Summary
I prodotti xenogenici (chimici o di derivazione animale) introdotti nelle fasi di preparazione/manipolazione della terapia cellulare sono associati ad un aumentato rischio di reattività immunitaria e trasmissione patogena nei pazienti ospiti. Qui viene descritto un metodo completamente privo di xenogenici per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano.
Abstract
Considerando il crescente impatto della terapia con cellule staminali, sono state sollevate preoccupazioni in materia di biosicurezza per quanto riguarda la potenziale contaminazione o trasmissione di infezioni dovute all'introduzione di prodotti di origine animale durante la manipolazione in vitro . I componenti xenogenici, come la collagenasi o il siero fetale bovino, comunemente usati durante le fasi di isolamento cellulare e di espansione potrebbero essere associati ai potenziali rischi di reattività immunitaria o infezione virale, batterica e prionica nei pazienti riceventi. Seguendo le linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione, la dissociazione chimica dei tessuti dovrebbe essere evitata, mentre il siero bovino fetale (FBS) può essere sostituito con integratori privi di xenogenici. Inoltre, per garantire la sicurezza dei prodotti cellulari, è importante definire metodi più affidabili e riproducibili. Abbiamo sviluppato un metodo innovativo, completamente xenogenico-free per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali derivate da adiposo umano senza alterarne le proprietà rispetto ai protocolli standard di coltura FBS di collagenasi. Qui, le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano (hASC) sono state isolate dal tessuto adiposo addominale. Il campione è stato tritato meccanicamente con forbici / bisturi, micro-sezionato e disperso meccanicamente in una capsula di Petri di 10 cm e preparato con incisioni di bisturi per facilitare l'attaccamento dei frammenti di tessuto e la migrazione delle hASC. Dopo le fasi di lavaggio, le hASC sono state selezionate grazie alla loro aderenza plastica senza digestione enzimatica. Le hASC isolate sono state coltivate con terreno integrato con lisato piastrinico umano privo di eparina al 5% e staccate con un sostituto della tripsina privo di animali. Seguendo le indicazioni delle buone pratiche di fabbricazione (GMP) sulla produzione di prodotti cellulari destinati alla terapia umana, non sono stati utilizzati antibiotici in alcun terreno di coltura.
Introduction
Negli ultimi decenni, la crescente domanda di trattamenti terapeutici innovativi ha dato luogo a notevoli sforzi e investimenti di risorse nel campo della medicina traslazionale1. I prodotti a base cellulare sono associati a rischi determinati dalla fonte cellulare, dal processo di produzione (isolamento, espansione o modificazione genetica) e dagli integratori non cellulari (enzimi, fattori di crescita, integratori di coltura e antibiotici) e questi fattori di rischio dipendono dalla specifica indicazione terapeutica. La qualità, la sicurezza e l'efficacia del prodotto finale potrebbero essere profondamente influenzate dagli elementi sopra indicati2. La terapia con cellule staminali richiede il rispetto dei principi di biosicurezza; I potenziali rischi di trasmissione patogena con prodotti di origine animale in coltura cellulare potrebbero essere problematici e la sperimentazione approfondita di qualsiasi prodotto introdotto nella fabbricazione è essenziale3.
Il metodo tradizionale per isolare le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano (hASC) prevede una digestione enzimatica eseguita con collagenasi seguita da fasi di lavaggio attraverso la centrifugazione4. Mentre l'isolamento enzimatico è generalmente considerato più efficiente di altre tecniche meccaniche in termini di rese cellulari e vitalità, i componenti di origine animale utilizzati, come la collagenasi, sono considerati più che minimamente manipolati dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. Ciò significa che vi è un rischio significativamente aumentato di reazioni immunitarie o di trasmissione di malattie, limitando così la traduzione della terapia con hASC in contesti clinici 5,6.
