Summary
Den aktuella artikeln syftar till att tillhandahålla detaljerade och adekvata protokoll för isolering av växtassocierade endofytiska svampar, långsiktigt bevarande av isolat, morfologisk karakterisering och total DNA-extraktion för efterföljande molekylär identifiering och metagenomiska analyser.
Abstract
Mykoheterotrofa växter utgör en av de mest extrema formerna av mykorrhizaberoende, eftersom de helt har förlorat sin autotrofa kapacitet. Lika viktiga som alla andra viktiga resurser, är svamparna som dessa växter är intimt förknippade med viktiga för dem. Därför är några av de mest relevanta teknikerna för att studera mykoheterotrofa arter de som möjliggör undersökning av associerade svampar, särskilt de som lever i rötter och underjordiska organ. I detta sammanhang används ofta tekniker för att identifiera odlingsberoende och odlingsoberoende endofytiska svampar. Att isolera svampendofyter ger ett sätt att morfologiskt identifiera dem, analysera deras mångfald och upprätthålla inokulering för tillämpningar i symbiotisk groning av orkidéfrön. Det är dock känt att det finns en stor variation av icke-odlingsbara svampar som lever i växtvävnader. Odlingsoberoende molekylära identifieringstekniker erbjuder således en bredare täckning av arternas mångfald och abundans. Syftet med denna artikel är att ge det metodstöd som krävs för att inleda två utredningsförfaranden: ett kulturberoende och ett oberoende. När det gäller det odlingsberoende protokollet beskrivs processerna för att samla in och underhålla växtprover från insamlingsplatser till laboratorieanläggningar, tillsammans med isolering av filamentösa svampar från underjordiska och luftorgan hos mykoheterotrofa växter, upprätthållande av en samling isolat, morfologiskt karakterisering av hyfer genom objektglasodlingsmetodik och molekylär identifiering av svampar genom total DNA-extraktion. De detaljerade procedurerna omfattar odlingsoberoende metoder och inkluderar insamling av växtprover för metagenomiska analyser och total DNA-extraktion från aklorofylllösa växtorgan med hjälp av ett kommersiellt kit. Slutligen föreslås även kontinuitetsprotokoll (t.ex. polymeraskedjereaktion [PCR], sekvensering) för analyser, och tekniker presenteras här.
Introduction
Endofytiska svampar är per definition de som lever i det inre av växtorgan och vävnader i oansenliga infektioner (dvs. utan att skada sin värd)1,2. Dessa svampar kan interagera neutralt eller fördelaktigt med värdväxter, kan ge resistens mot patogener och ogynnsamma miljöförhållanden och kan bidra till syntesen av nyttiga föreningar för växten (t.ex. tillväxtfaktorer och andra fytohormoner)1,3. Mykorrhizaendofyter är svampar som etablerar mykorrhizaföreningar med växten och deltar i näringsöverföring4. Hos Orchidaceae är interaktionen med mykorrhizaendofyter grundläggande för frögroning hos de allra flesta arter och plantetablering hos alla växter i familjen5. I sådana sammanhang representerar mykoheterotrofa orkidéer ett fall av totalt beroende av sina mykorrhizapartners, eftersom de är beroende av överföring av mineralnäringsämnen och kolföreningar från dessa svampar under hela deras livscykel6. Därför är isolering och identifiering av associerande svampar en grundläggande bas när man undersöker mykoheterotrofa livsstrategier. Dessutom är lite känt om svampendofyternas roller i mykoheterotrofa växter eller ens den verkliga mångfalden av dessa svampar 7,8.
Undersökningen av endofytiska svampar kan utföras med hjälp av olika tekniker, som traditionellt beskrivs som odlingsoberoende eller -beroende, till exempel: (a) direkt observation, (b) svampisolering och morfologisk och/eller molekylär identifiering, och (c) total DNA-extraktion av växtvävnader och molekylär identifiering9. I direkt observation (a) kan endofytiska svampar undersökas medan de fortfarande befinner sig i det inre av växtceller och vävnader med ljus- eller elektronmikroskopi9, eftersom olika mikroskopiprotokoll beskrivs i detalj av Pena-Passos et al.10. Genom isoleringsmetoder (b) kan svampendofyter karakteriseras enligt deras kolonier, hyfer och morfologi för reproduktions- eller resistensstruktur. Via isoleringstekniker är det också möjligt att utföra molekylär identifiering av isolat genom DNA-extraktion, amplifiering av molekylära identifieringssekvenser (streckkoder eller fingeravtryck) och sekvensering11. Den senare tekniken (c) möjliggör molekylär identifiering av endofytiska svampar per DNA-extraktion i det inre av växtvävnader (metabarcoding), följt av biblioteksförberedelse och sekvensering12.
Dessutom kan svampisolat användas i symbiotiska groningsförsök, med hjälp av frön från autotrofa eller mykoheterotrofa orkidéer. Ett exempel på en sådan tillämpning är den undersökning som utförts av Sisti et al.13, som beskriver groning och de inledande stadierna av protokormutveckling hos Pogoniopsis schenckii, en mykoheterotrofisk orkidé, tillsammans med några av dess isolat, som består av icke-mykorrhizaendofytiska svampar. Det tillämpade symbiotiska groningsprotokollet beskrivs i detalj och presenteras i en video av Pena-Passos et al.10. Att isolera svampar i samband med olika växtorgan möjliggör olika undersökningar av arten av växt-svampinteraktioner (t.ex. för att förstå antingen ekologiska eller fysiologiska aspekter av sambandet, samt undersökningar av näringsöverföringen från svampar till växten)9.
Metoderna som presenteras i avsnitt 1 är baserade på en insamling av underjordiska organprover, eftersom dessa organ utgör de svåraste att samla in, och de är av stort intresse eftersom mykorrhizaendofyter koloniserar dem. Båda de inkluderade protokollen (steg 1.1 och 1.2) kan dock tillämpas på andra mykoheterotrofa växtorgan (t.ex. rhizomer, blomstjälkar och frukter). Den insamlingsmetod som beskrivs i steg 1.1 är avsedd för isolering av endofytiska svampar (avsnitt 2) för morfologisk karakterisering (avsnitt 4 och 5) och/eller total DNA-extraktion för identifiering av isolat (avsnitt 6). Å andra sidan är den insamlingsmetod som beskrivs i steg 1.2 uteslutande avsedd för total DNA-extraktion av växtvävnader för metastreckkodningstekniker (avsnitt 7). I avsnitt 3 presenteras fyra metoder för lagring och konservering av filamentösa svampar, två för korttidslagring (3-6 månader) och de andra två lämpliga för långtidslagring (>1 år). Den morfologiska karakteriseringen (avsnitt 4 och 5) kan associeras med molekylär identifiering för att förstärka den och ge viktig information om svampars makro- och mikromorfologi. Figur 1 sammanfattar de samlade metoder som beskrivs nedan.
Figur 1: Schematisk sammanfattning av de presenterade metoderna. Växtinsamling och svampisolering, konservering och molekylär identifiering med odlingsberoende och -oberoende metoder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insamling av växtprover
- Exempelsamling för kulturberoende metoder
- Gräv försiktigt de underjordiska organen; Dessa kan vara rötter, stjälkar, rhizomer eller lagringsorgan från växten som ska samlas in. Förutom mycket kompakta jordar, samla in dessa prover för hand.
OBS: Det är olämpligt att använda verktyg som murslev eller skopor i detta steg, eftersom det kan skada de ömtåliga strukturerna hos mykoheterotrofa växter och kan orsaka vävnadskontaminering av icke-endofytiska svampar. - Samla så många underjordiska organ som möjligt. Förvara proverna i papperspåsar i en kyld behållare (t.ex. en låda av polystyrenskum eller en termopåse med is). Om luftorgan också samlas in, transportera dem separat från de underjordiska.
- Gräv försiktigt de underjordiska organen; Dessa kan vara rötter, stjälkar, rhizomer eller lagringsorgan från växten som ska samlas in. Förutom mycket kompakta jordar, samla in dessa prover för hand.
