Summary
מוצרים קסנוגניים (כימיים או מן החי) שהוכנסו בשלבי ההכנה/מניפולציה של הטיפול התא קשורים לסיכון מוגבר לתגובתיות חיסונית ולהעברה פתוגנית בחולים מארחים. כאן מתוארת שיטה שלמה נטולת קסנוגנים לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי.
Abstract
בהתחשב בהשפעה הגוברת של טיפול בתאי גזע, הועלו חששות בטיחות ביולוגית לגבי זיהום פוטנציאלי או העברת זיהום עקב הכנסת מוצרים שמקורם מן החי במהלך מניפולציה חוץ גופית . המרכיבים הקסנוגניים, כגון collagenase או סרום בקר עוברי, המשמשים בדרך כלל במהלך שלבי בידוד והרחבת התאים עשויים להיות קשורים לסיכונים פוטנציאליים של תגובתיות חיסונית או זיהום נגיפי, חיידקי ופריון בחולים המקבלים. בהתאם להנחיות נוהלי ייצור נאותים, יש להימנע מדיסוציאציה של רקמות כימיות, בעוד שניתן להחליף את סרום הבקר העוברי (FBS) בתוספים נטולי קסנוגניות. יתר על כן, כדי להבטיח את הבטיחות של מוצרי התא, ההגדרה של שיטות אמינות יותר לשחזור חשוב. פיתחנו שיטה חדשנית, נטולת קסנוגניות לחלוטין לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע אנושיים שמקורם בשומן מבלי לשנות את תכונותיהם בהשוואה לפרוטוקולים סטנדרטיים של קולגנאז בתרבית FBS. כאן, תאי גזע שמקורם בשומן אנושי (hASCs) בודדו מרקמת השומן הבטנית. הדגימה נטחנה באופן מכני עם מספריים/אזמל, נותחה במיקרו ופוזרה מכנית בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ, והוכנה עם חתכי אזמל כדי להקל על חיבור שברי הרקמה ונדידת hASCs. לאחר שלבי השטיפה, נבחרו hASCs בשל היצמדות הפלסטיק שלהם ללא עיכול אנזימטי. ה-hASCs המבודדים גודלו בתרבית עם תוספת בינונית עם 5% ליזט טסיות אדם ללא הפרין ומנותקים עם תחליף טריפסין ללא בעלי חיים. בעקבות הנחיות GMP (תנאי ייצור נאותים) על ייצור מוצרי תאים המיועדים לטיפול בבני אדם, לא נעשה שימוש באנטיביוטיקה בשום אמצעי תרבית.
Introduction
בעשורים האחרונים, הביקוש הגובר לטיפולים טיפוליים חדשניים הוליד מאמצים משמעותיים והשקעת משאבים בתחום הרפואה התרגומית1. מוצרים מבוססי תאים קשורים לסיכונים הנקבעים על ידי מקור התא, תהליך הייצור (בידוד, הרחבה או שינוי גנטי), והתוספים הלא-תאיים (אנזימים, גורמי גדילה, תוספי תרבית ואנטיביוטיקה), וגורמי סיכון אלה תלויים בהתוויה הטיפולית הספציפית. האיכות, הבטיחות והיעילות של המוצר הסופי עשויים להיות מושפעים עמוקות מהאלמנטים שצוינו לעיל2. טיפול בתאי גזע דורש דבקות בעקרונות הבטיחות הביולוגית; הסיכונים הפוטנציאליים של העברה פתוגנית עם מוצרים שמקורם מן החי בתרבית תאים עלולים להיות בעייתיים, ובדיקה יסודית של כל מוצר שהוכנס לייצור היא חיונית3.
השיטה המסורתית לבידוד תאי גזע שמקורם בשומן אנושי (hASCs) כוללת עיכול אנזימטי המבוצע עם collagenase ואחריו שטיפת שלבים באמצעות צנטריפוגה4. בעוד בידוד אנזימטי נחשב בדרך כלל יעיל יותר מאשר טכניקות מכניות אחרות במונחים של תפוקת תאים וכדאיות, רכיבים שמקורם מן החי בשימוש, כגון collagenase, נחשבים יותר מניפולציה מינימלית על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי. משמעות הדבר היא שיש סיכון מוגבר באופן משמעותי לתגובות חיסוניות או העברת מחלות, ובכך להגביל את התרגום של טיפול hASC להגדרות קליניות 5,6.
