Summary
Os produtos xenogênicos (químicos ou derivados de animais) introduzidos nas etapas de preparação/manipulação da terapia celular estão associados a um risco aumentado de reatividade imunológica e transmissão patogênica em pacientes hospedeiros. Aqui, um método completo livre de xenogênicos para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano é descrito.
Abstract
Considerando o crescente impacto da terapia com células-tronco, preocupações de biossegurança têm sido levantadas em relação à potencial contaminação ou transmissão de infecção devido à introdução de produtos derivados de animais durante a manipulação in vitro . Os componentes xenogênicos, como colagenase ou soro fetal bovino, comumente usados durante as etapas de isolamento e expansão celular podem estar associados aos riscos potenciais de reatividade imunológica ou infecção viral, bacteriana e príon nos pacientes receptores. Seguindo as diretrizes de boas práticas de fabricação, a dissociação química do tecido deve ser evitada, enquanto o soro fetal bovino (FBS) pode ser substituído por suplementos livres de xenogenes. Além disso, para garantir a segurança dos produtos celulares, é importante a definição de métodos mais fiáveis e reprodutíveis. Desenvolvemos um método inovador, completamente livre de xenogenes, para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano sem alterar suas propriedades em comparação com os protocolos padrão cultivados com colagenase FBS. Aqui, células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) foram isoladas do tecido adiposo abdominal. A amostra foi picada mecanicamente com tesoura/bisturi, microdissecada e dispersa mecanicamente em placa de Petri de 10 cm e preparada com incisões de bisturi para facilitar a fixação dos fragmentos de tecido e a migração de hASCs. Seguindo as etapas de lavagem, os hASCs foram selecionados devido à sua aderência plástica sem digestão enzimática. Os hASCs isolados foram cultivados com meio suplementado com lisado plaquetário humano livre de heparina a 5% e destacados com um substituto de tripsina livre de animais. Seguindo as instruções das boas práticas de fabrico (BPF) sobre a produção de produtos celulares destinados à terapia humana, não foram utilizados antibióticos em nenhum meio de cultura.
Introduction
Nas últimas décadas, a crescente demanda por tratamentos terapêuticos inovadores deu origem a esforços significativos e investimentos em recursos no campo da medicina translacional1. Os produtos à base de células estão associados a riscos determinados pela fonte celular, pelo processo de fabricação (isolamento, expansão ou modificação genética) e pelos suplementos não celulares (enzimas, fatores de crescimento, suplementos de cultura e antibióticos), e esses fatores de risco dependem da indicação terapêutica específica. A qualidade, a segurança e a eficácia do produto final podem ser profundamente influenciadas pelos elementos acima indicados2. A terapia com células-tronco requer adesão aos princípios de biossegurança; os riscos potenciais de transmissão patogénica com produtos derivados de animais em cultura de células podem ser problemáticos, e o ensaio exaustivo de qualquer produto introduzido no fabrico é essencial3.
O método tradicional de isolamento de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano (hASCs) envolve uma digestão enzimática realizada com colagenase seguida de etapas de lavagem por centrifugação4. Embora o isolamento enzimático seja geralmente considerado mais eficiente do que outras técnicas mecânicas em termos de rendimento celular e viabilidade, os componentes derivados de animais usados, como a colagenase, são considerados mais do que minimamente manipulados pela Food and Drug Administration dos EUA. Isso significa que há um risco significativamente aumentado de reações imunes ou transmissão da doença, limitando a tradução da terapia com hASC para ambientes clínicos 5,6.
A digestão à base de tripsina é outro protocolo enzimático para isolar ASCs. Diferentes técnicas foram descritas com pequenas modificações em termos de concentração de tripsina, velocidade de centrifugação e tempo de incubação. Infelizmente, esse método não é bem descrito, e existe uma falta de comparação na literatura, particularmente com os protocolos de isolamento mecânico7. No entanto, em termos de traduzibilidade da abordagem, a tripsina tem as mesmas desvantagens da colagenase.
Métodos alternativos de isolamento para obtenção de ASCs, baseados em forças mecânicas e sem adição enzimática, envolvem centrifugação em alta velocidade (800 x g ou 1.280 x g, 15 min) dos fragmentos de tecido adiposo. Em seguida, o pellet é incubado com um tampão de lise de hemácias (5 min), seguido de outra etapa de centrifugação a 600 x g antes da ressuspensão em meio de cultura. Apesar de um maior número de células ter sido isolado nos primeiros dias em comparação com os métodos de explante, um estudo prévio mostrou menor ou ausente proliferação após a segunda semana de cultura8.