- Provsamling för kulturoberoende metoder
- Gräv försiktigt upp rötterna på växten som ska samlas in enligt samma rekommendationer som anges i anmärkningen från punkt 1.1.1.
- Samla så många underjordiska organ som möjligt. Förvara de insamlade proverna i kryorör inuti flytande kväve (önskvärt alternativ) eller använd centrifugrör omgivna av torris (alternativt alternativ). Förvara luftorgan separat, om de samlas in.
2. Isolering av endofytiska svampar associerade med växtorgan14
OBS: Varje material, lösning och reagens som används i detta avsnitt måste vara sterila. De som inte kan köpas redan steriliserade bör autoklaveras vid 121 °C i 20 minuter.
- Ytligt angrepp av växtorgan
- Tvätta de insamlade proverna (steg 1.1.2) under rinnande vatten och ta bort så mycket substrat och annat skräp som proverna kan ha som möjligt.
- Inuti en huv med laminärt flöde, håll de tvättade proverna nedsänkta i 70 % etanol i 1 minut (en bägare eller en glasburk kan användas).
- Överför proverna till en annan behållare med natriumhypoklorit med 2 % aktivt klor i 3 minuter.
- Byt ut proverna till en behållare med 70 % etanol och håll dem nedsänkta i 1 min. Tvätta sedan proverna sekventiellt i två behållare med destillerat vatten.
- Installation av växtfragment i odlingsmedium
OBS: Varje steg som beskrivs i steg 2.2 måste utföras inuti en huv med laminärt flöde.- Före installation, förbered petriskålar (8-10 cm i diameter) med 19,5 g/L potatisdextrosagarodlingsmedium (PDA) + 7 g/L bakteriologisk agar + 3 ml/L antibiotika (t.ex. streptomycin, penicillin, tetracyklin, ampicillin).
- Förvara petriskålarna med odlingsmediet vid 36 °C i 24 timmar innan du använder dem för att säkerställa att de inte är kontaminerade. Kassera rätter som är förorenade med bakterier eller svampkolonier.
OBS: Tillsatsen av antibiotika i mediet är viktigt i detta steg, eftersom organen är mycket infekterade av bakterier som kan hämma svamptillväxt. Kontrollera om antibiotikan kan värmas upp under autoklavering; En del antibiotika måste tillsättas efter att mediet har svalnat till cirka 36 °C (innan det läggs i disken). - Omedelbart efter det att proverna har desinangripits vid ytligt angrepp och fortfarande i en huva med laminärt flöde, inokuleras några droppar destillerat vatten från den sista behållaren som användes för att tvätta proverna. Detta steg är viktigt för att utvärdera effekten av ytlig desinfektion av prover.
- I en tom autoklaverad skål, placera proverna och använd en flammad skalpell och pincett för att dela proverna till en tjocklek av cirka 0,2 cm.
- Dela cylindriska prover i längdriktningen i två halvor om så önskas för att förstärka ytan i kontakt med mediet. För att bättre exponera frukter och andra mer sfäriska organ, hacka eller skiva strukturerna noggrant. Fröna kan också vara viktiga svampkällor, så se till att den delade frukten utsätter dem för mediet.
OBS: Endast friska organ, utan vävnadsskador eller signaler på möjliga sjukdomar eller patogena infektioner, bör användas vid isolering av svampendofyter. - Fördela fem fragment av de underjordiska organen i petriskålarna med PDA + antibiotika. Se till att fragmenten är så långt borta från varandra som möjligt och inte heller vidrör skålens kanter. Ordna inte några fragment på mediet. Förbered replikat av varje installerat organ som en försiktighetsåtgärd i händelse av kontaminering.
- Förslut petriskålarna med plastfolie och förvara dem i mörker vid 25-27 °C (helst i en inkubator) i 5 dagar.
- Analys av isoleringsfrekvens (IF)11
- Efter 5 dagars inkubation av organfragment beräknas IF enligt antalet inkuberade fragment som bildar växande svampkolonier dividerat med det totala antalet inkuberade fragment, som representeras av följande ekvation:
- Efter 5 dagars inkubation av organfragment beräknas IF enligt antalet inkuberade fragment som bildar växande svampkolonier dividerat med det totala antalet inkuberade fragment, som representeras av följande ekvation:
- Rening av svampisolat genom strimmighet och subkulturering
OBS: Varje steg som beskrivs i steg 2.4 måste utföras inuti en huv med laminärt flöde.- Förbered petriskålar (5 cm i diameter) med 5-7 g/L agar-agar (AA; endast bakteriologisk agar). Förvara disken i 24 timmar vid 36 °C för att eliminera eventuellt förorenade diskar.
- Identifiera varje odlad svampkoloni med en kod och avgränsa dess marginaler på undersidan av skålen (kan göras med en permanent markör). Differentiera kolonierna efter färg, tillväxtmönster, textur och marginalformat.
- Med en autoklaverad tandpetare i trä, använd den fina spetsen, återvinn en liten mängd mycel från en svampkoloni. Koncentrera dig helst på kolonins kanter och välj ett område så långt som möjligt från ett annat samhälle, undvik att återhämta mer än en typ av samhälle på en gång.
- Använd samma tandpetare med mycel i spetsen och strimla AA så att det bildas tre striae (spår). Se till att varje stria är på ett avstånd av 1 cm från en annan och att skålen kantas. Skriv lämplig kod (använd klistermärkespapper och penna), försegla skålarna och låt dem inkuberas i mörker vid 25-27 °C i 3 dagar.
- Tillaga petriskålar (8 cm i diameter) med 39 g/L PDA. Det är inte nödvändigt att lägga till antibiotika i detta skede.
- Efter att ha inkuberat AA-skålarna, observera dem noggrant mot ljus (från en lampa eller ett fönster), i syfte att identifiera fina hyfer som bildar enskilda kolonier. Avgränsa arean av en enskild koloni per maträtt med hjälp av en permanent markör på undersidan av petriskålen.
- I en huva med laminärt flöde, använd en autoklaverad tandpetare för att skära en del av mediet som innehåller kolonin och överföra den skurna volymen till mitten av en ny PDA-skål.
- Identifiera petriskålarna med isolatens koder, försegla skålarna med plastfolie och förvara dem i mörker vid 25-27 °C i 7-14 dagar.
3. Konservering av renade svampisolat
OBS: Varje material, lösning och reagens som används i detta avsnitt måste vara sterila. De som inte kan köpas redan steriliserade bör autoklaveras vid 121 °C i 20 minuter.
- Konservering med Castellanis metod eller i mineralolja (3-6 månader)11,15
- Förbered 2 ml mikrocentrifugrör med 0.5 ml destillerat vatten eller innehållande 0.5 ml mineralolja (beroende på vald metod). Se till att rören är autoklaverade tomma och att det autoklaverade vattnet och oljan tillsätts till rören inuti en huv med laminärt flöde.
- Placera petriskålarna med renade isolat som redan odlats i PDA (39 g/L) i 7-14 dagar i en huva med laminärt flöde. Använd en autoklaverad tandpetare och skär små rätblock (0,5 cm x 0,5 cm i övre området) av medium som innehåller mycelets kanter.
- Placera fyra till sex rätblock i mikrocentrifugrören med destillerat vatten (Castellanis metod) eller mineralolja. Förvara rören mörkt, vid 25 °C så länge som det behövs, med beaktande av metodens tidsbegränsningar.
OBS: Undvik att lägga till för många rätblock i rören och göra dem fulla, vilket kan öka risken för kontaminering. Det är möjligt att hålla rören kylda, vilket kan gynna bevarandet av vissa isolat längre. Currah et al.16 rekommenderar att replikat av mykorrhizasvampisolat från tropiska orkidéer förvaras både i kylskåp och vid 25 °C, eftersom de kan gå förlorade när de förvaras i kylrum. - Återställ en rätblocksform och placera den i mitten av en ny PDA-skål för att odla ett lagrat isolat.
- Kryokonservering i oskalade riskorn (>1 år)17
- Tvätta oskalade riskorn i rinnande vatten och koka dem tills risskalet börjar öppna sig. Fördela de kokta kornen i glasprovrör med skruvlock och autoklav två gånger med 24 timmars mellanrum.
- Placera petriskålarna med renade isolat som redan odlats i PDA (39 g/L) i 7-14 dagar i en huva med laminärt flöde. Använd en autoklaverad tandpetare, återvinn fem små hyffragment från mycelets kanter och inokulera dem i röret som innehåller autoklaverade riskorn.
OBS: Inokulering av hyfer på olika punkter och djup i röret garanterar att isolatet koloniserar de oskalade riskornen på kortare tid. - Inkubera rören i mörker vid 25-27 °C i 14 dagar. Rör om rören genom att virvla dem var 3:e dag för att hålla kornen individualiserade.
- Efter att ha observerat svamptillväxt i riskornen, fördela kornen i en autoklaverad petriskål fodrad med filterpapper för att absorbera fukt, över pappret så att kornen kan torka. Förvaras mörkt vid 25-27 °C i 2-3 dagar.
- Förbered kryorör med 1/3 kiselgel i botten och 1/3 glasull ovanför kiseldioxiden. Fördela slutligen 1/3 av riskornen med odlat svampmycel. Förvaras vid -20 °C i 24 timmar.
- Efter 24 timmar förvaras kryorören vid -80 °C så länge som det behövs, med beaktande av metodens tidsbegränsningar.
- Kryokonservering i vermikulit med kryoprotektivt medel (>1 år)18
- Bered ett flytande odlingsmedium bestående av 0,2 % jästextrakt och 2 % glukos i destillerat vatten. Justera pH-värdet till 5 och autoklavera det.
- Fördela 0,2 g vermikulit (använd finkornig granulometri) i kryorör med skruvlock och autoklavera dem. Tillsätt 0,8 ml autoklaverat flytande medium till kryorören som innehåller vermikulit.
- Placera petriskålarna med renade isolat som redan odlats i PDA (39 g/L) i 7-14 dagar i en huva med laminärt flöde. Använd en autoklaverad tandpetare, återvinn tre till fem hyferfragment från mycelets kanter och inokulera längs röret som innehåller vermikulit + flytande odlingsmedium. Kom ihåg att identifiera kryorören med respektive isolatkod.
OBS: Inokulering av hyfer i olika punkter och djup av kryoröret garanterar att isolatet koloniserar vermikulit på kortare tid. - Förvara kryorören mörkt vid 25-27 °C tills kolonisering av de flesta vermikulitkornen kan observeras, vilket vanligtvis tar cirka 14 dagar.
- Bered en kryoprotektorativ lösning bestående av 5 % glycerol och 5 % trehalos i destillerat vatten och autoklavera den. Låt lösningen svalna innan du använder den.
- Efter att vermikulit i kryorör har koloniserats av respektive svampisolat, fördela 0,4 ml kryoprotektivt medel i varje rör och förvara kryorören i kylskåp vid 4 °C i 48 timmar. Behåll sedan kryorören vid -80 °C så länge som det behövs, med beaktande av metodens tidsbegränsningar.
4. Makromorfologisk karakterisering av filamentösa svampar (kolonimorfologi)
- För ett fotografiskt register över mycelet som odlas i varje petriskål med 39 g/L PDA i 7-14 dagar. Kom ihåg att registrera båda sidorna av kolonin, övre och undre (omvänt). Om disken lätt kommer att användas i avsnitt 6 eller inte underhållas, öppna disken när du fotograferar dem för att få bättre bilder.
- Om du är intresserad av kvantitativa data om kolonins morfologi, replikerar subkulturen isolaten och bibehåller dem under samma odlingsförhållanden och under en konstant period för att registrera kolonins diameter och beräkna tillväxthastigheten (vanligtvis i mm/h).
OBS: Mer sofistikerade kvantitativa resultat kan uppnås genom att använda olika typer av odlingsmedier för jämförelse19 och genom att ta hänsyn till statistikverktygen för att behandla data. - Observera kolonierna under ett stereomikroskop samt för att identifiera morfologiska egenskaper och fotografera i förstoring. Utvärdera kolonierna enligt deras makromorfologiska egenskaper, som beskrivs i resultatavsnittet. Konsultera olika bibliografiska källor för att hjälpa till att kategorisera och relatera makromorfologin till molekylär och/eller morfologisk identifiering.
5. Mikromorfologisk karakterisering av filamentösa svampar (hyfmorfologi)
OBS: De mikromorfologiska teknikerna jämförs i diskussionsavsnittet, med hänsyn till deras möjliga användningsområden och nackdelar.
- Odla isolaten på petriskålar med 39 g/L PDA i 7-14 dagar. För att utvärdera förmodade orkidémykorrhizasvampar, odla isolaten på 17 g/L majsmjölsagar (CMA; eller annat näringsbegränsande medium) i 3-7 dagar19.
- Retas montera
- Arbeta inuti en huv med laminärt flöde. Placera en droppe av en vald fläck (steg 5.5) på en ren glasskiva.
- Använd en autoklaverad tandpetare eller annat sterilt material för att försiktigt ta bort några hyfer från det odlade isolatet och placera dem i fläcken. Placera ett täckglas (helst i en initial vinkel på 45° för att undvika luftbubblor) och analysera under ett ljusmikroskop.
- Fäste för självhäftande tejp
OBS: Denna teknik används vanligtvis i svampkulturer som lätt kan användas i avsnitt 6 eller inte underhållas, eftersom tejpen inte kan autoklaveras och kontaminering kan uppstå efter att metoden har utförts.- Placera en droppe av en vald fläck (steg 5.5) på en ren glasskiva. Klipp en remsa genomskinlig tejp i en storlek som passar glasskivan och den centrala fläcken faller bra.
- Rikta remsans klibbiga yta mot mycelets yta. Tryck inte, och försök att samla några hyfer utan att fastna för många av dem.
- Fäst tejpen på glasskivan och se till att fläcken är i kontakt med de uppsamlade hyferna. Lägg en droppe vatten ovanför tejpen och placera ett täckglas. Analysera objektglaset under ett ljusmikroskop.
- Objektglaskultur av filamentösa svampar20
- Inuti en stor petriskål (helst >9 cm i diameter), placera: filterpapper i den nedre delen, en U-formad glasstav eller en anpassning (syftet är att ge en upphöjning för glasglaset), en glasskiva och två täckglas. Högre petriskålar underlättar manipulationen. Autoklavera dessa kit med petriskålar, en för varje isolat.
- Förbered en liten volym 39 g/L PDA eller 17 g/L CMA, tillsätt 10 g/L bakteriologisk agar och autoklav (volymen för en petriskål räcker till mer än 30 isolat). De kulturmedier som används i diabildskulturen måste vara hårdare än vanliga medier. Autoklav 100 ml destillerat vatten.
- Arbeta inuti en huv med laminärt flöde. Lägg det flytande mediet i en petriskål och få ett lager som är cirka 0,5 cm högt. Låt mediet stelna. När den är fast, använd en steril skalpell för att skära rutor av mediet som är 1 cm x 1 cm i dimension.
- Öppna petriskålsatsen inuti en laminär flödeshuv och använd flammig pincett för att organisera materialet autoklaverat inuti skålen. Ordna materialet i numrerad ordning, som visas i figur 2A, och placera en fyrkant med odlingsmedium på glasskivan. Innan du placerar täckglaset över mediet, fortsätt till steg 5.4.5.
- Använd en autoklaverad tandpetare för att återvinna några hyfer från ett isolat och gnugga försiktigt de fyra laterala ytorna på mediet som placerats på glasglaset. Placera en autoklaverad täckglas över mellanrutan med en flammande pincett.
- Använd en steril pipettspets för att placera autoklaverat vatten i filterpapperet för att skapa en fuktig kammare. Använd en volym för att mätta papperet utan att hälla vatten i överskott. Försegla petriskålen med plastfolie och identifiera den med respektive isolatkod. Förvara disken i mörker vid 25-27 °C i 3-7 dagar.
- Utvärdera hyfernas tillväxt i glasglaset och täckglaset. Två objektglas tillverkas från varje odlingskit, ett med hjälp av glasglaset med hyfer och det autoklaverade täckglaset, det andra med täckglaset med hyfer och ett annat glasglas.
- Efter att hyftillväxt har observerats, lossa försiktigt kvadraten av mediet från glasglaset (Figur 2B), montera de två glasen med en vald fläck (steg 5.5) och analysera under ett ljusmikroskop. Kom ihåg att identifiera isolatkoden på bilden. För att producera semi-permanenta objektglas, försegla täckglaset med genomskinligt nagellack.
- För att producera permanenta objektglas, tvätta försiktigt färgämnet från vidhäftade hyfer efter färgning och låt objektglaset torka. Montera med ett snabbmonteringsmedium (för detaljer, läs Pena-Passos et al.10).
OBS: Nackdelen med att producera ett permanent objektglas med denna teknik är att sporer och strukturer som inte fästs på glaset kan tvättas.
- Färgningsmetoder och hyfobservation
- Lactophenol cotton blue (LPCB)21: Tillsätt 20 ml mjölksyra, 40 ml glycerol och 20 ml destillerat vatten. Lös upp 20 g fenolkristaller i denna lösning genom försiktig upphettning. Lös upp 0,05 g metylblått (bomullsblått, eller 2 ml 1% vattenlösning). LPCB kan också enkelt köpas redan förberedd.
VARNING: Fenol är mycket giftigt och flyktigt; Manipulera den uteslutande inuti ett dragskåp och använd handskar. - Toluidinblått O10 (TBO): Bered 0,05 % TBO i 0,1 M fosfatbuffert (pH 6,8).
- Kongorött22,23,24: Bered en lösning av 1% Kongorött i destillerat vatten och filtrera det. Inkubera i 5-10 min. Detta färgämne kan även användas för fluorescensmikroskopi25.
- När du observerar och fotograferar svamphyfer under ett ljusmikroskop, konsultera olika bibliografiska källor för att hjälpa till att identifiera strukturer (se diskussionen).
- Lactophenol cotton blue (LPCB)21: Tillsätt 20 ml mjölksyra, 40 ml glycerol och 20 ml destillerat vatten. Lös upp 20 g fenolkristaller i denna lösning genom försiktig upphettning. Lös upp 0,05 g metylblått (bomullsblått, eller 2 ml 1% vattenlösning). LPCB kan också enkelt köpas redan förberedd.
Figur 2: Förfaranden för odling av objektsglas av filamentösa svampar . A) Schematisk konfiguration av en odlingssats för objektglas, där siffrorna anger i vilken ordning elementen är placerade. (B) Lossning av odlingsmediets kvadrat efter det att hyftillväxt observerats i glasglaset och täckglaset. Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Total DNA-extraktion från svampisolat (hemlagat protokoll26 med modifieringar 27)
OBS: Varje material, lösning och reagens som används i detta avsnitt måste vara sterila. De som inte kan köpas redan steriliserade bör autoklaveras vid 121 °C i 20 minuter. Använd handskar under hela protokollet och utför några steg i ett dragskåp.
- Förbered extraktionsbufferten: 1 % natriumdodecylsulfat (SDS), 250 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 8,0) och 25 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Odla de renade isolaten i 39 g/L PDA i 7-14 dagar.
- Skrapa försiktigt mycelet från ett isolat med en spatel eller en sked och överför fragmenten till en autoklaverad mortel, undvik att överföra odlingsmediet med hyfaggregatet. Använd en mortelstöt av porslin och mal mycelet med flytande kväve till ett fint pulver. Låt inte mycelet som mals smälta, tillsätt kväve för att undvika det.
- Tillsätt 1 ml extraktionsbuffert i ett 2 ml mikrocentrifugrör och placera jordprovet tills 1.5 ml markeringen. Rör försiktigt om innehållet i rören för att homogenisera.
- Rör om rören i en virvel i 5 s och placera dem i ett termoblock vid 65 °C i 20 minuter. Homogenisera innehållet försiktigt genom invertering var 7-10:e minut.
- Centrifugera rören vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Överför 800 μL från den övre fasen till ett nytt 2 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 800 μL fenol till rören och blanda innehållet genom inversion.
VARNING: Fenol är ett mycket giftigt och flyktigt reagens; Det kan orsaka erytem, kallbrand och vävnadsnekros. Vid inandning kan det orsaka andnöd och hosta. Den systemiska absorptionen kan skada levern, njurarna och det centrala nervsystemet. Manipulera fenol uteslutande inuti ett dragskåp och använd handskar.
OBS: Från och med nästa steg, använd handskar och utför protokollet inuti ett dragskåp. - Centrifugera rören vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 °C och överför 800 μl från den övre fasen till ett nytt 2 ml rör, undvik noggrant överföring av innehållet i den lägre fasen.
- Tillsätt 400 μl fenol och 400 μl kloroform till rören och blanda innehållet genom inversion. Centrifugera dem vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
VARNING: Kloroform är ett mycket giftigt och flyktigt reagens; Det kan orsaka irritation och skador vid kontakt med huden, och vid inandning påverkar det centrala nervsystemet och hjärt- och andningssystemet, levern och njurarna. Manipulera kloroform uteslutande inuti ett dragskåp och använd handskar. - Rekuperera 800 μL eller mindre från den övre fasen till ett nytt 2 ml rör. Tillsätt 800 μl kloroform, blanda innehållet genom invertering och centrifugera vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
OBS: I detta steg får inga rester från den nedre fasen överföras till nya rör. Var därför extra försiktig när du återhämtar den överlägsna fasen. - Överför 600-800 μL från den övre fasen till ett nytt 1,5 ml rör och tillsätt 450 μL isopropanol. Blanda innehållet genom att vända upp och ner och inkubera vid 25 °C i 5 minuter.
- Centrifugera rören vid 10 000 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten med en mikropipett. Var försiktig så att du inte kastar pelleten som deponeras i botten av röret.
- Tillsätt 500 μl 80 % etanol och centrifugera i 5 min. Upprepa två gånger om pelleten inte klarnar.
- Ta bort etanolen med en mikropipett och torka pelleten vid 37 °C i 30-60 minuter. Tillsätt 30-50 μL avjoniserat vatten och eluera pelleten med hjälp av en mikropipett.
- Håll rören vid 4 °C över natten för fullständig DNA-eluering och frys innehållet vid -20 °C.
7. Total DNA-extraktion från växtorgan för metastreckkodningsmetodik (kommersiellt kit)
OBS: För följande metodik är det nödvändigt att köpa det kommersiella kit som anges i materialtabellen som ett jord-DNA-extraktionskit. Varje material, lösning och reagens som används i detta avsnitt måste vara sterila. De som inte kan köpas redan steriliserade bör autoklaveras vid 121 °C i 20 minuter. Det rekommenderas starkt att bära handskar under hela protokollet, och stegen kan utföras inuti en huva med laminärt flöde. Det beskrivna protokollet är modifierat från De Souza et al.12, från det protokoll som beskrivs av tillverkaren.
- Mal rötterna som samlats in enligt steg 1.2 i flytande kväve med hjälp av mortelstötar och mortlar av porslin och reducera proverna till ett fint pulver. Tillsätt 0,3 g från de malda proverna till PowerBead-rören och rör försiktigt om för att homogenisera.
- Tillsätt 60 μl lösning C1 (ingår i satsen) till PowerBead-rören och blanda innehållet genom att vända upp och ner på innehållet. Använd en vävnadshomogenisator och celllysör (Materialtabell), bind rören ordentligt till ett lämpligt stöd, koppla stödet till virveln och starta utrustningen med maximal hastighet i 10-20 minuter.
OBS: Om C1-lösningen fälls ut, värm den till 60 °C tills den är helt upplöst. - Centrifugera rören vid 10 000 x g i 30 s vid 25 °C. Överför 500 μl av supernatanten till 2 ml mikrocentrifugrör. Det överförda innehållet kan vara partiklar.
- Tillsätt 250 μl lösning C2 till rören och skaka i en virvel i 5 s. Inkubera vid 4 °C i 5 minuter och centrifugera sedan vid 10 000 x g i 1–2 minuter vid 25 °C.
- Överför mer än 600 μl av supernatanten till nya 2 ml rör, undvik pelleten. Tillsätt 200 μl lösning C3 och rör om i en virvel i 5 s.
- Inkubera vid 4 °C i 5 minuter och centrifugera sedan vid 10 000 x g i 1 minut vid 25 °C. I detta skede, se till att supernatanten inte är partikelformig.
- Överför mer än 750 μl av supernatanten till nya 2 ml rör, undvik pelleten. Homogenisera lösningen C4 väl, tillsätt 1 100 μl lösning C4 till supernatanten och skaka i en virvel i 5 s.
- Fyll på 675 μl från rören i MB-centrifugeringskolonnerna över filtret och centrifugera vid 10 000 x g i 1 minut vid 25 °C. Kassera det flytande innehållet.
- Upprepa föregående steg två gånger tills allt innehåll i varje rör har bearbetats. Tillsätt sedan 500 μl lösning C5 i mitten av filtret vid rörets övre kolonn och centrifugera vid 10 000 x g i 30 s vid 25 °C.
- Kassera vätskeinnehållet och centrifugera igen under samma förhållanden som föregående steg. Överför försiktigt den överlägsna kolonnen i MB Spin-kolonnen till nya 2 ml mikrocentrifugrör, undvik att droppa något vätskeinnehåll i kolonnen.
- Tillsätt 85-100 μL lösning C6 till mitten av filtret och vänta 1 min. Centrifugera vid 10 000 x g i 30 s vid 25 °C och kassera MB Spin Column. Förvara rören vid -80 °C.
8. DNA-kvantifiering i en spektrofotometer (se materialtabellen)
- Öppna programvaran med hjälp av den angivna spektrofotometern. Välj alternativet Nukleinsyra, välj alternativet DNA och ställ in koncentrationen till ng/μL.
- Tillsätt 1 μL avjoniserat vatten till spektrofotometerdetektorn och kalibrera genom att välja alternativet Blank. Efter läsning, torka försiktigt av detektorn med mjukpapper.
- Namnge fältprovet med isolatkoden för det prov som ska avläsas och placera 1 μL av det i utrustningsdetektorn. Välj alternativet Mäta; En graf och en tabell med resultaten genereras.
- Upprepa steg 8.3 tills alla samples har lästs. Vi rekommenderar att du sparar tabellen med de genererade resultaten för registrering och analys: välj alternativet Rapporter och den plats där .xml filen ska sparas.
- Tillsätt 5 μL avjoniserat vatten till detektorn, vänta några minuter och torka försiktigt av den med mjukt silkespapper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I isoleringsprotokollet, med tanke på att det finns kontaminering från vattnet som användes vid den senaste tvätten och kontamineringen också detekteras i petriskålarna med inokulerade fragment, kan olika åtgärder vidtas beroende på typen av förorening (tabell 1). Detta förfarande måste upprepas från början när det gäller starkt sporulerande svampföroreningar, som också uppvisar accelererad tillväxt, och intensivt förökande bakterier som är resistenta mot de valda antibiotikana. Istället, om svampföroreningen uppvisar långsam tillväxt eller inte sporulerar, är det möjligt att helt enkelt undvika att isolera den i de efterföljande stegen i protokollet. Slutligen kan kontaminering med bakteriestammar som förökar sig långsamt också lätt undvikas i de bakre stegen, särskilt vid rening, vid återhämtning av hyfer.
I alla de fall som tidigare presenterats är det ideala scenariot att göra om desinfektionsproceduren med hjälp av andra prover och installera växtfragmenten i ett odlingsmedium som kombinerar andra antibiotika, med ett bredare verkningsspektrum, i fall av resistenta bakterier som kontaminerar de första rätterna. Med tanke på svårigheterna med att samla in nya prover och få organ från mykoheterotrofa växter kan dock vissa fall lösas framgångsrikt i de bakre stadierna av protokollet, vilket presenteras i tabell 1.
| Förorenande ämne | Förorenande egenskaper | Möjliga konsekvenser av kontaminering | Obligatorisk åtgärd | |||
| Bakterier | Intensiv multiplikation | Total eller partiell hämning av tillväxten av endofyter av intresse | Starta om isoleringen från början | |||
| Långsam multiplikation | Isolering av bakterierna tillsammans med endofyten av intresse | Undvik bakteriekolonier under rening | ||||
| Svampar | Kraftig tillväxt och/eller mycket sporulerande | Gör det omöjligt att isolera och/eller rena endofyter av intresse | Starta om isoleringen från början | |||
| Långsam tillväxt och/eller icke-sporulerande | Isolering av föroreningen av misstag | Undvik isolering av föroreningen | ||||
Tabell 1: Beskrivning av möjliga föroreningar i processen för isolering av endofytiska svampar, kontamineringskonsekvenser och begränsningsförfaranden.
Efter 5 dagar från installationen av organfragment i PDA-mediet är det möjligt att visualisera tillväxten av små grupper av filamentösa svampmycel som kommer ut från fragmentens inre (Figur 3). Varje mycelial morfotyp bör resultera i ett svampisolat i slutet av isoleringsprotokollet, med tanke på att var och en av dem måste strimmas i en ny petriskål med AA-medium för rening. Det rekommenderas att originalrätterna från fragmentinstallationen inte kasseras innan hela isoleringsprotokollet har slutförts. De kan förvaras i kylskåp vid 4 °C tills de renade kolonierna erhålls. När det gäller denna del av protokollet kan IF-analysen också vara till stor hjälp för att utvärdera andelen vävnadsprover som resulterar i isolerade svampar bland de totala installerade proverna.
Figur 3: Rotfragment för svampisolering i potatisdextrosagar. Odlingsbara endofytiska svampar som växer från rotfragmenten av en mykoheterotrofisk orkidé efter ca 5 dagars ruvning. Varje petriskål (A, B och C) innehåller fem rotfragment. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Efter 3 dagar efter inkubation av AA-skålarna för isolatrening bör små hyfkolonier, nästan omärkliga, ha vuxit från striae i AA-mediet. I detta skede, om det fanns någon kontaminering från långsamt växande bakterier i isoleringsskålarna, är det möjligt att dessa bakterier också överfördes till AA-skålarna med de utvalda svampendofythyferna. Om så är fallet kommer bakterierna att begränsas till stria-regioner, med liten tillväxt jämfört med svampen, vilket gör det möjligt att återhämta sig från enbart den svamp som är av intresse för nya PDA-rätter.
Under 7-14 dagars inokulering av de renade svampisolaten i PDA-skålar måste den rena kolonin växa centrifugalt (från mitten av skålen till dess periferi) och bilda ett enda cirkulärt mycel (figur 4). Möjliga föroreningar är lätta att identifiera i detta skede, eftersom de avsevärt äventyrar kolonins homogenitet när det gäller dess tillväxt, form, aspekt, färg, pigmentproduktion i mediet etc. (Figur 5). Om man antar att de slutliga kolonierna inte är rena, måste de svampar som ursprungligen odlats från organfragmenten på nytt genomgå reningsprocedurer, genom strimmor och subkulturation (steg 2.4). Det är möjligt att rekuperera isolaten från antingen de ursprungligen installerade organen eller de slutliga isoleringsskålarna som innehåller heterogena kulturer.
Figur 4: Representation av renade svampisolat, odlade i 7-14 dagar i ett PDA-odlingsmedium. I den första och tredje kolumnen (A, C, E, G, I och K) ses de registrerade kolonierna från ovansidan. den andra och fjärde kolumnen (B, D, F, H, J och L) visar samma kolonier, sett från undersidan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representation av orena svampisolat, odlade i 7-14 dagar i PDA-odlingsmedium. I den första kolumnen (A, D och G) ses en allmän bild av kolonierna från ovansidan; den andra kolumnen (B, E och F) visar kolonierna i detalj; den tredje kolumnen (C, F och I) visar kolonierna från undersidan. Siffrorna representerar olika svampmorfotyper som finns i varje maträtt, och linjerna representerar en subtil avgränsning mellan de olika svampisolaten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Konservering av isolat bör inte göras med en enda lagringsmetod, eftersom varje svamp kan vara mer eller mindre känslig för varje beskriven metod. Det är mycket tillrådligt att välja minst två typer av lagring för varje svampisolat, vilket garanterar fler chanser att lyckas bevara det. Vi betonar att olönsamheten för svampar som bevarats i Castellani eller mineralolja förväntas efter 6 månader eller mindre. Forskare bör överväga om dessa är de enda konserveringsmetoder som valts för att undvika eventuella oväntade förluster av isolat. För att förlänga denna begränsade period är det möjligt att återaktivera svampisolaten genom att odla dem i PDA-mediet (39 g/L) i 2-3 veckor och sedan lagra dem igen. Efter en tids lagring förväntas isolaten uppvisa en långsammare tillväxt, jämfört med den observerade tillväxthastigheten innan de konserverades, och kolonier med mindre kraftiga aspekter (dvs. mindre täta, annorlunda i färg). Subkulturodling några gånger i ett näringsrikt odlingsmedium är tillräckligt för att återupprätta sådana egenskaper.
Vid utvärdering av makromorfologin hos de kolonier som erhållits i isoleringsproceduren bör kvalitativa data samlas in, med hänsyn till så många egenskaper som möjligt: (a) Kolonins färg (ovan- och undersida), som kan analyseras med hjälp av tryckta färgguider (t.ex. Rayner28, Kornerup & Wanscher29, Ridgway30); b) Kolonins opacitet: genomskinlig, ogenomskinlig, genomskinlig. c) Diffuserbara pigment i mediet31 (förekomst/frånvaro och färg). d) Exsudat31 (förekomst/frånvaro, färg, allmänt utseende). e) Makroskopiska strukturer31 (förekomst/frånvaro, typ och utseende, t.ex. sklerotier, pyknidier). f) Mycel i luften och under vatten 19,32,21 (förekomst/frånvaro, förekomst av knappt eller rikligt förekommande förekomst); g) Marginalens utseende19 (färg, form, enhetlighet - nedsänkt eller i luften). och (h) kolonitopografi (hopad, skrynklig, krateriformad, platt, etc.), det allmänna utseendet och texturen - bomullsaktig, sammetslen, pudrig, ullig, talg (vaxartad), kal, kritaktig, slemmig, läderartad, taggig etc.19,21.
Figur 6: Makro- och mikromorfologi hos en oidentifierad svamp isolerad från den mykoheterotrofa orkidén Wullschlaegelia aphylla. (A) Övre och (B) nedre aspekter av kolonin, (C) förstärkt bild av flyghyferna (sett i ett stereomikroskop). Hyfernas mikromorfologi (D) utan färgning och färgad med (E) LPCB och (F) TBO. Förkortningar: c = konidiofor, p = phialid, s = septum. Skalstreck: A,B = 2 cm; C = 2 mm. D-F = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I figur 6 visas en koloni som isolerats från de fusiforma rötterna av den mykoheterotrofa orkidén Wullschlaegelia aphylla, med tillämpning av den beskrivna metodiken. Kolonin är vitaktig till grå på ovansidan (Figur 6A) och brunaktig på undersidan (Figur 6B). Den är ogenomskinlig, utan vare sig diffusa pigment i mediet eller exsudat. Mycelierna är luftiga och rikliga, kanterna är oregelbundna och luftiga, och kolonin har en sammetslen struktur och en skrynklig topografi (Figur 6A). Makroskopiska strukturer saknas.
Glasodlingsmetoden är traditionell och fördelaktig, och även om den är tidskrävande, kan den användas för att producera permanenta glasskivor som kan undersökas efteråt. De olika färgämnen som presenteras här kan användas för att påvisa viktiga strukturer, och de kräver tester i proverna för att bestämma den lämpligaste inkubationstiden. Kongorött och TBO är allmänna betser. Kongorött är tillräckligt för att visa några känsliga strukturer (vidare läsning: Malloch22). TBO färgar cellinnehållet mer intensivt än svampens cellvägg (Figur 6F). Även om TBO är ett vanligt färgämne för växtstrukturer och inte så vanligt inom svampmikroskopi, har det en viktig metakromatisk egenskap33, vilket gynnar andra tillämpningar, såsom svampanalys i växtvävnader10. LPCB är ett mycket applicerat färgämne vid svampanalys, även om det kräver försiktighet på grund av fenol. Bomullsblått (synonymt: metylblått) är fläcken, mjölksyra är ett clearingmedel och fenol är ett dödande medel21. LPCB har en affinitet för kitin och uppvisar sporväggar och ornament23,24. Svampsepta färgas varken av LPCB (figur 6E) eller TBO (figur 6F), vilket underlättar identifieringen av sådana strukturer. Applicering av fläckar är fördelaktigt för att visa strukturer som inte är lätta att se när hyfer inte är färgade (Figur 6D).
För DNA-extraktion från svampar och rotprover måste mängden markprov i flytande kväve som ska tillsättas extraktionsbufferten respekteras, och inte överstiga den mängd som anges i protokollet. Vi bör betona att en stor mängd bearbetade prover inte bara representerar en hög koncentration av DNA utan större nackdelar, eftersom det avsevärt kan äventyra den slutliga DNA-kvaliteten. Detta inträffar vid mättnad av de följande stadierna av DNA-rening. Dessutom kan koncentrerade förmodade föreningar som produceras av växter eller svampar (t.ex. pigment, sekundära metaboliter), som finns i den slutliga lösningen med DNA, verka för att minska DNA-kvaliteten och/eller hämma polymeraskedjereaktion (PCR). En annan fråga som avsevärt kan minska DNA-kvaliteten är att skrota odlingsmediet helt och hållet med svampmycel och mala det, vilket måste undvikas starkt. Vissa reagenser från extraktionsproceduren (t.ex. fenol, etylalkohol, SDS) och andra ämnen (t.ex. svamppigment) kan vara hämmare som stör PCR.
I DNA-reningsstegen, vid användning av fenol och kloroform, måste supernatanten alltid representera fasen med färre föroreningar, normalt omfatta den tydligaste fasen. Under ett sådant stadium får den nedre fasen inte återhämtas när man strävar efter supernatanten som kommer att överföras till nya rör. I slutet av protokollet bör pelleten (som består av DNA) uppvisa en translucid (mycket önskvärd) till vitaktig färg. I torkningsstadiet är det grundläggande att fortsätta med torkning av DNA i ett termoblock för att helt avdunsta etanol. Efter 12 timmar vid 4 °C ska pelleten ha eluerats helt i den vattenlösning som tillsatts i rören, utan att vara synlig efter det. Om elueringen inte är fullständig och DNA-koncentrationen ligger långt under den ideala koncentrationen, är det möjligt att hålla lösningen kyld i ytterligare 12 timmar, utan betydande kvalitetsförluster.
