Summary
Xenogena (kemiska eller animaliska produkter) som introduceras i cellterapins berednings-/manipuleringssteg är förknippade med en ökad risk för immunreaktivitet och patogen överföring hos värdpatienter. Här beskrivs en komplett xenogenfri metod för isolering och in vitro-expansion av humana fettderiverade stamceller.
Abstract
Med tanke på den ökande effekten av stamcellsterapi har biosäkerhetsproblem tagits upp när det gäller potentiell kontaminering eller infektionsöverföring på grund av införandet av animaliska produkter under in vitro-manipulation . De xenogena komponenterna, såsom kollagenas eller fetalt bovint serum, som vanligen används under cellisolerings- och expansionsstegen kan associeras med de potentiella riskerna för immunreaktivitet eller virus-, bakterie- och prioninfektion hos de mottagande patienterna. Enligt riktlinjer för god tillverkningssed bör kemisk vävnadsdissociation undvikas, medan fetalt bovint serum (FBS) kan ersättas med xenogenfria kosttillskott. För att garantera cellprodukternas säkerhet är det dessutom viktigt att fastställa mer tillförlitliga och reproducerbara metoder. Vi har utvecklat en innovativ, helt xenogenfri metod för isolering och in vitro-expansion av humana fett-härledda stamceller utan att ändra deras egenskaper jämfört med kollagenas FBS-odlade standardprotokoll. Här isolerades humana fett-härledda stamceller (hASCs) från bukfettvävnad. Provet maldes mekaniskt med sax/skalpell, mikrodissekerades och dispergerades mekaniskt i en 10 cm petriskål och bereddes med skalpellsnitt för att underlätta vidhäftningen av vävnadsfragmenten och migrationen av hASCs. Efter tvättstegen valdes hASC på grund av deras plastvidhäftning utan enzymatisk nedbrytning. De isolerade hASC odlades med medium kompletterat med 5% heparinfritt humant trombocytlysat och lossades med ett djurfritt trypsinsubstitut. I enlighet med god tillverkningssed (GMP) riktlinjer för produktion av cellprodukter avsedda för humanterapi användes inga antibiotika i något odlingsmedium.
Introduction
Under de senaste decennierna har den ökande efterfrågan på innovativa terapeutiska behandlingar gett upphov till betydande insatser och resursinvesteringar inom det translationella medicinområdet1. Cellbaserade produkter är förknippade med risker som bestäms av cellkällan, tillverkningsprocessen (isolering, expansion eller genetisk modifiering) och de icke-cellulära tillskotten (enzymer, tillväxtfaktorer, odlingstillskott och antibiotika), och dessa riskfaktorer beror på den specifika terapeutiska indikationen. Slutproduktens kvalitet, säkerhet och effektivitet kan påverkas starkt av ovanstående element2. Stamcellsterapi kräver att biosäkerhetsprinciper följs; De potentiella riskerna för patogen överföring med produkter av animaliskt ursprung i cellodlingar kan vara problematiska, och det är viktigt att noggrant testa alla produkter som införs vid tillverkningen3.
Den traditionella metoden att isolera humana fettstamceller (hSAC) innebär en enzymatisk nedbrytning som utförs med kollagenas följt av tvättsteg genom centrifugering4. Medan enzymatisk isolering i allmänhet anses vara effektivare än andra mekaniska tekniker när det gäller cellutbyten och livskraft, anses de animaliska härledda komponenterna som används, såsom kollagenas, mer än minimalt manipulerade av US Food and Drug Administration. Detta innebär att det finns en signifikant ökad risk för immunreaktioner eller sjukdomsöverföring, vilket begränsar översättningen av hASC-behandling till kliniska miljöer 5,6.
Trypsinbaserad matsmältning är ett annat enzymatiskt protokoll för att isolera ASC. Olika tekniker har beskrivits med små modifieringar när det gäller trypsinkoncentration, centrifugeringshastighet och inkubationstid. Tyvärr är denna metod inte väl beskriven, och en brist på jämförelse finns i litteraturen, särskilt med de mekaniska isoleringsprotokollen7. Men när det gäller översättbarheten av tillvägagångssättet har trypsin samma nackdelar med kollagenas.
Alternativa isoleringsmetoder för att erhålla ASC, baserade på mekaniska krafter och utan enzymtillsats, innefattar höghastighetscentrifugering (800 x g eller 1 280 x g, 15 min) av fettvävnadsfragmenten. Därefter inkuberas pelleten med en röd blodkroppslysbuffert (5 min), följt av ytterligare ett centrifugeringssteg vid 600 x g före resuspension i odlingsmedium. Trots att ett större antal celler isolerades under de första dagarna jämfört med explanteringsmetoderna, visade en tidigare studie lägre eller frånvarande proliferation bortom den andra odlingsveckan8.
