Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kontraktile målinger med høj kapacitet af hydrogelindlejrede intakte musemuskelfibre ved hjælp af et optikbaseret system

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65103
Automatic Translation
*1, *1, 1,4, 1,2,3
1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Amsterdam Cardiovascular Sciences, Heart Failures and Arrhythmias, Amsterdam UMC, 3Amsterdam Movement Sciences, Tissue Function and Regeneration, Amsterdam UMC, 4Discipline of Child and Adolescent Health, Faculty of Health and Medicine, University of Sydney
* These authors contributed equally

Summary

Skeletmuskelfunktion kan vurderes ved at kvantificere kontraktiliteten af isolerede muskelfibre, traditionelt ved hjælp af besværlige tilgange med lav kapacitet. Her beskriver vi en optikbaseret metode med høj kapacitet til at kvantificere kontraktiliteten af hydrogelindlejrede muskelfibre. Denne tilgang har applikationer til lægemiddelscreening og terapeutisk udvikling.

Abstract

In vitro cellekultur er et kraftfuldt værktøj til at vurdere cellulære processer og teste terapeutiske strategier. For skeletmuskulatur involverer de mest almindelige tilgange enten differentiering af myogene stamceller i umodne myorør eller kortvarig ex vivo-kultur af isolerede individuelle muskelfibre. En vigtig fordel ved ex vivo-kultur frem for in vitro er bevarelsen af den komplekse cellulære arkitektur og kontraktile egenskaber. Her beskriver vi en eksperimentel protokol til isolering af intakte flexor digitorum brevis muskelfibre fra mus og deres efterfølgende ex vivo-kultur . I denne protokol er muskelfibre indlejret i en fibrinbaseret og kældermembranmatrixhydrogel for at immobilisere fibrene og opretholde deres kontraktile funktion. Vi beskriver derefter metoder til at vurdere muskelfiberkontraktilfunktionen ved hjælp af et optikbaseret kontraktilitetssystem med høj kapacitet. De indlejrede muskelfibre stimuleres elektrisk for at fremkalde sammentrækninger, hvorefter deres funktionelle egenskaber, såsom sarkomerforkortelse og kontraktil hastighed, vurderes ved hjælp af optikbaseret kvantificering. Kobling af muskelfiberkultur med dette system muliggør high-throughput test af virkningerne af farmakologiske midler på kontraktil funktion og ex vivo undersøgelser af genetiske muskellidelser. Endelig kan denne protokol også tilpasses til at studere dynamiske cellulære processer i muskelfibre ved hjælp af levende cellemikroskopi.

Introduction

Fremskridt inden for in vitro-cellekulturteknikker har åbnet nye muligheder for at studere vævsregenerative evner, patofysiologiske cellulære mekanismer og efterfølgende terapeutiske strategier, alt sammen under anvendelse af pattedyrvæv under velkontrollerede forhold 1,2,3. Anvendelsen af in vitro-dyrkningssystemer er veletableret inden for muskelforskningsområdet 4,5. Generelt anvendes in vitro-differentierede umodne myorør fra myogene stamceller 2,6,7,8. Selvom der er gjort fremskridt i differentieringsprotokollen for at generere mere modne muskelfibre9, begrænser deres umodenhed stadig oversættelsen af resultaterne til en in vivo-indstilling 1,10. Et centralt spørgsmål inden for muskelbiologiområdet er manglende evne til in vitro-differentierede myorør til fuldt ud at indbegrebet af de komplekse intracellulære strukturer, cellesignaleringsprocesser og ekstracellulære interaktioner, der observeres i naturligt muskelvæv og, vigtigere, rekapitulere de kontraktile kræfter produceret af muskelfibre 1,2,10,11,12 . Derudover resulterer den ukoordinerede sammentrækning af myorør under differentieringsprocessen ofte i spontan løsrivelse fra kulturskålene, hvilket gør den kontraktile vurdering af in vitro-differentierede myorør udfordrende og begrænset til kvalitativ eller semikvantitativ evaluering 8,11,12,13. Disse begrænsninger kræver ofte regelmæssige in vivo-forsøg med dyr, især hvis muskelkontraktilitet er et primært eksperimentelt resultat1.

Et alternativ til dyrkning in vitro-differentierede myorør er ex vivo-kulturen af isolerede modne muskelfibre 1,14. Under ex vivo-dyrkning udskilles udviklingsmæssigt modent muskelvæv fra kroppen, efterfulgt af enkeltcelleisolering til dyrkning under laboratoriebetingelser 1,14. De isolerede modne muskelfibre opretholder deres komplekse cellulære strukturer observeret i det oprindelige væv14,15, og denne metode åbner mulighed for direkte interventioner, såsom genetisk manipulation og lægemiddelscreening, i et veldefineret og kontrollerbart kulturmiljø. En af de første rapporter om skeletmuskelfiberisolering og ex vivo-kultur går tilbage til 1930'erne; Udbyttet af levedygtige fibre fra denne protokol var imidlertid lavt16. Med den kontinuerlige optimering af isolationsproceduren og dyrkningsbetingelserne er en betydelig forbedring af mængden af levedygtige og funktionelle muskelfibre nu mulig 14,15,17,18,19. En sådan forbedring af dyrkningsbetingelserne involverer belægning af kulturskåle med ekstracellulære matrixproteiner for at fremme vedhæftningen af de isolerede muskelfibre på kulturskålen15,18,20. Normalt anvendes lamininbelægning, da laminin er et af de mest rigelige elementer inden for den ekstracellulære matrix af muskler20,21. Optimeringen af isolationsproceduren kombineret med belægningen af dyrkningsskålene har gjort det muligt for muskelforskningsfeltet at holde isolerede levedygtige muskelfibre med intakt cellulær arkitektur og kontraktil funktionalitet i kultur i korte perioder 1,15,18,22.