Além disso, a manipulação adicional com meio adicionado xenogênico, como o soro fetal bovino (FBS), que é utilizado como suplemento de fator de crescimento para cultura celular, está associada a um risco aumentado de reatividade imunológica e exposição a infecções virais, bacterianas ou priônicas do paciente hospedeiro 9,10. Reações imunes e desenvolvimento de erupções cutâneas urticariformes já foram descritas em indivíduos que receberam várias doses de células-tronco mesenquimais produzidas com FBS11. Além disso, a FBS está sujeita à variabilidade lote a lote, o que pode ter impacto na qualidade do produto final12.
De acordo com as diretrizes de boas práticas de fabricação (BPF), a dissociação do tecido enzimático deve ser evitada e a FBS deve ser substituída por suplementos livres de xenogenes. Essas etapas, aliadas a protocolos mais confiáveis e reprodutíveis, são essenciais para subsidiar a aplicação da terapia celular 3,13.
Nesse contexto, o lisado plaquetário humano (hPL) tem sido sugerido como um substituto para a FBS, uma vez que é um suplemento livre de células, contendo proteínas e enriquecido com fator de crescimento, e foi introduzido anteriormente entre produtos à base de células de grau clínico como aditivo de meio de crescimento para cultura e expansão celular in vitro 14,15. Como o hPL é um produto derivado de humanos, é frequentemente utilizado como substituto da FBS durante a cultura in vitro de hASCs destinadas a aplicações clínicas, reduzindo assim os problemas relacionados às reações imunológicas e infecções relacionadas à traduzibilidade da FBS15,16.
Apesar dos custos de produção mais elevados, já foi demonstrado que, em comparação com a FBS, o hPL suporta a viabilidade celular para muitos tipos de células, aumenta a proliferação, retarda a senescência, garante a estabilidade genômica e conserva o imunofenótipo celular mesmo em passagens celulares tardias; todos esses elementos sustentam a mudança para esse suplemento cultural11.
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo padronizado para isolar e cultivar hASCs com um método completo livre de animais, sem modificar a fisiologia celular e as propriedades da caule em comparação com as hASCs clássicas cultivadas em FBS (Figura 1).
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Protocol
Os hASCs foram isolados do tecido adiposo abdominal de uma mulher saudável que foi submetida à reconstrução mamária usando retalhos autólogos abdominais (retalhos perfuradores epigástricos inferiores profundos, [DIEP]) no Hospital Universitário de Lausanne, CHUV, Lausanne, Suíça. A parte descartada do retalho e do tecido adiposo foi obtida após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Todos os protocolos foram revisados e aprovados pelo Departamento de Biobanco DAL do hospital (número 314 GGC) e comitês de ética de acordo com a Declaração de Helsinque.
NOTA: Todas as etapas devem ser executadas sob um exaustor de fluxo laminar e com condições assépticas. Luvas e jalecos de laboratório para proteção individual devem ser sempre usados, e todas as superfícies devem ser lavadas com biocidas apropriados. O excesso de tecido deve ser descartado adequadamente como resíduo biomédico.
1. Materiais necessários e preparação das soluções culturais
- Para isolamento, expansão e criopreservação, obtenha-se os seguintes instrumentos: tesoura estéril; bisturis estéreis; pinças estéreis; uma placa de Petri de 10 cm; Tubos de 15 mL; Balões T25; uma câmara de Burker; crioviais; um recipiente de congelamento de células; um microscópio óptico com objetivos de ampliação de 4x e 10x; e uma centrífuga de balde oscilante.
- Para imunofenotipagem, obtenha-se os seguintes instrumentos e reagentes: tubos FACS, solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS); Meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM); hPL; sulfeto de dimetilo; e tripsina livre de animais.
- Prepare o meio de cultura completo suplementando DMEM com hPL livre de heparina a 5%. Conservar o meio a 4 °C até 3 semanas e utilizar sempre quente (entre a temperatura ambiente e os 37 °C). Seguindo as diretrizes GMP para a produção de medicamentos celulares destinados à terapia humana, não adicione antibióticos ao meio de cultura.
- Preparar meio de congelamento contendo 20% de hPL e 10% de sulfeto de dimetilo em DMEM.
2. Isolamento de hASCs da amostra de tecido adiposo
- Processar a amostra de tecido adiposo dentro de 6 h após a sua obtenção. Antes de prosseguir para o método de isolamento mecânico livre de xenogênicos estabelecido, lave o tecido 2x com PBS por 10 minutos até que o tecido conjuntivo e o sangue sejam liberados.
