Summary
在细胞疗法制备/操作步骤中引入的异源性（化学或动物源性）产品与宿主患者免疫反应性和致病性传播的风险增加有关。这里描述了一种完整的无异种方法，用于分离和 体外 扩增人脂肪来源的干细胞。
Abstract
考虑到干细胞疗法的影响越来越大，由于在 体外 操作期间引入动物源性产品，人们对潜在的污染或感染传播提出了生物安全问题。在细胞分离和扩增步骤中常用的异种成分，如胶原酶或胎牛血清，可能与接受患者的免疫反应性或病毒、细菌和朊病毒感染的潜在风险有关。遵循良好生产规范指南，应避免化学组织解离，而胎牛血清（FBS）可以用无异种补充剂代替。此外，为了确保细胞产品的安全性，定义更可靠和可重复的方法非常重要。与胶原酶FBS培养的标准方案相比，我们开发了一种创新的，完全无异种的方法，用于分离和体 外 扩增人脂肪来源的干细胞，而不会改变其特性。在这里，从腹部脂肪组织中分离出人脂肪来源的干细胞（hASCs）。用剪刀/手术刀机械切碎样品，显微解剖并机械分散在10cm培养皿中，并用手术刀切口制备，以促进组织碎片的附着和hASC的迁移。在洗涤步骤之后，选择hASCs，因为它们具有塑料粘附性，无需酶消化。分离的hASC用补充有5%无肝素的人血小板裂解物的培养基培养，并与无动物胰蛋白酶替代品分离。按照良好生产规范（GMP）关于生产用于人类治疗的细胞产品的指示，在任何培养基中均未使用抗生素。
Introduction
在过去的几十年中，对创新治疗的需求不断增加，这引起了转化医学领域的重大努力和资源投资1。基于细胞的产品与细胞来源、制造过程（分离、扩增或基因修饰）和非细胞补充剂（酶、生长因子、培养补充剂和抗生素）确定的风险相关，这些风险因素取决于具体的治疗适应症。最终产品的质量、安全性和有效性可能受到上述要素的深刻影响2.干细胞疗法需要遵守生物安全原则;细胞培养中动物源性产品致病传播的潜在风险可能存在问题，对制造过程中引入的任何产品进行彻底测试至关重要3.
分离人脂肪来源干细胞（hASCs）的传统方法包括用胶原酶进行酶消化，然后通过离心4进行洗涤步骤。虽然酶分离通常被认为在细胞产量和活力方面比其他机械技术更有效，但所使用的动物源性成分，如胶原酶，被美国食品和药物管理局认为不仅仅是最低限度的操纵。这意味着免疫反应或疾病传播的风险显着增加，从而限制了hASC治疗在临床环境中的转化5，6。
基于胰蛋白酶的消化是另一种分离ASC的酶方案。已经描述了不同的技术，在胰蛋白酶浓度、离心速度和孵育时间方面略有修改。不幸的是，这种方法没有得到很好的描述，并且文献中缺乏比较，特别是与机械隔离方案7的比较。然而，就该方法的可翻译性而言，胰蛋白酶具有与胶原酶相同的缺点。
基于机械力且不添加酶的替代分离方法涉及脂肪组织碎片的高速离心（800 x g 或 1，280 x g，15 分钟）。然后，将沉淀与红细胞裂解缓冲液孵育（5分钟），然后在培养基中重悬之前以600×g进行另一个离心步骤。尽管与外植体方法相比，在第一天分离的细胞数量更多，但之前的一项研究表明，在培养8的第二周之后，增殖较低或不存在。
除此之外，使用异源添加培养基（例如用作细胞培养的生长因子补充剂的胎牛血清（FBS））的进一步操作与宿主患者的免疫反应性和暴露于病毒，细菌或朊病毒感染的风险增加有关9，10。免疫反应和荨麻疹样皮疹的发展已经在接受用FBS11产生的几剂量间充质干细胞的个体中描述过。此外，FBS会受到批次间差异的影响，这可能会影响最终产品质量12。
根据良好生产规范 （GMP） 指南，应避免酶促组织解离，并应用无异基因补充剂替代 FBS。这些步骤以及更可靠和可重复的方案对于支持细胞疗法的应用至关重要3，13。
在这种情况下，人血小板裂解物（hPL）已被建议作为FBS的替代品，因为它是一种无细胞，含蛋白质，富含生长因子的补充剂，并且较早在临床级基于细胞的产品中引入，作为 体外 细胞培养和扩增的生长培养基的添加剂14，15。由于hPL是一种人源性产品，因此在用于临床应用的hASC的 体外 培养过程中，它经常被用作FBS的替代品，从而减少了与FBS可翻译性相关的免疫反应和感染问题15，16。