Den mest konventionelle tilgang, der anvendes inden for muskelfeltet til at måle kraft og kontraktile evner, er at montere individuelle muskelfibre mellem en længdedrivermotor og en krafttransducer23,24. Generelt dissekeres muskelfibrene, der anvendes til disse motordrevne opsætninger, fra enten snapfrosset eller frisk væv efterfulgt af permeabilisering eller "skinning", hvilket muliggør ekstern calciumaktivering, hvor varierende calciumkoncentrationer anvendes til at inducere muskelfiberkontraktion24. Mens denne metode er guldstandarden for muskelfiberkontraktile målinger, kan kun en enkelt muskelfiber måles ad gangen, hvilket gør denne teknik til en besværlig og tidskrævende procedure25. Desuden forstyrrer isolerings- og flåningsproceduren for muskelfibrene de forskellige strukturer, der er involveret i excitationskontraktionskobling (dvs. calciumfrigivelse og efterfølgende genoptagelse i det sarkoplasmatiske retikulum), hvorved det ikke er muligt at studere afslapningskinetik og sygdomme, der kan påvirke denne proces26,27. Et alternativ til det flåede fiberpræparat er at bruge mekanisk dissektion til at isolere intakte muskelfibre, hvor kontraktile kræfter kan måles som reaktion på elektrisk aktivering28; Denne tilgang er imidlertid teknisk udfordrende og meget tidskrævende, hvilket resulterer i målinger med lavt gennemløb. Endelig fjernes muskelcellerne fuldstændigt fra det ekstracellulære miljø under kontraktile målinger 24 i både flåede og intakte præparater, hvilket gør det umuligt at undersøge effekten af den ekstracellulære matrixsammensætning/stivhed på muskelfiberkontraktion24. Som et resultat er udviklingen af alternative metoder nødvendig for at muliggøre muskelfiberkontraktilitetsmålinger af isolerede intakte muskelfibre på en høj gennemstrømningsmåde, samtidig med at forbindelsen mellem muskelfibre og den ekstracellulære matrix genskabes.

For nylig blev der udviklet en ny optikbaseret tilgang til højkapacitetsmålinger af muskelfiberkontraktilitet29. Dette optikbaserede system måler hyppigheden af sarkomerer for at vurdere sarkomerlængden under sammentrækning ved hjælp af højhastighedsbilleddannelse. Inden for dette system forbliver cellerne på plads i kulturskålen, mens optikken flyttes, hvorved den nødvendige tid mellem målingerne af flere cellerminimeres 29. En stor fordel ved at bruge denne high-throughput, optik-baserede tilgang er, at det giver mulighed for at udvikle kulturforhold, der ligner dem i det oprindelige væv. En tilgang, der anvendes til at efterligne indfødte in vivo-forhold, er indlejring af celler i hydrogeler30. Typisk er en hydrogel et viskoelastisk materiale, der er i stand til at opretholde dets volumen og form, og hydrogeler har egenskaberne af både faste og flydende materialer31. Den faste del består af polymerkæder tværbundet til hinanden, hvilket skaber en struktur, der ligner en netto30,31. Hydrogelernes materialeegenskaber kan indstilles til at efterligne matrixaflejringen af muskler30,31. Således åbner kombinationen af et high-throughput, optikbaseret system med celler indlejret i hydrogeler nye muligheder for at vurdere virkningerne af ekstracellulær matrixsammensætning og mekaniske egenskaber på muskelfiberfunktionalitet.

Det overordnede mål med dette papir er at 1) beskrive metoden til enzymatisk isolering og ex vivo-kultur af muskelfibre under forhold, der efterligner det oprindelige vævsmiljø og 2) vurdere muskelfiberkontraktilitet ved hjælp af en high-throughput tilgang. Vi beskriver en detaljeret metode til let at isolere et stort antal enkelte muskelfibre fra flexor digitorum brevis (FDB) muskel ved hjælp af enzymatisk fordøjelse. Derudover beskriver vi en teknik til at indlejre de isolerede muskelfibre i en fibrinbaseret hydrogel for at efterligne musklernes oprindelige miljø og forbedre muskelfiberens levedygtighed og kontraktilitet. Vi skitserer derefter en metode med høj kapacitet til måling af levende muskelfiberkontraktioner in vitro ved hjælp af dette nyligt udviklede system. En ekstra fordel ved denne indlejringsprocedure er immobilisering af fibre under sammentrækning, hvilket kan forbedre signal-støjforholdet mellem disse målinger. Denne gelindlejringsmetode er anvendelig til både enkeltpolymer- og kompositgelindkapslingsprocedurer, hvilket letter vurderingen af virkningerne af ekstracellulær matrixsammensætning på muskelfiberkontraktilitet.

Protocol

Til ex vivo-kontraktionsundersøgelserne blev post mortem-væv opnået fra dyr, der blev ofret til andre godkendte forskningsprojekter og / eller avlsoverskud fra VU-universitetet i overensstemmelse med Det Europæiske Råds direktiv (2010/63 / EU) med tilladelse fra Nederlandenes lov om dyreforsøg.

1. Materiale forberedelse

  1. Forbered pipetter til trituration (opbevares i 70% ethanol i et flowskab indtil brug). Skær enderne af to P1.000 spidser for at skabe forskellige hulstørrelser; Sørg for, at hullet er lige stort nok til, at musklen kan passere igennem uden at blokere pipetten. Kør de afskårne ender gennem en flamme, så de bliver glatte.
  2. Tilbered Sylgard-retter som beskrevet andetsteds32, og steriliser med 70% ethanol på forhånd til brug for at sikre pote og muskel under isolering.
    BEMÆRK: Sylgard retter kan genbruges efter grundig rengøring med deioniseret vand og 70% ethanol.
  3. Forbered følgende opløsninger før isolationsproceduren: dissektionsmedium, fibrinkulturmedium og muskelfordøjelsesmedium (se tabel 1).
    BEMÆRK: Muskelfordøjelsesmediet skal filtreres ved hjælp af et 0,22 μm filter. Alle de tilberedte opløsninger skal ekvilibreres i en standard cellekulturinkubator ved 37 °C og 5% CO2 i mindst 30 minutter før brug.
  4. Efter muskelfordøjelsen fremstilles følgende opløsninger til støbning af hydrogelen: celleblanding og matrixblanding (se tabel 2). Kombiner celleblandingen og matrixblandingen i et forhold på 1: 1 for en endelig fibrinkoncentration på 2,5 mg / ml.
    BEMÆRK: Forbered matrixen på is, og brug forkølede pipettespidser for at forhindre for tidlig polymerisation af kældermembranmatrixen. Trombin:fibrinogenforholdet på 1:10 (enheder pr. mg fibrinogen), der anvendes her, er optimeret til en polymerisationstid på 30 min. Hvis gelen polymeriserer inden for 30 minutter, skal der anvendes en lavere trombinkoncentration. Se diskussionen for at få flere oplysninger.