- Armazenar a amostra de tecido adiposo obtida da cirurgia abdominoplástica em PBS a 4°C até o processamento e, em qualquer caso, não mais de 24 h, a fim de não prejudicar a viabilidade do hASC.
- Corte o tecido adiposo em pedaços menores de aproximadamente 1cm2 com tesoura estéril.
- Com bisturi, microdissecar cada peça em pequenos fragmentos com diâmetros <5 mm e dispersar cinco deles em uma placa de Petri de 10 cm (Figura 2A).
- Para anexar cada fragmento, use o bisturi para criar incisões na superfície do plástico, arrastando cada fragmento até que esteja firmemente preso à placa de Petri. Use uma pinça para ajudar a manipular o fragmento (Figura 2B).
- Adicionar suavemente 10 mL de meio de cultura completo para cobrir todos os fragmentos sem separá-los.
- Incubar as placas de Petri a 37 °C e 5% de CO2. Os hASCs migrarão para fora do tecido e serão selecionados devido à sua aderência plástica sem digestão enzimática.
- Até a confluência celular, monitore a expansão do hASC sob um microscópio óptico com ampliação de 4x uma vez por dia. À medida que os hASCs começam a sair do tecido, eles aparecem como pequenos aglomerados ao redor dos pedaços de tecido com uma morfologia típica semelhante a fibroblastos. Os hASCs são selecionados devido à sua capacidade de aderir à superfície plástica. A cada 72 h, remova o máximo de meio possível e substitua-o por meio fresco completo para remover os detritos celulares.
- Deixe os fragmentos de tecido no lugar até a primeira passagem das células, que geralmente ocorre após 7 dias.
3. cultura de hASC após a fase de isolamento
- Quando a cultura de hASC atinge 70% a 80% de confluência, os hASCs estão prontos para serem destacados e expandidos para serem usados em outros experimentos ou armazenamento a longo prazo.
- Com pinças estéreis, remova e descarte todos os pedaços de tecido da placa de Petri. Retire e descarte o meio exaurido, tomando cuidado para não tocar nos hASCs para não desprendê-los.
- Lave cuidadosamente as células uma vez com 10 mL de PBS. Adicionar 1 ml de tripsina 1x livre de animais e deixar a placa de Petri na incubadora a 37 °C durante 5 min.
- Verifique sob um microscópio óptico a uma ampliação de 4x se todas as células se desprenderam; caso contrário, deixe a placa de Petri por mais 2 minutos na incubadora e, eventualmente, bata suavemente na superfície de plástico para suportar o desprendimento celular.
- Pare a ação da tripsina adicionando 2 mL de meio completo e colete todas as células em um tubo de 15 mL.
- Para remover qualquer tripsina restante, centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 minutos. Rejeitar o sobrenadante, suspender as células com 5 ml de meio completo e transferir a suspensão celular para um novo balão T25. Mantenha os hASCs em cultura e expanda-os até que seja necessário.
4. Investigação do imunofenótipo por citometria de fluxo
- Quando a cultura de hASC atingir 70%-80% de confluência, desanexe os hASCs conforme descrito anteriormente na seção 3.
- Após a coleta das células, suspenda-as em 1 mL de meio completo e conte uma alíquota com o contador de células sob um microscópio óptico com ampliação de 10x.
- Centrifugar os hASCs a 300 x g durante 5 minutos e suspendê-los a 1 x 106 células/ml de tampão FACS. Transferir 100 μL da suspensão contendo 1 x 105 células para um tubo FACS. Use um tubo FACS para cada antígeno investigado, mais um para cada controle isotípico.
- Coloração das células com 100 μL dos seguintes anticorpos diluídos em tampão FACS: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, marcado com FITC), anti-CD105 (1:200, IgG1, marcado com PE); anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC-labeled); anti-CD45 (1:66, IgG1, marcado com FITC); e controles isotípicos para cada fluoróforo, IgG1 FITC-marcado (1:1.000) e IgG1 PE-marcado (1:50).
- Incubar as amostras durante 1 h no escuro com agitação a 4 °C. Centrifugar os tubos a 300 x g durante 5 min, eliminar o sobrenadante e suspender as células em 500 μL de tampão FACS.