La digestione a base di tripsina è un altro protocollo enzimatico per isolare le ASC. Sono state descritte diverse tecniche con lievi modifiche in termini di concentrazione di tripsina, velocità di centrifugazione e tempo di incubazione. Sfortunatamente, questo metodo non è ben descritto e manca il confronto in letteratura, in particolare con i protocolli di isolamento meccanico7. Tuttavia, in termini di traducibilità dell'approccio, la tripsina presenta gli stessi inconvenienti della collagenasi.
Metodi di isolamento alternativi per ottenere ASC, basati su forze meccaniche e senza aggiunta enzimatica, comportano la centrifugazione ad alta velocità (800 x g o 1.280 x g, 15 min) dei frammenti di tessuto adiposo. Quindi, il pellet viene incubato con un tampone di lisi dei globuli rossi (5 min), seguito da un'altra fase di centrifugazione a 600 x g prima della risospensione in terreno di coltura. Nonostante un numero maggiore di cellule isolate nei primi giorni rispetto ai metodi di espianto, uno studio precedente ha mostrato una proliferazione inferiore o assente oltre la seconda settimana di coltura8.
Oltre a ciò, un'ulteriore manipolazione con mezzo aggiunto xenogenico, come il siero bovino fetale (FBS), che viene utilizzato come integratore del fattore di crescita per la coltura cellulare, è associata ad un aumentato rischio di reattività immunitaria ed esposizione a infezioni virali, batteriche o prioniche del paziente ospite 9,10. Reazioni immunitarie e sviluppo di rash orticariforme sono già stati descritti in soggetti trattati con diverse dosi di cellule staminali mesenchimali prodotte con FBS11. Inoltre, FBS è soggetta a variabilità da lotto a lotto, che può avere un impatto sulla qualità del prodotto finale12.
In conformità con le linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione (GMP), la dissociazione enzimatica dei tessuti deve essere evitata e l'FBS deve essere sostituito con integratori privi di xenogenici. Questi passaggi, insieme a protocolli più affidabili e riproducibili, sono essenziali per supportare l'applicazione della terapia cellulare 3,13.
In questo contesto, il lisato piastrinico umano (hPL) è stato suggerito come sostituto di FBS poiché è un integratore privo di cellule, contenente proteine, arricchito con fattore di crescita, ed è stato precedentemente introdotto tra i prodotti cellulari di grado clinico come additivo del mezzo di crescita per la coltura cellulare in vitro el'espansione 14,15. Poiché l'hPL è un prodotto di derivazione umana, viene spesso utilizzato come sostituto dell'FBS durante la coltura in vitro di hASC destinate ad applicazioni cliniche, riducendo così i problemi relativi alle reazioni immunologiche e alle infezioni correlate alla traducibilità della FBS15,16.
Nonostante i maggiori costi di produzione, è già stato dimostrato che rispetto all'FBS, l'hPL supporta la vitalità cellulare per molti tipi cellulari, aumenta la proliferazione, ritarda la senescenza, assicura la stabilità genomica e conserva l'immunofenotipo cellulare anche nei passaggi cellulari tardivi; Tutti questi elementi supportano il passaggio a questo supplemento culturale11.
Lo scopo di questo lavoro era quello di sviluppare un protocollo standardizzato per isolare e coltivare hASC con un metodo completo privo di animali, senza modificare la fisiologia cellulare e le proprietà di staminalità rispetto alle classiche hASC coltivate con FBS (Figura 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le hASC sono state isolate dal tessuto adiposo addominale di una donna sana sottoposta a ricostruzione mammaria utilizzando lembi autologhi addominali (lembi perforatori epigastrici inferiori profondi, [DIEP]) presso l'Ospedale universitario di Losanna, CHUV, Losanna, Svizzera. La parte scartata del lembo e del tessuto adiposo è stata ottenuta dopo che il paziente ha firmato il consenso informato. Tutti i protocolli sono stati esaminati e approvati dal Dipartimento della Biobanca dell'ospedale DAL (numero 314 GGC) e dai comitati etici in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.
NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti sotto una cappa a flusso laminare e con condizioni asettiche. Guanti e camici da laboratorio per la protezione personale devono essere sempre indossati e tutte le superfici devono essere lavate con biocidi appropriati. Il tessuto in eccesso deve essere smaltito correttamente come rifiuto biomedico.
1. Materiali necessari e preparazione delle soluzioni colturali
- Per l'isolamento, l'espansione e la crioconservazione delle cellule, ottenere i seguenti strumenti: forbici sterili; bisturi sterili; pinzette sterili; una capsula di Petri da 10 cm; Tubi da 15 ml; palloni T25; una camera Burker; criovali; un contenitore di congelamento cellulare; un microscopio ottico con obiettivi di ingrandimento 4x e 10x; e una centrifuga a secchio oscillante.
- Per l'immunofenotipizzazione, ottenere i seguenti strumenti e reagenti: tubi FACS, soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS); Il mezzo essenziale minimo (DMEM) di Dulbecco; hPL; solfuro di dimetile; e tripsina senza animali.
- Preparare il terreno di coltura completo integrando DMEM con hPL privo di eparina al 5%. Conservare il fluido a 4 °C per un massimo di 3 settimane e utilizzare sempre in caldo (tra temperatura ambiente e 37 °C). Seguendo le linee guida GMP per la produzione di farmaci cellulari destinati alla terapia umana, non aggiungere antibiotici al terreno di coltura.
- Preparare il mezzo di congelamento contenente il 20% di hPL e il 10% di dimetil solfuro in DMEM.
2. Isolamento delle hASC dal campione di tessuto adiposo
- Elaborare il campione di tessuto adiposo entro 6 ore dal suo ottenimento. Prima di procedere al metodo di isolamento meccanico privo di xenogenici stabilito, lavare il tessuto 2x con PBS per 10 minuti fino al rilascio di tessuto connettivo e sangue.
- Conservare il campione di tessuto adiposo ottenuto dalla chirurgia addominoplastica in PBS a 4°C fino alla lavorazione e, comunque, non più di 24 h, al fine di non danneggiare la vitalità dell'hASC.
- Tagliare il tessuto adiposo in pezzi più piccoli di circa 1 cm2 con forbici sterili.
- Con un bisturi, micro-sezionare ogni pezzo in piccoli frammenti con diametri <5 mm, e disperderne cinque in una capsula di Petri di 10 cm (Figura 2A).
- Per attaccare ogni frammento, utilizzare il bisturi per creare incisioni sulla superficie di plastica, trascinando ogni frammento fino a quando non è saldamente attaccato alla capsula di Petri. Utilizzare una pinzetta per gestire il frammento (Figura 2B).
- Aggiungere delicatamente 10 ml di terreno di coltura completo per coprire tutti i frammenti senza staccarli.
- Incubare le piastre di Petri a 37 °C e 5% di CO2. Le hASC migreranno fuori dal tessuto e saranno selezionate a causa della loro aderenza plastica senza digestione enzimatica.
- Fino alla confluenza cellulare, monitorare l'espansione hASC al microscopio ottico con un ingrandimento 4x una volta al giorno. Quando le hASC iniziano a uscire dal tessuto, appaiono come piccoli gruppi attorno ai pezzi di tessuto con una tipica morfologia simile ai fibroblasti. Gli hASC sono selezionati in base alla loro capacità di aderire alla superficie plastica. Ogni 72 ore, rimuovere quanto più mezzo possibile e sostituirlo con un mezzo completo fresco per rimuovere i detriti cellulari.
- Lasciare i frammenti di tessuto sul posto fino al primo passaggio delle cellule, che di solito è dopo 7 giorni.
3. Coltura hASC dopo la fase di isolamento
- Quando la coltura hASC raggiunge il 70%-80% di confluenza, le hASC sono pronte per essere staccate e ulteriormente espanse per essere utilizzate per altri esperimenti o per la conservazione a lungo termine.
