion
- Eutanize musen genom cervikal dislokation. Desinficera bakbenet med 70% alkohol.
- Klipp av det nedre bakbenet ovanför fotleden. Skär upp huden på ryggsidan av foten mot tårna.
OBS: Skär av det nedre bakbenet vid fotleden för att förhindra skador på musklerna i nedre extremiteterna och skenbenet om de behövs senare. - Skala försiktigt huden mot tårna. Var försiktig så att du inte skadar muskeln. FDB är den mest ytliga muskeln på fotens ventrala sida.
- Placera den dissekerade foten i en Sylgard-skål med 10 ml förvärmt dissektionsmedium vid 37 °C. Fäst foten genom huden som fortfarande är fäst vid tårna och fäst underbenet bortom fotleden.
- Ta försiktigt bort bindväven ovanpå muskeln. Skär senan vid hälen och lyft muskeln upp i senan.
- Skär bredvid och under muskeln genom bindväven. Fortsätt klippa tills tåsenorna exponeras.
- När hälften av längden på de tre senorna exponeras, skär senorna och släpp muskeln från foten. VALFRITT: Klipp av den fjärde laterala senan och dess muskelfibrer.
- Rengör bindväven från muskeln och överför till ett rör som innehåller förvärmt dissektionsmedium.
3. FDB muskel matsmältning
- Bered muskeluppslutningsmediet i enlighet med tabell 1.
- Överför FDB-musklerna till muskeluppslutningsmediet med hjälp av en serologisk pipett. Inkubera i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 °C och 5 %CO2 i 80 minuter.
OBS: Denna tid bör optimeras för varje kollagenassats. Matsmältningen är klar när muskeln börjar slita och ser förstorad ut. Se diskussionen för optimering av matsmältningstiden. - Efter matsmältningen, överför muskeln till ett 15 ml rör innehållande 3 ml dissektionsmedium och inkubera i 30 minuter före triturering.
4. FDB muskeltrituration och gravitationssedimentering
- Triturera muskeln med hjälp av de tidigare beredda triturationsspetsarna (steg 1.1) genom att pipettera muskeln, från den största till den minsta storleken. Om detta steg tar längre tid än 5 minuter, placera muskeln i inkubatorn i 5 minuter så att den vilar.
- Triturera tills muskelfibrerna mestadels har kommit av senan och senan kan passera genom en P200-spets. Ta bort senorna.
- Tillsätt de dissocierade FDB-fibrerna till ett 15 ml rör innehållande 10 ml dissektionsmedium och låt fibrerna sätta sig i inkubatorn i 20 minuter. Observera den bildade pelleten.
- Valfritt: Ta bort 10 ml medium från toppen och upprepa steg 4.3. Detta steg underlättar avlägsnandet av överskott av skräp och tillhörande mononukleerade celler.
5. Inbäddning av FDB-fiber
- Ta försiktigt bort allt medium från toppen av fiberpelleten. Resuspendera cellerna i 875 μL cellblandning per FDB-muskel (på is).
OBS: En FDB-muskel ger tillräckligt med fibrer för sju brunnar på en 24-brunnsplatta. Denna densitet kan justeras enligt experimentets behov. Följande gelvolym (250 μL) är optimerad för ett 24-brunnsformat men kan skalas därefter för andra format. - Alikvot 125 μL av cellen blandas i enkla mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 125 μl matrisblandning en brunn i taget till en alikvot av cellsuspensionen och blanda försiktigt uppåt och nedåt för att undvika att bubblor bildas.
- Överför omedelbart den slutliga blandningen till en brunn.
OBS: Var noga med att pipettera blandningen i mitten av brunnen. Upprepa steg 5.3 och steg 5.4 för varje brunn. - Stelna gelerna i en inkubator i 30-45 min. Efter stelning, tillsätt försiktigt odlingsmediet till brunnarna.
OBS: Snabb pipettering kan lossa hydrogelen från brunnen. Från och med denna tidpunkt kan fibrerna stimuleras och mätas. Men enligt vår erfarenhet kan låta fibrerna anpassa sig till odlingsförhållandena i 24 timmar förbättra fiberkontraktiliteten. - För längre kultur, fyll på odlingsmediet med en halv förändring var 2: e dag. För att göra detta, ta bort hälften av odlingsmediet och ersätt det med lika mycket färskt medium.