尽管生产成本较高，但已经证明，与FBS相比，hPL支持许多细胞类型的细胞活力，增加增殖，延缓衰老，确保基因组稳定性，即使在晚期细胞传代中也能保存细胞免疫表型;所有这些要素都支持向这种文化补充11的转变。
这项工作的目的是开发一种标准化方案，以使用完整的无动物方法分离和培养hASC，与经典FBS培养的hASC相比，无需改变细胞生理学和干性特性（图1）。
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Protocol
hASCs是从一名健康女性的腹部脂肪组织中分离出来的，该女性在瑞士洛桑CHUV洛桑大学医院使用腹部自体皮瓣（深下上腹部穿支肌皮瓣，[DIEP]）进行了乳房重建。皮瓣的废弃部分和脂肪组织是在患者签署知情同意书后获得的。根据《赫尔辛基宣言》，所有协议均由医院的生物银行部门DAL（编号314 GGC）和伦理委员会审查和批准。
注意：所有步骤必须在层流罩下和无菌条件下进行。应始终佩戴用于个人防护的手套和实验室外套，并应使用适当的杀菌剂清洗所有表面。多余的组织应作为生物医学废物妥善处理。
1. 所需材料和培养液的制备
- 对于细胞分离、扩增和冷冻保存，请获得以下仪器：无菌剪刀;无菌手术刀;无菌镊子;一个10厘米的培养皿;15 mL 管;T25烧瓶;伯克室;冷冻管;细胞冷冻容器;具有4倍和10倍放大镜的光学显微镜;和一台摆动式斗式离心机。
- 对于免疫表型，请获得以下仪器和试剂：FACS 管、无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS）;杜尔贝克的最小必需培养基（DMEM）;hPL;二甲基硫醚;和无动物胰蛋白酶。
- 通过补充 DMEM 中加入 5% 无肝素的 hPL 来制备完整的培养基。将培养基在4°C下储存长达3周，并始终使用温热（室温和37°C之间）。遵循用于人类治疗的细胞药物生产的GMP指南，不要向培养基中添加任何抗生素。
- 在DMEM中制备含有20%hPL和10%二甲基硫醚的冷冻培养基。
2. 从脂肪组织样本中分离hASC
- 在获得脂肪组织样品后6小时内处理脂肪组织样品。在进行已建立的机械无异种分离方法之前，用PBS洗涤组织2倍10分钟，直到结缔组织和血液释放。
- 将从腹部整形手术中获得的脂肪组织样本储存在4°C的PBS中，直到处理，无论如何，不超过24小时，以免损害hASC活力。
- 用无菌剪刀将脂肪组织切成约1厘米2 的小块。
- 用手术刀将每块切片成直径<5毫米的小碎片，并将其中的五个分散在10厘米的培养皿中（图2A）。
- 为了附着每个碎片，使用手术刀在塑料表面上创建切口，拖动每个碎片直到它牢固地粘在培养皿上。使用镊子帮助处理碎片（图2B）。
- 轻轻加入 10 mL 完全培养基，以覆盖所有片段而不分离它们。
- 将培养皿在37°C和5%CO2下孵育。hASCs将迁移到组织中，并由于其可塑性粘附而无需酶消化而被选中。
- 直到细胞汇合，每天一次在光学显微镜下以4倍放大倍率监测hASC扩增。当hASCs开始从组织中退出时，它们在组织碎片周围显示为具有典型成纤维细胞样形态的小簇。选择hASC是因为它们能够粘附在塑料表面上。每72小时，尽可能多地去除培养基，并用新鲜的完全培养基代替，以去除细胞碎片。
- 将组织碎片留在原位，直到细胞第一次通过，通常是7天后。
3. 分离期后的hASC培养
- 当hASC培养物达到70%-80%汇合时，hASC准备分离并进一步扩增以用于其他实验或长期储存。
- 用无菌镊子，从培养皿中取出并丢弃所有组织碎片。取出并丢弃耗尽的培养基，小心不要触摸hASC，以免将它们分离。
- 用 10 mL PBS 仔细清洗细胞一次。加入1mL的1x无动物胰蛋白酶，并将培养皿在37°C的培养箱中放置5分钟。
- 在光学显微镜下以4倍放大倍率检查所有细胞是否都脱落;否则，将培养皿在培养箱中再放置2分钟，最终轻轻敲击塑料表面以支持细胞分离。
- 通过加入 2 mL 完全培养基停止胰蛋白酶作用，并将所有细胞收集在 15 mL 管中。
- 为了去除任何残留的胰蛋白酶，将管以300× g 离心5分钟。弃去上清液，用5mL完全培养基悬浮细胞，并将细胞悬液转移到新的T25烧瓶中。将hASC保留在培养物中，并在需要时扩增它们。
