Summary
Het huidige protocol bereidt en evalueert de fysieke eigenschappen, immuunrespons en in vivo beschermend effect van een nieuw nano-emulsie-adjuvans vaccin.
Abstract
Nano-emulsie-adjuvante vaccins hebben uitgebreide aandacht getrokken vanwege hun kleine deeltjesgrootte, hoge thermische stabiliteit en het vermogen om geldig immuunresponsen te induceren. Het vaststellen van een reeks uitgebreide protocollen om de immuunrespons van een nieuw nano-emulsie-adjuvansvaccin te evalueren, is echter van vitaal belang. Daarom bevat dit artikel een rigoureuze procedure om de fysisch-chemische kenmerken van een vaccin te bepalen (door transmissie-elektronenmicroscopie [TEM], atoomkrachtmicroscopie [AFM] en dynamische lichtverstrooiing [DLS]), de stabiliteit van het vaccinantigeen en -systeem (door een hogesnelheidscentrifugetest, een thermodynamische stabiliteitstest, SDS-PAGE en western blot) en de specifieke immuunrespons (IgG1, IgG2a en IgG2b). Met behulp van deze aanpak kunnen onderzoekers het beschermende effect van een nieuw nano-emulsieadjuvansvaccin in een dodelijk MRSA252 muismodel nauwkeurig evalueren. Met deze protocollen kan het meest veelbelovende nano-emulsievaccinadjuvans in termen van effectief adjuvanspotentieel worden geïdentificeerd. Bovendien kunnen de methoden helpen bij het optimaliseren van nieuwe vaccins voor toekomstige ontwikkeling.
Introduction
Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) is een opportunistische ziekteverwekker met een van de hoogste infectiepercentages op een intensive care unit (ICU) afdeling1, cardiologieafdelingen en brandwondenafdelingen wereldwijd. MRSA vertoont hoge infectiepercentages, mortaliteit en brede resistentie tegen geneesmiddelen, wat grote problemen oplevert bij klinische behandeling2. In de wereldwijde prioriteitenlijst van antibioticaresistente bacteriën die in 2017 door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) werd vrijgegeven, werd MRSA opgenomen in de meest kritieke categorie3. Een vaccin tegen MRSA-infectie is daarom dringend nodig.
Aluminiumadjuvans wordt al lange tijd gebruikt en het hulpmechanisme van het adjuvans is relatief duidelijk, veilig, effectief en goed verdragen4. Aluminium adjuvantia zijn momenteel een veel gebruikt type adjuvans. Over het algemeen wordt aangenomen dat antigenen geadsorbeerd aan aluminiumzoutdeeltjes de stabiliteit kunnen verbeteren en het vermogen van de injectieplaats om antigenen op te nemen kunnen verbeteren, wat zorgt voor een goede absorptie en langzame afgifte5. Momenteel is het grootste nadeel van aluminiumadjuvantia dat ze geen adjuvans effect hebben of slechts een zwak adjuvans effect vertonen op sommige kandidaat-vaccinantigenen6. Bovendien induceren aluminiumadjuvantia IgE-gemedieerde overgevoeligheidsreacties5. Daarom is het noodzakelijk om nieuwe adjuvantia te ontwikkelen om een sterkere immuunrespons te stimuleren.