6. Optikbaserade kontraktila mätningar
- Slå på det optikbaserade kontraktila mätsystemet (se materialförteckningen), fluorescenslampan, den elektriska cellpacern och datorn. Ställ in den elektriska stimulatorn på 1,0 Hz, 10,0 V och en pulsvaraktighet på 5,00 ms för att stimulera de isolerade muskelfibrerna.
- Sätt in plattan i mätsystemet. Anslut pacern till pacinginsatsen och sätt in den i odlingsplattan.
- Öppna programmet IonWizard och öppna en ny fil genom att klicka på Arkiv (uppe till vänster på skärmen) | Nyhet.
- Kontrollera om programmet är på rätt experiment, Skeletal Sarcomere, genom att klicka på Ny | Samla experiment. För att ändra experimentet, klicka på önskat experiment och tryck på lägg till. För Skeletal sarcomere-experimentet , använd följande inställningar: Sarc 20x, Genomsnittliga linjer, enkel FFT, 250 Hz samplingsfrekvens och en förvärvstid på 10 s.
OBS: De experimentella inställningarna bör förberedas före experimentet. Inställningarna kan anpassas till experimentets behov. - Justera mätsystemets temperatur till 25 °C. Klicka på öppna cellsökaren under verktygsfältet och vänta tills en ny skärm dyker upp. Längst upp till höger på den här skärmen väljer du platttyp och aktiva brunnar.
OBS: Mätningarna utförs vid 25 ° C för att minska kontraktionshastigheten hos de snabbt ryckande FDB-muskelfibrerna och därigenom förhindra undersampling av kontraktilhändelsen. - Sätt fibrerna i fokus genom att justera fokusreglaget. Alternativt kan du använda W-tangenten och S-tangenten för denna fokuseringsfunktion.
- Aktivera stimuleringen för att starta den elektriska stimuleringen. Observera att fibrerna nu börjar rycka.
OBS: Om inga fibrer rycker, se till att alla ledningar är anslutna och pacern är helt nedsänkt. Om det efter detta fortfarande inte finns någon rörelse, kan fibrerna inte svara på grund av övermatsmältning eller överdriven skada under trituration. - Fokusera mätområdet på änden av en fiber så att sarkomererna löper vertikalt. Se till att sarkomererna är i fokus. Om sarkomererna är i fokus syns en enda topp i verktygsfältet. Under sammandragningen kommer denna topp att röra sig åt höger när sarkomeren förkortas.
OBS: Det lila mätområdet kan justeras innan experimentet påbörjas. För att säkerställa en korrekt mätning, inkludera ~ 20 sarkomerer. Om denna topp ändrar form under sammandragningen kan detta indikera att sarkomeren är dold eller ur fokus under sammandragningen, vilket introducerar brus. - Starta experimentet genom att klicka på start i verktygsfältet. Tryck på Q-tangenten för att starta en mätning och vänta tills programmet mäter 10 kontraktionstransienter. Om fler än fyra transienter ser brusfria ut, acceptera mätningen genom att trycka på Z-tangenten. Om transienterna har för mycket brus, avvisa mätningen genom att trycka på X-tangenten .
- Mät mellan 10 fibrer och 20 fibrer per tillstånd. Placeringen av de tidigare uppmätta fibrerna behålls.
- Valfritt: Lägg till föreningar, varefter fibrer kan mätas om vid denna punkt.
- När experimentet är klart trycker du på stoppknappen i det nedre verktygsfältet för att stänga cellsökningsfönstret. Spara filen och starta en ny fil.
- För att analysera data, öppna programmet "Cytosolver desktop". Klicka på importera och välj de filer som ska analyseras.
- När programmet har slutfört analysen letar du efter blå, röda och grå toppar. De blå topparna är transienter som accepteras av programmet. De röda topparna är transienter som avvisas av programmet, och de grå topparna är transienter som avvisas av användaren.