2. FDB muskeldissektion

  1. Aflive musen ved cervikal dislokation. Desinficere bagbenet med 70% alkohol.
  2. Skær det nederste bagben af over anklen. Skær huden på den dorsale side af foden op mod tæerne.
    BEMÆRK: Afskær det nederste bagben ved ankelleddet for at forhindre skade på underekstremitetsmusklerne og skinnebenet, hvis de er nødvendige senere.
  3. Skræl forsigtigt huden mod tæerne. Pas på ikke at beskadige musklen. FDB er den mest overfladiske muskel på den ventrale side af foden.
  4. Den dissekerede fod anbringes i et Sylgard-fad med 10 ml forvarmet dissektionsmedium ved 37 °C. Fastgør foden gennem huden, der stadig er fastgjort til tæerne, og fastgør underbenet ud over anklen.
  5. Fjern forsigtigt bindevævet oven på musklen. Klip senen ved hælen, og løft musklen op ved senen.
  6. Skær langs og under musklen gennem bindevævet. Bliv ved med at skære, indtil tåsenerne er udsatte.
  7. Når halvdelen af længden af de tre sener er udsat, skal du skære senerne og frigøre musklen fra foden. VALGFRIT: Trim den fjerde laterale sene og dens muskelfibre af.
  8. Rens bindevævet fra musklen og overfør det til et rør, der indeholder forvarmet dissektionsmedium.

3. FDB muskelfordøjelse

  1. Klargør muskelfordøjelsesmediet i overensstemmelse med tabel 1.
  2. Overfør FDB-musklerne til muskelfordøjelsesmediet ved hjælp af en serologisk pipette. Der inkuberes i en vævskulturkuvøse ved 37 °C og 5% CO2 i 80 minutter.
    BEMÆRK: Denne tid skal optimeres for hver kollagenasebatch. Fordøjelsen er færdig, når musklen begynder at flosse og ser forstørret ud. Se diskussionen for optimering af fordøjelsestiden.
  3. Efter fordøjelsen overføres musklen til et 15 ml rør indeholdende 3 ml dissektionsmedium og inkuberes i 30 minutter før triturering.

4. FDB muskeltrituration og tyngdekraftssedimentering

  1. Triturere musklen ved hjælp af de tidligere forberedte triturationsspidser (trin 1.1) ved at pipettere musklen, gå fra den største til den mindste størrelse. Hvis dette trin tager længere tid end 5 minutter, skal du placere musklen i inkubatoren i 5 minutter for at lade den hvile.
  2. Triturere, indtil muskelfibrene for det meste er kommet ud af senen, og senen kan passere gennem en P200-spids. Fjern senerne.
  3. Tilsæt de dissocierede FDB-fibre til et 15 ml rør indeholdende 10 ml dissektionsmedium, og lad fibrene sætte sig i inkubatoren i 20 minutter. Overhold den dannede pellet.
  4. Valgfrit: Fjern 10 ml medium fra toppen, og gentag trin 4.3. Dette trin letter fjernelsen af overskydende affald og tilhørende mononukleerede celler.

5. Indlejring af FDB-fibre

  1. Fjern forsigtigt alt mediet fra toppen af fiberpelleten. Resuspender cellerne i 875 μL celleblanding pr. FDB-muskel (på is).
    BEMÆRK: En FDB-muskel giver nok fibre til syv brønde i en 24-brøndplade. Denne tæthed kan justeres efter eksperimentets behov. Følgende gelvolumen (250 μL) er optimeret til et 24-brønds format, men kan skaleres tilsvarende til andre formater.
  2. Alikvote 125 μL af cellen blandes i enkelte mikrocentrifugeglas.
  3. En brønd ad gangen tilsættes 125 μL matrixblanding til en cellesuspension alikvote, og blandes ved at pipettere forsigtigt op og ned, så dannelse af bobler undgås.
  4. Overfør straks den endelige blanding til en brønd.
    BEMÆRK: Sørg for at pipet blandingen ind i midten af brønden. Gentag trin 5.3 og trin 5.4 for hvert hul.
  5. Størkn gelerne i en inkubator i 30-45 min. Efter størkning tilsættes forsigtigt kulturmediet til brøndene.
    BEMÆRK: Hurtig pipettering kan løsne hydrogelen fra brønden. Fra dette tidspunkt kan fibrene stimuleres og måles. Det er imidlertid vores erfaring, at lade fibrene tilpasse sig dyrkningsbetingelserne i 24 timer kan forbedre fiberkontraktiliteten.
  6. For længere kultur skal du genopfylde kulturmediet med en halv ændring hver 2. dag. For at gøre dette skal du fjerne halvdelen af kulturmediet og erstatte det med en lige stor mængde frisk medium.

