Summary
Xenogene (kemiske eller animalsk afledte) produkter, der introduceres i celleterapiforberedelses-/manipulationstrinnene, er forbundet med en øget risiko for immunreaktivitet og patogen overførsel hos værtspatienter. Her beskrives en komplet xenogenfri metode til isolering og in vitro-ekspansion af humane fedtafledte stamceller.
Abstract
I betragtning af den stigende virkning af stamcelleterapi er der blevet rejst biosikkerhedsmæssige betænkeligheder med hensyn til potentiel kontaminering eller infektionsoverførsel som følge af indførelsen af animalske produkter under in vitro-manipulation . De xenogene komponenter, såsom kollagenase eller føtalt bovint serum, der almindeligvis anvendes under celleisolations- og ekspansionstrinnene, kan være forbundet med de potentielle risici for immunreaktivitet eller virus-, bakterie- og prioninfektion hos de modtagende patienter. Efter retningslinjer for god fremstillingspraksis bør kemisk vævsdissociation undgås, mens føtalt bovint serum (FBS) kan erstattes med xenogenfrie kosttilskud. For at sikre celleprodukternes sikkerhed er det desuden vigtigt at definere mere pålidelige og reproducerbare metoder. Vi har udviklet en innovativ, fuldstændig xenogen-fri metode til isolering og in vitro ekspansion af humane fedtafledte stamceller uden at ændre deres egenskaber sammenlignet med collagenase FBS-dyrkede standardprotokoller. Her blev humane fedtafledte stamceller (hASC'er) isoleret fra abdominalt fedtvæv. Prøven blev mekanisk hakket med en saks/en skalpel, mikrodissekeret og mekanisk dispergeret i en 10 cm petriskål og forberedt med skalpelsnit for at lette fastgørelsen af vævsfragmenterne og migrationen af hASC'er. Efter vasketrinnene blev hASC'er valgt på grund af deres plastiske vedhæftning uden enzymatisk fordøjelse. De isolerede hASC'er blev dyrket med medium suppleret med 5% heparinfrit humant blodpladelysat og løsrevet med en dyrefri trypsinerstatning. I overensstemmelse med god fremstillingspraksis (GMP) anvisninger om produktion af celleprodukter beregnet til human terapi blev der ikke anvendt antibiotika i nogen kulturmedier.
Introduction
I de seneste årtier har den stigende efterspørgsel efter innovative terapeutiske behandlinger givet anledning til betydelige bestræbelser og ressourceinvesteringer inden for translationel medicin1. Cellebaserede produkter er forbundet med risici bestemt af cellekilden, fremstillingsprocessen (isolering, ekspansion eller genetisk modifikation) og de ikke-cellulære kosttilskud (enzymer, vækstfaktorer, kulturtilskud og antibiotika), og disse risikofaktorer afhænger af den specifikke terapeutiske indikation. Slutproduktets kvalitet, sikkerhed og effektivitet kan påvirkes dybt af ovennævnte elementer2. Stamcelleterapi kræver overholdelse af biosikkerhedsprincipper; De potentielle risici for patogen overførsel med animalske produkter i cellekultur kan være problematiske, og grundig testning af ethvert produkt, der introduceres i fremstillingen, er afgørende3.
Den traditionelle metode til isolering af humane fedtafledte stamceller (hASC'er) involverer en enzymatisk fordøjelse udført med kollagenase efterfulgt af vasketrin gennem centrifugering4. Mens enzymatisk isolering generelt betragtes som mere effektiv end andre mekaniske teknikker med hensyn til celleudbytter og levedygtighed, betragtes de anvendte animalske afledte komponenter, såsom collagenase, som mere end minimalt manipuleret af US Food and Drug Administration. Dette betyder, at der er en signifikant øget risiko for immunreaktioner eller sygdomsoverførsel, hvilket begrænser oversættelsen af hASC-behandling til kliniske indstillinger 5,6.