OBS: Avslagskriterierna kan justeras i analysprogramvaran. I allmänhet avvisas värden om de överskrider en maximal derivatgräns och transienter avvisas baserat på kurvpassningsvärdenpå <0,95. - Klicka på exportera. Markera följande rutor: Genomsnittliga tillfälliga data och exportera till Excel.
- Stäng av alla maskiner när du är klar. Ta ut kulturplattan och kassera den. Rengör pacerelektroderna med avjoniserat vatten och 70% etanol.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll isolerades enstaka FDB-muskelfibrer och inbäddades i hydrogel. En översikt över muskeldissektionsproceduren visas i figur 1. FDB-muskeln exponeras med intakta senor och skärs loss från fascian. Att bibehålla musklernas senor som fixeringspunkter minimerar potentiell skada på muskelfibrerna under isoleringsproceduren. Överskott av bindväv kan trimmas bort för att minska skräp och tillväxten av sekundära celltyper. När muskeln har skurits ut och rengjorts tillräckligt, smälts muskeln enzymatiskt med kollagenas och enstaka muskelfibrer frigörs genom trituration innan de isolerade cellerna bäddas in i hydrogeler. Isoleringen av FDB-muskelfibrer ger relativt korta muskelfibrer, som har fördelen att de lätt kan manipuleras. På grund av sin storlek kan FDB-muskelfibrer pipetteras säkert utan trasselinducerad skada och är lätt inbäddade i en hydrogel. Eftersom enstaka muskelfibrer inte fäster vid odlingsplattor särskilt bra, säkerställer inbäddning av fibrerna i hydrogel att fibrerna stannar kvar under cellkulturen och kontraktila mätningar. Dessutom möjliggör tillsatsen av en basalmembranmatris till fibringeln interaktioner mellan muskelfibrerna och matrisen, vilket efterliknar den ursprungliga in vivo-miljön . Isolerade enstaka muskelfibrer kan manipuleras och bibehållas i kultur i flera dagar efter isolering. I figur 2 visas ett exempel på isolerade FDB-fibrer inbäddade i en hydrogelmatris. De friska fibrerna har synliga sarkomerer och sträcker sig rakt ut (blå pil), medan de böjda fibrerna vanligtvis är skadade eller olönsamma (gul pil) och bör uteslutas från mätningarna. Hyperkontrakterade fibrer visas som mörka upprullade objekt i matrisen (röd pil). Om isoleringsproceduren lyckades bör andelen friska fibrer vara ~ 75%. En större andel hyperkontrakterade fibrer indikerar vanligtvis skador under isoleringsproceduren. Muskelfibrernas membran kan skadas antingen genom överkylning av muskeln eller skada på fibrerna under trituration. Triturationsskador uppstår huvudsakligen om muskeln är undersmält och därmed inte kommer isär lätt.
Fiberns funktionalitet och livskraft bedömdes genom kontraktila mätningar av muskelfibrerna med hjälp av ett optikbaserat kontraktilmätningssystem med hög genomströmning. Systemet matar ut flera parametrar, såsom sarkomerlängd, procentandel sarkomerförkortning, kontraktilhastighet och avslappningshastighet. Med hjälp av kontraktilmätningssystemet kan sarkomerkontraktion mätas per muskelfiber. Figur 3 visar exempel på muskelfibersammandragningar uppmätta med mätsystemet. Från en enda kontraktionstransient erhålls följande parametrar: sarkomerlängd vid baslinjen, kontraktionstid, sarkomerlängd vid maximal sammandragning och avkopplingsvaraktighet (figur 3A). Dessa parametrar används för att beräkna procentandelen sarkomerförkortning, sammandragning och avslappningshastigheter. Medelhastighetsvärden kan också beräknas från varaktighets- och absolutförkortningsvärdena, om det behövs. En giltig kontraktionsmätning har en rak baslinje, följt av ett dopp till toppen och en återgång till baslinjen (figur 3A). Brus, ofokuserade sarkomerer eller avvikande rörelse av fibern kan påverka mättransienten (figur 3B, C), och dessa mätningar kan kasseras manuellt eller kommer att avvisas av analysprogrammet. I detta tillvägagångssätt är den tydliga visualiseringen av sarkomererna viktig för att mäta sammandragningarna; Således kan allt som minskar sarkomerernas synlighet införa buller. Detta kan inträffa om sarkomeren rör sig utanför fokalplanet under sammandragning. Mätningar där en serie sammandragningar skiljer sig åt i hastighet eller djup bör också uteslutas från datasetet.