עיכול מבוסס טריפסין הוא פרוטוקול אנזימטי נוסף לבידוד ASC. טכניקות שונות תוארו עם שינויים קלים במונחים של ריכוז טריפסין, מהירות צנטריפוגה, וזמן הדגירה. למרבה הצער, שיטה זו אינה מתוארת היטב, וחוסר השוואה קיים בספרות, במיוחד עם פרוטוקולי בידוד מכני7. עם זאת, במונחים של תרגום של הגישה, טריפסין יש את אותם חסרונות של collagenase.
שיטות בידוד חלופיות להשגת ASCs, המבוססות על כוחות מכניים וללא תוספת אנזימים, כוללות צנטריפוגה במהירות גבוהה (800 x גרם או 1,280 x גרם, 15 דקות) של שברי רקמת השומן. לאחר מכן, הגלולה מודגרת עם חיץ ליזה של תאי דם אדומים (5 דקות), ואחריו צעד צנטריפוגה נוסף ב 600 x גרם לפני השעיה בתווך תרבית. למרות מספר גדול יותר של תאים שבודדו בימים הראשונים בהשוואה לשיטות explant, מחקר קודם הראה התפשטות נמוכה או נעדרת מעבר לשבוע השני של תרבית8.
מלבד זאת, מניפולציה נוספת עם תוספת קסנוגנית, כגון סרום בקר עוברי (FBS), המשמש כתוסף גורם גדילה לתרבית תאים, קשורה לסיכון מוגבר לתגובתיות חיסונית וחשיפה לזיהומים ויראליים, חיידקיים או פריונים של החולה המארח 9,10. תגובות חיסוניות והתפתחות פריחה באורטיקריפורמים כבר תוארו אצל אנשים שקיבלו מספר מנות של תאי גזע מזנכימליים המיוצרים עם FBS11. יתר על כן, FBS נתון לשונות אצווה לאצווה, אשר יכולה להשפיע על איכות המוצר הסופי12.
בהתאם להנחיות תנאי ייצור נאותים (GMP), יש להימנע מדיסוציאציה אנזימטית של רקמות, ויש להחליף את FBS בתוספים נטולי קסנוגניות. צעדים אלה, יחד עם פרוטוקולים אמינים יותר הניתנים לשחזור, חיוניים לתמיכה ביישום של טיפול תאי 3,13.
בהקשר זה, הוצע ליזט טסיות דם אנושי (hPL) כתחליף ל- FBS מכיוון שהוא תוסף ללא תאים, המכיל חלבונים ומועשר בגורמי גדילה, והוא הוצג מוקדם יותר בקרב מוצרים מבוססי תאים ברמה קלינית כתוסף של מדיום גדילה לתרבית תאים חוץ גופית והרחבה14,15. מכיוון ש- hPL הוא מוצר שמקורו בבני אדם, הוא משמש לעתים קרובות כתחליף ל- FBS במהלך תרבית החוץ גופית של hASCs המיועדים ליישומים קליניים, ובכך מפחית בעיות לגבי תגובות אימונולוגיות וזיהומים הקשורים לתרגום FBS15,16.
למרות עלויות הייצור הגבוהות יותר, כבר הוכח כי בהשוואה ל- FBS, hPL תומך בכדאיות התא עבור סוגי תאים רבים, מגביר את ההתפשטות, מעכב הזדקנות, מבטיח יציבות גנומית ומשמר את האימונופנוטיפ התאי גם במעברי תאים מאוחרים; כל המרכיבים הללו תומכים במעבר למוסף תרבות זה11.
מטרת העבודה הזו הייתה לפתח פרוטוקול סטנדרטי לבידוד ולתרבית של hASCs בשיטה מלאה נטולת בעלי חיים, מבלי לשנות את הפיזיולוגיה של התא ואת תכונות הגבעול בהשוואה ל-hASCs קלאסיים בתרבית FBS (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hASCs בודדו מרקמת השומן הבטני של אישה בריאה שעברה שחזור שד באמצעות דשים אוטולוגיים בטניים (דשים אפיגסטריים עמוקים נחותים, [DIEP]) בבית החולים האוניברסיטאי של לוזאן, CHUV, לוזאן, שוויץ. החלק המושלך של הדש ורקמת השומן הושג לאחר שהמטופל חתם על הסכמה מדעת. כל הפרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי מחלקת הביובנק של בית החולים DAL (מספר 314 GGC) וועדות האתיקה בהתאם להצהרת הלסינקי.