Nano-emulsie-adjuvantia zijn colloïdale dispersiesystemen die bestaan uit olie, water, oppervlakteactieve stoffen en cosurfactanten7. Bovendien zijn de adjuvantia thermodynamisch stabiel en isotroop, kunnen ze worden geautoclaveerd of gestabiliseerd door centrifugatie met hoge snelheid en kunnen ze spontaan worden gevormd onder milde bereidingsomstandigheden. Verschillende emulsie-adjuvantia (zoals MF59, NB001-002-serie, AS01-04-serie, enz.) zijn momenteel op de markt of in de klinische onderzoeksfase, maar hun deeltjesgroottes zijn groter dan 160 nm8. Daarom kunnen de voordelen van medicinale preparaten op nanoschaal (1-100 nm) (d.w.z. groot specifiek oppervlak, kleine deeltjesgrootte, oppervlakte-effect, hoge oppervlakte-energie, klein effect en macro-kwantumtunneleffect) niet volledig worden benut. In het huidige protocol is gemeld dat een nieuw adjuvans op basis van nano-emulsietechnologie met een diametergrootte van 1-100 nm een goede adjuvante activiteit vertoont9. We testten het recombinatiesubunitvaccinantigeeneiwit HI (α-hemolysinemutant [Hla] en Fe-ionenoppervlakbepalende factor B [IsdB] subunit N2 actief fragmentfusie-eiwit); Een reeks procedures werd vastgesteld om de fysieke eigenschappen en stabiliteit te onderzoeken, de specifieke antilichaamrespons na intramusculaire toediening te evalueren en het beschermende effect van het vaccin te testen met behulp van een systemisch infectiemodel voor muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproeven werden uitgevoerd op basis van de handleiding over het gebruik en de verzorging van proefdieren en werden goedgekeurd door de Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee van de Third Military Medical University. Vrouwelijke Balb / c-muizen, 6-8 weken oud, werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden verkregen uit commerciële bronnen (zie tabel met materialen).
1. Bereiding van het MRSA HI-antigeeneiwit
- Verkrijg IsdB- en Hla-klonen uit commerciële bronnen (zie Tabel met materialen), voer polymerasekettingreactie (PCR) amplificatie uit om IsdB- en Hla-genen te versterken en ligate hun producten naar het PGEX-6P-2-plasmide (commercieel verkregen; zie Tabel met materialen). Scherm met de vector Xl/blauwe stam van Escherichia coli10.
- Transformeer de positieve kloon in E. coli BL21 competente cellen (zie tabel met materialen) en versterk met haaiencultuur10.
- Druk het antigeen en isolaat na inductie uit met isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside en multimodale chromatografie (MMC) isolaatkits11 (zie materiaaltabel).
- Karakteriseer het antigeeneiwit en zuiver het met een volledig geautomatiseerde reiniger11.
- Affiniteitszuiverende gutathion S-transferase (GST)-gelabelde eiwitten uit geklaarde lysaten met behulp van een in de handel verkrijgbare affiniteitschromatografiehars (zie materiaaltabel).
- Zuiver de recombinante eiwitten door MMC11.
- Verwijder het endotoxine met de Triton X-114 fasescheidingsmethode11. Meng in het kort 1% Triton X-114 met recombinant eiwit eluaat bij 0 °C gedurende 5 minuten om een homogene oplossing te garanderen en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C om twee fasen te laten vormen.
- Gebruik de bacteriële endotoxinetestmethode11 met schildpadkits (zie materiaaltabel) om de endotoxineconcentratie te detecteren. Het endotoxine voor eiwitantigeen is 0,06 EU/μg, lager dan de internationale norm (1,5 EU/μg)10.
- Voer een interferentietest uit om de mogelijke invloed van het testproduct op de detectie van endotoxinete elimineren 11.
OPMERKING: Volgens de bijlage 2020 van de Chinese farmacopee12 moet het endotoxinegehalte lager zijn dan 5 EU/dosis. De gevoeligheid van Limuluslysaat (λ0,25 EU/ml) en de maximale effectieve verdunningsverhouding van 33,3 werden berekend12 op basis van MVD = cL/λ, waarbij L de grenswaarde van bacterieel endotoxine voor het testvoorwerp is, c de concentratie van de oplossing van het testvoorwerp en wanneer L wordt uitgedrukt in EU/m, c gelijk is aan 1,0 mg/ml. λ is de gelabelde gevoeligheid (EU/ml) van het degenkrabreagens in de gelmethode.