Kontraktila data för enstaka muskelfibrer erhållna med detta system kan användas för att jämföra olika odlingsförhållanden. Systemets effektivitet illustreras i figur 4. Här mätte vi sammandragningarna av FDB-muskelfibrer i både 2D (lamininbelagda odlingsplattor) och 3D (fibrinhydrogel) odlingsformat. En högre andel användbara mätningar uppnåddes i 3D, eftersom inbäddning av fibrerna i gelén förhindrade lateral rörelse och andra rörelseartefakter från att påverka mätningen (figur 4A). Inbäddning av fibrerna hade ingen signifikant effekt på varken sarkomerförkortningen eller maximala kontraktionshastighetsvärden jämfört med 2D-odlade fibrer (figur 4B). För att illustrera hur olika matriser påverkar sammandragningen av FDB-muskelfibrer jämförde vi också denna fibrinhydrogel med en ren basalmembranmatris (4 mg / ml) (figur 4C). Den minskade kontraktiliteten som observerades i den rena basalmembranmatrisen berodde sannolikt på gelens styvhet eller ökade cellmatrisinteraktioner. Fibrinkoncentrationer på upp till 7 mg/ml har också testats, utan signifikant effekt på kontraktil hastighet och förkortning (opublicerade data). Användningen av denna fibrinbaserade hydrogel säkerställer minimal störning av kontraktila parametrar.
Figur 1: En översikt över FDB-muskeldissektionsproceduren. (A) Bakbenet skärs ovanför fotleden (röd streckad linje), och (B) huden avlägsnas genom att skära längs toppen av foten längs den blå streckade linjen. (C) Foten är fastnålad genom fotleden och huden vid tårna. (D) Mikroskopisk bild av den exponerade muskeln och dess omgivande bindväv. Fascian är synlig som ett vitt ogenomskinligt skikt genom vilket kärlen löper. (E) Fascian avlägsnas från muskeln och senan skärs längs den röda streckade linjen. (F) FDB-muskeln separeras från den underliggande vävnaden genom att lyfta och skära under och bredvid muskeln. (G) När tårnas senor är tydligt synliga skärs FDB loss längs den röda streckade linjen. (H) FDB säkras av senorna, och den fjärde laterala senan och dess fibrer kan avlägsnas genom att skära längs den röda streckade linjen. Överskott av fascia kan nu trimmas bort. (I) Efter rengöring överförs FDB-muskeln till kollagenaslösningen. Skalstänger = (D-I) 2 mm. Förkortning: FDB = flexor digitorum brevis. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mikroskopisk bild av FDB-muskelfibrer inbäddade i hydrogel efter 24 timmars kultur. Blå pil: Exempel på en livskraftig FDB-muskelfiber. Gul pil: Exempel på en vriden FDB-muskelfiber. Vridna muskelfibrer kan ha minskad livskraft och försämrade sammandragningar och bör därför uteslutas från mätningarna. Röd pil: Exempel på en hyperkontrakterad FDB-muskelfiber. Överdriven hyperkontraktion uppstår när trituration utförs för kraftigt eller kan orsakas av övergärdning av kollagenas eller användning av icke-jämviktat odlingsmedium. Skalstång = 100 μm. Förkortning: FDB = flexor digitorum brevis. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på fiberkontraktionstransienter mätta med det optikbaserade kontraktilsystemet med hög genomströmning. (A) Exempel på en normal sammandragningsövergående. Denna övergående erhålls från sarkomererna som omges av den lila fyrkanten som visas i det nedre verktygsfältet. Transienten består av följande komponenter: sarkomerlängd vid baslinjen (grön), kontraktionstid (blå), sarkomerlängd vid maximal sammandragning (lila) och avkopplingstid (röd). Parametrar som hastighet och procentandel av kontraktion beräknas utifrån dessa värden. (B) Exempel på en otillräcklig sammandragningsövergående. Dessa mätningar sker när sarkomersignalen inte plockas upp på grund av brus (se röda pilar). (C) Exempel på en sammandragningstransient som har en rörelseartefakt (se gröna pilar). Rörelseartefakter uppstår när muskelfibrerna rör sig utanför fokus under sammandragningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa data erhållna med hjälp av det optikbaserade kontraktila systemet med hög genomströmning vid jämförelse av 2D-kontra 3D-förhållanden och olika hydrogeler . (A) Procentandel accepterade och avvisade kontraktionsmätningar som hittats av dataanalysprogrammet i 2D-kultur och i 3D-kultur baserat på 30 mätningar. (B) Jämförelse av den maximala kontraktionshastigheten i 2D-odlade och 3D-odlade muskelfibrer isolerade från tre möss efter 24 timmars odling. (C) Jämförelse av sarkomerförkortningen i 2D-odlade och 3D-odlade muskelfibrer isolerade från tre möss efter 24 timmars odling. (D) Jämförelse av den maximala kontraktionshastigheten för ren basalmembranmatris (Matrigel)-inbäddade och fibrinhydrogelinbäddade muskelfibrer isolerade från tre möss efter 24 timmars odling. (E) Jämförelse av sarkomerförkortning av ren basalmembranmatris (Matrigel)-inbäddade och fibrinhydrogelinbäddade muskelfibrer isolerade från tre möss efter 24 timmars odling. Data analyserades med hjälp av en Students t-test och visas som medelvärde ± SD. Varje datapunkt är en muskelfiber. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Sammansättning av dissektionsmediet som används för att dissekera muskeln, fibrinodlingsmediet som används för att odla de isolerade muskelfibrerna och muskelmatsmältningsmediet som används för att enzymatiskt smälta de isolerade musklerna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Sammansättning av cellblandningen som används för att gjuta hydrogelerna och matrisblandningen som används för att gjuta hydrogelerna. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för att utföra enzymatisk isolering och odling av FDB-muskelfibrer i ett 3D-odlingsformat, följt av kontraktila mätningar med ett optikbaserat kontraktilmätningssystem. Detta protokoll har ett antal fördelar, inklusive 1) rakt fram och snabb isolering av många intakta muskelfibrer från en enda muskel; 2) inbäddning av muskelfibrerna i en avstämbar hydrogelmatris; 3) utförandet av kontraktilitetsmätningar med hög genomströmning med hjälp av det optikbaserade systemet; och 4) förmågan att genomföra upprepade mätningar av samma muskelfibrer efter ett ingrepp. Isoleringen av enstaka levande muskelfibrer ger mogna muskelceller som behåller sin kontraktila funktion. Eftersom muskelfibrerna erhållna från musen FDB är relativt små, manipuleras de lätt under isolering och bibehåller sin raka form, vilket möjliggör kontraktila mätningar nedströms. Även om systemet främst utvecklades för att studera kardiomyocytkontraktion, innehåller skelettmuskelfibrer samma kontraktila maskiner med lätt urskiljbar sarkomermönstring och kan därför också mätas med detta system29. Kopplingen av encellskontraktila mätningar med levande ex vivo muskelfiberodling är ett kraftfullt verktyg för att bedöma mogen muskelfiberhälsa och funktion som svar på elektrisk aktivering.