הערה: כל השלבים חייבים להתבצע תחת מכסה מנוע זרימה למינרית ובתנאים אספטיים. תמיד יש ללבוש כפפות ומעילי מעבדה להגנה אישית, ויש לשטוף את כל המשטחים עם ביוצידים מתאימים. יש להשליך רקמות עודפות כראוי כפסולת ביו-רפואית.
1. החומרים הדרושים והכנת פתרונות התרבות
- לבידוד, הרחבה ושימור בהקפאה של תאים, השג את המכשירים הבאים: מספריים סטריליים; אזמלים סטריליים; פינצטה סטרילית; צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ; צינורות 15 מ"ל; T25 צלוחיות; תא בורקר; קריובלים; מיכל הקפאת תאים; מיקרוסקופ אופטי עם מטרות הגדלה פי 4 ו-10; וצנטריפוגת דלי מתנדנדת.
- עבור immunophenotyping, להשיג את המכשירים הבאים ריאגנטים: צינורות FACS, מלוחים סטריליים פוספט חוצץ (PBS); המדיום החיוני המינימלי של דולבקו (DMEM); hPL; דימתיל סולפיד; וטריפסין ללא בעלי חיים.
- הכן את מדיום התרבית המלא על ידי תוספת DMEM עם 5% hPL ללא הפרין. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 שבועות, ולהשתמש תמיד בחום (בין טמפרטורת החדר ל-37°C). בהתאם להנחיות GMP לייצור תרופות תאיות המיועדות לטיפול בבני אדם, אין להוסיף אנטיביוטיקה למדיום התרבית.
- הכינו אמצעי הקפאה המכיל 20% hPL ו-10% דימתיל סולפיד ב-DMEM.
2. בידוד hASCs מדגימת רקמת השומן
- עבד את דגימת רקמת השומן תוך 6 שעות מקבלתה. לפני שתמשיך לשיטת הבידוד המכנית נטולת קסנוגניות, שטוף את הרקמה 2x עם PBS במשך 10 דקות עד לשחרור רקמת החיבור והדם.
- אחסן את דגימת רקמת השומן המתקבלת מניתוח בטן ב- PBS ב -4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד, ובכל מקרה, לא יותר מ -24 שעות, על מנת לא לפגוע בכדאיות hASC.
- חותכים את רקמת השומן לחתיכות קטנות יותר של כ 1 ס"מ2 עם מספריים סטריליים.
- בעזרת אזמל, חתכו במיקרו כל חתיכה לשברים קטנים בקוטר <5 מ"מ, ופזרו חמישה מהם בצלוחית פטרי בקוטר 10 ס"מ (איור 2A).
- על מנת לחבר כל שבר, השתמשו באזמל כדי ליצור חתכים על משטח הפלסטיק, וגררו כל שבר עד שהוא נדבק היטב לצלחת הפטרי. השתמשו בפינצטה כדי לעזור לטפל בשבר (איור 2B).
- מוסיפים בעדינות 10 מ"ל של מדיום תרבית שלם על מנת לכסות את כל השברים מבלי לנתק אותם.
- לדגור על צלחות פטרי ב 37 ° C ו 5% CO2. ה- hASCs ינדדו אל מחוץ לרקמה וייבחרו בשל היצמדות הפלסטיק שלהם ללא עיכול אנזימטי.
- עד למפגש התא, עקוב אחר התרחבות ה- hASC תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה פי 4 פעם ביום. כאשר hASCs מתחילים לצאת מהרקמה, הם מופיעים כאשכולות קטנים סביב חלקי הרקמה עם מורפולוגיה טיפוסית דמוית פיברובלסט. ה- hASCs נבחרים בשל יכולתם להיצמד למשטח הפלסטיק. כל 72 שעות, להסיר כמה שיותר מדיום, ולהחליף אותו עם מדיום שלם טרי על מנת להסיר פסולת התא.
- השאירו את שברי הרקמה במקום עד המעבר הראשון של תאים, אשר בדרך כלל לאחר 7 ימים.
3. תרבית hASC לאחר שלב הבידוד
- כאשר תרבית ה-hASC מגיעה למפגש של 70%-80%, ה-hASCs מוכנים לניתוק ולהרחבה נוספת כדי שישמשו לניסויים אחרים או לאחסון לטווח ארוך.