Trypsin-baseret fordøjelse er en anden enzymatisk protokol til at isolere ASC'er. Forskellige teknikker er blevet beskrevet med små ændringer med hensyn til trypsinkoncentration, centrifugeringshastighed og inkubationstid. Desværre er denne metode ikke godt beskrevet, og der mangler sammenligning i litteraturen, især med de mekaniske isolationsprotokoller7. Med hensyn til oversætteligheden af tilgangen har trypsin imidlertid de samme ulemper ved collagenase.
Alternative isolationsmetoder til opnåelse af ASC'er, baseret på mekaniske kræfter og uden enzymtilsætning, involverer højhastighedscentrifugering (800 x g eller 1.280 x g, 15 min) af fedtvævsfragmenterne. Derefter inkuberes pelleten med en røde blodlegemer lysebuffer (5 min) efterfulgt af et andet centrifugeringstrin ved 600 x g før resuspension i dyrkningsmedium. På trods af at et større antal celler blev isoleret i de første dage sammenlignet med explant-metoderne, viste en tidligere undersøgelse lavere eller fraværende spredning ud over den anden uge af kultur8.
Derudover er yderligere manipulation med xenogent tilsat medium, såsom føtalt bovint serum (FBS), der bruges som vækstfaktortilskud til cellekultur, forbundet med en øget risiko for immunreaktivitet og eksponering for virale, bakterielle eller prioninfektioner hos værtspatienten 9,10. Immunreaktioner og udvikling af urticariform udslæt er allerede beskrevet hos personer, der får flere doser mesenkymale stamceller produceret med FBS11. Desuden udsættes FBS for batch-til-batch-variabilitet, hvilket kan have indflydelse på den endelige produktkvalitet12.
I overensstemmelse med god fremstillingspraksis (GMP) retningslinjer, enzymatisk væv dissociation bør undgås, og FBS bør erstattes med xenogen-fri kosttilskud. Disse trin er sammen med mere pålidelige og reproducerbare protokoller afgørende for at understøtte anvendelsen af celleterapi 3,13.
I denne sammenhæng er humant blodpladelysat (hPL) blevet foreslået som erstatning for FBS, da det er et cellefrit, proteinholdigt, vækstfaktorberiget supplement, og det blev tidligere introduceret blandt cellebaserede produkter af klinisk kvalitet som et tilsætningsstof til vækstmedium til in vitro-cellekultur og ekspansion14,15. Da hPL er et humant afledt produkt, anvendes det ofte som erstatning for FBS under in vitro-kulturen af hASC'er beregnet til kliniske anvendelser, hvilket reducerer problemer vedrørende immunologiske reaktioner og infektioner relateret til FBS-oversættelighed15,16.
På trods af de højere produktionsomkostninger er det allerede blevet påvist, at hPL sammenlignet med FBS understøtter cellelevedygtighed for mange celletyper, øger spredning, forsinker ældning, sikrer genomisk stabilitet og bevarer den cellulære immunofænotype selv i sene cellepassager; Alle disse elementer understøtter skiftet til dette kulturtillæg11.
Formålet med dette arbejde var at udvikle en standardiseret protokol til isolering og dyrkning af hASC'er med en komplet dyrefri metode uden at ændre cellefysiologien og stamhedsegenskaberne sammenlignet med klassiske FBS-dyrkede hASC'er (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hASC'er blev isoleret fra det abdominale fedtvæv hos en sund kvinde, der gennemgik brystrekonstruktion ved hjælp af abdominale autologe klapper (dybe inferiole epigastriske perforatorklapper, [DIEP]) på universitetshospitalet i Lausanne, CHUV, Lausanne, Schweiz. Den kasserede del af klappen og fedtvævet blev opnået, efter at patienten underskrev informeret samtykke. Alle protokoller blev gennemgået og godkendt af hospitalets Biobank Department DAL (nummer 314 GGC) og etiske komitéer i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen.