En begränsning med att använda dissocierade muskelfibrer är bristen på yttre krafter (dvs passiv stretch) applicerad på fibrerna, vilket resulterar i lägre vilande sarkomerlängder jämfört med de som finns in vivo. Även om en sarkomerlängd på 2,4-2,5 μm säkerställer optimal kraftproduktion, kan vilande sarkomerlängden variera kraftigt33. Medan FDB: s in vivo vilande sarkomerlängd ännu inte har beskrivits, tyder våra egna opublicerade data på en genomsnittlig längd på 2,2 μm. De aktuella resultaten visar en genomsnittlig vilande sarkomerlängd på ~ 1,95 μm i obelastade FDB-fibrer efter 24 timmar i odling (figur 3). Även om denna lägre vilande sarkomerlängd skulle resultera i lägre kraftproduktion, bör en längd på ~ 1,95 μm fortfarande producera >90% av den maximala kraften34. Som sådan bör dessa sarkomerlängder vara tillräckliga för att bestämma skillnader i fiberfunktion mellan olika genetiska modeller eller efter läkemedelsbehandlingar. Dessutom ger inbäddningen av fibrer i en hydrogel många ytterligare punkter för vidhäftning jämfört med fritt flytande 2D-odlade fibrer, vilket skulle begränsa ytterligare sarkomerförkortning över tiden.
En fördel med detta isoleringsprotokoll för muskelfibrer är användningen av en lätt dissekerad snabbmuskel bestående av relativt små muskelfibrer jämfört med andra muskler, såsom extensor digitorum longus (EDL). Deras mindre storlek gör muskelisoleringen mer lämplig för triturationsbaserad separation, vilket minskar risken för pipet- eller trasselinducerad skada på muskelfibrerna. Den extracellulära matrisen av FDB-muskler kan lätt enzymatiskt smälta med kollagenas, vilket möjliggör isolering av hundratals muskelfibrer på kort tid. Övermatsmältning kan dock leda till skador på muskelfibrerna. Översmältningen av muskelfibrerna kan erkännas när muskeln faller isär nästan omedelbart när muskeln tritureras eller när en stor del av cellvolymen hyperkontrakteras under cellsåddproceduren. För att förhindra överuppslutning av muskeln måste matsmältningstiden optimeras för varje kollagenassats. För att testa detta bör två FDB-muskler smälta parallellt med en förskjuten matsmältningstid på 5 minuter mellan dem. Digestionstiden med det högsta utbytet av livskraftiga muskelfibrer bör väljas. Denna optimering bör sedan utföras en andra gång, återigen med 5 minuters separation i matsmältningstiden. Digestionstiden som ger de högsta livskraftiga muskelfibrerna bör användas som den optimala matsmältningstiden för den aktuella satsen kollagenas. Ett annat sätt att begränsa variationen i batch-till-batch-kollagenas skulle vara att direkt beräkna aktivitetsenheterna per ml stamlösning och sedan rekonstituera de efterföljande kollagenassatserna till samma mängd. Slutligen kan matsmältningstiderna behöva optimeras över olika musstammar, till exempel om man studerar åldrade eller sjuka djur som uppvisar ökad extracellulär matrisdeposition35,36.
Möjligheten att pipettera livskraftiga isolerade muskelfibrer öppnar möjligheter att odla FDB-muskelfibrer under olika odlingsförhållanden. Ett sådant alternativ är odlingen av dessa fibrer i hydrogeler för att efterlikna den ursprungliga vävnadsodlingsmiljön. Detta inbäddningsprotokoll säkerställer att fibrerna förblir på plats under kontraktilmätningarna och har optimerats för att låta fibrerna sätta sig till botten av plattan innan gelén stelnar. Detta protokoll kan dock behöva justeras för att ta hänsyn till skillnader i trombin- och fibrinogenbestånden. Om trombinaktiviteten är för hög kommer gelén att stelna för tidigt, och fibrerna kan förbli suspenderade på högre platser utanför mikroskopets fokalplan. Om detta händer måste trombin: fibrinogenförhållandet justeras. Detta kan testas genom att plätera fibrer i allt lägre trombinkoncentrationer och notera hur lång tid polymerisationen tar. Vanligtvis bör detta inte ske snabbare än 30 minuter. Att ha en trombinkoncentration som är för låg kan emellertid också försämra polymerisationsprocessen. En annan metod för att säkerställa att fibrerna är i rätt fokalplan är att först fröa dem med ett 2D-protokoll och sedan tillsätta ett lager hydrogel över fibrerna efter att de har fastnat på odlingsplattan. Man bör dock vara medveten om att avlägsnande av mediet från fibrerna kan inducera hyperkontraktion, eftersom de är känsliga för uttorkning. Det är också oklart om hydrogelen kommer att fästa helt på odlingsplattan, och det kan lossna lättare. Därför är denna inbäddningsprocedur att föredra för att hålla fibrerna livskraftiga och på plats för kontraktionsmätningar.