- בעזרת פינצטה סטרילית, מוציאים ומשליכים את כל חתיכות הרקמה מצלחת הפטרי. מוציאים ומשליכים את המדיום המותש, נזהרים לא לגעת ב- hASCs כדי לא לנתק אותם.
- בזהירות לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל של PBS. הוסף 1 מ"ל של 1x טריפסין ללא בעלי חיים, ולהשאיר את צלחת פטרי באינקובטור ב 37 ° C למשך 5 דקות.
- בדוק תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה פי 4 אם כל התאים התנתקו; אחרת, השאירו את צלחת הפטרי למשך 2 דקות נוספות באינקובטור, ובסופו של דבר טפחו בעדינות על משטח הפלסטיק כדי לתמוך בניתוק התא.
- עצור את פעולת הטריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום שלם, ולאסוף את כל התאים בצינור 15 מ"ל.
- על מנת להסיר את שאריות הטריפסין, צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט, השהו את התאים עם 5 מ"ל של תווך שלם, והעבירו את תרחיף התא לצלוחית T25 חדשה. שמור את hASCs בתרבית, ולהרחיב אותם עד הצורך.
4. חקירת אימונופנוטיפ על ידי ציטומטריית זרימה
- כאשר תרבית ה- hASC מגיעה למפגש של 70%-80%, נתק את ה- hASCs כפי שתואר קודם בסעיף 3.
- לאחר איסוף התאים, להשעות אותם ב 1 מ"ל של תווך שלם, ולספור aliquot עם מונה התא תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה 10x.
- צנטריפוגו את ה- hASCs ב- 300 x g למשך 5 דקות, והשהו אותם ב- 1 x 106 תאים/מ"ל של מאגר FACS. העבר 100 μL של המתלה המכיל 1 x 105 תאים לתוך צינור FACS אחד. השתמש בשפופרת FACS אחת עבור כל אנטיגן שנחקר, ועוד אחת עבור כל בקרה איזוטיפית.
- לצבוע את התאים עם 100 μL של הנוגדנים הבאים מדולל במאגר FACS: anti-CD73 (1:1,000, IgG1, FITC-labeled), anti-CD105 (1:200, IgG1, PE-labeled); אנטי-CD34 (1:66, IgG1, עם תווית FITC); אנטי-CD45 (1:66, IgG1, עם תווית FITC); ובקרות איזוטיפיות עבור כל פלואורופור, עם תווית IgG1 FITC (1:1,000) ועם תווית IgG1 PE (1:50).
- לדגור את הדגימות במשך 1 שעה בחושך עם תסיסה ב 4 ° C. צנטריפוגו את הצינורות ב 300 x גרם במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ולהשהות את התאים ב 500 μL של חיץ FACS.
- להעריך את האימונופנוטיפ של התא באמצעות מכשיר ציטומטריית זרימה, המתעד 50,000 אירועים עבור כל צינור בתוך השער שנבחר כדי להוציא פסולת תאים. חשב את אחוז התאים המבטאים כהפרש מהבקרה האיזוטיפית הספציפית.
5. בדיקת התפשטות של hASC
- כאשר תרבית ה- hASC מגיעה למפגש של 70%-80%, נתק את ה- hASC כמתואר בסעיף 3.
- לאחר איסוף התאים, להשעות אותם ב 1 מ"ל של תווך שלם, ולספור aliquot עם מונה התא תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה 10x.
- זרע 5 x 102 hASCs ב 200 μL של מדיום שלם בלוחות שקופים 96 באר. זרעו את התאים בשכפולים טכניים, עם באר אחת לכל נקודת זמן.
- לאחר 3 ימים לאחר הזריעה, התחל לזהות את התפשטות התאים באמצעות ערכת בדיקת התפשטות בהתאם להוראות היצרן. בקיצור, להחליף את המדיום תרבית עם 100 μL של מדיום טרי הוסיף 20 μL של מגיב assay לכל באר. לדגור על hASCs במשך 2.5 שעות ב 37 ° C, 5% CO2 לפיתוח מגיבים, ולאחר מכן לזהות ספיגה ב 490 ננומטר עם ספקטרופוטומטר.
- בטא את התפשטות ה- hASC כאחוז הספיגה לאחר הסרת הספיגה הריקה.
6. שימור ואחסון בהקפאה של hASCs
- נתקו את התאים כמתואר בסעיף 3, וספרו אליציטוט עם מונה התא תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה של פי 10.
- צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ולזרוק את supernatant. להשהות את התאים עם תערובת הקפאה בצפיפות של 1 x 106 hASCs/mL, ולהעביר 1 מ"ל של תמיסת התא לתוך cryovial אחד.
- שים את הקריובלים ב -80 ° C במיכל הקפאה שמוריד את הטמפרטורה ב -1 ° C / min, ולאחר מכן להעביר את cryovials לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביישום שיטת הבידוד המפורטת לעיל, hASCs התקבלו בהצלחה מדגימות רקמת שומן בטני ללא שימוש בקולגנאז. יתר על כן, hASCs הורחבו בתנאים נטולי קסנוגניות לחלוטין בנוכחות hPL וללא רכיבים אחרים ממוצא מן החי. התוצאות הבאות תומכות בפרוטוקול ומתקבלות מ- hASCs בתרבית במקביל ל- hPL ועם FBS כתנאי הבקרה.
לאחר הופעת הצביר הראשונית, ה-hASCs הראו את הצורה הקלאסית דמוית הציר והיו קטנים ומוארכים יותר בהשוואה לתאי הבקרה בנוכחות FBS (איור 3). האימונופנוטיפ של התא שהוערך על ידי ציטומטריית זרימה נראה דומה בין hASCs בתרבית עם שני התוספים. בפרט, יותר מ 80%-90% של hASCs היו חיוביים עבור CD73 17 ו CD105 17, ופחות מ 5% ביטאו CD34 17 ו CD45 17 (איור 4). לבסוף, בדיקת ההתפשטות חשפה עלייה משמעותית בצמיחת התאים כאשר hPL נוסף לתווך בהשוואה לבקרת FBS (איור 5).
איור 1: תקציר גרפי של הפרוטוקול. שיטה נטולת קסנוגנים לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תהליך חיתוך וזריעה של רקמת שומן להשגת hASCs בתרבית חוץ גופית . (A) מיקרודיסקציה של רקמת השומן לשברים בקוטר <5 מ"מ ופיזור השברים בצלוחית פטרי בקוטר 10 ס"מ. (B) חיבור לצלחת הפטרי לאחר יצירת חתכים על משטח הפלסטיק באמצעות אזמל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מורפולוגיה של hASCs. ה-hASCs שגודלו בתרבית במצב נטול קסנוגניות הראו צורה דמוית ציר ומורפולוגיה מוארכת. ה- hASCs שתורבתו בנוכחות FBS כבקרה היו גדולים יותר והיו בעלי צורת בולזאיי. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אימונופנוטיפ של hASCs. האימונופנוטיפ של hASCs היה דומה בנוכחות hPL ו- FBS. בפרט, hASCs בשני התנאים יכול להיחשב חיובי עבור CD73 ו CD105 ושלילי עבור CD34 ו CD45. קווי השגיאה מציינים את השגיאה הסטנדרטית (n = 3). קיצורים: hPL = ליזט טסיות אדם; FBS = נסיוב בקר עוברי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: התפשטות hASC. ה- hASCs התרחבו בתנאים נטולי קסנוגניות התרבו באופן משמעותי יותר מאלה בנוכחות FBS. ** p < 0.01 (מובהקות מוערכת עם מבחן t של תלמיד, n = 3). ציר ה-x מייצג את הזמן במונחים של מספר הימים לאחר הזריעה. קיצורים: hPL = ליזט טסיות אדם; FBS = נסיוב בקר עוברי; hASCs = תאי גזע שמקורם בשומן אנושי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאי גזע שמקורם בשומן משכו את העניין של מחקר תרגומי בעשור האחרון בשל השפע שלהם, שיטות בידוד מהירות ובמחיר סביר, שיעור גבוה של ריבוי מבחנה / in vivo, ותכונות גזע / התמיינות18,19,20. כתוצאה מכך, hASCs נחשבים מועמדים מצוינים לאסטרטגיות מבוססות תאים ברפואה רגנרטיבית21. לאחר בידוד מרקמת השומן, hASCs דורשים הרחבה במבחנה, ובמקרים מסוימים, צריך להיות נתון לשלב התמיינות לפני השימוש ביישום טיפולי ספציפי. התהליך כולו, כולל הבידוד, הרחבת te in vitro ובסופו של דבר בידול, חייב להתבצע בהתאם להנחיות GMP כדי להפחית סיכונים מנקודת מבט של תרגום22,23.