- Avaliar o imunofenótipo celular com um instrumento de citometria de fluxo, registrando 50.000 eventos para cada tubo dentro do portão selecionado para excluir detritos celulares. Calcule a porcentagem de células expressas como a diferença em relação ao controle isotípico específico.
5. Ensaio de proliferação de hASC
- Quando a cultura de hASC atingir 70%-80% de confluência, desprenda os hASCs conforme descrito na seção 3.
- Após a coleta das células, suspenda-as em 1 mL de meio completo e conte uma alíquota com o contador de células sob um microscópio óptico com ampliação de 10x.
- Semear 5 x 102 hASCs em 200 μL de meio completo em placas transparentes de 96 poços. Semeia as células em replicações técnicas, com um poço para cada ponto de tempo.
- Aos 3 dias após a semeadura, comece a detectar a proliferação celular usando um kit de ensaio de proliferação seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, substitua o meio de cultura por 100 μL de meio fresco adicionado a 20 μL de reagente de ensaio por poço. Incubar os hASCs por 2,5 h a 37 °C, 5% de CO2 para desenvolvimento de reagentes e, em seguida, detectar a absorvância a 490 nm com um espectrofotômetro.
- Expresse a proliferação de hASC como a porcentagem de absorvância após a remoção da absorvância em branco.
6. Criopreservação e armazenamento dos hASCs
- Desprenda as células conforme descrito na secção 3 e conte uma alíquota com o contador de células sob um microscópio óptico com uma ampliação de 10x.
- Centrifugar as células a 300 x g durante 5 minutos e eliminar o sobrenadante. Suspender as células com mistura de congelação a uma densidade de 1 x 106 hASCs/ml e transferir 1 ml da solução celular para uma criovial.
- Coloque os criovios a -80 °C num recipiente de congelação que diminua a temperatura em 1 °C/min e, em seguida, mova os criovios para azoto líquido para armazenamento a longo prazo.
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Representative Results
Aplicando o método de isolamento detalhado acima, os hASCs foram obtidos com sucesso a partir de amostras de tecido adiposo abdominal sem o uso de colagenase. Além disso, os hASCs foram expandidos em condições livres de xenogenea, na presença de hPL e sem quaisquer outros componentes de origem animal. Os resultados a seguir corroboram o protocolo e são obtidos a partir de hASCs cultivadas em paralelo com hPL e com FBS como condição controle.
Após o aparecimento inicial do cluster, os hASCs apresentaram a forma clássica fusiforme e foram menores e mais alongados em comparação com as células controle na presença de FBS (Figura 3). O imunofenótipo celular avaliado pela citometria de fluxo pareceu ser semelhante entre os hASCs cultivados com os dois suplementos. Em particular, mais de 80%-90% dos hASCs foram positivos para CD73 17 e CD105 17, e menos de 5% expressaram CD34 17 e CD45 17 (Figura 4). Finalmente, o ensaio de proliferação revelou um aumento significativo no crescimento celular quando o hPL foi adicionado ao meio em comparação com o controle FBS (Figura 5).
Figura 1: Resumo gráfico do protocolo. Método livre de xenogênicos para o isolamento e expansão in vitro de células-tronco derivadas de tecido adiposo humano. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Processo de corte e semeadura de tecido adiposo para obtenção de hASCs em cultura in vitro . (A) Microdissecção do tecido adiposo em fragmentos com diâmetros <5 mm e dispersão dos fragmentos em placa de Petri de 10 cm. (B) Fixação à placa de Petri após a criação de incisões na superfície plástica com um bisturi. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Morfologia dos hASCs. Os hASCs cultivados na condição livre de xenogênicos mostraram uma forma fusiforme e morfologia alongada. Os hASCs cultivados na presença de FBS como controle eram maiores e tinham uma forma de bullseye. A barra de escala representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imunofenótipo dos hASCs. O imunofenótipo das hASCs foi semelhante na presença de hPL e FBS. Em particular, os hASCs em ambas as condições podem ser considerados positivos para CD73 e CD105 e negativos para CD34 e CD45. As barras de erro indicam o erro padrão (n = 3). Abreviaturas: hPL = lisado plaquetário humano; FBS = soro fetal bovino. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Proliferação de hASC. Os hASCs expandidos em condições livres de xenogênicos proliferaram significativamente mais do que aqueles na presença de FBS. ** p < 0,01 (significância avaliada pelo teste t de Student, n = 3). O eixo x representa o tempo em termos do número de dias após a semeadura. Abreviaturas: hPL = lisado plaquetário humano; FBS = soro fetal bovino; hASCs = células-tronco derivadas de tecido adiposo humano. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As células-tronco derivadas de tecido adiposo têm atraído o interesse da pesquisa translacional na última década devido à sua abundância, métodos de isolamento rápidos e acessíveis, alta taxa de proliferação in vitro/in vivo e propriedades de caule/diferenciação18,19,20. Como resultado, as hASCs são consideradas um excelente candidato para estratégias baseadas em células em medicina regenerativa21. Após o isolamento do tecido adiposo, os hASCs requerem expansão in vitro e, em alguns casos, devem ser submetidos a uma etapa de diferenciação antes de serem usados para uma aplicação terapêutica específica. Todo o processo, incluindo o isolamento, a expansão in vitro e a eventual diferenciação, deve ser conduzido de acordo com as diretrizes GMP para reduzir quaisquer riscos do ponto de vista da tradução22,23.