Användningen av detta protokoll möjliggör studier av kontraktildynamiken hos mogna muskelfibrer ex vivo och kan tillämpas på både friska möss och de som bär genetiska mutationer för muskelsjukdomar. På samma sätt möjliggör det testning av hur odlingsförhållanden eller tillsats av föreningar påverkar muskelfiberfunktionen. De kontraktila data som erhållits med hjälp av det optikbaserade systemet ger en indikation på kontraktilförmågan hos levande enstaka muskelfibrer, och förändringar i denna förmåga kan korreleras med fiberhälsa. Dessa data ensamma är emellertid inte tillräckliga för att avgöra om dessa förändringar inträffar vid aktin-myosin-korsbryggnings- eller kalciumfrisättningsstadierna av muskelkontraktion. Även om vi inte beskriver metoder för att mäta kalciumsignalering i detta protokoll, kan denna inställning också mäta Fura-baserade kalciumtransienter i sammandragande muskelceller29. En nackdel med detta system är att FDB-muskeln endast innehåller snabba ryckningar typ IIa / IIx muskelfibrer, och muskler som innehåller långsamma ryckningar typ I-fibrer av denna storlek har ännu inte beskrivits37. Detta eliminerar möjligheten att studera fibertypspecifik funktion med denna metod. Protokollet vi föreslår här kan potentiellt anpassas för andra muskler som EDL eller soleus för att studera skillnader i fibertyp. På grund av deras större storlek skulle detta protokoll behöva optimeras ytterligare för dessa muskler. Längre fibrer tenderar att trassla in sig under gravitationssedimenteringssteget och kommer att brista om de manipuleras genom pipettering, vilket skulle leda till lägre avkastning. På grund av deras inkompatibilitet med pipettering är längre fibrer därför också mindre kompatibla med gelinbäddningstekniken. Mätningar av dessa fibrer kan fortfarande göras i ett 2D-odlingsformat, men fibrerna kan röra sig mer under sammandragning på grund av deras storlek, vilket påverkar signal-brusförhållandet. En annan begränsning av detta system är oförmågan att utföra kraftmätningar tillsammans med kontraktilmätningarna, såsom de kraftmätningar som kan erhållas med andra intakta muskelfiberpreparat28. Denna begränsning kan emellertid kringgås genom att uppskatta kraften som genereras av muskelfibern. Den genererade kraften av muskelfibrer kan uppskattas om muskelfiberformen under sammandragna och avslappnade tillstånd, liksom Youngs modul i matrisen, är kända25. Ändå ger detta optiska baserade system en lättanvänd, hög genomströmningsmetod för att studera muskelkontraktil funktion och öppnar en rad nya möjligheter för att studera genetiska muskelsjukdomar och terapeutiska ingrepp.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes och Emmy Manders för deras tekniska expertis för att hjälpa till att utveckla detta protokoll. Detta arbete stöddes av utmärkelser från Muscular Dystrophy Association (Development Award MDA603238 till T.J.K), Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) och National Health and Medical Research Council (NHMRC, Australien; Fellowship APP1121651 till M.Y).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
References
- Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).
- Khodabukus, A., Prabhu, N., Wang, J., Bursac, N. In vitro tissue-engineered skeletal muscle models for studying muscle physiology and disease. Advanced Healthcare Materials. 7 (15), 1701498 (2018).
- Fernandez-Costa, J. M., Fernandez-Garibay, X., Velasco-Mallorqui, F., Ramon-Azcon, J. Bioengineered in vitro skeletal muscles as new tools for muscular dystrophies preclinical studies. Journal of Tissue Engineering. 12, 2041731420981339 (2021).
- Romagnoli, C., Iantomasi, T., Brandi, M. L. Available in vitro models for human satellite cells from skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13221 (2021).