6. Optikbaserede kontraktile målinger

  1. Tænd for det optikbaserede kontraktile målesystem (se materialetabellen), fluorescenslampen, den elektriske cellepacer og computeren. Indstil den elektriske stimulator til 1,0 Hz, 10,0 V og en pulsvarighed på 5,00 ms for at stimulere de isolerede muskelfibre.
  2. Indsæt pladen i målesystemet. Tilslut paceren til pacingindsatsen, og sæt den i kulturpladen.
  3. Åbn programmet IonWizard, og åbn en ny fil ved at klikke på File (øverst til venstre på skærmen) | Ny.
  4. Kontroller, om programmet er på det rigtige eksperiment, Skeletal Sarcomere, ved at klikke på Ny | Indsaml eksperiment. For at ændre eksperimentet skal du klikke på det ønskede eksperiment og trykke på tilføj. For skeletsarkomereksperimentet skal du anvende følgende indstillinger: Sarc 20x, Gennemsnitlige linjer, enkelt FFT, 250 Hz samplinghastighed og en anskaffelsestid på 10 s.
    BEMÆRK: De eksperimentelle indstillinger skal udarbejdes før eksperimentet. Indstillingerne kan tilpasses eksperimentets behov.
  5. Målesystemets temperatur indstilles til 25 °C. Klik på åben cellefinder under værktøjslinjen, og vent på, at en ny skærm dukker op. Øverst til højre på dette skærmbillede skal du vælge pladetype og aktive huller.
    BEMÆRK: Målingerne udføres ved 25 °C for at reducere sammentrækningshastigheden for de hurtigt rykkende FDB-muskelfibre og derved forhindre undersampling af den kontraktile begivenhed.
  6. Bring fibrene i fokus ved at justere fokusskyderen. Alternativt kan du bruge W-tasten og S-tasten til denne fokuseringsfunktion.
  7. Aktivér tempoet for at starte den elektriske stimulering. Bemærk, at fibrene nu begynder at rykke.
    BEMÆRK: Hvis ingen fibre rykker, skal du sørge for, at alle ledninger er tilsluttet, og at paceren er nedsænket helt. Hvis der efter dette stadig ikke er nogen bevægelse, reagerer fibrene muligvis ikke på grund af overfordøjelse eller overdreven skade under trituration.
  8. Fokuser måleområdet på enden af en fiber, så sarkomererne løber lodret. Sørg for, at sarkomererne er i fokus. Hvis sarkomererne er i fokus, er en enkelt top synlig i værktøjslinjen. Under sammentrækning vil denne top bevæge sig til højre, når sarkomeren forkortes.
    BEMÆRK: Det lilla måleområde kan justeres, før eksperimentet startes. For at sikre en korrekt måling skal du inkludere ~ 20 sarkomerer. Hvis denne top ændrer form under sammentrækning, kan dette indikere, at sarkomeren er skjult eller ude af fokus under sammentrækningen, hvilket introducerer støj.
  9. Start eksperimentet ved at klikke på start på værktøjslinjen. Tryk på Q-tasten for at starte en måling, og vent på, at programmet måler 10 kontraktionstransienter. Hvis mere end fire transienter ser støjfrie ud, skal du acceptere målingen ved at trykke på Z-tasten. Hvis transienterne har for meget støj, skal du afvise målingen ved at trykke på X-tasten.
  10. Mål mellem 10 fibre og 20 fibre pr. Tilstand. Placeringen af de tidligere målte fibre bevares.
  11. Valgfrit: Tilføj forbindelser, hvorefter fibre kan måles igen på dette tidspunkt.
  12. Når eksperimentet er færdigt, skal du trykke på stopknappen på den nederste værktøjslinje for at lukke cellefindervinduet. Gem filen, og start en ny fil.
  13. For at analysere dataene skal du åbne programmet "Cytosolver desktop". Klik på import, og vælg den eller de filer, der skal analyseres.
  14. Når programmet er færdig med analysen, skal du kigge efter blå, røde og grå toppe. De blå toppe er transienter, der accepteres af programmet. De røde toppe er transienter, der afvises af programmet, og de grå toppe er transienter, der afvises af brugeren.
    BEMÆRK: Afvisningskriterierne kan justeres i analysesoftwaren. Generelt afvises værdier, hvis de overstiger en maksimal afledt grænse, og transienter afvises baseret på kurvetilpasning R2-værdier på <0,95.
  15. Klik på eksport. Markér følgende felter: Gennemsnitlige midlertidige data og eksportér til Excel.
  16. Når du er færdig, skal du slukke for alle maskinerne. Tag kulturpladen ud, og bortskaf den. Rengør pacerelektroderne med deioniseret vand og 70% ethanol.

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol blev enkelte FDB-muskelfibre isoleret og indlejret i hydrogel. En oversigt over muskeldissektionsproceduren er vist i figur 1. FDB-musklen blotlægges med intakte sener og skæres løs fra fasciaen. Vedligeholdelse af musklernes sener som fikseringspunkter minimerer potentiel skade på muskelfibrene under isolationsproceduren. Overskydende bindevæv kan trimmes af for at reducere snavs og væksten af sekundære celletyper. Når musklen er blevet udskåret og renset tilstrækkeligt, fordøjes musklen enzymatisk ved hjælp af collagenase, og enkelte muskelfibre frigives ved trituration inden indlejring af de isolerede celler i hydrogeler. Isoleringen af FDB-muskelfibre giver relativt korte muskelfibre, som har den fordel, at de let kan manipuleres. På grund af deres størrelse kan FDB-muskelfibre pipetteres sikkert uden indfiltringsinduceret skade og er let indlejret i en hydrogel. Da enkelte muskelfibre ikke klæber særlig godt til kulturplader, sikrer indlejring af fibrene i hydrogel, at fibrene forbliver sat under cellekulturen og kontraktile målinger. Desuden tillader tilføjelsen af en kældermembranmatrix til fibringlen interaktioner mellem muskelfibrene og matrixen, der efterligner det oprindelige in vivo-miljø . Isolerede enkeltmuskelfibre kan manipuleres og opretholdes i kultur i flere dage efter isolation. I figur 2 vises et eksempel på isolerede FDB-fibre indlejret i en hydrogelmatrix. De sunde fibre har synlige sarkomerer og strækkes lige ud (blå pil), mens de buede fibre typisk er beskadigede eller uigennemtrængelige (gul pil) og bør udelukkes fra målingerne. Hyperkontraherede fibre fremstår som mørke balled-up objekter i matrixen (rød pil). Hvis isolationsproceduren var vellykket, skal andelen af sunde fibre være ~ 75%. En større andel af hyperkontraherede fibre indikerer normalt skade under isoleringsproceduren. Membranen i muskelfibrene kan blive beskadiget enten ved overfordøjelse af musklen eller beskadigelse af fibrene under trituration. Triturationsskader opstår hovedsageligt, hvis musklen er underfordøjet og dermed ikke let kommer fra hinanden.