באשר לתהליך הבידוד, בעוד ששלבי העיכול והצנטריפוגה האנזימטיים מניבים במהירות מספר גבוה של hASCs בזמן קצר יחסית, דיווחים קודמים הראו כי שיטות אלה גורמות לשינויים פנוטיפיים אפשריים בתאים במונחים של סמני התמיינות אשכולות בהשוואה לשיטות בידוד מכניות אחרות, ובכך מעלים שאלות לגבי הבטיחות הביולוגית, תכונות התא ובעיות התנהגות בעת יישום hASCs אלה עם חולים אנושיים3 . יתר על כן, כדי למזער את הסיכונים הקשורים לרכיבים קסנוגניים, מחקרים אחרונים הציעו להשתמש באנזימים סינתטיים או בשיטות מכניות כדי לבודד hASCs. עם זאת, אפילו אנזימים סינתטיים עשויים לשנות את פרופיל התא ולהשפיע על איכות המוצר24. נהפוך הוא, השיטה מבוססת הצמחים הנחקרת כאן עשויה להוות חלופה תקפה למטרות תרגום, שכן ה- hASCs נודדים אל מחוץ לרקמה ונדבקים למשטחי הפלסטיק באופן טבעי, ללא שימוש בריאגנטים קסנוגניים כלשהם9. יחד עם זאת, יש לקחת בחשבון כי שיטה זו הראתה תפוקת תאים נמוכה יותר בהשוואה לבידוד הקלאסי של collagenase25.
לגבי מדיום התוסף, בהתבסס על ספרות עדכנית, אשר מסכימה כי hPL תומך בהרחבת hASC במידה גבוהה יותר מאשר FBS מבלי לשנות את התכונות הפיזיולוגיות של hASC 26,27,28,29, החלפנו את המדיום המסורתי שנוסף FBS ב- hPL16. בתמיכה בתרבית התאים עם hPL, התגברנו על תפוקת התאים המופחתת ועל ההתאוששות האיטית יותר הקשורה לבידוד מכני. hASCs אלה שעברו פחות מניפולציה התרבו במבחנה עם קצב המאפשר את ההתרחבות הנדרשת כדי להגיע לנפחים רלוונטיים מבחינה קלינית בצורה יעילה ובטוחה30,31. יתר על כן, התרבית עם hPL לא שינתה את התכונות דמויות הגזע ואת האימונופנוטיפ האופייני ל- hASCs, ולכן האינטרס הטיפולי של תאים אלה נשמר.
למיטב ידיעתנו, בעוד שמגוון פרוטוקולי בידוד explant תוארו עבור ASCs, השיטה שלנו היא הראשונה המשלבת בידוד מכני נטול קסנוגניות של ASCs עם תרבית בינונית בתוספת hPL כדי להשיג אוכלוסיית תאים בעלת ערך עבור יישומים תרגומיים.
מלבד זאת, לשיטה המתוארת בעבודה זו יש כמה היבטים קריטיים שיש לפרט עוד יותר. ראשית, הקטרים של שברי רקמת השומן הטחונים לא יעלו על 5 מ"מ כדי להקל על הידבקותם על פני השטח הפלסטיים ולאפשר נדידה של hASCs אל מחוץ לרקמה. שנית, יש לאזן את נוכחותם של שברי רקמת שומן בתרבית יחד עם hASCs שכבר מחוברים לצלחת, בהתחשב בסיכון הזיהום ובצורך במספר מספיק של תאים נודדים. שלישית, החוקרים צריכים להיות מודעים לקצב צמיחה מופחת אפשרי ב -24 השעות הראשונות לאחר זריעת העציץ; לאחר פרק זמן זה, תוסף hPL מעודד התאוששות תאים והתפשטות בהשוואה ל- FBS30 הקלאסי.
לעת עתה, לא הוכנסו צעדים או שינויים נוספים בהשוואה לפרוטוקול המקורי שתואר לעיל.
לסיכום, השיטה המלאה ללא קסנוגנים המתוארת כאן מספקת דרך פשוטה לבודד hASCs מרקמת השומן, כולל ליפואספירטים ורקמת שומן בטנית, בהיעדר מוצרים מן החי, אנזימים כימיים או שלבי צנטריפוגה. יתר על כן, התווך בתוספת hPL מאזן את התפוקה הנמוכה יותר של התא הראשוני שנוצר ומשפר את התפשטות התאים תוך שמירה על התכונות הטיפוליות של hASCs ללא שינוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
למחברים אין הכרות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