- Con una pinzetta sterile, rimuovere e scartare tutti i pezzi di tessuto dalla capsula di Petri. Rimuovere e scartare il mezzo esausto, facendo attenzione a non toccare le hASC per non staccarle.
- Lavare accuratamente le cellule una volta con 10 ml di PBS. Aggiungere 1 mL di 1x tripsina senza animali e lasciare la capsula di Petri nell'incubatrice a 37 °C per 5 minuti.
- Controllare al microscopio ottico con ingrandimento 4x se tutte le cellule si sono staccate; altrimenti, lasciare la capsula di Petri per altri 2 minuti nell'incubatrice e infine picchiettare delicatamente la superficie di plastica per supportare il distacco della cella.
- Interrompere l'azione della tripsina aggiungendo 2 ml di terreno completo e raccogliere tutte le cellule in una provetta da 15 ml.
- Per rimuovere la tripsina residua, centrifugare il tubo a 300 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante, sospendere le cellule con 5 ml di terreno completo e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo matraccio T25. Mantieni le hASC in cultura ed espandile fino a quando necessario.
4. Studio immunofenotipico mediante citometria a flusso
- Quando la coltura hASC raggiunge il 70%-80% di confluenza, staccare gli hASC come descritto in precedenza nella sezione 3.
- Dopo aver raccolto le cellule, sospenderle in 1 mL di mezzo completo e contare un'aliquota con il contatore di cellule al microscopio ottico con un ingrandimento 10x.
- Centrifugare gli hASC a 300 x g per 5 minuti e sospenderli a 1 x 106 celle/ml di tampone FACS. Trasferire 100 μL della sospensione contenente 1 x 105 celle in un tubo FACS. Utilizzare un tubo FACS per ogni antigene studiato, più un altro per ogni controllo isotipico.
- Colorare le cellule con 100 μL dei seguenti anticorpi diluiti in tampone FACS: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, marcato con FITC), anti-CD105 (1:200, IgG1, marcato PE); anti-CD34 (1:66, IgG1, marcato con FITC); anti-CD45 (1:66, IgG1, marcato con FITC); e controlli isotipici per ciascun fluoroforo, marcato con IgG1 con FITC (1:1.000) e con PE IgG1 (1:50).
- Incubare i campioni per 1 ora al buio agitando a 4 °C. Centrifugare le provette a 300 x g per 5 minuti, eliminare il surnatante e sospendere le cellule in 500 μL di tampone FACS.
- Valutare l'immunofenotipo cellulare con uno strumento di citometria a flusso, registrando 50.000 eventi per ogni tubo all'interno del cancello selezionato per escludere i detriti cellulari. Calcola la percentuale di cellule che esprimono come differenza dal controllo isotipico specifico.
5. Saggio di proliferazione di hASC
- Quando la coltura hASC raggiunge il 70%-80% di confluenza, staccare le hASC come descritto nella sezione 3.
- Dopo aver raccolto le cellule, sospenderle in 1 mL di mezzo completo e contare un'aliquota con il contatore di cellule al microscopio ottico con un ingrandimento 10x.
- Semina 5 x 102 hASC in 200 μL di terreno completo in lastre trasparenti a 96 pozzetti. Semina le celle in repliche tecniche, con un pozzetto per ogni punto temporale.
- A 3 giorni dalla semina, iniziare a rilevare la proliferazione cellulare utilizzando un kit di test di proliferazione seguendo le istruzioni del produttore. In breve, sostituire il terreno di coltura con 100 μL di terreno fresco aggiunto a 20 μL di reagente di analisi per pozzetto. Incubare le hASC per 2,5 ore a 37 °C, 5% CO2 per lo sviluppo del reagente, quindi rilevare l'assorbanza a 490 nm con uno spettrofotometro.
- Esprimere la proliferazione hASC come assorbanza percentuale dopo aver rimosso l'assorbanza in bianco.