Fiberfunktionaliteten og levedygtigheden blev vurderet gennem kontraktile målinger af muskelfibrene ved hjælp af et optikbaseret kontraktilt målesystem med høj kapacitet. Systemet udsender flere parametre, såsom sarkomerlængden, procentdelen af sarkomerforkortelse, kontraktil hastighed og afslapningshastighed. Ved hjælp af det kontraktile målesystem kan sarkomerkontraktion måles pr. Muskelfiber. Figur 3 viser eksempler på muskelfiberkontraktioner målt ved hjælp af målesystemet. Fra en enkelt kontraktionstransient opnås følgende parametre: sarkomerlængde ved baseline, sammentrækningsvarighed, sarkomerlængde ved maksimal sammentrækning og afslapningsvarighed (figur 3A). Disse parametre bruges til at beregne procentdelen af sarkomerforkortelse, sammentrækning og afslapningshastigheder. Gennemsnitshastighedsværdier kan også beregnes ud fra varigheds- og absolutte afkortningsværdier, hvis det er nødvendigt. En gyldig kontraktionsmåling omfatter en lige basislinje efterfulgt af et dyk til toppen og en tilbagevenden til basislinjen (figur 3A). Støj, ufokuserede sarkomerer eller afvigende bevægelse af fiberen kan påvirke måletransienten (figur 3B, C), og disse målinger kan kasseres manuelt eller afvises af analyseprogrammet. I denne tilgang er den klare visualisering af sarkomererne vigtig for måling af sammentrækningerne; Således kan alt, hvad der reducerer sarkomerernes synlighed, introducere støj. Dette kan forekomme, hvis der er bevægelse af sarkomeren uden for brændplanet under sammentrækning. Målinger, hvor en række sammentrækninger afviger i hastighed eller dybde, bør også udelukkes fra datasættet.

De kontraktile data for enkeltmuskelfibre opnået med dette system kan bruges til at sammenligne forskellige dyrkningsforhold. Systemets effektivitet er illustreret i figur 4. Her målte vi sammentrækningerne af FDB-muskelfibre i både 2D (lamininbelagte kulturplader) og 3D (fibrinhydrogel) kulturformater. En højere procentdel af brugbare målinger blev opnået i 3D, da indlejring af fibrene i gelen forhindrede lateral bevægelse og andre bevægelsesartefakter i at påvirke målingen (figur 4A). Indlejring af fibrene havde ingen signifikant effekt på hverken sarkomerforkortelsen eller de maksimale sammentrækningshastighedsværdier sammenlignet med de 2D-dyrkede fibre (figur 4B). For at illustrere, hvordan forskellige matricer påvirker sammentrækningen af FDB-muskelfibre, sammenlignede vi også denne fibrinhydrogel med en ren kældermembranmatrix (4 mg / ml) (figur 4C). Den reducerede kontraktilitet, der blev observeret i den rene kældermembranmatrix, skyldtes sandsynligvis gelens stivhed eller øgede celle-matrix-interaktioner. Fibrinkoncentrationer på op til 7 mg/ml er også blevet testet uden signifikant effekt på kontraktil hastighed og forkortelse (upublicerede data). Brugen af denne fibrinbaserede hydrogel sikrer minimal interferens med kontraktile parametre.