BEMÆRK: Alle trin skal udføres under en laminar strømningshætte og under aseptiske forhold. Handsker og laboratoriefrakker til personlig beskyttelse bør altid bæres, og alle overflader skal vaskes med passende biocider. Overskydende væv skal bortskaffes korrekt som biomedicinsk affald.
1. Nødvendige materialer og forberedelse af dyrkningsopløsningerne
- Til celleisolering, ekspansion og kryopræservering opnås følgende instrumenter: steril saks; sterile skalpeller; steril pincet; en 10 cm petriskål; 15 ml rør; T25 kolber; et Burker-kammer; kryovialer; en cellefrysebeholder; et optisk mikroskop med 4x og 10x forstørrelsesmål og en svingende spandcentrifuge.
- Til immunofænotypning opnås følgende instrumenter og reagenser: FACS-rør, sterilt fosfatbufret saltvand (PBS); Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM); hPL; dimethylsulfid; og dyrefri trypsin.
- Forbered det komplette dyrkningsmedium ved at supplere DMEM med 5% heparinfri hPL. Opbevar mediet ved 4 °C i op til 3 uger, og brug det altid varmt (mellem stuetemperatur og 37 °C). I henhold til GMP-retningslinjerne for fremstilling af cellemedicin beregnet til human terapi må der ikke tilsættes antibiotika til dyrkningsmediet.
- Forbered frysemedium indeholdende 20% hPL og 10% dimethylsulfid i DMEM.
2. Isolering af hASC'er fra fedtvævsprøven
- Behandl fedtvævsprøven inden for 6 timer efter opnåelse af den. Før du fortsætter til den etablerede mekaniske xenogenfri isolationsmetode, vaskes vævet 2x med PBS i 10 minutter, indtil bindevæv og blod frigives.
- Opbevar den opnåede fedtvævsprøve fra abdominoplastikkirurgi i PBS ved 4 ° C indtil behandling og under alle omstændigheder ikke længere end 24 timer for ikke at skade hASC-levedygtigheden.
- Skær fedtvævet i mindre stykker på ca. 1 cm2 med steril saks.
- Med en skalpel mikrodissekeres hvert stykke i små fragmenter med diametre <5 mm, og fem af dem spredes i en 10 cm petriskål (figur 2A).
- For at fastgøre hvert fragment skal du bruge skalpellen til at skabe snit på plastoverfladen og trække hvert fragment, indtil det sidder fast på petriskålen. Brug pincet til at håndtere fragmentet (figur 2B).
- Tilsæt forsigtigt 10 ml komplet dyrkningsmedium for at dække alle fragmenterne uden at løsne dem.
- Petriskålene inkuberes ved 37 °C og 5% CO2. hASC'erne vil migrere ud af vævet og blive valgt på grund af deres plastiske vedhæftning uden enzymatisk fordøjelse.
- Indtil cellesammenløbet overvåges hASC-udvidelsen under et optisk mikroskop ved 4x forstørrelse en gang dagligt. Når hASC'erne begynder at komme ud af vævet, fremstår de som små klynger omkring vævsstykkerne med en typisk fibroblastlignende morfologi. hASC'erne vælges på grund af deres evne til at klæbe til plastoverfladen. Hver 72. time fjernes så meget medium som muligt, og erstattes med frisk komplet medium for at fjerne celleaffald.
- Lad vævsfragmenterne være på plads indtil den første passage af celler, hvilket normalt er efter 7 dage.
3. hASC-kultur efter isolationsfasen
- Når hASC-kulturen når 70% -80% sammenløb, er hASC'erne klar til at blive løsrevet og yderligere udvidet til enten at blive brugt til andre eksperimenter eller langtidsopbevaring.
- Med steril pincet fjernes og kasseres alle vævsstykker fra petriskålen. Fjern og kassér det udmattede medium, pas på ikke at røre ved hASC'erne for ikke at løsne dem.