DNA-analyserna i programvaran genererar en tabell, som representeras i tabell 2, där data relaterade till DNA-kvantitet och -kvalitet anges. DNA-kvantifieringen ges av koncentrationen av nukleinsyror i nanogram per mikroliter av ett prov. Med tanke på den molekylära identifieringen av isolerade svampar bör DNA-prover ha en koncentration på cirka 200 ng/μL, vilket är idealiskt för PCR-stadier. När det gäller prover med högre koncentrationer av nukleinsyror bör en alikvot från provet spädas ut så att koncentrationen approximeras till det värde som tidigare nämnts. Prover med för höga koncentrationer, såsom prov 1 och 2 i tabell 2, kan tyda på en falsk detektion på grund av föroreningar i lösningen. Under tiden kan prover med lägre nukleinsyrakoncentrationer, såsom nummer 7 (tabell 2), fortfarande användas för PCR, vilket är viktigt för att applicera en högre volym av provet i reaktionerna. När det gäller kvalitetsparametrarna är det tillfredsställande att kvoterna 260/280 och 260/230 ligger mellan 1,8 och 2,2, vilket anges i urval 3, 5 och 8 (tabell 2). Prover som uppvisar sådana värden (som ligger mycket under eller över) bör genomgå nya DNA-extraktioner, vilket anges i urval 9 och 10 i tabell 2. När det gäller prover med tillräcklig mängd DNA och som minimalt överskrider det ideala kvalitetsintervallet, vilket föreslås av värdena 260/280 och 260/230 i punkterna 4 och 6 (tabell 2), är utspädning det mest fördelaktiga förfarandet för att göra nukleinsyrakoncentrationen tillräcklig för PCR och späda ut eventuella inhibitorer, t.ex. rudimentära reagenser från extraktionsförfarandet. i proverna.
| Prov | Nukleinsyra konc. | Enhet | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | Exempel på typ |
| 1 | 14491.7 | ng/μL | 289.833 | 141.175 | 2.05 | 1.8 | DNA |
| 2 | 13359.3 | ng/μL | 267.187 | 124.607 | 2.14 | 2.15 | DNA |
| 3 | 1137.6 | ng/μL | 22.751 | 10.574 | 2.15 | 2.13 | DNA |
| 4 | 1472.6 | ng/μL | 29.452 | 13.287 | 2.22 | 2.16 | DNA |
| 5 | 3464.8 | ng/μL | 69.295 | 33.329 | 2.08 | 1.88 | DNA |
| 6 | 1884.2 | ng/μL | 37.684 | 17.912 | 2.1 | 1.78 | DNA |
| 7 | 187.6 | ng/μL | 3.751 | 1.834 | 2.05 | 2.06 | DNA |
| 8 | 1580.3 | ng/μL | 31.607 | 15.281 | 2.07 | 1.98 | DNA |
| 9 | 923.3 | ng/μL | 18.466 | 9.196 | 2.01 | 1.37 | DNA |
| 10 | 2414.4 | ng/μL | 48.287 | 21.008 | 2.3 | 3.45 | DNA |
Tabell 2: Genererade resultat i programvaran från svamp-DNA-prover analyserade i en spektrofotometer.
Till skillnad från DNA-prover från isolerade endofytiska svampar bör DNA-koncentrationen i prover för metastreckkodsanalyser uppvisa enorma mängder extraherade DNA-molekyler, med hög kvalitet och molekylvikt. Proverna bör utvärderas genom elektrofores i agarosgel, för att uppnå största möjliga integritet, med liten eller ingen utstrykning i gelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ytliga desinfektionen av växtprover är ett av de mest kritiska stegen i det presenterade protokollet. Ingen kontaminering i PDA-disken med droppar från den senaste tvätten är mycket önskvärd. Bakterier observeras ofta som föroreningar i isoleringsskålarna, vanligtvis mer än luftburna sporbildande svampar, med tanke på att endofytiska bakterier också är vanliga i växtvävnader 3,11. Därför är det viktigt att tillsätta antibiotika i odlingsmediet vid installation av organfragmenten. Bättre resultat uppnås när olika antibiotikatyper kombineras, vilket resulterar i ett bredare spektrum av verkningsmedel. En annan viktig faktor är den inneboende partiskheten i att isolera svamparna, eftersom användning av PDA och AA oundvikligen kommer att välja vissa arter och missgynna andra. Kombinationen av andra kulturmedier kan minimera partiskheten, men inte eliminera sådana begränsningar9.
Generellt sett har svampar som producerar sporer när de växer i petriskålar högre överlevnadsgrad i konserveringsprotokoll, antingen i lägre temperaturer eller inte, och icke-sporulerande isolat kanske inte tolererar Castellanis eller mineraloljekonservering34,35,36, så en kryokonserveringsmetod kan vara avgörande i sådana fall. Dessutom kan vissa isolat vara känsliga för frysning, och tillsatsen av kryoprotektiva medel hjälper till med konserveringen, som i den presenterade metoden med vermikulit18. Kolonins och hyfernas egenskaper kan vara användbara för att gruppera isolaten med liknande egenskaper, vilket underlättar urvalet för användning i symbiotiska groningsbehandlingar (som beskrivs av Pena-Passos et al.10). Dessa egenskaper bidrar också till att välja vilka konserveringsmetoder som ska användas, särskilt med tanke på sporulering eller frånvaro av sporulering.
Morfologiskt karakterisering av isolaten förbättrar och kompletterar också morfologiska beskrivningar som finns tillgängliga i specialiserad litteratur, särskilt när de är associerade med molekylär karakterisering. Trots att det är en utmaning med många isolat är morfologiskt karakterisering av svampar tidskrävande och beroende av publicerade data. Även om endast den molekylära karakteriseringen är planerad att utföras, är det tillrådligt att upprätthålla ett fotografiskt register över kolonins utseende (makromorfologi) och publicera det när det är möjligt, för att bidra till framtida identifieringsprocedurer. Det är också viktigt att bevara foton av de paraboler där fragment är installerade, för att möjliggöra jämförelse mellan de slutliga erhållna isolaten och de morfotyper som observerats växa i installationsskålar. I ett sådant fall måste de jämförda svamparna odlas i samma typ av medium. Ytterligare metoder finns i Currah et al.16 för att utvärdera vanliga orkidémykorrhizasvampar, såsom odling på garvsyramedium (TAM) för att differentiera släktena Epulorhiza (teleomorf: Tulasnella) och Ceratorhiza (teleomorf: Ceratobasidium), och odling på CMA för att stimulera monilioida celler för karakterisering av svampar från Rhizoctonia-komplexet .
Med tanke på de detaljerade metoderna för att observera svamphyfer under ett ljusmikroskop är tease-montering och tejpmontering snabbare än objektglasodling, även om tease-monteringsmetoden inte är lämplig för att analysera sporer och mäta grenvinklar. Självhäftande tejpfäste bevarar mycelets organisation bättre än tease mount-tekniken, även om det inte är lika tillförlitligt att använda tejp som diabildskultur för att mäta grenvinklar (författarnas observation). Objektglaskultur, trots att det är tidskrävande, är den mest lämpliga tekniken för att producera semipermanenta och permanenta objektglas. Makro- och mikromorfologi analyseras med hänsyn till litteraturen. Webster och Weber32 är en omfattande allmän informationskälla och ytterligare referenser. Currah et al.16 och Zettler och Corey37 ger användbar information om orkidémykorrhizasvampar. Även om Walsh et al.21 och McGinnis31 beskriver svampar av medicinsk betydelse är de också till hjälp när det gäller allmänna egenskaper hos filamentösa svampkolonier, visuell/beskrivande information och ytterligare referenser för svampmikromorfologi.
Enligt Yu et al.38 uppvisar DNA-kvantifieringsanalyserna i en spektrofotometer stor precision och noggrannhet, vilket överensstämmer med kvantitativa PCR-analyser i realtid. En viktig observation är att vissa isolat kanske inte ger DNA-prover som är tillräckligt rena för de efterföljande molekylära identifieringsstadierna, eftersom mykoheterotrofers svampendofyter är extremt olika, särskilt de som är associerade med tropiska växter39, liksom de producerade metaboliterna. Spektrofotometeranalyser kan användas för att utvärdera sådana fall och olika protokoll, eller kommersiella kit som används för DNA-rening av proverna. De föreslagna efterföljande stegen i den molekylära identifieringen av isolat är amplifiering av den interna transkriberade spacerregionen (ITS) och sekvensering. ITS-regionen är ett ribosomalt RNA-spacer-DNA som används i stor utsträckning i den specialiserade litteraturen och formellt accepteras som den huvudsakliga streckkoden för svampidentifiering 9,40. Den kan förstärkas med PCR med primrarna ITS1 och ITS441 och sedan sekvenseras i Sanger-plattformen42.