4. 流式细胞术免疫表型研究
- 当hASC培养物达到70%-80%汇合度时，如前第3节所述分离hASC。
- 收集细胞后，将它们悬浮在 1 mL 完全培养基中，并在光学显微镜下用细胞计数器以 10 倍放大倍率计数等分试样。
- 将hASC以300 x g 离心5分钟，并将其悬浮在1 x 106 细胞/ mL的FACS缓冲液中。将 100 μL 含有 1 x 105 个细胞的悬浮液转移到一个 FACS 管中。对每个研究的抗原使用一个FACS管，对每个同型对照再使用一个。
- 用 100 μL 在 FACS 缓冲液中稀释的以下抗体对细胞进行染色：抗 CD73（1：1，000，IgG1，FITC标记）、抗 CD105（1：200，IgG1，PE 标记）;抗CD34（1：66，IgG1，FITC标记）;抗CD45（1：66，IgG1，FITC标记）;以及每种荧光基团的同型对照，IgG1 FITC标记（1：1，000）和IgG1 PE标记（1：50）。
- 将样品在黑暗中孵育1小时，并在4°C下搅拌。 将试管以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞悬浮在 500 μL FACS 缓冲液中。
- 使用流式细胞术仪器评估细胞免疫表型，为选择排除细胞碎片的门内每个管记录 50，000 个事件。计算表达细胞的百分比作为与特定同型对照的差异。
5. hASC的增殖测定
- 当 hASC 培养物达到 70%-80% 汇合度时，如第 3 节所述分离 hASC。
- 收集细胞后，将它们悬浮在 1 mL 完全培养基中，并在光学显微镜下用细胞计数器以 10 倍放大倍率计数等分试样。
- 在 96 孔透明板中的 200 μL 完全培养基中接种 5 x 102 hASC。在技术重复中播种细胞，每个时间点一个孔。
- 接种后3天，按照制造商的说明开始使用增殖测定试剂盒检测细胞增殖。简而言之，每孔用 100 μL 新鲜培养基加入 20 μL 测定试剂替换培养基。将hASC在37°C，5%CO 2下孵育2.5 小时以进行试剂开发，然后用分光光度计检测490nm处的吸光度。
- 将hASC增殖表示为去除空白吸光度后吸光度的百分比。
6. hASC的冷冻保存和储存
- 如第3节所述分离细胞，并在光学显微镜下以10倍放大倍率用细胞计数器计数等分试样。
- 将细胞以300× g 离心5分钟，弃去上清液。用冷冻混合物以 1 x 106 hASCs/mL 的密度悬浮细胞，并将 1 mL 细胞溶液转移到一个冷冻管中。
- 将冷冻管置于-80°C的冷冻容器中，使温度降低1°C / min，然后将冷冻管移至液氮中长期储存。
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Representative Results
应用上述分离方法，在不使用胶原酶的情况下，成功地从腹部脂肪组织样品中获得hASC。此外，hASCs在完全无异种条件下在hPL存在下扩增，并且没有任何其他动物来源的成分。以下结果支持该协议，并且是从与hPL并行培养的hASC和以FBS作为对照条件中获得的。
在最初的簇出现后，hASC显示出经典的纺锤状形状，并且与存在FBS的对照细胞相比更小，更细长（图3）。通过流式细胞术评估的细胞免疫表型似乎在用两种补充剂培养的hASCs之间相似。特别是，超过80%-90%的hASC对CD73 17和CD105 17呈阳性，不到5%的hASC表达CD34 17和CD45 17（图4）。最后，增殖测定显示，与FBS对照相比，将hPL添加到培养基中时细胞生长显着增加（图5）。
图 1：协议的图形摘要。 用于分离和 体外 扩增人脂肪来源干细胞的无异种方法。 请点击此处查看此图的大图。
图2：脂肪组织切割和接种过程，以获得 体外 培养中的hASC。 （A）将脂肪组织显微切割成直径为<5毫米的碎片，并将碎片分散在10厘米的培养皿中。（B）用手术刀在塑料表面上切开切口后附着在培养皿上。 请点击此处查看此图的大图。