Em relação ao processo de isolamento, embora as etapas de digestão enzimática e centrifugação produzam rapidamente um alto número de hASCs em um tempo relativamente curto, relatos anteriores mostraram que esses métodos causam possíveis alterações fenotípicas celulares em termos de marcadores de diferenciação de clusters em comparação com outros métodos de isolamento mecânico, levantando questões sobre a biossegurança, propriedades celulares e questões comportamentais ao aplicar essas hASCs com pacientes humanos3 . Além disso, para minimizar os riscos relacionados aos componentes xenogênicos, estudos recentes sugeriram o uso de enzimas sintéticas ou métodos mecânicos para isolar hASCs. No entanto, mesmo enzimas sintéticas podem modificar o perfil celular e afetar a qualidade do produto24. Ao contrário, o método baseado em explantes aqui investigado pode ser uma alternativa válida para fins translacionais, uma vez que os hASCs migram para fora do tecido e aderem às superfícies plásticas naturalmente, sem o uso de reagentes xenogênicos9. Ao mesmo tempo, deve-se considerar que esse método evidenciou menor rendimento celular em comparação com o isolamento clássico da colagenase25.
Em relação ao meio suplementar, com base na literatura recente, que concorda que o hPL suporta a expansão do hASC em maior grau do que o FBS sem alterar as propriedades fisiológicas do hASC 26,27,28,29, substituímos o meio tradicional adicionado à FBS pelo hPL 16. Apoiando a cultura celular com hPL, superamos a diminuição da produção celular e a recuperação mais lenta relacionada ao isolamento mecânico. Essas hASCs menos manipuladas proliferaram in vitro com uma taxa que permitiu a expansão necessária para atingir volumes clinicamente relevantes de forma eficiente e segura30,31. Além disso, a cultura com hPL não alterou as características caule e o imunofenótipo típicos das hASCs, o que significa que o interesse terapêutico dessas células foi mantido.
Até onde sabemos, embora uma variedade de protocolos de isolamento de explante tenha sido descrita para ASCs, nosso método é a primeira combinação de isolamento mecânico livre de xenogênicos de ASCs com cultura de meio suplementado com hPL para obter uma valiosa população celular para aplicações translacionais.
Além disso, o método descrito neste trabalho possui alguns aspectos críticos que precisam ser mais detalhados. Em primeiro lugar, os diâmetros dos fragmentos de tecido adiposo picados não devem exceder 5 mm para facilitar a sua adesão à superfície plástica e permitir a migração dos hASCs para fora do tecido. Em segundo lugar, a presença de fragmentos de tecido adiposo em cultura, juntamente com os hASCs já ligados à placa, deve ser equilibrada, considerando o risco de contaminação e a necessidade de um número suficiente de células migradas. Em terceiro lugar, os pesquisadores precisam estar cientes de uma possível taxa de crescimento reduzida nas primeiras 24 horas após a semeadura do explante; após esse período de tempo, a suplementação de hPL estimula a recuperação e proliferação celular em comparação com a FBS clássica30.
No momento, nenhuma outra etapa ou modificação foi introduzida em comparação com o protocolo original descrito acima.
Em conclusão, o método livre de xenogênicos completo descrito aqui fornece uma maneira simples de isolar hASCs do tecido adiposo, incluindo lipoaspirados e tecido adiposo abdominal, na ausência de produtos derivados de animais, enzimas químicas ou etapas de centrifugação. Além disso, o meio suplementado com hPL contrabalança o menor rendimento celular inicial resultante e aumenta a proliferação celular, mantendo as propriedades terapêuticas dos hASCs inalteradas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores não têm reconhecimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
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