Dessutom är ytterligare manipulation med xenogent tillsatt medium, såsom fetalt bovint serum (FBS), som används som ett tillväxtfaktortillskott för cellodling, förknippat med en ökad risk för immunreaktivitet och exponering för virus-, bakterie- eller prioninfektioner hos värdpatienten 9,10. Immunreaktioner och utveckling av urtikariforma utslag har redan beskrivits hos individer som fått flera doser mesenkymala stamceller producerade med FBS11. Dessutom utsätts FBS för batch-till-batch-variabilitet, vilket kan påverka slutproduktens kvalitet12.
I enlighet med riktlinjerna för god tillverkningssed (GMP) bör enzymatisk vävnadsdissociation undvikas och FBS bör ersättas med xenogenfria kosttillskott. Dessa steg, tillsammans med mer tillförlitliga och reproducerbara protokoll, är avgörande för att stödja tillämpningen av cellterapi 3,13.
I detta sammanhang har humant trombocytlysat (hPL) föreslagits som ett substitut för FBS eftersom det är ett cellfritt, proteininnehållande, tillväxtfaktorberikat tillskott, och det introducerades tidigare bland cellbaserade produkter av klinisk kvalitet som tillsats till tillväxtmedium för in vitro-cellodling och expansion14,15. Eftersom hPL är en produkt av mänskligt ursprung används den ofta som ersättning för FBS under in vitro-odling av hASC avsedda för kliniska tillämpningar, vilket minskar problem med immunologiska reaktioner och infektioner relaterade till FBS-översättbarhet15,16.
Trots de högre produktionskostnaderna har det redan visats att jämfört med FBS stöder hPL cellviabilitet för många celltyper, ökar proliferationen, fördröjer åldrandet, säkerställer genomisk stabilitet och bevarar den cellulära immunofenotypen även i sena cellpassager; Alla dessa element stöder övergången till detta kulturtillägg11.
Syftet med detta arbete var att utveckla ett standardiserat protokoll för att isolera och odla hASC med en komplett djurfri metod, utan att modifiera cellfysiologin och stamhetsegenskaperna i jämförelse med klassiska FBS-odlade hASC (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hASC isolerades från bukfettvävnaden hos en frisk kvinna som genomgick bröstrekonstruktion med hjälp av autologa flikar i buken (djupa underlägsna epigastriska perforatorflikar, [DIEP]) vid universitetssjukhuset i Lausanne, CHUV, Lausanne, Schweiz. Den kasserade delen av klaffen och fettvävnaden erhölls efter att patienten undertecknat informerat samtycke. Alla protokoll granskades och godkändes av sjukhusets biobanksavdelning DAL (nummer 314 GGC) och etiska kommittéer i enlighet med Helsingforsdeklarationen.
OBS: Alla steg måste utföras under en laminär flödeshuv och med aseptiska förhållanden. Handskar och labbrockar för personligt skydd ska alltid bäras och alla ytor ska tvättas med lämpliga biocider. Överskott av vävnad ska kasseras ordentligt som biomedicinskt avfall.
1. Material som behövs och beredning av kulturlösningarna
- För cellisolering, expansion och kryokonservering, skaffa följande instrument: steril sax; sterila skalpeller; steril pincett; en 10 cm petriskål; 15 ml rör; T25-kolvar; en burkerkammare; kryovialer; en cellfrysningsbehållare; ett optiskt mikroskop med 4x och 10x förstoringsmål; och en svängande hinkcentrifug.
- För immunofenotypning, erhålla följande instrument och reagens: FACS-rör, steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS); Dulbeccos minimala essentiella medium (DMEM); hPL; dimetylsulfid; och djurfritt trypsin.
- Förbered hela odlingsmediet genom att komplettera DMEM med 5% heparinfritt hPL. Förvara mediet vid 4 °C i upp till 3 veckor och använd alltid varmt (mellan rumstemperatur och 37 °C). Följ GMP-riktlinjerna för produktion av cellläkemedel avsedda för humanterapi, tillsätt inga antibiotika till odlingsmediet.
- Förbered frysmedel innehållande 20% hPL och 10% dimetylsulfid i DMEM.