Figure 1
Figur 1: En oversigt over FDB-muskeldissektionsproceduren. (A) Bagbenet skæres over anklen (rød stiplede linje), og (B) huden fjernes ved at skære langs toppen af foden langs den blå stiplede linje. (C) Foden fastgøres gennem anklen og huden ved tæerne. D) Mikroskopisk billede af den eksponerede muskel og dens omgivende bindevæv. Fascia er synlig som et hvidt uigennemsigtigt lag, gennem hvilket vaskulaturen løber. (E) Fascia fjernes fra musklen, og senen skæres langs den røde stiplede linje. (F) FDB-musklen adskilles fra det underliggende væv ved at løfte og skære under og langs musklen. (G) Når tæernes sener er tydeligt synlige, skæres FDB løs langs den røde stiplede linje. (H) FDB er sikret af senerne, og den fjerde laterale sene og dens fibre kan fjernes ved at skære langs den røde stiplede linje. Overskydende fascia kan nu trimmes af. (I) Efter rengøring overføres FDB-musklen til kollagenaseopløsningen. Skalastænger = (D-I) 2 mm. Forkortelse: FDB = flexor digitorum brevis. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Mikroskopisk billede af FDB-muskelfibre indlejret i hydrogel efter 24 timers kultur. Blå pil: Eksempel på en levedygtig FDB muskelfiber. Gul pil: Eksempel på en snoet FDB muskelfiber. Twisted muskelfibre kan have nedsat levedygtighed og nedsat sammentrækninger og bør derfor udelukkes fra målingerne. Rød pil: Eksempel på en hyperkontraheret FDB-muskelfiber. Overdreven hyperkontraktion opstår, når trituration udføres for kraftigt eller kan skyldes kollagenaseoverfordøjelse eller anvendelse af ikke-ekvilibreret kulturmedium. Skalabjælke = 100 μm. Forkortelse: FDB = flexor digitorum brevis. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på fiberkontraktionstransienter målt ved hjælp af det optikbaserede kontraktilesystem med høj kapacitet. (A) Eksempel på en normal kontraktionstransient. Denne forbigående opnås fra sarkomererne omgivet af den lilla firkant vist i den nederste værktøjslinje. Transienten består af følgende komponenter: sarkomerlængde ved baseline (grøn), sammentrækningsvarighed (blå), sarkomerlængde ved maksimal sammentrækning (lilla) og afslapningsvarighed (rød). Parametre som hastighed og procentdel af sammentrækning beregnes ud fra disse værdier. (B) Eksempel på en utilstrækkelig kontraktionsforbigående. Disse målinger foretages, når sarkomersignalet ikke opfanges på grund af støj (se røde pile). (C) Eksempel på en kontraktionstransient, der har en bevægelsesartefakt (se grønne pile). Bevægelsesartefakter opstår, når muskelfiberen bevæger sig uden for fokus under sammentrækningen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative data opnået ved hjælp af det optikbaserede kontraktilesystem med høj kapacitet ved sammenligning af 2D versus 3D-betingelser og forskellige hydrogeler . (A) Procentdel af accepterede og afviste kontraktionsmålinger fundet af dataanalyseprogrammet i 2D-kultur og i 3D-kultur baseret på 30 målinger. (B) Sammenligning af den maksimale sammentrækningshastighed i 2D-dyrkede og 3D-dyrkede muskelfibre isoleret fra tre mus efter 24 timers kultur. (C) Sammenligning af sarkomerforkortelsen i 2D-dyrkede og 3D-dyrkede muskelfibre isoleret fra tre mus efter 24 timers kultur. (D) Sammenligning af den maksimale sammentrækningshastighed for rene kældermembranmatrix (Matrigel)-indlejrede og fibrinhydrogelindlejrede muskelfibre isoleret fra tre mus efter 24 timers kultur. (E) Sammenligning af sarkomerforkortelsen af rene kældermembranmatrix (Matrigel)-indlejrede og fibrinhydrogelindlejrede muskelfibre isoleret fra tre mus efter 24 timers kultur. Dataene blev analyseret ved hjælp af en studerendes t-test og vises som gennemsnit ± SD. Hvert datapunkt er en muskelfiber. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammensætning af dissektionsmediet, der bruges til at dissekere musklen, fibrinkulturmediet, der bruges til at dyrke de isolerede muskelfibre, og muskelfordøjelsesmediet, der bruges til enzymatisk at fordøje de isolerede muskler. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Sammensætning af celleblandingen, der blev brugt til at støbe hydrogelerne, og matrixblandingen, der blev brugt til at støbe hydrogelerne. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Her beskriver vi en protokol til udførelse af enzymatisk isolering og kultur af FDB-muskelfibre i et 3D-kulturformat efterfulgt af kontraktile målinger ved hjælp af et optikbaseret kontraktilt målesystem. Denne protokol har en række fordele, herunder 1) ligetil og rettidig isolering af mange intakte muskelfibre fra en enkelt muskel; 2) indlejring af muskelfibrene i en justerbar hydrogelmatrix; 3) udførelsen af kontraktilitetsmålinger med høj kapacitet ved hjælp af det optikbaserede system og 4) evnen til at foretage gentagne målinger af de samme muskelfibre efter en intervention. Isoleringen af enkelte levende muskelfibre giver modne muskelceller, der bevarer deres kontraktile funktion. Da muskelfibrene opnået fra musens FDB er relativt små, manipuleres de let under isolering og opretholder deres lige form, hvilket muliggør nedstrøms kontraktile målinger. Selvom systemet primært blev udviklet til at studere kardiomyocytkontraktion, indeholder skeletmuskelfibre det samme kontraktile maskineri med let skelneligt sarkomermønster og kan således også måles ved hjælp af dette system29. Koblingen af enkeltcellekontraktile målinger med levende ex vivo muskelfiberkultur er et kraftfuldt værktøj til at vurdere modne muskelfibres sundhed og funktion som reaktion på elektrisk aktivering.

En begrænsning ved anvendelse af dissocierede muskelfibre er manglen på eksterne kræfter (dvs. passiv strækning) påført fibrene, hvilket resulterer i lavere hvilende sarkomomerlængder sammenlignet med dem, der findes in vivo. Selvom en sarkomerlængde på 2,4-2,5 μm sikrer optimal kraftproduktion, kan hvilesarkomerlængden variere meget33. Mens in vivo hvilesarkomerlængden af FDB endnu ikke er blevet beskrevet, tyder vores egne upublicerede data på en gennemsnitlig længde på 2,2 μm. De aktuelle resultater viser en gennemsnitlig hvilesarkomerlængde på ~ 1,95 μm i ubelastede FDB-fibre efter 24 timer i kultur (figur 3). Selvom denne lavere hvilende sarkomerlængde ville resultere i lavere kraftproduktion, bør en længde på ~ 1,95 μm stadig producere >90% af den maksimale kraft34. Som sådan bør disse sarkomerlængder være tilstrækkelige til at bestemme forskelle i fiberfunktion mellem forskellige genetiske modeller eller efter lægemiddelbehandlinger. Derudover giver indlejringen af fibre i en hydrogel mange yderligere punkter for vedhæftning sammenlignet med fritflydende 2D-dyrkede fibre, hvilket ville begrænse yderligere sarkomerforkortelse over tid.

En fordel ved denne muskelfiberisoleringsprotokol er brugen af en let dissekeret hurtig muskel bestående af relativt små muskelfibre sammenlignet med andre muskler, såsom extensor digitorum longus (EDL). Deres mindre størrelse gør muskelisoleringen mere velegnet til triturationsbaseret adskillelse, hvilket reducerer risikoen for pipet- eller sammenfiltringsinduceret skade på muskelfibrene. Den ekstracellulære matrix af FDB-muskler kan let enzymatisk fordøjes med kollagenase, hvilket muliggør isolering af hundredvis af muskelfibre på kort tid. Overfordøjelse kan dog føre til skade på muskelfibrene. Overfordøjelsen af muskelfibrene kan genkendes, når musklen falder fra hinanden næsten øjeblikkeligt, når musklen tritureres, eller når en stor del af cellevolumenet hyperkontraheres under cellesåningsproceduren. For at forhindre overfordøjelse af musklen skal fordøjelsestiden optimeres for hver kollagenasebatch. For at teste dette skal to FDB-muskler fordøjes parallelt med en forskudt fordøjelsestid på 5 min mellem dem. Fordøjelsestiden med det højeste udbytte af levedygtige muskelfibre bør vælges. Denne optimering skal derefter udføres en anden gang, igen med 5 minutters adskillelse i fordøjelsestiden. Fordøjelsestiden, der giver de højest levedygtige muskelfibre, bør anvendes som den optimale fordøjelsestid for den aktuelle batch af collagenase. En anden måde at begrænse batch-til-batch-variabiliteten af collagenase ville være direkte at beregne aktivitetsenhederne pr. milliliter stamopløsning og derefter rekonstituere de efterfølgende kollagenasebatcher til samme mængde. Endelig kan det være nødvendigt at optimere fordøjelsestiderne på tværs af forskellige musestammer, for eksempel hvis man studerer ældre eller syge dyr, der udviser øget ekstracellulær matrixaflejring35,36.