- Voer een interferentietest uit om de mogelijke invloed van het testproduct op de detectie van endotoxinete elimineren 11.
- Recombineer het antigeen (48 kDa, bepaald door 12% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese [SDS-PAGE]) bij 1,5 mg/ml in steriel water zonder endotoxine of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (natriumdichloraatmethode)11.
OPMERKING: De eiwitpiektijd was 13,843 min, de zuiverheid was 99,4% (high-performance vloeistofchromatografiemethode) en het eiwit werd opgeslagen bij -70 °C10. Genomisch DNA geëxtraheerd uit de S. aureus-stam MRSA252 (zie tabel met materialen) werd gebruikt als pcr-sjabloon. Het IsdB-gen werd versterkt met behulp van de forward primer 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 en de omgekeerde primer 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTATTATTATTC-39. Het Hla-gen werd versterkt met behulp van de forward primer PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC) en de reverse primer PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
CAATTTGTCATTTCTTC).
2. Bereiding van het nano-emulsievaccin
- Voeg volgens de massaverhouding van 1:6:3(w/w) drie soorten hulpstoffen achter elkaar (isopropylmyristaat, polyoxyethyleenricinusolie en propyleenglycol; zie Materiaaltabel) toe aan de HI-antigeeneiwitoplossing (10 mg/ml) en roer goed. Voeg vervolgens geleidelijk gesteriliseerd zuiver water toe tot een eindvolume van 10 ml en roer bij 500 tpm en 25 °C gedurende ongeveer 20 minuten.
OPMERKING: De nano-emulsie die in dit protocol wordt bereid, heeft een volume van 10 ml en de massa's van de drie hulpstoffen zijn respectievelijk 0,34 g, 2 g en 1 g. De eiwitoplossing is hier de werkoplossing, 10 keer de concentratie van de uiteindelijke oplossing. - Bereid het nano-emulsieadjuvansvaccin (1 mg/ml eiwit) met behulp van laagenergetische emulgeringsmethoden13 om een heldere en transparante vloeibare oplossing te verkrijgen.
OPMERKING: De blanco nano-emulsie (BNE) werd op vergelijkbare wijze bereid, behalve dat water werd vervangen door HI. De gebruikelijke emulgeringsmethode omvat het verwarmen van de buitenste en binnenste fasen tot ongeveer 80 °C voor emulgering en vervolgens geleidelijk roeren en afkoelen. In dit proces wordt een grote hoeveelheid energie verbruikt en uiteindelijk wordt de emulsie verkregen.
3. Fysische karakterisering en stabiliteit van het nano-emulsieadjuvansvaccin
- Deeltjesgrootte, zetapotentiaal en polymeerdispersie-indexkarakterisering (PDI).
- Bereid 100 μL van het nano-emulsieadjuvansvaccin en verdun 50 keer met water voor injectie. Voeg 2 ml monster toe voor detectie.
- Observeer de deeltjesgroottes, zetapotentiaal en PDI bij 25 °C met behulp van een Nano Zetasizer (ZS; zie materiaaltabel).
- Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
- Verdun 10 μL nano-emulsievaccin 50-voudig met water, plaats op een met koolstof gecoat koperen rooster met 100 mazen en kleurt gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met 1% fosfotungstinezuur (zie materiaaltabel).
- Verwijder overtollige fosfotungstische zuuroplossing met filtreerpapier.
- Observeer de morfologie onder een transmissie-elektronenmicroscoop (zie tabel met materialen). Onderzoek of de eindproducten bijna stabiel en cirkelvormig zijn binnen het gezichtsveld van de elektronenmicroscoop en of ze een goede dispersie vertonen.
- Scanning elektronenmicroscopie (SEM)
- Verdun 10 μL van het nano-emulsieadjuvansvaccin 50-voudig met water, laat 10 μL voorverdunde monsters op een siliciumwafer vallen en plaats gedurende 24 uur in een thermostaatgestuurde incubator van 37 °C.