2. Isolering av hASC från fettvävnadsprovet
- Bearbeta fettvävnadsprovet inom 6 timmar efter att det erhållits. Innan du fortsätter till den etablerade mekaniska xenogenfria isoleringsmetoden, tvätta vävnaden 2x med PBS i 10 minuter tills bindväv och blod frigörs.
- Förvara det erhållna fettvävnadsprovet från bukplastikkirurgi i PBS vid 4 °C fram till bearbetningen och under inga omständigheter längre än 24 timmar för att inte skada hASC-livsdugligheten.
- Skär fettvävnaden i mindre bitar på ca 1 cm2 med steril sax.
- Mikrodissekera varje bit med en skalpell i små fragment med diametrar <5 mm och sprida fem av dem i en 10 cm petriskål (figur 2A).
- För att fästa varje fragment, använd skalpellen för att skapa snitt på plastytan, dra varje fragment tills det sitter fast i petriskålen. Använd pincett för att hantera fragmentet (bild 2B).
- Tillsätt försiktigt 10 ml komplett odlingsmedium för att täcka alla fragment utan att lossa dem.
- Inkubera petriskålarna vid 37 °C och 5 %CO2. hASC:erna kommer att migrera ut ur vävnaden och väljas på grund av deras plastvidhäftning utan enzymatisk nedbrytning.
- Fram till cellsammanflödet, övervaka hASC-expansionen under ett optiskt mikroskop vid 4x förstoring en gång per dag. När hASC börjar gå ut ur vävnaden uppträder de som små kluster runt vävnadsbitarna med en typisk fibroblastliknande morfologi. hASC: erna väljs på grund av deras förmåga att fästa vid plastytan. Var 72: e timme, ta bort så mycket medium som möjligt och ersätt det med nytt komplett medium för att ta bort cellskräp.
- Lämna fragmenten av vävnad på plats tills den första passagen av celler, vilket vanligtvis är efter 7 dagar.
3. hASC-kultur efter isoleringsfasen
- När hASC-kulturen når 70% -80% sammanflöde är hASC redo att lossas och utvidgas ytterligare för att antingen användas för andra experiment eller långvarig lagring.
- Med steril pincett, ta bort och kassera alla bitar av vävnad från petriskålen. Ta bort och kassera det uttömda mediet, var försiktig så att du inte rör vid hASC för att inte lossna dem.
- Tvätta cellerna försiktigt en gång med 10 ml PBS. Tillsätt 1 ml 1x djurfritt trypsin och låt petriskålen stå i inkubatorn vid 37 °C i 5 minuter.
- Kontrollera under ett optiskt mikroskop vid 4x förstoring om alla celler har lossnat; annars lämnar du petriskålen i ytterligare 2 minuter i inkubatorn och knackar så småningom försiktigt på plastytan för att stödja cellavskiljningen.
- Stoppa trypsinverkan genom att tillsätta 2 ml komplett medium och samla alla celler i ett 15 ml rör.
- För att avlägsna eventuellt kvarvarande trypsin, centrifugera röret vid 300 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten, suspendera cellerna med 5 ml fullständigt medium och överför cellsuspensionen till en ny T25-kolv. Håll hASC i kultur och expandera dem tills det behövs.
4. Immunofenotypundersökning med flödescytometri
- När hASC-kulturen når 70–80 % sammanflöde, lossa hASC:erna enligt beskrivningen i avsnitt 3.
- Efter uppsamling av cellerna, suspendera dem i 1 ml komplett medium och räkna en alikvot med cellräknaren under ett optiskt mikroskop vid 10x förstoring.
- Centrifugera hASC:erna vid 300 x g i 5 minuter och suspendera dem vid 1 x 106 celler/ml FACS-buffert. Överför 100 μL suspension innehållande 1 x 105 celler till ett FACS-rör. Använd ett FACS-rör för varje undersökt antigen, plus ytterligare ett för varje isotypisk kontroll.
- Färga cellerna med 100 μL av följande antikroppar utspädda i FACS-buffert: anti-CD73 (1:1 000, IgG1, FITC-märkt), anti-CD105 (1:200, IgG1, PE-märkt); anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC-märkt); anti-CD45 (1:66, IgG1, FITC-märkt); och isotypiska kontroller för varje fluorofor, IgG1 FITC-märkt (1:1 000) och IgG1 PE-märkt (1:50).
- Inkubera proverna i 1 timme i mörker under omrörning vid 4 °C. Centrifugera rören vid 300 x g i 5 minuter, kassera supernatanten och suspendera cellerna i 500 μL FACS-buffert.