- Vask forsigtigt cellerne en gang med 10 ml PBS. Tilsæt 1 ml 1x dyrefri trypsin, og lad petriskålen stå i inkubatoren ved 37 °C i 5 min.
- Kontroller under et optisk mikroskop ved 4x forstørrelse, om alle cellerne har løsnet sig; Ellers skal du lade petriskålen stå i yderligere 2 minutter i inkubatoren, og til sidst banke forsigtigt på plastoverfladen for at understøtte cellefrigørelse.
- Stop trypsinvirkningen ved at tilføje 2 ml komplet medium, og saml alle cellerne i et 15 ml rør.
- For at fjerne eventuelt resterende trypsin centrifugeres røret ved 300 x g i 5 minutter. Supernatanten kasseres, cellerne opslæmmes med 5 ml komplet substrat, og cellesuspensionen overføres til en ny T25-kolbe. Hold hASC'erne i kultur, og udvid dem, indtil det er nødvendigt.
4. Immunofænotypeundersøgelse ved flowcytometri
- Når hASC-kulturen når 70-80% sammenløb, afmonteres hASC'erne som tidligere beskrevet i afsnit 3.
- Efter opsamling af cellerne suspenderes de i 1 ml komplet medium, og en prøve tælles med celletælleren under et optisk mikroskop ved 10x forstørrelse.
- HASC'erne centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter, og de suspenderes ved 1 x 106 celler/ml FACS-buffer. 100 μL af suspensionen indeholdende 1 x 105 celler overføres til et FACS-glas. Der anvendes et FACS-rør for hvert undersøgt antigen plus endnu et for hver isotypisk kontrol.
- Plet cellerne med 100 μL af følgende antistoffer fortyndet i FACS-buffer: anti-CD73 (1: 1,000, IgG1, FITC-mærket), anti-CD105 (1:200, IgG1, PE-mærket); anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC-mærket); anti-CD45 (1:66, IgG1, FITC-mærket); og isotypiske kontroller for hver fluorofor, IgG1 FITC-mærket (1:1,000) og IgG1 PE-mærket (1:50).
- Prøverne inkuberes i 1 time i mørke under omrystning ved 4 °C. Centrifuger glassene ved 300 x g i 5 minutter, kassér supernatanten, og opslæmm cellerne i 500 μL FACS-buffer.
- Vurder celleimmunofænotypen med et flowcytometriinstrument, der registrerer 50.000 hændelser for hvert rør inde i porten, der er valgt for at udelukke celleaffald. Beregn procentdelen af ekspressive celler som forskellen fra den specifikke isotypiske kontrol.
5. Proliferationsanalyse af hASC
- Når hASC-kulturen når 70% -80% sammenløb, løsnes hASC'erne som beskrevet i afsnit 3.
- Efter opsamling af cellerne suspenderes de i 1 ml komplet medium, og en prøve tælles med celletælleren under et optisk mikroskop ved 10x forstørrelse.
- Der sås 5 x 102 hASC'er i 200 μL komplet substrat i gennemsigtige plader med 96 brønde. Frø cellerne i tekniske replikater, med en brønd for hvert tidspunkt.
- 3 dage efter såning skal du begynde at detektere celleproliferation ved hjælp af et proliferationsanalysesæt efter producentens anvisninger. Kort fortalt erstattes dyrkningsmediet med 100 μL frisk medium tilsat til 20 μL assayreagens pr. Brønd. hASC'erne inkuberes i 2,5 timer ved 37 °C, 5 % CO2 for reagensudvikling, og absorbansen detekteres derefter ved 490 nm med et spektrofotometer.
- HASC-proliferation udtrykkes som absorbansprocenten efter fjernelse af blindabsorbansen.
6. Kryopræservering og opbevaring af hASC'erne
- Cellerne afmonteres som beskrevet i punkt 3, og en prøve tælles med celletælleren under et optisk mikroskop ved 10x forstørrelse.
- Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 5 min., og supernatanten kasseres. Cellerne suspenderes med fryseblanding med en densitet på 1 x 106 hASC'er/ml, og 1 ml af celleopløsningen overføres til én kryovial.
- Sæt kryoialerne ved -80 °C i en frysebeholder, der sænker temperaturen med 1 °C/min, og flyt derefter kryoialerne til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved anvendelse af isolationsmetoden beskrevet ovenfor blev hASC'er med succes opnået fra abdominale fedtvævsprøver uden brug af collagenase. Desuden blev hASC'erne udvidet under fuldstændig xenogenfrie forhold under tilstedeværelse af hPL og uden andre komponenter af animalsk oprindelse. Følgende resultater understøtter protokollen og opnås fra hASC'er dyrket parallelt med hPL og med FBS som kontrolbetingelse.
Efter det første klyngeudseende viste hASC'erne den klassiske spindellignende form og var mindre og mere aflange sammenlignet med kontrolcellerne i nærvær af FBS (figur 3). Celleimmunofænotypen evalueret ved flowcytometri syntes at være ens mellem hASC'erne dyrket med de to kosttilskud. Især var mere end 80%-90% af hASC'erne positive for CD73 17 og CD105 17, og mindre end 5% udtrykte CD34 17 og CD45 17 (figur 4). Endelig afslørede proliferationsanalysen en signifikant stigning i cellevækst, når hPL blev tilføjet til mediet sammenlignet med FBS-kontrollen (figur 5).
Figur 1: Grafisk abstrakt af protokollen. Xenogenfri metode til isolering og in vitro-ekspansion af humane fedtafledte stamceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fedtvævsskæring og såningsproces for at opnå hASC'er i in vitro-kultur . A) Mikrodissektion af fedtvævet i fragmenter med diametre <5 mm og spredning af fragmenterne i en 10 cm petriskål. (B) Fastgørelse til petriskålen efter oprettelse af snit på plastoverfladen med en skalpel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Morfologi af hASC'erne. De hASC'er, der blev dyrket i den xenogenfrie tilstand, viste en spindellignende form og langstrakt morfologi. De hASC'er, der blev dyrket i nærværelse af FBS som kontrol, var større og havde en bullseye-form. Skalabjælken repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Immunofænotype af hASC'erne. Immunofænotypen af hASC'erne var ens i nærvær af hPL og FBS. Navnlig kunne hASC'erne under begge betingelser betragtes som positive for CD73 og CD105 og negative for CD34 og CD45. Fejlbjælkerne angiver standardfejlen (n = 3). Forkortelser: hPL = humant blodpladelysat; FBS = føtalt kvægserum. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: hASC-spredning. hASC'erne ekspanderet under xenogenfrie forhold spredte sig betydeligt mere end dem i nærvær af FBS. ** p < 0,01 (signifikans evalueret med en studerendes t-test, n = 3). X-aksen repræsenterer tiden med hensyn til antallet af dage efter såning. Forkortelser: hPL = humant blodpladelysat; FBS = føtalt kvægserum; hASC'er = humane fedtafledte stamceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fedtafledte stamceller har tiltrukket sig interesse for translationel forskning i det sidste årti på grund af deres overflod, hurtige og overkommelige isolationsmetoder, høj in vitro / in vivo spredningshastighed og stamme / differentieringsegenskaber18,19,20. Som følge heraf betragtes hASC'er som en fremragende kandidat til cellebaserede strategier inden for regenerativ medicin21. Efter isolering fra fedtvæv kræver hASC'er ekspansion in vitro og bør i nogle tilfælde underkastes et differentieringstrin, før de anvendes til en specifik terapeutisk anvendelse. Hele processen, herunder isolering, in vitro-ekspansion og eventuel differentiering, skal udføres i overensstemmelse med GMP-retningslinjer for at reducere eventuelle risici fra et oversættelsesperspektiv22,23.