图3：hASC的形态。 在无异种条件下培养的hASCs表现出纺锤状形状和细长的形态。在FBS作为对照存在下培养的hASC更大，并且具有靶心形状。比例尺代表 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：hASC 的免疫表型。 hASC的免疫表型在hPL和FBS存在下相似。特别是，两种情况下的hASC可被认为是CD73和CD105的阳性和CD34和CD45的阴性。误差线表示标准误差 （n = 3）。缩写：hPL = 人血小板裂解物;FBS = 胎牛血清。 请点击此处查看此图的大图。
图5：hASC增殖。 在无异种条件下扩增的hASC明显多于存在FBS的hASC。** p < 0.01（使用学生 t 检验评估的显著性，n = 3）。x 轴表示播种后的天数。缩写：hPL = 人血小板裂解物;FBS = 胎牛血清;hASC = 人脂肪来源的干细胞。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
脂肪来源的干细胞因其丰富、快速且经济实惠的分离方法、高体外/体内增殖率和干性/分化特性而在过去十年中引起了转化研究的兴趣18，19，20。因此，hASCs被认为是再生医学中基于细胞的策略的绝佳候选者21。从脂肪组织中分离后，hASC需要在体外扩增，并且在某些情况下，在用于特定治疗应用之前应进行分化步骤。整个过程，包括分离、体外扩增和最终分化，必须按照GMP指南进行，以降低翻译角度的任何风险22，23。
关于分离过程，虽然酶消化和离心步骤在相对较短的时间内快速产生大量hASC，但以前的报告表明，与其他机械分离方法相比，这些方法在簇分化标记方面引起可能的细胞表型变化，从而引发了有关将这些hASC应用于人类患者时的生物安全性，细胞特性和行为问题的问题3.此外，为了尽量减少与异种成分相关的风险，最近的研究表明使用合成酶或机械方法来分离hASC。然而，即使是合成酶也可能改变细胞谱并影响产品质量24。相反，这里研究的基于外植体的方法可能是用于翻译目的的有效替代方案，因为hASC从组织中迁移出来并自然地粘附在塑料表面上，而无需使用任何异种试剂9。同时，必须考虑到，与传统胶原酶分离相比，该方法证明了较低的细胞产量25。
关于补充培养基，基于最近的文献，该文献同意hPL在不改变hASC生理特性的情况下支持hASC扩增的程度高于FBS26，27，28，29，我们用hPL 16代替了传统的FBS添加培养基。通过hPL支持细胞培养，我们克服了细胞产量下降和与机械分离相关的恢复缓慢的问题。这些较少操作的hASCs在体外增殖，其速率允许以有效和安全的方式达到临床相关体积所需的扩增30，31。此外，用hPL培养不会改变hASCs典型的茎样特征和免疫表型，因此意味着这些细胞的治疗兴趣得以维持。
据我们所知，虽然已经描述了各种用于ASC的外植体分离方案，但我们的方法首次将ASC的无异种机械分离与补充hPL的培养基培养物相结合，以获得用于翻译应用的有价值的细胞群。
除此之外，这项工作中描述的方法还有一些关键方面需要进一步详细说明。首先，切碎的脂肪组织碎片的直径不应超过5毫米，以促进它们粘附在塑料表面上，并允许hASCs从组织中迁移出来。其次，考虑到污染风险和对足够数量的迁移细胞的需求，应平衡培养物中脂肪组织碎片的存在以及已经附着在平板上的hASC。第三，研究人员需要意识到外植体播种后前24小时内生长速率可能降低;在这段时间之后，与经典的FBS30相比，hPL补充剂刺激细胞恢复和增殖。
目前，与上述原始协议相比，尚未引入进一步的步骤或修改。
总之，这里描述的完全无异种方法提供了一种在没有动物源性产物、化学酶或离心步骤的情况下从脂肪组织（包括脂抽吸物和腹部脂肪组织）中分离hASC的简单方法。此外，补充hPL的培养基抵消了由此产生的初始细胞产量降低，并增强了细胞增殖，同时保持hASC的治疗特性不变。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者没有承认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
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