Metastreckkodningsanalyser kan, förutom att möjliggöra undersökning av mikroorganismernas rikedom, förekomst och taxonomiska sammansättning i miljö- och växtprover, ge resultat av positiva eller negativa interaktioner mellan dessa mikroorganismer12. Macerationssteget med flytande kväve som lagts till i DNeasy PowerSoil-standardprotokollet syftar till att bryta så många svampceller som möjligt i förhållande till växtvävnader, vilket möjliggör bättre provtagning av svampsamhället i den macererade vävnaden11. Primerval för svampsekvenser (streckkoder) vid molekylär identifiering måste ta hänsyn till interferens med växt-DNA. Vi rekommenderar användning av primers som förstärker variabla regioner av svampens 18S-gen, till exempel ITS1-5,8S-ITS243. Efter att ha erhållit DNA-proverna är de efterföljande stegen att förbereda de metagenomiska biblioteken, som beror på den valda sekvenseringsplattformen, posterior sekvensering av biblioteken och analysera de erhållna uppgifterna med hjälp av bioinformatiska verktyg. Vi rekommenderar att du använder plattformen Illumina MiSeq, som representerar ett billigare alternativ med hög effekt, som genererar 250 bp-sekvenser på korta tidsperioder 11,44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja och ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar för finansiering från FAPESP (2015/26479-6) och CNPq (447453/2014-9). JLSM tackar CNPq för produktivitetsbidrag (303664/2020-7). MPP tackar Capes (masterexamensstipendium, process 88887.600591/2021-00) och CNPq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | (from any company, for adhesive tape mount in micromorphological analyses) | ||
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A5354 | (for installation of plant fragments; other antibiotics may be used - check step 2.2.1) |
| Autoclave | (from any company, for materials sterilization in many steps) | ||
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A1296 | (for many steps) |
| C1, C2, C3, C4, C5, and C6 solutions | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
| Centrifuge | Merck/Eppendorf | 5810 G | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Centrifuge tubes | Merck | CLS430828 | (for samples collection) |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Congo red | Supelco | 75768 | (for hyphae staining) |
| Cryotubes | Merck | BR114831 | (for many steps) |
| Ethanol | Supelco | 100983 | It will be necessary to carry out the appropriate dilutions (for many steps) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Filter paper | Merck | WHA10010155 | (for many steps) |
| Glass test tubes | Merck | CLS7082516 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
| Glass wool | Supelco | 20411 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Or dextrose (for cryopreservation in vermiculite) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Or glycerin (for cryopreservation in vermiculite, for preparing LPCB) |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Lactic acid | Sigma-Aldrich | 252476 | (for preparing LPCB - hyphae staining) |
| Lactophenol blue solution (LPCB) | Sigma-Aldrich | 61335 | (for hyphae staining) |
| Laminar flow hood | (class I, from any company, for many steps) | ||
| Light microscope | (from any company, for hyphae observation) | ||
| MB Spin Columns | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
| Methyl blue (cotton blue) | Sigma-Aldrich | M5528 | (for preparing LPCB - hyphae staining) |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Merck | HS4323 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Merck | BR780546 | (for many steps) |
| Mineral oil | (for preservation of fungal isolates) | ||
| Paper bags | Average size 150 mm x 200 mm (for samples collection) | ||
| Petri dish (Glass, 120 mm x 20 mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (autoclavable, for fungi slide culture, prefer higher ones) |
| Petri dish (Glass, 50 mm x 17 mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (for purification of fungal isolates); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
| Petri dish (Glass, 80 mm x 15 mm) | Merck/Brand | BR455732 | (for installation of plant fragments); alternatively: polystyrene petri dishes (sterile, γ-irradiated, non-autoclavable) |
| Phenol | Sigma-Aldrich | P1037 | (for total DNA extraction from fungal isolates, for preparing LPCB) |
| Porcelain mortar | Sigma-Aldrich | Z247464 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Porcelain pestle | Sigma-Aldrich | Z247502 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Potato dextrose agar (PDA) | Millipore | P2182 | (for many steps) |
| PowerBead tubes | Qiagen | 12888-50 | (purchased with DNeasy PowerSoil kit) |
| Rapid mounting medium (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | (for fungi slide culture) |
| Silica gel | Supelco | 717185 | (for cryopreservation in unhulled rice grains) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Lauryl sulfate sodium salt (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Sodium hypochlorite (w/ 2% active chlorine) | (commercial product, for superficial desinfestation) | ||
| Soil DNA extraction kit (DNeasy PowerSoil kit) | Qiagen | 12888-50 | (for total DNA extraction from plant organs) |
| Spectrophotometer - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | (for total DNA extraction from plant organs) |
| Stereomicroscope | (=dissecting microscope, from any company, for macromorphological analyses) | ||
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | (for installation of plant fragments) |
| Thermoblock | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (or from other companies) |
| Tissue homogenizer and cell lyzer | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs) | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich/Harleco | 364-M | (for hyphae staining) |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T9531 | (for cryopreservation in vermiculite) |
| Tris Base Solution (Tris) | Sigma-Aldrich | T1699 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Unhulled rice grains | (for cryopreservation) | ||
| U-shaped glass rod | (or an adaptation - check step 5.4.1, for fungi slide culture) | ||
| Vermiculite | Fine granulometry (for cryopreservation in vermiculite) | ||
| Vortexer | Sigma-Aldrich/BenchMixer | BMSBV1000 | (for total DNA extraction from fungal isolates) |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | (for cryopreservation in vermiculite) |
References
- de Azevedo, J. L.
- Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
- Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes. Microbial Root Endophytes. , Springer-Verlag. Berlin. 1-13 (2006).
- Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. , Elsevier Science Academic Press. London. (2008).
- Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
- Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids. Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).
- Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship. Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).
- Sun, X., Guo, L. -D. Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques. Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).
- Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds. Journal of Visualized Experiments. (183), e63777 (2022).
- Araújo, W. L., et al. Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed. 1, Santarém: UFOPA. 257 (2014).
- de Souza, R. S. C., et al. Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome. Scientific Reports. 6, 28774 (2016).
- Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).
- Araújo, W. L., et al. Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks. Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).
- Castellani, A. Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water. Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).
- Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A.
- Freitas, E. F. S., et al. Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species. Scientific Reports. 10 (1), 7069 (2020).
- Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes. Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).
- Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Araújo, E. F. D. Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil. Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).
- Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
- Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification. , ASM Press. (2018).
- Malloch, D. Moulds: Isolation, Cultivation, Identification. , Available from: http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Moulds.html (1997).
- Smith, P. Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society. , Available from: https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents (2022).
- Senanayake, I. C., et al. Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation. Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).
- Slifkin, M., Cumbie, R. Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
- Raeder, U., Broda, P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).
- Martins, M. K., et al. Molecular characterization of endophytic microorganisms. Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition. , Santarém: UFOPA. 189-211 (2014).
- Rayner, R. W. A Mycological Colour Chart. Commonwealth Mycological Institute. , (1970).
- Kornerup, A., Wanscher, J. H. Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour. , Methuen & Co. Ltd. London. (1967).
- Ridgway, R. Color Standards and Color Nomenclature. , Washington, DC. Published by the author (1912).
- McGinnis, M. R. Laboratory Handbook of Medical Mycology. , Elsevier Science. (2012).
- Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Sridharan, G., Shankar, A. A. Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).
- Smith, D., Onions, A. H. S. A comparison of some preservation techniques for fungi. Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).
- Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).
- Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).
- Zettler, L. W., Corey, L. L. Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).
- Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer. Optik. 145, 555-560 (2017).
- Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
- Schoch, C. L., et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability. Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Metzker, M. L.