- Bedöm cellimmunofenotypen med ett flödescytometriinstrument och registrera 50 000 händelser för varje rör inuti grinden som valts för att utesluta cellskräp. Beräkna procentandelen uttryckande celler som skillnaden från den specifika isotypiska kontrollen.
5. Proliferationstest av hASC
- När hASC-kulturen når 70–80 % sammanflöde, lossa hASC enligt beskrivningen i avsnitt 3.
- Efter uppsamling av cellerna, suspendera dem i 1 ml komplett medium och räkna en alikvot med cellräknaren under ett optiskt mikroskop vid 10x förstoring.
- Frö 5 x 102 hASC i 200 μL komplett medium i 96-brunns transparenta plattor. Frö cellerna i tekniska replikat, med en brunn för varje tidpunkt.
- Vid 3 dagar efter sådd, börja detektera cellproliferationen med hjälp av ett proliferationsanalyssats enligt tillverkarens instruktioner. I korthet, ersätt odlingsmediet med 100 μL färskt medium tillsatt till 20 μL analysreagens per brunn. Inkubera hASC i 2,5 timmar vid 37 °C, 5 %CO2 för reagensutveckling och detektera sedan absorbans vid 490 nm med en spektrofotometer.
- Uttryck hASC-proliferationen som den procentuella absorbansen efter avlägsnande av blindabsorbansen.
6. Kryokonservering och lagring av hASC
- Lossa cellerna enligt beskrivningen i avsnitt 3 och räkna en alikvot med cellräknaren under ett optiskt mikroskop vid 10x förstoring.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter och kassera supernatanten. Suspendera cellerna med frysblandning med en densitet av 1 x 106 hASCs/ml och överför 1 ml av celllösningen till en kryovial.
- Lägg kryovialerna vid -80 ° C i en frysbehållare som sänker temperaturen med 1 ° C / min och flytta sedan kryovialerna till flytande kväve för långvarig lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att tillämpa isoleringsmetoden som beskrivs ovan erhölls hASC framgångsrikt från bukfettvävnadsprover utan användning av kollagenas. Dessutom utvidgades hASC under fullständiga xenogena förhållanden i närvaro av hPL och utan några andra komponenter av animaliskt ursprung. Följande resultat stöder protokollet och erhålls från hASC odlade parallellt med hPL och med FBS som kontrollvillkor.
Efter det initiala klusterutseendet visade hASC den klassiska spindelliknande formen och var mindre och mer långsträckta jämfört med kontrollcellerna i närvaro av FBS (figur 3). Cellimmunofenotypen utvärderad med flödescytometri tycktes vara likartad mellan hASC odlade med de två tillskotten. I synnerhet var mer än 80%-90% av hASC positiva för CD73 17 och CD105 17, och mindre än 5% uttryckte CD34 17 och CD45 17 (figur 4). Slutligen avslöjade proliferationsanalysen en signifikant ökning av celltillväxt när hPL tillsattes till mediet jämfört med FBS-kontrollen (figur 5).
Figur 1: Grafiskt sammandrag av protokollet. Xenogen metod för isolering och in vitro-expansion av humana fettderiverade stamceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Skärning av fettvävnad och såddprocess för att erhålla hASC i in vitro-odling . (A) Mikrodissektion av fettvävnaden i fragment med diametrar <5 mm och dispersion av fragmenten i en 10 cm petriskål. (B) Fäst på petriskålen efter att ha skapat snitt på plastytan med en skalpell. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: HASC:ernas morfologi. De hASC som odlades i det xenogena tillståndet visade en spindelliknande form och långsträckt morfologi. De hASC som odlades i närvaro av FBS som kontroll var större och hade en bullseye-form. Skalstapeln representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Immunofenotyp för hASCs. Immunofenotypen för hASC var likartad i närvaro av hPL och FBS. I synnerhet kan hASC under båda förhållandena anses vara positivt för CD73 och CD105 och negativt för CD34 och CD45. Felstaplarna anger standardfelet (n = 3). Förkortningar: hPL = humant trombocytlysat; FBS = fetalt bovint serum. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: hASC-spridning. De hASC som expanderade under xenogena förhållanden förökade sig betydligt mer än de i närvaro av FBS. ** p < 0,01 (signifikans utvärderad med en Students t-test, n = 3). X-axeln representerar tiden när det gäller antalet dagar efter sådd. Förkortningar: hPL = humant trombocytlysat; FBS = fetalt bovint serum; hASC = humana fettbaserade stamceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fettbaserade stamceller har väckt intresse för translationell forskning under det senaste decenniet på grund av deras överflöd, snabba och prisvärda isoleringsmetoder, hög in vitro / in vivo proliferationshastighet och stamhet / differentieringsegenskaper18,19,20. Som ett resultat anses hASC vara en utmärkt kandidat för cellbaserade strategier inom regenerativ medicin21. Efter isolering från fettvävnad kräver hASC expansion in vitro och bör i vissa fall genomgå ett differentieringssteg innan det används för en specifik terapeutisk tillämpning. Hela processen, inklusive isolering, in vitro-expansion och eventuell differentiering, måste utföras i enlighet med GMP-riktlinjer för att minska eventuella risker ur ett översättningsperspektiv22,23.