Muligheden for pipettering af levedygtige isolerede muskelfibre åbner muligheder for dyrkning af FDB-muskelfibre under forskellige dyrkningsforhold. En sådan mulighed er dyrkning af disse fibre i hydrogeler for at efterligne det oprindelige vævskulturmiljø. Denne indlejringsprotokol sikrer, at fibrene forbliver på plads under kontraktile målinger og er optimeret til at lade fibrene sætte sig i bunden af pladen, før gelen sætter sig. Det kan dog være nødvendigt at justere denne protokol for at tage hensyn til forskelle i trombin- og fibrinogenbestandene. Hvis trombinaktiviteten er for høj, vil gelen sætte sig for tidligt, og fibrene kan forblive suspenderet på højere steder uden for mikroskopets brændplan. Hvis dette sker, skal trombin:fibrinogenforholdet justeres. Dette kan testes ved plettering af fibre i stadig lavere trombinkoncentrationer og notere, hvor lang tid polymerisationen tager. Dette bør typisk ikke ske hurtigere end 30 min. At have en trombinkoncentration, der er for lav, kan imidlertid også forringe polymerisationsprocessen. En anden metode til at sikre, at fibrene er i det korrekte brændplan, er først at frø dem ved hjælp af en 2D-protokol og derefter tilføje et lag hydrogel over fibrene, efter at de har klæbet til kulturpladen. Man skal dog være opmærksom på, at fjernelse af mediet fra fibrene kan fremkalde hypersammentrækning, da de er følsomme over for udtørring. Det er også uklart, om hydrogelen vil fastgøre fuldt ud til kulturpladen, og det kan løsne sig lettere. Derfor foretrækkes denne indlejringsprocedure for at holde fibre levedygtige og på plads til sammentrækningsmålinger.