Med hensyn til isolationsprocessen, mens de enzymatiske fordøjelses- og centrifugeringstrin hurtigt giver et stort antal hASC'er på relativt kort tid, har tidligere rapporter vist, at disse metoder forårsager mulige cellefænotypiske ændringer med hensyn til klyngedifferentieringsmarkører sammenlignet med andre mekaniske isolationsmetoder, hvilket rejser spørgsmål om biosikkerhed, celleegenskaber og adfærdsmæssige problemer ved anvendelse af disse hASC'er med humane patienter3 . For at minimere risiciene i forbindelse med xenogene komponenter har nylige undersøgelser desuden foreslået anvendelse af syntetiske enzymer eller mekaniske metoder til isolering af hASC'er. Selv syntetiske enzymer kan dog muligvis ændre celleprofilen og påvirke produktkvaliteten24. Tværtimod kan den eksplantbaserede metode, der undersøges her, være et gyldigt alternativ til translationelle formål, da hASC'erne migrerer ud af vævet og klæber naturligt til plastoverfladerne uden brug af xenogene reagenser9. Samtidig må det overvejes, at denne metode viste lavere celleudbytte sammenlignet med den klassiske kollagenaseisolering25.
Med hensyn til tilskudsmediet, baseret på nyere litteratur, som er enig i, at hPL understøtter hASC-ekspansion i højere grad end FBS uden at ændre hASC's fysiologiske egenskaber 26,27,28,29, erstattede vi det traditionelle FBS-tilføjede medium med hPL 16. Ved at understøtte cellekulturen med hPL overvandt vi de reducerede celleudbytter og den langsommere genopretning relateret til mekanisk isolering. Disse mindre manipulerede hASC'er spredte sig in vitro med en hastighed, der tillod den ekspansion, der kræves for at nå klinisk relevante volumener på en effektiv og sikker måde30,31. Desuden ændrede kulturen med hPL ikke de stammelignende træk og immunofænotype, der er typiske for hASC'er, hvilket betyder, at disse cellers terapeutiske interesse blev opretholdt.
Så vidt vi ved, mens en række explant-isolationsprotokoller er blevet beskrevet for ASC'er, er vores metode den første, der kombinerer xenogenfri mekanisk isolering af ASC'er med hPL-suppleret mediumkultur for at opnå en værdifuld cellepopulation til translationelle applikationer.
Derudover har metoden beskrevet i dette arbejde nogle kritiske aspekter, der skal beskrives yderligere. For det første bør diametrene af de hakkede fedtvævsfragmenter ikke overstige 5 mm for at lette deres vedhæftning til plastoverfladen og tillade migration af hASC'erne ud af vævet. For det andet bør tilstedeværelsen af fedtvævsfragmenter i kultur sammen med de hASC'er, der allerede er fastgjort til pladen, afbalanceres under hensyntagen til kontamineringsrisikoen og behovet for et tilstrækkeligt antal migrerede celler. For det tredje skal forskere være opmærksomme på en mulig reduceret væksthastighed i de første 24 timer efter explant-såningen; efter denne periode stimulerer hPL-tilskuddet cellegendannelse og spredning sammenlignet med den klassiske FBS30.
I øjeblikket er der ikke indført yderligere trin eller ændringer i forhold til den oprindelige protokol, der er beskrevet ovenfor.
Afslutningsvis giver den komplette xenogenfrie metode, der er beskrevet her, en enkel måde at isolere hASC'er fra fedtvæv, herunder både lipoaspirater og abdominal fedtvæv, i fravær af animalske afledte produkter, kemiske enzymer eller centrifugeringstrin. Desuden opvejer det hPL-supplerede medium det resulterende indledende celle lavere udbytte og forbedrer celleproliferation samtidig med, at de terapeutiske egenskaber af hASC'er forbliver uændrede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