När det gäller isoleringsprocessen, medan de enzymatiska matsmältnings- och centrifugeringsstegen snabbt ger ett stort antal hASC på relativt kort tid, har tidigare rapporter visat att dessa metoder orsakar möjliga cellfenotypiska förändringar när det gäller klusterdifferentieringsmarkörer jämfört med andra mekaniska isoleringsmetoder, vilket väcker frågor om biosäkerhet, cellegenskaper och beteendeproblem vid tillämpning av dessa hASC med mänskliga patienter3 . Dessutom, för att minimera riskerna relaterade till xenogena komponenter, har nyligen genomförda studier föreslagit att man använder syntetiska enzymer eller mekaniska metoder för att isolera hSAC. Men även syntetiska enzymer kan eventuellt modifiera cellprofilen och påverka produktkvaliteten24. Tvärtom kan den explantbaserade metod som undersöks här vara ett giltigt alternativ för translationella ändamål, eftersom hASC migrerar ut ur vävnaden och fäster naturligt på plastytorna utan användning av xenogena reagens9. Samtidigt måste det anses att denna metod visade lägre cellutbyte jämfört med den klassiska kollagenasisoleringen25.
När det gäller tillskottsmediet, baserat på ny litteratur, som håller med om att hPL stöder hASC-expansion i högre grad än FBS utan att ändra hASC-fysiologiska egenskaper 26,27,28,29, ersatte vi det traditionella FBS-tillsatta mediet med hPL 16. Genom att stödja cellkulturen med hPL övervann vi de minskade cellutbytena och den långsammare återhämtningen relaterad till mekanisk isolering. Dessa mindre manipulerade hASC förökade sig in vitro med en hastighet som möjliggjorde den expansion som krävs för att nå kliniskt relevanta volymer på ett effektivt och säkert sätt30,31. Dessutom förändrade kulturen med hPL inte de stamliknande egenskaperna och immunofenotypen som är typiska för hASCs, vilket innebär att det terapeutiska intresset för dessa celler bibehölls.
Så vitt vi vet, medan en mängd olika explantisoleringsprotokoll har beskrivits för ASC, är vår metod den första som kombinerar xenogenfri mekanisk isolering av ASC med hPL-kompletterad mediumkultur för att erhålla en värdefull cellpopulation för translationella applikationer.
Dessutom har metoden som beskrivs i detta arbete några kritiska aspekter som behöver beskrivas ytterligare. För det första bör diametrarna på fettvävsfragmenten inte överstiga 5 mm för att underlätta deras vidhäftning till plastytan och möjliggöra migrering av hASC ut ur vävnaden. För det andra bör förekomsten av fettvävnadsfragment i odling tillsammans med de hASC som redan är fästa vid plattan balanseras, med tanke på kontamineringsrisken och behovet av ett tillräckligt antal migrerade celler. För det tredje måste forskare vara medvetna om en eventuell minskad tillväxthastighet under de första 24 timmarna efter sådden av explanten. efter denna tidsperiod stimulerar hPL-tillskottet cellåterhämtning och proliferation jämfört med den klassiska FBS30.
För närvarande har inga ytterligare steg eller ändringar införts jämfört med det ursprungliga protokollet som beskrivs ovan.
Sammanfattningsvis ger den fullständiga xenogenfria metoden som beskrivs här ett enkelt sätt att isolera hASC från fettvävnad, inklusive både lipoaspirater och bukfettvävnad, i frånvaro av animaliska produkter, kemiska enzymer eller centrifugeringssteg. Dessutom motverkar det hPL-kompletterade mediet det resulterande initiala celllägre utbytet och förbättrar cellproliferationen samtidigt som de terapeutiska egenskaperna hos hASC förblir oförändrade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga erkännanden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