Brugen af denne protokol muliggør undersøgelse af kontraktil dynamik af modne muskelfibre ex vivo og kan anvendes på både raske mus og dem, der bærer genetiske mutationer for muskelsygdomme. Ligeledes muliggør det test af, hvordan kulturbetingelser eller tilsætning af forbindelser påvirker muskelfiberfunktionen. De kontraktile data opnået ved hjælp af det optikbaserede system giver en indikation af kontraktiliteten af levende enkeltmuskelfibre, og ændringer i denne evne kan korreleres med fibersundhed. Disse data alene er imidlertid ikke tilstrækkelige til at afgøre, om disse ændringer forekommer i actin-myosin krydsbrobygning eller calciumfrigivelsesstadier af muskelkontraktion. Selvom vi ikke beskriver metoder til måling af calciumsignalering i denne protokol, er denne opsætning også i stand til at måle Fura-baserede calciumtransienter i kontraherende muskelceller29. En ulempe ved dette system er, at FDB-musklen kun indeholder hurtige træk type IIa / IIx muskelfibre, og muskler, der indeholder langsomme træk type I-fibre af denne størrelse, er endnu ikke beskrevet37. Dette eliminerer evnen til at studere fibertypespecifik funktion ved hjælp af denne metode. Den protokol, vi foreslår her, kan potentielt tilpasses andre muskler såsom EDL eller soleus for at studere fibertypeforskelle. På grund af deres større størrelse skal denne protokol optimeres yderligere til disse muskler. Længere fibre har tendens til at blive sammenfiltret under tyngdekraftssedimenteringstrinnet og vil briste, hvis de manipuleres ved pipettering, hvilket ville føre til lavere udbytte. På grund af deres uforenelighed med pipettering er længere fibre derfor også mindre kompatible med gelindlejringsteknikken. Målinger af disse fibre kan stadig udføres i et 2D-kulturformat, men fibrene kan bevæge sig mere rundt under sammentrækning på grund af deres størrelse og dermed påvirke signal-støj-forholdet. En anden begrænsning af dette system er manglende evne til at udføre kraftmålinger sammen med kontraktile målinger, såsom de kraftmålinger, der kan opnås ved hjælp af andre intakte muskelfiberpræparater28. Denne begrænsning kan dog omgås ved at estimere den kraft, der genereres af muskelfiberen. Den genererede kraft af muskelfibre kan estimeres, hvis muskelfiberformen under kontraherede og afslappede tilstande såvel som Youngs matrixmodul er kendt25. Ikke desto mindre giver dette optiske baserede system en brugervenlig tilgang med høj kapacitet til at studere muskelkontraktil funktion og åbner en række nye muligheder for at studere genetiske muskelsygdomme og terapeutiske indgreb.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes og Emmy Manders for deres tekniske ekspertise i at hjælpe med at udvikle denne protokol. Dette arbejde blev støttet af priser fra Muskelsvindforeningen (Development Award MDA603238 til T.J.K), Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) og National Health and Medical Research Council (NHMRC, Australien; Fellowship APP1121651 til M.Y).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aprotinin, from Bovine Lung Thermo Scientific AAJ63039MC 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C.  Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Collagenase type 2 Worthington 77336 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous.
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fibrinogen from Bovine Plasma Sigma Aldrich 50-176-5054 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher A1413201 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C.
Gibco MEM High glucose + pyruvate Thermo Fisher 11095080
Horse serum Thermo Fisher H1270
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning CB-40230 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C.
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333
Serum Replacement 2 (50x) Sigma Aldrich S9388
Thrombin, Bovine Plasma Thermo Scientific AAJ63383EXP 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Tranexamic Acid Thermo Scientific AC228042500 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C.  Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Equipment
24-well electrical stimulator IonOptix N/a
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11295-51
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
MultiCell Cytocypher IonOptix N/a
MyoCam-S3 IonOptix N/a
MyoPacer IonOptix N/a
SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent  Dow corning  N/a
Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15002-08
Software
CytoSolver IonOptix N/a
IonWizard IonOptix N/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  2. Khodabukus, A., Prabhu, N., Wang, J., Bursac, N. In vitro tissue-engineered skeletal muscle models for studying muscle physiology and disease. Advanced Healthcare Materials. 7 (15), 1701498 (2018).
  3. Fernandez-Costa, J. M., Fernandez-Garibay, X., Velasco-Mallorqui, F., Ramon-Azcon, J. Bioengineered in vitro skeletal muscles as new tools for muscular dystrophies preclinical studies. Journal of Tissue Engineering. 12, 2041731420981339 (2021).
  4. Romagnoli, C., Iantomasi, T., Brandi, M. L. Available in vitro models for human satellite cells from skeletal muscle. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13221 (2021).
  5. Dessauge, F., Schleder, C., Perruchot, M. -H., Rouger, K. 3D in vitro models of skeletal muscle: Myopshere, myobundle and bioprinted muscle construct. Veterinary Research. 52 (1), 72 (2021).
  6. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell Biology International. 37 (2), 191-196 (2013).
  7. Guo, X., et al. In vitro differentiation of functional human skeletal myotubes in a defined system. Biomaterials Science. 2 (1), 131-138 (2014).
  8. Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
  9. Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In vitro differentiation of mature myofibers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
  10. Khodabukus, A. Tissue-engineered skeletal muscle models to study muscle function, plasticity, and disease. Frontiers in Physiology. 12, 619710 (2021).
  11. Engler, A. J., et al. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: Pathological implications for soft or stiff microenvironments. Journal of Cell Biology. 166 (6), 877-887 (2004).
  12. Huang, N. F., et al. Myotube assembly on nanofibrous and micropatterned polymers. Nano Letters. 6 (3), 537-542 (2006).
  13. Earle, A. J., et al. Mutant lamins cause nuclear envelope rupture and DNA damage in skeletal muscle cells. Nature Materials. 19 (4), 464-473 (2020).
  14. Stange, K., Ahrens, H. E., von Maltzahn, J., Rontgen, M. Isolation and ex vivo cultivation of single myofibers from porcine muscle. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 56 (8), 585-592 (2020).
  15. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--A more mature muscle culture system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  16. Ramsey, R. W., Street, S. F. The isometric length-tension diagram of isolated skeletal muscle fibers of the frog. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 15 (1), 11-34 (1940).
  17. Selvin, D., Hesse, E., Renaud, J. M. Properties of single FDB fibers following a collagenase digestion for studying contractility, fatigue, and pCa-sarcomere shortening relationship. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 308 (6), R467-R479 (2015).
  18. Renzini, A., et al. Culture conditions influence satellite cell activation and survival of single myofibers. European Journal of Translational Myology. 28 (2), 7567 (2018).
  19. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
  20. Holmberg, J., Durbeej, M. Laminin-211 in skeletal muscle function. Cell Adhesion and Migration. 7 (1), 111-121 (2013).
  21. Stuelsatz, P., Keire, P., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation, culture, and immunostaining of skeletal muscle myofibers from wildtype and nestin-GFP mice as a means to analyze satellite cell. Methods in Molecular Biology. 1556, 51-102 (2017).
  22. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Bonen, A. Viability of the isolated soleus muscle during long-term incubation. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. 31 (4), 467-476 (2006).
  23. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  24. Ottenheijm, C. A., et al. Altered myofilament function depresses force generation in patients with nebulin-based nemaline myopathy (NEM2). Journal of Structural Biology. 170 (2), 334-343 (2010).
  25. Rausch, M., et al. Measurement of skeletal muscle fiber contractility with high-speed traction microscopy. Biophysical Journal. 118 (3), 657-666 (2020).
  26. de Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 754-767 (2020).
  27. Wijnker, P. J. M., vander Velden, J. Mutation-specific pathology and treatment of hypertrophic cardiomyopathy in patients, mouse models and human engineered heart tissue. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165774 (2020).
  28. Cheng, A. J., Westerblad, H. Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca(2+)] in fully intact single skeletal muscle fibers. Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).
  29. Cao, L., Manders, E., Helmes, M. Automatic detection of adult cardiomyocyte for high throughput measurements of calcium and contractility. PLoS One. 16 (9), e0256713 (2021).
  30. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2010).
  31. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical Research. 26 (3), 631-643 (2009).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Sylgard-coated coverslips and petri dishes. Cold Spring Harbor Protocols. 2022 (8), Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2022).
  33. Moo, E. K., Fortuna, R., Sibole, S. C., Abusara, Z., Herzog, W. In vivo sarcomere lengths and sarcomere elongations are not uniform across an intact muscle. Frontiers in Physiology. 7, 187 (2016).
  34. Moo, E. K., Leonard, T. R., Herzog, W. The sarcomere force-length relationship in an intact muscle-tendon unit. Journal of Experimental Biology. 223, 215020 (2020).
  35. Schuler, S. C., et al. Extensive remodeling of the extracellular matrix during aging contributes to age-dependent impairments of muscle stem cell functionality. Cell Reports. 35 (10), 109223 (2021).
  36. Carberry, S., Zweyer, M., Swandulla, D., Ohlendieck, K. Proteomics reveals drastic increase of extracellular matrix proteins collagen and dermatopontin in the aged mdx diaphragm model of Duchenne muscular dystrophy. International Journal of Molecular Medicine. 30 (2), 229-234 (2012).
  37. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14 (2018).

Tags

Tom værdi udgave 195
Kontraktile målinger med høj kapacitet af hydrogelindlejrede intakte musemuskelfibre ved hjælp af et optikbaseret system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vonk, L. A., Esen, O., Yuen, M.,… More

Vonk, L. A., Esen, O., Yuen, M., Kirby, T. J. High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System. J. Vis. Exp. (195), e65103, doi:10.3791/65103 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter