Summary
Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.
Abstract
Mycoheterotrofe planten vertonen een van de meest extreme vormen van mycorrhiza-afhankelijkheid, omdat ze hun autotrofe capaciteit volledig hebben verloren. Net zo essentieel als elke andere vitale hulpbron, zijn de schimmels waarmee deze planten nauw associëren essentieel voor hen. Daarom zijn enkele van de meest relevante technieken bij het bestuderen van mycoheterotrofe soorten degene die het onderzoek van geassocieerde schimmels mogelijk maken, met name die welke wortels en ondergrondse organen bewonen. In deze context worden vaak technieken toegepast voor het identificeren van cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke endofytische schimmels. Het isoleren van schimmelendofyten biedt een middel om ze morfologisch te identificeren, hun diversiteit te analyseren en inocula te behouden voor toepassingen in de symbiotische ontkieming van orchideeënzaden. Het is echter bekend dat er een grote verscheidenheid aan niet-kweekbare schimmels is die plantenweefsels bewonen. Cultuuronafhankelijke moleculaire identificatietechnieken bieden dus een bredere dekking van soortendiversiteit en -overvloed. Dit artikel beoogt de methodologische ondersteuning te bieden die nodig is voor het opstarten van twee onderzoeksprocedures: een cultuurafhankelijke en een onafhankelijke. Met betrekking tot het cultuurafhankelijke protocol worden de processen voor het verzamelen en bewaren van plantenmonsters van verzamelplaatsen naar laboratoriumfaciliteiten gedetailleerd, samen met het isoleren van draadvormige schimmels uit ondergrondse en luchtorganen van mycoheterotrofe planten, het bijhouden van een verzameling isolaten, het morfologisch karakteriseren van hyfen door middel van een objectglaasjescultuurmethodologie en moleculaire identificatie van schimmels door totale DNA-extractie. De gedetailleerde procedures omvatten cultuuronafhankelijke methodologieën en omvatten het verzamelen van plantenmonsters voor metagenomische analyses en totale DNA-extractie uit achlorofylachtige plantenorganen met behulp van een commerciële kit. Ten slotte worden ook continuïteitsprotocollen (bijv. polymerasekettingreactie [PCR], sequencing) voorgesteld voor analyses, en technieken worden hier gepresenteerd.
Introduction
Endofytische schimmels zijn per definitie schimmels die het inwendige van plantenorganen en -weefsels bewonen bij onopvallende infecties (d.w.z. zonder schade toe te brengen aan hun gastheer)1,2. Deze schimmels kunnen neutraal of gunstig interageren met waardplanten, kunnen resistentie verlenen tegen ziekteverwekkers en ongunstige omgevingsomstandigheden, en kunnen bijdragen aan de synthese van nuttige verbindingen voor de plant (bijv. groeifactoren en andere fytohormonen)1,3. Mycorrhiza-endofyten zijn schimmels die mycorrhiza-associaties met de plant tot stand brengen en deelnemen aan de overdracht van voedingsstoffen4. In Orchidaceae is de interactie met mycorrhiza-endofyten van fundamenteel belang voor het ontkiemen van zaden in de overgrote meerderheid van de soorten, en voor de vestiging van zaailingen in alle planten in defamilie5. In dergelijke contexten vertegenwoordigen mycoheterotrofe orchideeën een geval van totale afhankelijkheid van hun mycorrhiza-partners, aangezien ze gedurende hun hele levenscyclus afhankelijk zijn van de overdracht van minerale voedingsstoffen en koolstofverbindingen door deze schimmels6. Daarom is de isolatie en identificatie van associërende schimmels een fundamentele basis bij het onderzoeken van mycoheterotrofe levensstrategieën. Bovendien is er weinig bekend over de rol van schimmelendofyten in mycoheterotrofe planten of zelfs de werkelijke diversiteit van deze schimmels 7,8.
Het onderzoek naar endofytische schimmels kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende technieken, die traditioneel als cultuuronafhankelijk of -afhankelijk worden omschreven, bijvoorbeeld: (a) directe observatie, (b) schimmelisolatie en morfologische en/of moleculaire identificatie, en (c) totale DNA-extractie van plantenweefsels en moleculaire identificatie9. In directe observatie (a) kunnen endofytische schimmels worden onderzocht terwijl ze zich nog in het inwendige van plantencellen en weefsels bevinden door middel van licht- of elektronenmicroscopie9, aangezien verschillende microscopieprotocollen worden beschreven door Pena-Passos et al.10. Door isolatiemethoden (b) kunnen endofyten van schimmels worden gekarakteriseerd op basis van hun kolonies, hyfen en morfologie van de voortplantings- of resistentiestructuur. Ook is het via isolatietechnieken mogelijk om de moleculaire identificatie van isolaten uit te voeren door middel van DNA-extractie, amplificatie van moleculaire identificatiesequenties (barcodes of vingerafdrukken) en sequencing11. Deze laatste techniek (c) maakt de moleculaire identificatie van endofytische schimmels mogelijk door middel van DNA-extractie in het inwendige van plantenweefsels (metabarcoding), gevolgd door bibliotheekvoorbereiding en sequencing12.
Bovendien kunnen schimmelisolaten worden toegepast in symbiotische kiemproeven, met behulp van zaden van autotrofe of mycoheterotrofe orchideeën. Een voorbeeld van een dergelijke toepassing is het onderzoek van Sisti et al.13, waarin de kieming en de beginstadia van de ontwikkeling van protocormen worden beschreven in Pogoniopsis schenckii, een mycoheterotrofe orchidee, in combinatie met enkele van zijn isolaten, bestaande uit niet-mycorrhiza-endofytische schimmels. Het toegepaste symbiotische kiemprotocol wordt gedetailleerd beschreven en gepresenteerd in een video van Pena-Passos et al.10. Het isoleren van schimmels in associatie met verschillende plantenorganen maakt divers onderzoek mogelijk met betrekking tot de aard van plant-schimmelinteracties (bijv. om ecologische of fysiologische aspecten van de associatie te begrijpen, evenals onderzoek naar de overdracht van voedingsstoffen van schimmels naar de plant)9.
De methodologieën die in sectie 1 worden gepresenteerd, zijn gebaseerd op een verzameling van ondergrondse orgaanmonsters, aangezien deze organen de meeste moeilijkheden opleveren bij het verzamelen, en ze zijn van groot belang omdat mycorrhiza-endofyten ze koloniseren. Beide opgenomen protocollen (stappen 1.1 en 1.2) kunnen echter worden toegepast op andere mycoheterotrofe plantenorganen (bijv. wortelstokken, bloemstengels en vruchten). De in stap 1.1 beschreven verzamelmethode is bedoeld voor het isoleren van endofytische schimmels (sectie 2), voor morfologische karakterisering (secties 4 en 5) en/of totale DNA-extractie voor isolaatidentificatie (sectie 6). Aan de andere kant wordt de in stap 1.2 beschreven verzamelmethode uitsluitend gebruikt voor de totale DNA-extractie van plantenweefsels voor metabarcodingtechnieken (punt 7). In hoofdstuk 3 worden vier methoden voor de opslag en conservering van draadvormige schimmels gepresenteerd, twee voor opslag op korte termijn (3-6 maanden) en de andere twee geschikt voor opslag op lange termijn (>1 jaar). De morfologische karakterisering (secties 4 en 5) kan in verband worden gebracht met moleculaire identificatie om deze te versterken en belangrijke informatie te verschaffen over de macro- en micromorfologie van schimmels. Figuur 1 geeft een overzicht van de collectieve methodologieën die daarna worden beschreven.
Figuur 1: Schematische samenvatting van de gepresenteerde methoden. Plantenverzameling en schimmelisolatie, conservering en moleculaire identificatie door middel van cultuurafhankelijke en -onafhankelijke methodologieën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Verzameling van plantenmonsters
- Monstername voor cultuurafhankelijke methoden
- Graaf voorzichtig de ondergrondse organen; Dit kunnen wortels, stengels, wortelstokken of opslagorganen van de te verzamelen plant zijn. Afgezien van zeer compacte bodems, verzamelt u deze monsters met de hand.
OPMERKING: Het gebruik van hulpmiddelen zoals troffels of schepjes in deze stap is niet aan te raden, omdat dit de fragiele structuren van mycoheterotrofe planten kan beschadigen en weefselbesmetting door niet-endofytische schimmels kan veroorzaken. - Verzamel zoveel mogelijk ondergrondse organen. Bewaar de monsters in papieren zakken in een gekoelde container (bijv. polystyreenschuimdoos of thermische zak met ijs). Als er ook luchtorganen worden verzameld, vervoer ze dan apart van de ondergrondse.
- Graaf voorzichtig de ondergrondse organen; Dit kunnen wortels, stengels, wortelstokken of opslagorganen van de te verzamelen plant zijn. Afgezien van zeer compacte bodems, verzamelt u deze monsters met de hand.
- Monsterverzameling voor cultuuronafhankelijke methoden
- Graaf zorgvuldig de wortels van de te verzamelen plant volgens dezelfde aanbevelingen die zijn aangegeven in de OPMERKING van stap 1.1.1.
- Verzamel zoveel mogelijk ondergrondse organen. Bewaar de verzamelde monsters in cryobuizen in vloeibare stikstof (wenselijke optie) of gebruik centrifugebuisjes omgeven door droogijs (alternatieve optie). Onderhoud luchtorganen afzonderlijk, indien verzameld.
2. Isolatie van endofytische schimmels geassocieerd met plantenorganen14
NOTITIE: Elk materiaal, elke oplossing en elk reagens dat in deze sectie wordt gebruikt, moet steriel zijn. Degenen die niet al gesteriliseerd kunnen worden gekocht, moeten gedurende 20 minuten bij 121 °C worden geautoclaveerd.
- Oppervlakkige ontsmetting van plantenorganen
- Was de verzamelde monsters (stap 1.1.2) onder stromend water en verwijder zoveel mogelijk substraat en ander vuil dat de monsters kunnen bevatten.
- Houd de gewassen monsters in een laminaire stroomkap gedurende 1 minuut ondergedompeld in 70% ethanol (een bekerglas of een glazen pot kan worden gebruikt).
- Breng de monsters over naar een andere container met natriumhypochloriet met 2% actief chloor gedurende 3 minuten.
- Vervang de monsters in een container met 70% ethanol en laat ze 1 minuut ondergedompeld blijven. Was daarna de monsters achtereenvolgens in twee containers met gedestilleerd water.
- Installatie van plantenfragmenten in kweekmedium
NOTITIE: Elke stap die in stap 2.2 wordt beschreven, moet worden uitgevoerd in een lamellenvormige stroomkap.- Bereid voor de installatie petrischalen (8-10 cm in diameter) met 19,5 g/L aardappeldextrose-agar kweekmedium (PDA) + 7 g/L bacteriologische agar + 3 ml/L antibiotica (bijv. streptomycine, penicilline, tetracycline, ampicilline).
- Houd de petrischaaltjes met het kweekmedium 24 uur op 36 °C voordat u ze gebruikt om er zeker van te zijn dat er geen verontreiniging is. Gooi gerechten weg die besmet zijn met bacterie- of schimmelkolonies.
OPMERKING: De toevoeging van antibiotica in het medium is essentieel in deze stap, omdat de organen sterk geïnfecteerd zijn door bacteriën die de schimmelgroei kunnen remmen. Controleer of de antibiotica tijdens het autoclaveren mogen worden verwarmd; sommige antibiotica moeten worden toegevoegd na afkoeling van het medium tot ongeveer 36 °C (voordat het in de schalen wordt geplaatst). - Inoculeer onmiddellijk na de oppervlakkige ontsmetting van de monsters en nog steeds in een laminaire stroomkap, in PDA, enkele druppels van het gedestilleerde water uit de laatste container die is gebruikt om de monsters te wassen. Deze stap is belangrijk om de werkzaamheid van oppervlakkige ontsmetting van monsters te evalueren.
- Plaats de monsters in een lege geautoclaveerde schaal en gebruik een gevlamde scalpel en een pincet om de monsters in stukken te snijden tot een dikte van ongeveer 0,2 cm.
- Doorsnede cilindrische monsters in de lengterichting in twee helften, indien gewenst, om het oppervlak dat in contact komt met het medium te versterken. Om fruit en andere meer bolvormige organen beter bloot te leggen, hakt u de structuren in stukken of snijdt u ze grondig. De zaden kunnen ook belangrijke schimmelbronnen zijn, dus zorg ervoor dat de in stukken gesneden vrucht ze blootstelt aan het medium.
OPMERKING: Alleen gezonde organen, zonder weefselbeschadiging of signalen van mogelijke ziekten of pathogene infecties, mogen worden gebruikt bij het isoleren van endofyten van schimmels. - Verdeel vijf fragmenten van de ondergrondse organen in de petrischaaltjes met PDA + antibioticum. Zorg ervoor dat de fragmenten zo ver mogelijk van elkaar verwijderd zijn en ook de randen van de schaal niet raken. Plaats geen fragmenten op het medium. Bereid replica's voor van elk geïnstalleerd orgaan, uit voorzorg in geval van besmetting.
- Sluit de petrischaaltjes af met vershoudfolie en bewaar ze 5 dagen in het donker bij 25-27 °C (bij voorkeur in een broedmachine).
- Isolatiefrequentie (IF) calculus11
- Bereken na 5 dagen incubatie van orgaanfragmenten de IF op basis van het aantal geïncubeerde fragmenten dat schimmelkolonies vertoont die groeien gedeeld door het totaal van geïncubeerde fragmenten, zoals weergegeven in de volgende vergelijking:
- Bereken na 5 dagen incubatie van orgaanfragmenten de IF op basis van het aantal geïncubeerde fragmenten dat schimmelkolonies vertoont die groeien gedeeld door het totaal van geïncubeerde fragmenten, zoals weergegeven in de volgende vergelijking:
- Zuivering van schimmelisolaten door strepen en subculturing
NOTITIE: Elke stap die in stap 2.4 wordt beschreven, moet worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap.- Bereid petrischaaltjes (diameter 5 cm) met 5-7 g/l agar-agar (AA; alleen bacteriologische agar). Houd de vaat 24 uur op 36 °C om mogelijk besmette gerechten te verwijderen.
- Identificeer elke gekweekte schimmelkolonie met een code en bain de marges af aan de onderkant van de schaal (kan met een permanente marker). Onderscheid de kolonies op kleur, groeipatroon, textuur en margeformaat.
- Met een geautoclaveerde houten tandenstoker recupereert u met behulp van de fijne punt een kleine hoeveelheid mycelium uit een schimmelkolonie. Concentreer u bij voorkeur op de randen van de kolonie en kies een gebied dat zo ver mogelijk van een andere kolonie verwijderd is, zodat u niet meer dan één type kolonie tegelijk kunt recupereren.
- Gebruik dezelfde tandenstoker met mycelium aan de punt om de AA te strepen en drie striae (groeven) te produceren. Zorg ervoor dat elke stria zich op een afstand van 1 cm van een andere en de randen van de schaal bevindt. Schrijf de juiste code (met stickerpapier en potlood), sluit de schalen af en bewaar ze gedurende 3 dagen in het donker bij 25-27 °C.
- Bereid petrischaaltjes (diameter 8 cm) met 39 g/l PDA. Het is in dit stadium niet nodig om antibiotica toe te voegen.
- Nadat u de AA-schalen hebt geïncubeerd, observeert u ze nauwgezet tegen het licht (van een lamp of een raam), met als doel fijne hyfen te identificeren die individuele kolonies vormen. Baken de oppervlakte van een individuele kolonie per schaal af met behulp van een permanente marker aan de onderkant van de petrischaal.
- Gebruik in een laminaire stroomkap een geautoclaveerde tandenstoker om een deel van het medium met de kolonie te snijden en breng het gesneden volume over naar het midden van een nieuwe PDA-schaal.
- Identificeer de petrischaaltjes met de codes van de isolaten, sluit de schaaltjes af met huishoudfolie en bewaar ze 7-14 dagen in het donker bij 25-27 °C.
3. Conservering van gezuiverde schimmelisolaten
NOTITIE: Elk materiaal, elke oplossing en elk reagens dat in deze sectie wordt gebruikt, moet steriel zijn. Degenen die niet al gesteriliseerd kunnen worden gekocht, moeten gedurende 20 minuten bij 121 °C worden geautoclaveerd.
- Conservering met Castellani's methode of in minerale olie (3-6 maanden)11,15
- Bereid 2 ml microcentrifugebuisjes voor met 0,5 ml gedestilleerd water of met 0,5 ml minerale olie (afhankelijk van de gekozen methode). Zorg ervoor dat de buizen leeg zijn geautoclaveerd en dat het geautoclaveerde water en de olie worden toegevoegd aan de buizen in een laminaire stroomkap.
- Plaats de petrischalen met gezuiverde isolaten die al in PDA (39 g/L) zijn gekweekt gedurende 7-14 dagen in een laminaire stroomkap. Snijd met een geautoclaveerde tandenstoker kleine kubussen (0,5 cm x 0,5 cm in het bovenste gedeelte) van medium met de myceliumranden.
- Plaats vier tot zes kubussen in de microcentrifugebuisjes met gedestilleerd water (Castellani's methode) of minerale olie. Bewaar de buizen zo lang als nodig is in het donker, bij 25 °C, met inachtneming van de tijdsbeperkingen van de methode.
OPMERKING: Voeg niet te veel blokjes toe aan de buizen en maak ze vol, omdat dit de kans op besmetting kan vergroten. Het is mogelijk om de buizen gekoeld te bewaren, wat de bewaring van sommige isolaten langer kan bevorderen. Currah et al.16 raden aan om replicaten van mycorrhiza-schimmelisolaten van tropische orchideeën zowel gekoeld als bij 25 °C te bewaren, omdat ze verloren kunnen gaan in koude opslag. - Recupereer een kubus en plaats deze in het midden van een nieuwe PDA-schaal om een opgeslagen isolaat te laten groeien.
- Cryopreservatie in ongepelde rijstkorrels (>1 jaar)17
- Was ongepelde rijstkorrels in stromend water en kook ze tot de rijstschil begint te openen. Verdeel de gekookte korrels in glazen reageerbuizen met een schroefdop en autoclaaf twee keer met een tussenpoos van 24 uur.
- Plaats de petrischalen met gezuiverde isolaten die al in PDA (39 g/L) zijn gekweekt gedurende 7-14 dagen in een laminaire stroomkap. Recupereer met een geautoclaveerde tandenstoker vijf kleine hyfenfragmenten uit de myceliumranden en inoculeer ze in de buis met geautoclaveerde rijstkorrels.
OPMERKING: Het inoculeren van hyfen op verschillende punten en dieptes van de buis garandeert dat het isolaat de ongepelde rijstkorrels in minder tijd koloniseert. - Incubeer de buisjes gedurende 14 dagen in het donker bij 25-27 °C. Roer de buizen door ze elke 3 dagen te vortexen om de korrels geïndividualiseerd te houden.
- Nadat je schimmelgroei in de rijstkorrels hebt waargenomen, verdeel je de korrels in een geautoclaveerde petrischaal bekleed met filtreerpapier om vocht te absorberen, over het papier zodat de korrels kunnen drogen. Bewaren in het donker bij 25-27 °C gedurende 2-3 dagen.
- Bereid cryobuisjes voor met 1/3 silicagel aan de onderkant en 1/3 glaswol boven de silica. Verdeel ten slotte 1/3 van de rijstkorrels met gekweekt schimmelmycelium. Bewaren bij -20 °C gedurende 24 uur.
- Bewaar de cryobuisjes na 24 uur zo lang als nodig is bij -80 °C, rekening houdend met de tijdsbeperkingen van de methode.
- Cryopreservatie in vermiculiet met behulp van een cryoprotectant (>1 jaar)18
- Bereid een vloeibaar kweekmedium bestaande uit 0,2% gistextract en 2% glucose in gedestilleerd water. Stel de pH in op 5 en autoclaaf deze.
- Verdeel 0,2 g vermiculiet (gebruik fijne granulometrie) in cryobuisjes met een schroefdop en autoclaaf ze. Voeg 0,8 ml geautoclaveerd vloeibaar medium toe aan de cryobuisjes met vermiculiet.
- Plaats de petrischalen met gezuiverde isolaten die al in PDA (39 g/L) zijn gekweekt gedurende 7-14 dagen in een laminaire stroomkap. Recupereer met een geautoclaveerde tandenstoker drie tot vijf hyfenfragmenten van de myceliumranden en inoculeer langs de buis met vermiculiet + vloeibaar kweekmedium. Vergeet niet om de cryobuisjes te identificeren met de respectievelijke isolaatcode.
OPMERKING: Het inoculeren van hyfen op verschillende punten en diepten van de cryobuis garandeert dat het isolaat het vermiculiet in minder tijd koloniseert. - Bewaar de cryobuizen in het donker bij 25-27 °C totdat kolonisatie van de meeste vermiculietkorrels kan worden waargenomen, wat meestal ongeveer 14 dagen duurt.
- Bereid een cryoprotectieve oplossing bestaande uit 5% glycerol en 5% trehalose in gedestilleerd water en autoclaaf deze. Laat de oplossing afkoelen voordat u deze gebruikt.
- Nadat het vermiculiet in cryobuizen is gekoloniseerd door het respectieve schimmelisolaat, verdeel je 0,4 ml cryoprotectant in elke buis en bewaar je de cryobuizen gedurende 48 uur gekoeld bij 4 °C. Houd de cryobuizen daarna zo lang als nodig op -80 °C en houd daarbij rekening met de tijdsbeperkingen van de methode.
4. Macromorfologische karakterisering van draadvormige schimmels (koloniemorfologie)
- Houd gedurende 7-14 dagen een fotografisch register bij van het mycelium dat in elke petrischaal wordt gekweekt met 39 g/l PDA. Vergeet niet om beide zijden van de kolonie te registreren, boven- en onderkant (achterkant). Als de schalen gemakkelijk worden gebruikt in sectie 6 of niet worden onderhouden, open dan de schalen wanneer u ze fotografeert om betere foto's te krijgen.
- Als u geïnteresseerd bent in kwantitatieve gegevens over de morfologie van kolonies, repliceert de subcultuur de isolaten en houdt ze in dezelfde groeiomstandigheden en gedurende een constante periode om de koloniediameter te registreren en de groeisnelheid te berekenen (meestal in mm/u).
OPMERKING: Meer geavanceerde kwantitatieve resultaten kunnen worden bereikt door verschillende soorten kweekmedia te gebruiken voor vergelijking19 en door rekening te houden met de statistische instrumenten om gegevens te behandelen. - Observeer de kolonies ook onder een stereomicroscoop om morfologische kenmerken te identificeren en in vergroting te fotograferen. Evalueer de kolonies op basis van hun macromorfologische kenmerken, zoals beschreven in de resultatensectie. Raadpleeg diverse bibliografische bronnen om de macromorfologie te categoriseren en te relateren aan moleculaire en/of morfologische identificatie.
5. Micromorfologische karakterisering van draadvormige schimmels (hyfale morfologie)
OPMERKING: De micromorfologische technieken worden vergeleken in de discussiesectie, rekening houdend met hun mogelijke toepassingen en nadelen.
- Kweek de isolaten op petrischaaltjes met 39 g/L PDA gedurende 7-14 dagen. Voor het evalueren van vermeende mycorrhiza-schimmels van orchideeën, kweekt u de isolaten op 17 g/L maïsmeelagar (CMA; of een ander voedingsbeperkend medium) gedurende 3-7 dagen19.
- Plaag monteren
- Werk in een laminaire stromingskap. Plaats een druppel van een gekozen vlek (stap 5.5) op een schoon glasplaatje.
- Gebruik een geautoclaveerde tandenstoker of een ander steriel materiaal om voorzichtig enkele hyfen uit het gegroeide isolaat te verwijderen en in de druppel vlek te plaatsen. Plaats een dekglaasje (bij voorkeur in een beginhoek van 45° om luchtbellen te voorkomen) en analyseer onder een lichtmicroscoop.
- Plakband bevestiging
OPMERKING: Deze techniek wordt meestal toegepast in schimmelculturen die gemakkelijk kunnen worden gebruikt in sectie 6 of niet worden onderhouden, aangezien het plakband niet kan worden geautoclaveerd en er verontreinigingen kunnen optreden na het uitvoeren van de methode.- Plaats een druppel van een gekozen vlek (stap 5.5) op een schoon glasplaatje. Knip een strook transparant plakband in een maat die goed past bij het glasplaatje en de centrale vlekdruppel.
- Richt het kleverige oppervlak van de strip op het myceliumoppervlak. Druk niet en probeer wat hyfen te verzamelen zonder er te veel van te plakken.
- Plak de tape op het glasplaatje en zorg ervoor dat de vlek in contact komt met de verzamelde hyfen. Plaats een druppel water boven de tape en plaats een dekglaasje. Analyseer het objectglaasje onder een lichtmicroscoop.
- Diacultuur van draadvormige schimmels20
- Plaats in een grote petrischaal (bij voorkeur >9 cm in diameter): filtreerpapier aan de onderkant, een U-vormige glasstaaf of een aanpassing (het doel is om een verhoging voor het glasglaasje te maken), een glasplaatje en twee dekglaasjes. Hogere petrischalen vergemakkelijken de manipulatie. Autoclaaf deze kits van petrischaaltjes, één voor elk isolaat.
- Bereid een klein volume van 39 g/L PDA of 17 g/L CMA, voeg 10 g/L bacteriologische agar en autoclaaf toe (het volume voor één petrischaal is voldoende voor meer dan 30 isolaten). De cultuurmedia die in de diacultuur worden gebruikt, moeten harder zijn dan de gebruikelijke media. Autoclaaf 100 ml gedestilleerd water.
- Werk in een laminaire stromingskap. Plaats het vloeibare medium in een petrischaal, zodat er een laag van ongeveer 0,5 cm hoog ontstaat. Laat het medium stollen. Eenmaal stevig, gebruik je een steriele scalpel om vierkanten van het medium te snijden die 1 cm x 1 cm groot zijn.
- Open de petrischaalset in een laminaire stroomkap en gebruik een gevlamde pincet om het materiaal dat in de schaal is geautoclaveerd te ordenen. Schik het materiaal in de genummerde volgorde, zoals te zien is in figuur 2A, en plaats een vierkant kweekmedium op het objectglaasje. Voordat u het dekglaasje over het medium plaatst, gaat u verder met stap 5.4.5.
- Gebruik een geautoclaveerde tandenstoker om enkele hyfen uit een isolaat te recupereren en wrijf voorzichtig over de vier zijvlakken van het medium dat op het glasplaatje is geplaatst. Plaats een geautoclaveerd dekglaasje over het middelgrote vierkant met behulp van een gevlamde pincet.
- Gebruik een steriele pipetpunt om geautoclaveerd water in het filtreerpapier te plaatsen, om een vochtige kamer te creëren. Gebruik een volume om het papier te verzadigen zonder er te veel water in te doen. Sluit de petrischaal af met huishoudfolie en identificeer deze met de betreffende isolaatcode. Bewaar de vaat 3-7 dagen in het donker op 25-27 °C.
- Evalueer de groei van hyfen in het glasplaatje en het dekglaasje. Van elke objectglaasjeskweekset worden twee objectglaasjes gemaakt, één met behulp van het glasglaasje met hyfen en het geautoclaveerde dekglaasje, het tweede met het dekglaasje met hyfen en nog een glasplaatje.
- Nadat de groei van de hyfen is waargenomen, maakt u het vierkant van het medium voorzichtig los van het glasplaatje (Figuur 2B), monteert u de twee objectglaasjes met behulp van een gekozen vlek (stap 5.5) en analyseert u ze onder een lichtmicroscoop. Vergeet niet om de isolaatcode op de dia te identificeren. Om semi-permanente glaasjes te maken, verzegelt u het dekglaasje met doorzichtige nagellak.
- Om permanente objectglaasjes te maken, wast u de kleurstof van aangehechte hyfen na het kleuren zorgvuldig en laat u het glaasje drogen. Monteer met een snel montagemedium (lees voor details Pena-Passos et al.10).
OPMERKING: Het nadeel van het produceren van een permanent objectglaasje met deze techniek is dat sporen en structuren die niet aan het glas zijn gehecht, kunnen worden gewassen.
- Kleuringsmethoden en waarneming van hyfen
- Lactofenol katoen blauw (LPCB)21: Voeg 20 ml melkzuur, 40 ml glycerol en 20 ml gedestilleerd water toe. Los 20 g fenolkristallen op in deze oplossing door ze zachtjes te verwarmen. Los 0,05 g methylblauw (katoenblauw of 2 ml 1% waterige oplossing) op. LPCB kan ook gemakkelijk worden gekocht, al voorbereid.
LET OP: Fenol is zeer giftig en vluchtig; Manipuleer het uitsluitend in een zuurkast en draag handschoenen. - Toluïdineblauw O10(TBO): Bereid 0,05% TBO in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 6,8).
- Congorood22,23,24: Bereid een oplossing van 1% Congorood in gedestilleerd water en filtreer deze. Incubeer gedurende 5-10 min. Deze kleurstof kan ook worden toegepast voor fluorescentiemicroscopie25.
- Raadpleeg bij het observeren en fotograferen van schimmeldraden onder een lichtmicroscoop diverse bibliografische bronnen om structuren te helpen identificeren (zie de discussie).
- Lactofenol katoen blauw (LPCB)21: Voeg 20 ml melkzuur, 40 ml glycerol en 20 ml gedestilleerd water toe. Los 20 g fenolkristallen op in deze oplossing door ze zachtjes te verwarmen. Los 0,05 g methylblauw (katoenblauw of 2 ml 1% waterige oplossing) op. LPCB kan ook gemakkelijk worden gekocht, al voorbereid.
Figuur 2: Procedures voor het kweken van draadvormige schimmels . (A) Schematische configuratie van een objectglaasjeskweekset, waarbij de nummers de volgorde van rangschikking van de elementen aangeven. (B) Het losmaken van het vierkant van het kweekmedium nadat de groei van de hyfen is waargenomen in het glasplaatje en het dekglaasje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Totale DNA-extractie uit schimmelisolaten (zelfgemaakt protocol26 met wijzigingen 27)
NOTITIE: Elk materiaal, elke oplossing en elk reagens dat in deze sectie wordt gebruikt, moet steriel zijn. Degenen die niet al gesteriliseerd kunnen worden gekocht, moeten gedurende 20 minuten bij 121 °C worden geautoclaveerd. Draag handschoenen tijdens het hele protocol en voer enkele fasen uit in een zuurkast.
- Bereid de extractiebuffer voor: 1% natriumdodecylsulfaat (SDS), 250 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 25 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Kweek de gezuiverde isolaten in 39 g/L PDA gedurende 7-14 dagen.
- Schraap voorzichtig het mycelium uit een isolaat met een spatel of een lepel en breng de fragmenten over naar een geautoclaveerde vijzel, vermijd het overbrengen van het kweekmedium met het hyfenaggregaat. Maal het mycelium met vloeibare stikstof met een porseleinen stamper tot een fijn poeder. Laat het mycelium dat wordt vermalen niet smelten, voeg stikstof toe om dit te voorkomen.
- Voeg 1 ml extractiebuffer toe aan een microcentrifugebuisje van 2 ml en plaats het gemalen monster tot de 1,5 ml-markering. Roer voorzichtig de inhoud van de buisjes om te homogeniseren.
- Schud de buizen gedurende 5 s in een draaikolk en plaats ze gedurende 20 minuten in een thermoblok bij 65 °C. Homogeniseer de inhoud zorgvuldig door inversie om de 7-10 minuten.
- Centrifugeer de buisjes bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng 800 μL over van de superieure fase naar een nieuwe microcentrifugebuis van 2 ml, voeg 800 μL fenol toe aan de buizen en meng de inhoud door inversie.
LET OP: Fenol is een zeer giftig en vluchtig reagens; Het kan erytheem, gangreen en weefselnecrose veroorzaken. Bij inademing kan het kortademigheid en hoesten veroorzaken. De systemische absorptie kan de lever, de nieren en het centrale zenuwstelsel beschadigen. Manipuleer fenol uitsluitend in een zuurkast en draag handschoenen.
NOTITIE: Gebruik vanaf de volgende stap handschoenen en voer het protocol uit in een zuurkast. - Centrifugeer de buisjes bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en breng 800 μl over van de bovenste fase naar een nieuw buisje van 2 ml, waarbij de overdracht van de inhoud van de inferieure fase zorgvuldig wordt vermeden.
- Voeg 400 μL fenol en 400 μL chloroform toe aan de buisjes en meng de inhoud door inversie. Centrifugeer ze bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
LET OP: Chloroform is een zeer giftig en vluchtig reagens; Het kan irritatie en verwondingen veroorzaken bij contact met de huid en tast bij inademing het centrale zenuwstelsel en het cardiorespiratoire systeem, de lever en de nieren aan. Manipuleer chloroform uitsluitend in een zuurkast en draag handschoenen. - Recupereer 800 μL of minder uit de superieure fase naar een nieuwe buis van 2 ml. Voeg 800 μL chloroform toe, meng de inhoud door inversie en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 10.000 x g .
OPMERKING: In deze stap mogen geen resten van de inferieure fase worden overgebracht naar nieuwe buizen. Wees dus extra voorzichtig bij het recupereren van de superieure fase. - Breng 600-800 μL over van de superieure fase naar een nieuwe buis van 1,5 ml en voeg 450 μL isopropanol toe. Meng de inhoud door inversie en incubeer bij 25 °C gedurende 5 min.
- Centrifugeer de buisjes bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans weg met behulp van een micropipet. Pas op dat u de pellet die op de bodem van de buis is afgezet, niet weggooit.
- Voeg 500 μL 80% ethanol toe en centrifugeer gedurende 5 minuten. Herhaal dit twee keer voor het geval de pellet niet geklaard is.
- Verwijder de ethanol met behulp van een micropipet en droog de pellet gedurende 30-60 minuten bij 37 °C. Voeg 30-50 μL gedeïoniseerd water toe en eluer de pellet met behulp van een micropipet.
- Houd de buisjes 's nachts op 4 °C voor volledige DNA-elutie en vries de inhoud in bij -20 °C.
7. Totale DNA-extractie uit plantenorganen voor metabarcoding-methodologie (commerciële kit)
OPMERKING: Voor de volgende methodologie is het noodzakelijk om de commerciële kit aan te schaffen die in de materiaaltabel wordt aangegeven als een DNA-extractiekit voor de bodem. Elk materiaal, elke oplossing en elk reagens dat in deze sectie wordt gebruikt, moet steriel zijn. Degenen die niet al gesteriliseerd kunnen worden gekocht, moeten gedurende 20 minuten bij 121 °C worden geautoclaveerd. Het wordt ten zeerste aanbevolen om handschoenen te dragen tijdens het hele protocol en de stappen kunnen worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap. Het beschreven protocol is gewijzigd van De Souza et al.12, van het protocol dat door de fabrikant is beschreven.
- Maal met behulp van porseleinen vijzels de wortels die volgens stap 1.2 zijn verzameld in vloeibare stikstof en reduceer de monsters tot een fijn poeder. Voeg 0,3 g van de gemalen monsters toe aan de PowerBead-buisjes en schud voorzichtig om te homogeniseren.
- Voeg 60 μL oplossing C1 (meegeleverd in de kit) toe aan de PowerBead-buisjes en meng de inhoud door inversie. Gebruik een weefselhomogenisator en cellyser (Tabel met materialen), bind de buizen stevig vast aan een geschikte steun, koppel de steun aan de vortex en start de apparatuur gedurende 10-20 minuten op maximale snelheid.
NOTITIE: Als de C1-oplossing is neergeslagen, verwarm deze dan op 60 °C tot deze volledig is opgelost. - Centrifugeer de buisjes bij 10.000 x g gedurende 30 s bij 25 °C. Breng 500 μl van het supernatans over in microcentrifugebuisjes van 2 ml. De overgedragen inhoud kan deeltjes zijn.
- Voeg 250 μL oplossing C2 toe aan de buisjes en schud gedurende 5 s in een draaikolk. Incubeer gedurende 5 minuten bij 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 1-2 minuten bij 10.000 x g bij 25 °C.
- Breng meer dan 600 μl van het supernatans over in nieuwe buisjes van 2 ml, vermijd de pellet. Voeg 200 μL oplossing C3 toe en schud gedurende 5 s op een vortex.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 25 °C. Zorg er in deze fase voor dat het supernatans geen deeltjes is.
- Breng meer dan 750 μl van het supernatans over in nieuwe buisjes van 2 ml, vermijd de pellet. Homogeniseer de oplossing C4 goed, voeg 1.100 μL oplossing C4 toe aan de supernatant en schud gedurende 5 s in een vortex.
- Laad 675 μL uit de inhoud van de buisjes in de MB Spin Columns, over het filter, en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 minuut bij 25 °C. Gooi de vloeibare inhoud weg.
- Herhaal de vorige stap twee keer totdat alle inhoud van elke buis is verwerkt. Voeg vervolgens 500 μL oplossing C5 toe in het midden van het filter dat aanwezig is in de bovenste kolom van de buis en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s bij 25 °C.
- Gooi de vloeibare inhoud weg en centrifugeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden als in de vorige stap. Breng de bovenste kolom van de MB Spin Column voorzichtig over naar nieuwe microcentrifugebuisjes van 2 ml, zodat er geen vloeistof in de kolom druppelt.
- Voeg 85-100 μL oplossing C6 toe aan het midden van het filter en wacht 1 minuut. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s bij 25 °C en gooi de MB Spin Column weg. Bewaar de buizen bij -80 °C.
8. DNA-kwantificering in een spectrofotometer (zie de materiaaltabel)
- Open de software met behulp van de aangegeven spectrofotometer. Selecteer de optie Nucleïnezuur, kies de optie DNA en stel de concentratie in op ng/μL.
- Voeg 1 μL gedeïoniseerd water toe aan de spectrofotometerdetector en kalibreer door de optie Blanco te selecteren. Veeg de detector na het lezen voorzichtig schoon met zacht tissuepapier.
- Geef het veldmonster een naam met de isolaatcode van het af te lezen monster en plaats er 1 μL van in de apparatuurdetector. Selecteer de optie Meten; Er wordt een grafiek en een tabel met de resultaten gegenereerd.
- Herhaal stap 8.3 totdat alle monsters zijn afgelezen. Het wordt aanbevolen om de tabel met de gegenereerde resultaten op te slaan voor record en analyse: selecteer de optie Rapporten en de locatie waar het .xml bestand wordt opgeslagen.
- Voeg 5 μL gedeïoniseerd water toe aan de detector, wacht enkele minuten en veeg het voorzichtig af met zacht tissuepapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het isolatieprotocol kunnen, gezien het feit dat er sprake is van verontreiniging door het water dat bij de laatste wasbeurt is gebruikt en de verontreiniging ook wordt gedetecteerd in de petrischalen met geïnoculeerde fragmenten, verschillende acties worden ondernomen, afhankelijk van het type verontreiniging (tabel 1). Deze procedure moet vanaf het begin worden herhaald in het geval van sterk sporulerende schimmelverontreinigingen, die ook een versnelde groei vertonen en zich intens vermenigvuldigende bacteriën, resistent tegen de gekozen antibiotica. In plaats daarvan, als de schimmelverontreiniging een langzame groei vertoont of niet sporuleert , is het mogelijk om deze in de volgende stappen van het protocol eenvoudigweg niet te isoleren. Ten slotte kunnen besmettingen met bacteriestammen die zich langzaam vermenigvuldigen ook gemakkelijk worden vermeden in de achterste stappen, vooral bij zuivering, bij het recupereren van hyfen.
In alle eerder gepresenteerde gevallen is het ideale scenario om de ontsmettingsprocedure opnieuw uit te voeren met andere monsters en de plantenfragmenten te installeren in een kweekmedium dat andere antibiotica combineert, met een breder werkingsspectrum, in het geval van resistente bacteriën die de eerste gerechten besmetten. Gezien de moeilijkheden die gepaard gaan met het verzamelen van nieuwe monsters en het verkrijgen van organen uit mycoheterotrofe planten, kunnen sommige gevallen echter met succes worden opgelost in de latere stadia van het protocol, zoals weergegeven in tabel 1.
| Verontreiniging | Eigenschap van de verontreiniging | Mogelijk gevolg van besmetting | Vereiste actie | |||
| Bacteriën | Intense vermenigvuldiging | Gehele of gedeeltelijke remming van de groei van de endofyten van belang | Start de isolatie opnieuw vanaf het begin | |||
| Langzame vermenigvuldiging | Isolatie van de bacteriën samen met de endofyt van belang | Vermijd bacteriekolonies tijdens het zuiveren | ||||
| Celwand | Krachtige groei en/of sterk sporulerend | Maakt het onmogelijk om de endofyten van belang te isoleren en/of te zuiveren | Start de isolatie opnieuw vanaf het begin | |||
| Langzame groei en/of niet-sporulerend | Isolatie van de verontreiniging per ongeluk | Vermijd isolatie van de verontreiniging | ||||
Tabel 1: Beschrijving van de mogelijke contaminanten in het proces van isolatie van endofytische schimmels, gevolgen voor besmetting en mitigatieprocedures.
Na 5 dagen na de installatie van orgaanfragmenten in het PDA-medium, is het mogelijk om de groei van kleine groepen filamenteuze schimmelmycelium te visualiseren, die uit het binnenste van de fragmenten tevoorschijn komen (Figuur 3). Elk myceliummorfotype zou moeten resulteren in een schimmelisolaat tegen het einde van het isolatieprotocol, aangezien elk van hen moet worden gestreept in een nieuwe petrischaal met AA-medium voor zuivering. Het wordt geadviseerd om de originele gerechten uit de fragmentinstallatie niet weg te gooien voordat het hele isolatieprotocol is voltooid. Zij kunnen gekoeld bij 4 °C worden bewaard totdat de gezuiverde kolonies zijn verkregen. Ook met betrekking tot dit deel van het protocol kan de IF-analyse zeer nuttig zijn bij het evalueren van het percentage weefselmonsters dat resulteert in geïsoleerde schimmels onder het totale aantal geïnstalleerde monsters.
Figuur 3: Wortelfragmenten voor schimmelisolatie in aardappeldextrose-agar. Kweekbare endofytische schimmels die groeien uit de wortelfragmenten van een mycoheterotrofe orchidee na ca. 5 dagen incubatie. Elke petrischaal (A, B en C) bevat vijf wortelfragmenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Na 3 dagen na incubatie van de AA-schalen voor isolaatzuivering, zouden minuscule hyf-kolonies, bijna onmerkbaar, uit de striae in het AA-medium moeten zijn gegroeid. In dit stadium, in het geval dat er sprake was van besmetting door langzaam groeiende bacteriën in de isolatieschalen, is het mogelijk dat deze bacteriën ook zijn overgebracht naar de AA-schalen met de geselecteerde schimmel-endofythyfen. Als dat zo is, zullen bacteriën beperkt blijven tot stria-regio's, met weinig groei in vergelijking met de schimmel, waardoor alleen de schimmel kan worden gerecupereerd die van belang is voor nieuwe PDA-gerechten.
Gedurende 7-14 dagen na inoculatie van de gezuiverde schimmelisolaten in PDA-schalen, moet de zuivere kolonie centrifugaal groeien (van het midden van de schaal naar de periferie), waardoor een enkel cirkelvormig mycelium wordt gevormd (Figuur 4). Mogelijke verontreinigingen zijn in dit stadium gemakkelijk te identificeren, omdat ze de homogeniteit van de kolonie aanzienlijk aantasten wat betreft de groei, de vorm, het uiterlijk, de kleur, de pigmentproductie in het medium, enz. (Figuur 5). Ervan uitgaande dat de verkregen kolonies niet zuiver zijn, moeten de schimmels die oorspronkelijk uit de orgaanfragmenten zijn gekweekt, opnieuw worden onderworpen aan zuiveringsprocedures, door middel van strepen en subcultuur (stap 2.4). Het is mogelijk om de isolaten te recupereren uit de initieel geïnstalleerde organen of de uiteindelijke isolatieschalen die heterogene culturen bevatten.
Figuur 4: Weergave van gezuiverde schimmelisolaten, gedurende 7-14 dagen gekweekt in een PDA-kweekmedium. In de eerste en derde kolom (A, C, E, G, I en K) zijn de geregistreerde kolonies vanaf de bovenzijde te zien; de tweede en vierde kolom (B, D, F, H, J en L) presenteren dezelfde kolonies, respectievelijk van onderaf gezien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Weergave van onzuivere schimmelisolaten, gekweekt gedurende 7-14 dagen in PDA-kweekmedium. In de eerste kolom (A, D en G) is een algemeen beeld van de koloniën vanaf de bovenzijde te zien; de tweede kolom (B, E en F) toont de kolonies in detail; de derde kolom (C, F en I) toont de kolonies vanaf de onderkant. De nummers vertegenwoordigen verschillende schimmelmorfotypes die in elk gerecht aanwezig zijn, en de lijnen vertegenwoordigen een subtiele afbakening tussen de verschillende schimmelisolaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De conservering van isolaten mag niet plaatsvinden met behulp van één enkele opslagmethode, aangezien elke schimmel meer of minder gevoelig kan zijn voor elke beschreven methode. Het is ten zeerste aan te raden om voor elk schimmelisolaat ten minste twee soorten opslag te kiezen, waardoor meer kans op succes bij het bewaren ervan wordt gegarandeerd. We benadrukken dat de niet-levensvatbaarheid van schimmels die in Castellani of minerale olie worden bewaard, na 6 maanden of minder wordt verwacht. Onderzoekers moeten overwegen of dit de enige gekozen conserveringsmethoden zijn, om mogelijke onverwachte verliezen van isolaten te voorkomen. Om deze beperkte periode te verlengen, is het mogelijk om de schimmelisolaten te reactiveren door ze 2-3 weken in het PDA-medium (39 g/L) te laten groeien en ze vervolgens weer op te slaan. Na een periode van opslag wordt verwacht dat de isolaten een langzamere groei vertonen, vergeleken met de waargenomen groeisnelheid vóór de bewaring, en kolonies met minder krachtige aspecten (d.w.z. minder dicht, anders van kleur). Een paar keer subcultureren in een voedingsrijk kweekmedium is voldoende om dergelijke kenmerken te herstellen.
Bij het evalueren van de macromorfologie van de kolonies verkregen in de isolatieprocedure, moeten kwalitatieve gegevens worden verzameld, waarbij zoveel mogelijk kenmerken in aanmerking worden genomen: (a) kleur van de kolonie (boven- en onderkant), die kan worden geanalyseerd met behulp van gedrukte kleurengidsen (bijv. Rayner28, Kornerup & Wanscher29, Ridgway30); b) de opaciteit van de kolonie: transparant, ondoorzichtig, doorschijnend; c) diffuse pigmenten in het medium31 (aan-/afwezigheid en kleur); d) exsudaat31 (aan-/afwezigheid, kleur, algemeen voorkomen); (e) macroscopische structuren31 (aan-/afwezigheid, type en uiterlijk; bijv. sclerotia, pycnidia); f) mycelium in de lucht en onder water 19,32,21 (aanwezigheid/afwezigheid, weinig of overvloedig voorkomen); g) marge-uiterlijk19 (kleur, vorm, uniformiteit - ondergedompeld of luchtig); en (h) de topografie van de kolonie (opgehoopt, gerimpeld, kratervormig, plat, enz.), het algemene uiterlijk en de textuur - katoenachtig, fluweelachtig, poederachtig, wollig, talgachtig (wasachtig), kaal, krijtachtig, slijmerig, leerachtig, stekelig, enz.19,21.
Figuur 6: Macro- en micromorfologie van een niet-geïdentificeerde schimmel geïsoleerd uit de mycoheterotrofe orchidee Wullschlaegelia aphylla. (A) Bovenste en (B) onderste aspecten van de kolonie, (C) versterkt beeld van de luchthyfen (zoals te zien in een stereomicroscoop). Micromorfologie van de hyfen (D) zonder vlek en gekleurd met (E) LPCB en (F) TBO. Afkortingen: c = conidiofoor, p = phialide, s = septum. Schaalbalken: A,B = 2 cm; C = 2 mm; D-F = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In figuur 6 is een kolonie te zien die is geïsoleerd uit de spoelvormige wortels van de mycoheterotrofe orchidee Wullschlaegelia aphylla, waarbij de beschreven methodologie wordt toegepast. De kolonie is witachtig tot grijs aan de bovenzijde (figuur 6A) en bruinachtig aan de onderzijde (figuur 6B). Het is ondoorzichtig, zonder diffuse pigmenten in het medium of exsudaten. De mycelia zijn luchtig en overvloedig, de randen zijn onregelmatig en luchtig, en de kolonie heeft een fluweelachtige textuur en een gerimpelde topografie (Figuur 6A). Macroscopische structuren zijn afwezig.
De methode voor het kweken van objectglaasjes is traditioneel en voordelig, en hoewel tijdrovend, kan het worden toegepast om permanente objectglaasjes te produceren die achteraf kunnen worden onderzocht. De verschillende kleurstoffen die hier worden gepresenteerd, kunnen worden gebruikt om belangrijke structuren aan te tonen, en ze vereisen tests in de monsters om de meest geschikte incubatietijd te bepalen. Congorood en TBO zijn vlekken voor algemeen gebruik. Congorood is voldoende om enkele delicate structuren te demonstreren (verder lezen: Malloch22). TBO kleurt de celinhoud intenser dan de celwand van de schimmel (Figuur 6F). Hoewel het een gebruikelijke kleurstof is voor plantenstructuren en niet zo gebruikelijk is in schimmelmicroscopie, heeft TBO een belangrijke metachromatische eigenschap33, die andere toepassingen bevordert, zoals schimmelanalyse in plantenweefsels10. LPCB is een veel toegepaste kleurstof in schimmelanalyse, hoewel voorzichtigheid vereist vanwege fenol. Katoenblauw (synoniem: methylblauw) is de vlek, melkzuur is een klaringsmiddel en fenol is een dodendmiddel21. LPCB heeft affiniteit met chitine en vertoont sporenwanden en versieringen23,24. De schimmelsepta zijn niet gekleurd door LPCB (Figuur 6E) of TBO (Figuur 6F), wat de identificatie van dergelijke structuren vergemakkelijkt. Het aanbrengen van kleurstoffen is voordelig om structuren aan te tonen die niet gemakkelijk te zien zijn wanneer hyfen niet worden gekleurd (Figuur 6D).
Voor DNA-extractie uit schimmels en wortelmonsters moet de hoeveelheid gemalen monster in vloeibare stikstof die aan de extractiebuffer moet worden toegevoegd, worden gerespecteerd en mag de in het protocol aangegeven hoeveelheid niet worden overschreden. We moeten benadrukken dat een grote hoeveelheid verwerkt monster niet alleen het verkrijgen van een hoge DNA-concentratie zonder grote nadelen vertegenwoordigt, omdat dit de uiteindelijke DNA-kwaliteit aanzienlijk in gevaar kan brengen. Dit gebeurt bij het verzadigen van de volgende stadia van DNA-zuivering. Bovendien kan het concentreren van vermeende verbindingen geproduceerd door planten of schimmels (bijv. pigmenten, secundaire metabolieten), aanwezig in de uiteindelijke oplossing met DNA, de DNA-kwaliteit verminderen en/of de polymerasekettingreactie (PCR) remmen. Een ander probleem dat de DNA-kwaliteit aanzienlijk kan verminderen, is het helemaal schrappen van het kweekmedium met schimmelmycelium en het vermalen ervan, wat sterk moet worden vermeden. Sommige reagentia uit de extractieprocedure (bijv. fenol, ethylalcohol, SDS) en andere stoffen (bijv. schimmelpigmenten) kunnen remmers zijn die PCR verstoren.
In de DNA-reinigingsfasen, bij gebruik van fenol en chloroform, moet het supernatans altijd de fase met minder onzuiverheden vertegenwoordigen, die normaal gesproken de helderste fase omvat. Tijdens een dergelijke fase mag de inferieure fase niet worden gerecupereerd bij het aspireren van het supernatans dat naar nieuwe buizen zal worden overgebracht. Tegen het einde van het protocol moet de pellet (gevormd door DNA) een doorschijnende (zeer wenselijke) tot witachtige kleur hebben. In de droogfase is het drogen van het DNA in een thermoblok van fundamenteel belang voor het volledig verdampen van ethanol. Na 12 uur bij 4 °C moet de pellet volledig zijn geëlueerd in de waterige oplossing die aan de buizen is toegevoegd, en daarna niet meer zichtbaar zijn. Als de elutie niet volledig is en de DNA-concentratie ver onder de ideale concentratie ligt, is het mogelijk om de oplossing nog 12 uur gekoeld te bewaren, zonder noemenswaardig kwaliteitsverlies.
De DNA-analyses in de software genereren een tabel, zoals weergegeven in tabel 2, waarin gegevens met betrekking tot de hoeveelheid en kwaliteit van DNA worden aangegeven. De DNA-kwantificering wordt gegeven door de concentratie van nucleïnezuren in nanogram per microliter van een monster. Gezien de moleculaire identificatie van geïsoleerde schimmels, moeten DNA-monsters een concentratie van ongeveer 200 ng/μL hebben, ideaal voor PCR-stadia. In het geval van monsters met hogere concentraties nucleïnezuren moet een aliquot van het monster worden verdund, waarbij de concentratie wordt benaderd tot de eerder genoemde waarde. Monsters met te hoge concentraties, zoals monsters 1 en 2 in tabel 2, kunnen wijzen op een valse detectie als gevolg van verontreinigingen in de oplossing. Ondertussen kunnen monsters met lagere nucleïnezuurconcentraties, zoals nummer 7 (tabel 2), nog steeds worden gebruikt voor PCR, wat belangrijk is om een groter volume monster in de reacties toe te passen. Wat de kwaliteitsparameters betreft, is het bevredigend dat de quotiënten 260/280 en 260/230 tussen 1,8 en 2,2 liggen, zoals aangegeven in de monsters 3, 5 en 8 (tabel 2). Monsters die dergelijke waarden vertonen (die veel lager of hoger zijn) moeten worden onderworpen aan nieuwe DNA-extracties, zoals aangegeven in de monsters 9 en 10 van tabel 2. In het geval van monsters met een toereikende hoeveelheid DNA en een minimale overschrijding van het ideale kwaliteitsbereik, zoals gesuggereerd door de waarden 260/280 en 260/230 in de nummers 4 en 6 (tabel 2), is verdunnen de meest gunstige procedure om de nucleïnezuurconcentratie geschikt te maken voor PCR en eventuele remmers, zoals rudimentaire reagentia uit de extractieprocedure, te verdunnen; in de monsters.
| Monster | Nucleïnezuur conc. | Eenheid | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | Soort steekproef |
| 1 | 14491.7 | ng/μl | 289.833 | 141.175 | 2.05 | 1.8 | DNA |
| 2 | 13359.3 | ng/μl | 267.187 | 124.607 | 2.14 | 2.15 | DNA |
| 3 | 1137.6 | ng/μl | 22.751 | 10.574 | 2.15 | 2.13 | DNA |
| 4 | 1472.6 | ng/μl | 29.452 | 13.287 | 2.22 | 2.16 | DNA |
| 5 | 3464.8 | ng/μl | 69.295 | 33.329 | 2.08 | 1.88 | DNA |
| 6 | 1884.2 | ng/μl | 37.684 | 17.912 | 2.1 | 1.78 | DNA |
| 7 | 187.6 | ng/μl | 3.751 | 1.834 | 2.05 | 2.06 | DNA |
| 8 | 1580.3 | ng/μl | 31.607 | 15.281 | 2.07 | 1.98 | DNA |
| 9 | 923.3 | ng/μl | 18.466 | 9.196 | 2.01 | 1.37 | DNA |
| 10 | 2414.4 | ng/μl | 48.287 | 21.008 | 2.3 | 3.45 | DNA |
Tabel 2: Gegenereerde resultaten in de software van schimmel-DNA-monsters geanalyseerd in een spectrofotometer.
Anders dan bij DNA-monsters van geïsoleerde endofytische schimmels, zou de DNA-concentratie in monsters voor metabarcoding-analyses enorme hoeveelheden geëxtraheerde DNA-moleculen moeten bevatten, met een hoge kwaliteit en molecuulgewicht. De monsters moeten worden geëvalueerd door middel van elektroforese in agarosegel, waarbij de grootst mogelijke integriteit wordt verkregen, met weinig of geen uitsmeren in de gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De oppervlakkige ontsmetting van plantenmonsters is een van de meest kritieke fasen in het gepresenteerde protocol. Geen contaminatie in de PDA-vaat met druppels van de laatste wasbeurt is zeer gewenst. Bacteriën worden vaak waargenomen als verontreinigingen in de isolatieschalen, meestal meer dan sporulerende schimmels in de lucht, aangezien endofytische bacteriën ook veel voorkomen in plantenweefsels 3,11. De toevoeging van antibiotica in het kweekmedium bij het installeren van de orgaanfragmenten is dus essentieel. Betere resultaten worden bereikt door verschillende soorten antibiotica te combineren, wat resulteert in een breder werkingsspectrum. Een andere belangrijke overweging is de intrinsieke vooringenomenheid bij het isoleren van de schimmels, aangezien het gebruik van PDA en AA onvermijdelijk bepaalde soorten zal selecteren en andere zal benadelen. De combinatie van andere cultuurmedia kan de vooringenomenheid minimaliseren, maar dergelijke beperkingen niet wegnemen9.
Over het algemeen vertonen schimmels die sporen produceren terwijl ze groeien in petrischalen hogere overlevingskansen in conserveringsprotocollen, al dan niet bij lagere temperaturen, en niet-sporulerende isolaten verdragen mogelijk geen conservering van Castellani of minerale olie34,35,36, dus een cryopreservatiemethode kan in dergelijke gevallen cruciaal zijn. Bovendien kunnen sommige isolaten gevoelig zijn voor bevriezing, en de toevoeging van cryoprotectanten helpt bij de conservering, zoals bij de gepresenteerde methode met vermiculiet18. De kenmerken van de kolonie en de hyfen kunnen nuttig zijn om de isolaten met vergelijkbare eigenschappen te groeperen, waardoor de selectie voor gebruik in symbiotische kiembehandelingen wordt vergemakkelijkt (zoals beschreven door Pena-Passos et al.10). Deze kenmerken dragen ook bij aan de keuze van de toe te passen conserveringsmethoden, vooral rekening houdend met sporulatie of de afwezigheid ervan.
Morfologisch karakteriseren van de isolaten verbetert en vormt ook een aanvulling op morfologische beschrijvingen die beschikbaar zijn in gespecialiseerde literatuur, vooral wanneer ze worden geassocieerd met moleculaire karakterisering. Ondanks dat het een uitdaging is met tal van isolaten, is het morfologisch karakteriseren van schimmels tijdrovend en afhankelijk van gepubliceerde gegevens. Zelfs als alleen de moleculaire karakterisering is gepland, is het raadzaam om een fotografisch register bij te houden van het uiterlijk van de kolonie (macromorfologie) en dit waar mogelijk te publiceren, om bij te dragen aan toekomstige identificatieprocedures. Het bijhouden van foto's van de schotels waar fragmenten zijn geïnstalleerd is ook belangrijk, om een vergelijking mogelijk te maken tussen de uiteindelijk verkregen isolaten en de morfotypen die in installatieschalen worden waargenomen. In zo'n geval moeten de vergeleken schimmels in hetzelfde type medium worden gekweekt. Aanvullende methodologieën zijn te vinden in Currah et al.16 om veel voorkomende mycorrhiza-schimmels van orchideeën te evalueren, zoals kweek op looizuurmedium (TAM) om Epulorhiza (teleomorf: Tulasnella) en Ceratorhiza (teleomorf: Ceratobasidium) geslachten te differentiëren, en kweek op CMA om monilioïde cellen te stimuleren voor de karakterisering van schimmels uit het Rhizoctonia-complex.
Gezien de gedetailleerde methoden om schimmeldraden onder een lichtmicroscoop te observeren, zijn plaagmontage en plakbandbevestiging sneller dan diacultuur, hoewel de plaagmontagemethode niet geschikt is voor het analyseren van sporen en het meten van vertakkingshoeken. Plakbandmontage behoudt de myceliumorganisatie beter dan de plaagmontagetechniek, hoewel het gebruik van plakband niet zo betrouwbaar is als een schuifcultuur voor het meten van vertakkingshoeken (observatie van de auteurs). Diacultuur is, ondanks dat het tijdrovend is, de meest geschikte techniek om semi-permanente en permanente dia's te produceren. Macro- en micromorfologie worden geanalyseerd met behulp van de literatuur. Webster en Weber32 is een uitgebreide algemene bron van informatie en aanvullende referenties. Currah et al.16 en Zettler en Corey37 geven nuttige informatie over mycorrhizaschimmels van orchideeën. Hoewel ze schimmels van medisch belang beschrijven, zijn Walsh et al.21 en McGinnis31 ook nuttig voor algemene kenmerken van kolonies van draadvormige schimmels, visuele/beschrijvende informatie en aanvullende referenties voor schimmelmicromorfologie.
Volgens Yu et al.38 vertonen de DNA-kwantificeringsanalyses in een spectrofotometer een grote precisie en nauwkeurigheid, omdat ze consistent zijn met kwantitatieve real-time PCR-analyses. Een belangrijke observatie is dat sommige isolaten mogelijk geen DNA-monsters leveren die voldoende zuiver zijn voor de volgende moleculaire identificatiestadia, aangezien de schimmel-endofyten van mycoheterotrofen zeer divers zijn, vooral die geassocieerd met tropische planten39, net als de geproduceerde metabolieten. Spectrofotometeranalyses kunnen worden gebruikt om dergelijke gevallen en verschillende protocollen te evalueren, of commerciële kits die worden toegepast voor DNA-zuivering van de monsters. De voorgestelde volgende fasen in de moleculaire identificatie van isolaten zijn de amplificatie van het interne getranscribeerde spacer (ITS)-gebied en sequencing. De ITS-regio is een ribosomaal RNA-spacer-DNA dat op grote schaal wordt gebruikt in de gespecialiseerde literatuur en formeel wordt geaccepteerd als de belangrijkste streepjescode voor schimmelidentificatie 9,40. Het kan worden geamplificeerd door PCR met de primers ITS1 en ITS441 en vervolgens worden gesequenced in het Sanger-platform42.
Metabarcoding-analyses maken het niet alleen mogelijk om de rijkdom, abundantie en taxonomische samenstelling van micro-organismen in milieu- en plantenmonsters te onderzoeken, maar kunnen ook resultaten opleveren van positieve of negatieve interacties tussen deze micro-organismen12. De maceratiefase met vloeibare stikstof toegevoegd aan het DNeasy PowerSoil-standaardprotocol heeft tot doel zoveel mogelijk schimmelcellen te breken in relatie tot plantenweefsels, waardoor een betere bemonstering van de schimmelgemeenschap in het gemacereerde weefsel mogelijk wordt11. Bij de keuze van de inleiding voor schimmelsequenties (streepjescodes) bij moleculaire identificatie moet rekening worden gehouden met de interferentie met het DNA van planten. We adviseren het gebruik van primers die variabele regio's van het schimmel 18S-gen versterken, bijvoorbeeld ITS1-5,8S-ITS243. Na het verkrijgen van de DNA-monsters zijn de volgende stappen het voorbereiden van de metagenomische bibliotheken, die afhankelijk zijn van het gekozen sequencingplatform, posterieure sequencing van de bibliotheken en het analyseren van de verkregen gegevens met behulp van bio-informaticatools. We raden aan om het platform Illumina MiSeq te gebruiken, dat een goedkopere optie is met een hoge output, die in korte tijd 250 bp-sequenties genereert11,44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We danken de financiering van FAPESP (2015/26479-6) en CNPq (447453/2014-9). JLSM bedankt CNPq voor productiviteitssubsidies (303664/2020-7). MPP bedankt Capes (master's degree scholarship, proces 88887.600591/2021-00) en CNPq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | (from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses) | ||
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A5354 | (for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1) |
| Autoclave | (from any company, for materials sterilization in many steps) | ||
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A1296 | (for many steps) |
| C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
| Centrifuge | Merck/Eppendorf | 5810 G | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Centrifuge tubes | Merck | CLS430828 | (for samples collection) |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Congo red | Supelco | 75768 | (for hyphae staining) |
| Cryotubes | Merck | BR114831 | (for many steps) |
| Ethanol | Supelco | 100983 | It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Filter paper | Merck | WHA10010155 | (for many steps) |
| Glass test tubes | Merck | CLS7082516 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
| Glass wool | Supelco | 20411 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB) |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | 252476 | (for preparing LPCB - hyphae staining) |
| Lactophenol blue solution (LPCB) | Sigma-Aldrich | 61335 | (for hyphae staining) |
| Laminar flow hood | (class I, from any company, for many steps) | ||
| Light microscope | (from any company, for hyphae observation) | ||
| MB Spin Columns | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
| Methyl blue (cotton blue) | Sigma-Aldrich | M5528 | (for preparing LPCB - hyphae staining) |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Merck | HS4323 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Merck | BR780546 | (for many steps) |
| Mineral oil | (for preservation of fungal isolates) | ||
| Paper bags | Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection) | ||
| Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones) |
| Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
| Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm) | Merck/Brand | BR455732 | (for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | (for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB) |
| Porcelain mortar | Sigma-Aldrich | Z247464 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Porcelain pestle | Sigma-Aldrich | Z247502 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Potato dextrose agar (PDA) | Millipore | P2182 | (for many steps) |
| PowerBead tubes | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
| Rapid mounting medium (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | (for fungi slide culture) |
| Silica gel | Supelco | 717185 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine) | (commercial product, for superficial desinfestation) | ||
| Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit) | Qiagen | 12888-50 | (for total DNA extraction from plant organs) |
| Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | (for total DNA extraction from plant organs) |
| Stereomicroscope | (=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses) | ||
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | (for installation of plant fragments) |
| Thermoblock | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (or from other companies) |
| Tissue homogenizer and cell lyzer | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs) | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich/Harleco | 364-M | (for hyphae staining) |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T9531 | (for cryopreservation in vermiculite) |
| Tris Base Solution (Tris) | Sigma-Aldrich | T1699 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Unhulled rice grains | (for cryopreservation) | ||
| U-shaped glass rod | (or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture) | ||
| Vermiculite | Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite) | ||
| Vortexer | Sigma-Aldrich/BenchMixer | BMSBV1000 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | (for cryopreservation in vermiculite) |
References
- de Azevedo, J. L.
- Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
- Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes. Microbial Root Endophytes. , Springer-Verlag. Berlin. 1-13 (2006).
- Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. , Elsevier Science Academic Press. London. (2008).
- Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
- Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids. Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).
- Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship. Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).
- Sun, X., Guo, L. -D. Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques. Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).
- Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds. Journal of Visualized Experiments. (183), e63777 (2022).
- Araújo, W. L., et al. Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed. 1, Santarém: UFOPA. 257 (2014).
- de Souza, R. S. C., et al. Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome. Scientific Reports. 6, 28774 (2016).
- Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).
- Araújo, W. L., et al. Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks. Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).
- Castellani, A. Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water. Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).
- Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A.
- Freitas, E. F. S., et al. Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species. Scientific Reports. 10 (1), 7069 (2020).
- Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes. Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).
- Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Araújo, E. F. D. Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil. Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification. , ASM Press. (2018).
- Malloch, D. Moulds: Isolation, Cultivation, Identification. , Available from: http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Moulds.html (1997).
- Smith, P. Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society. , Available from: https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents (2022).
- Senanayake, I. C., et al. Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation. Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).
- Slifkin, M., Cumbie, R. Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
- Raeder, U., Broda, P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).
- Martins, M. K., et al. Molecular characterization of endophytic microorganisms. Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition. , Santarém: UFOPA. 189-211 (2014).
- Rayner, R. W. A Mycological Colour Chart. Commonwealth Mycological Institute. , (1970).
- Kornerup, A., Wanscher, J. H. Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour. , Methuen & Co. Ltd. London. (1967).
- Ridgway, R. Color Standards and Color Nomenclature. , Washington, DC. Published by the author (1912).
- McGinnis, M. R. Laboratory Handbook of Medical Mycology. , Elsevier Science. (2012).
- Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).
- Smith, D., Onions, A. H. S. A comparison of some preservation techniques for fungi. Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).
- Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).
- Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).
- Zettler, L. W., Corey, L. L. Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).
- Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer. Optik. 145, 555-560 (2017).
- Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
- Schoch, C. L., et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability. Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Metzker, M. L.