- Spuit het bereide platina gedurende 40 s op het silicium en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Observeer de morfologische eigenschappen van de geprepareerde monsters onder een hoge-resolutie scanning elektronenmicroscoop (zie tabel met materialen). Bepaal of de monsters bijna stabiel, bolvormig en goed verspreid zijn binnen het gezichtsveld onder de elektronenmicroscoop.
- Morfologische stabiliteit
- Plaats 1 ml nano-emulsievaccinmonsters in microcentrifugebuizen en evalueer de stabiliteit van verse monsters door gedurende 30 minuten te centrifugeren bij 13.000 x g bij kamertemperatuur (25 °).
- Observeer het uiterlijk van deze verse monsters en voer vervolgens een thermodynamische stabiliteitstest uit van zes temperatuurcycli (één cyclus: bewaren bij 4 °C gedurende 48 uur, 25 °C gedurende 48 uur en 37 °C gedurende 48 uur).
- Laat de monsters na het centrifugeren 15 minuten staan om te bepalen of er een Tyndall-effect is (of het monster helder en transparant is onder licht) en of er demulgering is opgetreden (aangetoond door duidelijke stratificatie na demulsificatie).
- SDS-PAGE en western blot
- Schud de monsters, meng een oplossing van 0,6 ml absolute ethanol en 0,3 ml vaccin en centrifugeer (13.000 x g, 30 minuten bij kamertemperatuur, 25 °C).
- Breng het supernatant van de oplossing over in een schone buis en los het neerslag op met 0,3 ml water. Verkrijg de supernatante en neerslagoplossingen (zowel blanco nano-emulsie als vaccin) na behandeling met absolute ethanol en gedestilleerde wateroplossing en voer dezelfde 50-voudige verdunning uit.
- Meng 2,5 ml scheidingsgel A en 2,5 ml scheidingsgel B (zie materiaaltabel), voeg 50 μl 10% ammoniumpersulfaat toe en plaats de oplossing snel met een pipet in de glasplaat. Meng 1 ml geconcentreerde gel A en 1 ml geconcentreerde gel B, voeg 20 μL 10% ammoniumpersulfaat toe aan de glasplaat, plaats een kam van de juiste grootte en wacht op stolling.
- Voeg in totaal 5 μL 5x eiwitladende bufferoplossing toe aan het verdunde monster verkregen in stap 3.5.2 en kook het monster gedurende 5 minuten.
- Voeg 10 μL verwarmd eiwit toe aan de overeenkomstige put en voeg 5 μL eiwitmarker toe aan de markerput.
- Sluit de elektrode aan, schakel de elektroforesemeter in (zie Materiaaltabel) en stel de spanning in op 300 V. Schakel de stroom uit wanneer de elektroforese 1 cm verwijderd is van de onderkant van het PAGE-rubber.
- Verwijder de gel en spoel af met ddH2O. Voeg Coomassie helderblauwe G-250 kleuringsoplossing (zie Materiaaltabel) toe gedurende 10 min. Giet de kleuringsoplossing uit en spoel de gel twee keer af met ddH2O.
- Voeg de in de handel verkrijgbare ontkleuringsoplossing toe en magnetron de gel gedurende 1 min. Schud de gel gedurende 10 minuten en verander herhaaldelijk de ontkleuringsoplossing totdat de gelachtergrond helder is. Voer vervolgens gelbeeldvorming uit (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De westelijke vlek is voorbewerkt, zoals beschreven in stap 3.5.1-3.5.6. - Week drie filterpapierblokken met een elektroforese-overdrachtsbuffer. Week het polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan in methanol gedurende 30 s en breng over met een semidry gel transfer instrument (twee lagen filterpapier, PVDF-membraan, elektroforesegel en één laag filterpapier). Gebruik een spanning van 23 V om het membraan gedurende 23 minuten over te brengen.