6. Crioconservazione e conservazione delle hASC
- Staccare le cellule come descritto nella sezione 3 e contare un'aliquota con il contatore di cellule al microscopio ottico con un ingrandimento 10x.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Sospendere le cellule con miscela di congelamento ad una densità di 1 x 106 hASCs/mL e trasferire 1 mL della soluzione cellulare in un crioviale.
- Mettere i crioviali a -80 °C in un contenitore di congelamento che riduce la temperatura di 1 °C/min, quindi spostare i crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Applicando il metodo di isolamento descritto sopra, le hASC sono state ottenute con successo da campioni di tessuto adiposo addominale senza l'uso di collagenasi. Inoltre, le hASC sono state espanse in condizioni completamente prive di xenogenici in presenza di hPL e senza altri componenti di origine animale. I seguenti risultati supportano il protocollo e sono ottenuti da hASC coltivate in parallelo con hPL e con FBS come condizione di controllo.
Dopo l'apparizione iniziale del cluster, le hASC hanno mostrato la classica forma a fuso ed erano più piccole e più allungate rispetto alle celle di controllo in presenza di FBS (Figura 3). L'immunofenotipo cellulare valutato mediante citometria a flusso sembrava essere simile tra le hASC coltivate con i due integratori. In particolare, oltre l'80%-90% delle hASC era positivo per CD73 17 e CD105 17, e meno del 5% esprimeva CD34 17 e CD45 17 (Figura 4). Infine, il test di proliferazione ha rivelato un aumento significativo della crescita cellulare quando l'hPL è stato aggiunto al mezzo rispetto al controllo FBS (Figura 5).
Figura 1: Abstract grafico del protocollo. Metodo xenogenico-free per l'isolamento e l'espansione in vitro di cellule staminali adipose umane. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Processo di taglio e semina del tessuto adiposo per ottenere hASC in coltura in vitro . (A) Microdissezione del tessuto adiposo in frammenti con diametro <5 mm e dispersione dei frammenti in una capsula di Petri di 10 cm. (B) Attaccamento alla capsula di Petri dopo aver creato incisioni sulla superficie plastica con un bisturi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Morfologia delle hASC. Le hASC coltivate nella condizione xenogenica-free mostravano una forma a fuso e una morfologia allungata. Gli hASC coltivati in presenza di FBS come controllo erano più grandi e avevano una forma a occhio di bue. La barra della scala rappresenta 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Immunofenotipo delle hASC. L'immunofenotipo delle hASC era simile in presenza di hPL e FBS. In particolare, le hASC in entrambe le condizioni potrebbero essere considerate positive per CD73 e CD105 e negative per CD34 e CD45. Le barre di errore indicano l'errore standard (n = 3). Abbreviazioni: hPL = lisato piastrinico umano; FBS = siero fetale bovino. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: proliferazione di hASC. Le hASC espanse in condizioni di assenza di xenogenici proliferarono significativamente più di quelle in presenza di FBS. ** p < 0,01 (significatività valutata con un test t di Student, n = 3). L'asse x rappresenta il tempo in termini di numero di giorni dopo la semina. Abbreviazioni: hPL = lisato piastrinico umano; FBS = siero fetale bovino; hASCs = cellule staminali derivate dal tessuto adiposo umano. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le cellule staminali derivate dall'adiposio hanno attirato l'interesse della ricerca traslazionale nell'ultimo decennio grazie alla loro abbondanza, ai metodi di isolamento rapidi e convenienti, all'alto tasso di proliferazione in vitro / in vivo e alle proprietà di staminalità / differenziazione18,19,20. Di conseguenza, le hASC sono considerate un ottimo candidato per le strategie basate sulle cellule nella medicina rigenerativa21. Dopo l'isolamento dal tessuto adiposo, le hASC richiedono un'espansione in vitro e, in alcuni casi, dovrebbero essere sottoposte a una fase di differenziazione prima di essere utilizzate per una specifica applicazione terapeutica. L'intero processo, compreso l'isolamento, l'espansione in vitro e l'eventuale differenziazione, deve essere condotto in conformità con le linee guida GMP per ridurre eventuali rischi dal punto di vista della traduzione22,23.