- Dessauge, F., Schleder, C., Perruchot, M. -H., Rouger, K. 3D in vitro models of skeletal muscle: Myopshere, myobundle and bioprinted muscle construct. Veterinary Research. 52 (1), 72 (2021).
- Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell Biology International. 37 (2), 191-196 (2013).
- Guo, X., et al. In vitro differentiation of functional human skeletal myotubes in a defined system. Biomaterials Science. 2 (1), 131-138 (2014).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In vitro differentiation of mature myofibers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Khodabukus, A. Tissue-engineered skeletal muscle models to study muscle function, plasticity, and disease. Frontiers in Physiology. 12, 619710 (2021).
- Engler, A. J., et al. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: Pathological implications for soft or stiff microenvironments. Journal of Cell Biology. 166 (6), 877-887 (2004).
- Huang, N. F., et al. Myotube assembly on nanofibrous and micropatterned polymers. Nano Letters. 6 (3), 537-542 (2006).
- Earle, A. J., et al. Mutant lamins cause nuclear envelope rupture and DNA damage in skeletal muscle cells. Nature Materials. 19 (4), 464-473 (2020).
- Stange, K., Ahrens, H. E., von Maltzahn, J., Rontgen, M. Isolation and ex vivo cultivation of single myofibers from porcine muscle. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 56 (8), 585-592 (2020).
- Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--A more mature muscle culture system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
- Ramsey, R. W., Street, S. F. The isometric length-tension diagram of isolated skeletal muscle fibers of the frog. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 15 (1), 11-34 (1940).
- Selvin, D., Hesse, E., Renaud, J. M. Properties of single FDB fibers following a collagenase digestion for studying contractility, fatigue, and pCa-sarcomere shortening relationship. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), R467-R479 (2015).
- Renzini, A., et al. Culture conditions influence satellite cell activation and survival of single myofibers. European Journal of Translational Myology. 28 (2), 7567 (2018).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Holmberg, J., Durbeej, M.
- Stuelsatz, P., Keire, P., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation, culture, and immunostaining of skeletal muscle myofibers from wildtype and nestin-GFP mice as a means to analyze satellite cell. Methods in Molecular Biology. 1556, 51-102 (2017).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Ottenheijm, C. A., et al. Altered myofilament function depresses force generation in patients with nebulin-based nemaline myopathy (NEM2). Journal of Structural Biology. 170 (2), 334-343 (2010).
- Rausch, M., et al. Measurement of skeletal muscle fiber contractility with high-speed traction microscopy. Biophysical Journal. 118 (3), 657-666 (2020).
- de Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 754-767 (2020).
- Wijnker, P. J. M., vander Velden, J. Mutation-specific pathology and treatment of hypertrophic cardiomyopathy in patients, mouse models and human engineered heart tissue. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165774 (2020).
- Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca(2+)] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
- Cao, L., Manders, E., Helmes, M. Automatic detection of adult cardiomyocyte for high throughput measurements of calcium and contractility. PLoS One. 16 (9), e0256713 (2021).
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2010).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical Research. 26 (3), 631-643 (2009).
- Cold Spring Harbor Protocols. Sylgard-coated coverslips and petri dishes. Cold Spring Harbor Protocols. 2022 (8), Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2022).
- Moo, E. K., Fortuna, R., Sibole, S. C., Abusara, Z., Herzog, W. In vivo sarcomere lengths and sarcomere elongations are not uniform across an intact muscle. Frontiers in Physiology. 7, 187 (2016).
- Moo, E. K., Leonard, T. R., Herzog, W. The sarcomere force-length relationship in an intact muscle-tendon unit. Journal of Experimental Biology. 223, 215020 (2020).
- Schuler, S. C., et al. Extensive remodeling of the extracellular matrix during aging contributes to age-dependent impairments of muscle stem cell functionality. Cell Reports. 35 (10), 109223 (2021).
- Carberry, S., Zweyer, M., Swandulla, D., Ohlendieck, K. Proteomics reveals drastic increase of extracellular matrix proteins collagen and dermatopontin in the aged mdx diaphragm model of Duchenne muscular dystrophy. International Journal of Molecular Medicine. 30 (2), 229-234 (2012).
- Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14 (2018).