- Verwijder het PVDF-membraan en was eenmaal met tris-gebufferde zoutoplossing-Tween 20 (TBST) na overdracht.
- Plaats het PVDF-membraan in een afdichtingsoplossing (5% mageremelkpoederoplossing) en sluit een nacht af bij 4 °C.
- Verwijder het PVDF-membraan en was het drie keer met TBST of elk 10 minuten.
- Incubeer met het primaire antilichaam (van geïmmuniseerde muizen met positief serum). Verdun het primaire antilichaam11 (zie materiaaltabel) dat 500-voudig (100-voudig) moet worden getest met TBST. Plaats het geblokkeerde PVDF-membraan in het primaire antilichaam en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Verwijder het PVDF-membraan en was drie keer met TBST gedurende elk 10 minuten.
- Incubeer met het secundaire antilichaam (zie materiaaltabel). Verdun alkalische fosfatase (AP)-gelabelde geit anti-muis secundair antilichaam 5.000-voudig met TBST. Plaats het PVDF-membraan in het secundaire antilichaam en incubeer gedurende 40 minuten bij 37 °C.
- Verwijder het PVDF-membraan en was vier keer met TBST gedurende elk 10 minuten.
- Dompel de PVDF-membranen onder in een mengsel (net genoeg om het membraan te weken) van het AP-substraat nitroblauwtetrazol (NBT) en BCIP (5-broom-4-chloor-3'-indolyfosfaat p-toluidinezout) (zie materiaaltabel) voor kleuring. Een positief resultaat is paars.
OPMERKING: De resultaten moeten een duidelijke paarse band hebben en de monsterstrook en het molecuulgewicht van het antigeen moeten op dezelfde gelabelde positie staan.
4. Beoordeling van de immuunrespons van antilichamen op dit vaccin na intramusculaire toediening
OPMERKING: De muizen werden geïmmuniseerd door intramusculaire injectie van het nano-emulsievaccin na een gepubliceerd rapport11. De muizen kregen PBS toegediend als negatieve controle. 1 week nadat drie immunisaties waren voltooid, werd serum verzameld van de muizen11. De serumspiegels van IgG en subklassen van IgG1, IgG2a en IgG2b werden kwantitatief bepaald door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
- Antigeencoating: Verdun HI-eiwitantigeen tot 10 μg/ml met coatingoplossing en voeg toe aan de ELISA-plaat met 100 μL/put. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
OPMERKING: De coatingoplossing wordt bereid door 1,6 g watervrij natriumcarbonaat en 2,9 g natriumbicarbonaat op te lossen in 1 l gedeïoniseerd water. - Afdichting: Was de plaat (drie cycli, elke cyclus 300 μL). Voeg 300 μL van de afdichtingsoplossing toe aan elke put en sluit de putten gedurende 2 uur af bij 37 °C.
OPMERKING: De afdichtingsoplossing wordt bereid door Tween-20 en runderserumalbumine (BSA) aan PBS toe te voegen. Het gehalte aan BSA in de PBST-oplossing is 1%. - Serumverdunning: Verdun het monsterserum van muizen 100 keer met PBST (neem 3 μL serum en voeg het toe aan 297 μL PBST en vortex) en gebruik 100 μL voor elk serummonster. Verdun het positieve serum en het negatieve controleserum 100 keer met PBST door 4 μL toe te voegen aan 396 μL PBST en meng vervolgens door vortexing.
- Verdunning met dubbele verhouding: Voeg 200 μL van het bovenstaande verdunde experimentele serum toe aan de eerste rij van de gecoate ELISA-plaat en voeg 100 μL PBST toe aan alle putjes behalve de eerste en12e rij. Voer een verdunning van 1:2 uit vanaf de eerste rij: stel de pipet in op 100 μL, breng 100 μL over van de eerste rij naar de tweede rij en meng 10 keer met de pipet.