Per quanto riguarda il processo di isolamento, mentre le fasi di digestione enzimatica e centrifugazione producono rapidamente un numero elevato di hASC in un tempo relativamente breve, precedenti studi hanno dimostrato che questi metodi causano possibili cambiamenti fenotipici cellulari in termini di marcatori di differenziazione dei cluster rispetto ad altri metodi di isolamento meccanico, sollevando così domande sulla biosicurezza, le proprietà cellulari e i problemi comportamentali quando si applicano queste hASC con pazienti umani3 . Inoltre, per ridurre al minimo i rischi legati ai componenti xenogenici, studi recenti hanno suggerito l'utilizzo di enzimi sintetici o metodi meccanici per isolare le hASC. Tuttavia, anche gli enzimi sintetici possono eventualmente modificare il profilo cellulare e influenzare la qualità del prodotto24. Al contrario, il metodo basato sugli espianti qui studiato può essere una valida alternativa a fini traslazionali, poiché le hASC migrano fuori dal tessuto e aderiscono naturalmente alle superfici plastiche, senza l'uso di reagenti xenogenici9. Allo stesso tempo, va considerato che questo metodo ha evidenziato una resa cellulare inferiore rispetto al classico isolamento della collagenasi25.
Per quanto riguarda il mezzo integratore, basato sulla letteratura recente, che concorda sul fatto che hPL supporta l'espansione di hASC in misura maggiore rispetto a FBS senza alterare le proprietà fisiologiche hASC 26,27,28,29, abbiamo sostituito il tradizionale mezzo aggiunto FBS con hPL 16. Supportando la coltura cellulare con hPL, abbiamo superato la diminuzione delle rese cellulari e il recupero più lento legato all'isolamento meccanico. Queste hASC meno manipolate proliferano in vitro con una velocità che consente l'espansione necessaria per raggiungere volumi clinicamente rilevanti in modo efficiente e sicuro30,31. Inoltre, la coltura con hPL non ha alterato le caratteristiche staminali e l'immunofenotipo tipico delle hASC, mantenendo così l'interesse terapeutico di queste cellule.
Per quanto a nostra conoscenza, mentre una varietà di protocolli di isolamento degli espianti sono stati descritti per le ASC, il nostro metodo è il primo che combina l'isolamento meccanico privo di xenogenici delle ASC con una coltura di terreno integrata con hPL per ottenere una preziosa popolazione cellulare per applicazioni traslazionali.
Oltre a ciò, il metodo descritto in questo lavoro ha alcuni aspetti critici che devono essere ulteriormente dettagliati. In primo luogo, i diametri dei frammenti di tessuto adiposo tritato non devono superare i 5 mm per facilitare la loro adesione alla superficie plastica e consentire la migrazione delle hASC fuori dal tessuto. In secondo luogo, la presenza di frammenti di tessuto adiposo in coltura insieme alle hASC già attaccate alla piastra dovrebbe essere bilanciata, considerando il rischio di contaminazione e la necessità di un numero sufficiente di cellule migrate. In terzo luogo, i ricercatori devono essere consapevoli di un possibile tasso di crescita ridotto nelle prime 24 ore dopo la semina dell'espianto; dopo questo periodo di tempo, l'integrazione di hPL stimola il recupero e la proliferazione cellulare rispetto al classico FBS30.
Per il momento non sono stati introdotti ulteriori passaggi o modifiche rispetto al protocollo originale sopra descritto.
In conclusione, il metodo xenogenicic free completo qui descritto fornisce un modo semplice per isolare le hASC dal tessuto adiposo, compresi sia i lipoaspirati che il tessuto adiposo addominale, in assenza di prodotti di derivazione animale, enzimi chimici o fasi di centrifugazione. Inoltre, il mezzo integrato con hPL controbilancia la resa iniziale delle cellule e migliora la proliferazione cellulare mantenendo inalterate le proprietà terapeutiche delle hASC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori non hanno riconoscimenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