- Verdun het serum tot rij 11 in meerdere verhoudingen en gooi 100 μL vloeistof weg.
- Voeg verdund negatief en positief serum toe aan de overeenkomstige putjes in rij 12 volgens het monstersjabloon (zie tabel 1)-100 μl/put.
- Sluit de ELISA-platen af met plasticfolie en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Verdun secundair antilichaam antimuis IgG-HRP (zie materiaaltabel) met PBST bij 1:10.000.
- Was de plaat (drie cycli, elke cyclus 300 μL). Voeg vervolgens 100 μL van het verdunde secundaire antilichaam toe aan elk putje en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 40 minuten.
- Kleuring en beëindiging: Was de plaat (vijf cycli, elke cyclus 300 μL). Voeg 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) kleuringsoplossing (100 μL; zie Materiaaltabel) toe aan elk putje. Plaats de platen op 37 °C gedurende 10 minuten van het licht en beëindig de reactie onmiddellijk met 50 μL van 2 MH 2SO4.
- Detecteer de optische dichtheid (OD 450) waarde door een enzymmarker (lees de OD450-waarde binnen 15 minuten na beëindiging).
5. Evaluatie van de in vivo effecten van de nieuwe adjuvante vaccins
OPMERKING: Het beschermende effect van dit nano-emulsievaccin werd geëvalueerd in een commercieel verkregen letale MRSA252 muismodel (zie materiaaltabel). Volgens de eerdere resultaten van onze onderzoeksgroep 14 is 1 x10 8 kolonievormende eenheden (CFU)/muis de beste dosis om het beschermende effect van het dodelijke model van MRSA252 bacteriële infectie te evalueren.
- Stamherstel: Verkrijg een buisje bevroren MRSA252, ent de bacteriën op Mueller Hinton (MH) (A) platen (zie tabel met materialen) volgens de "drieregelige methode" en kweek 's nachts bij 37 °C. Voer de stappen van de "drieregelige methode" uit zoals hieronder vermeld:
- Houd de inentingsring in de rechterhand, cauteriseer en koel deze af om een ring van bacteriële vloeistof te verkrijgen.
- Houd de agarplaat in de linkerhand (houd het deksel op de tafel) boven het linkervoorgedeelte van de vlam van de alcohollamp, zodat de plaat naar de vlam is gericht, waardoor wordt voorkomen dat de bacteriën de lucht binnendringen. Beweeg met de rechterhand de inentingsring van geïnfecteerde bacteriën heen en weer op het agaroppervlak op een dichte maar niet-overlappende manier, waarbij een gebied van ongeveer 1/5-1/6 van de hele plaat wordt bedekt, wat de eerste zone is.
OPMERKING: De inentingsring en de agar moeten in een hoek van 30°-40° voorzichtig contact zijn; Beschadiging van de agar kan worden voorkomen door met polskracht te schuiven. - Cauteriseer de overtollige bacteriën op de inentingsring (of elk gebied moet worden dichtgeschroeid of gesteriliseerd, hangt af van de hoeveelheid bacteriën in het monster). Herhaal na het afkoelen de voorlaatste rijen 2-3 aan het einde en teken een tweede gebied (ongeveer 1/4 van het plaatoppervlak).
- Nadat de tweede zone is voltooid, dichtschroeit u de ring en tekent u de derde zone op dezelfde manier om de hele plaat te vullen.
- Nadat de lijnen zijn getrokken, plaatst u de plaat op het deksel van de schaal, markeert u de plaat en incubeert u gedurende 18-24 uur in een incubator van 37 ° C om de verdeling van kolonies op het agaroppervlak te observeren. Richt de aandacht op de vraag of een enkele kolonie geïsoleerd is en observeer koloniekenmerken (zoals grootte, vorm, transparantie en pigmentatie).
- Bacteriële activering: Neem de volgende dag twee 50 ml schudkolven en voeg 20 ml MH (B) medium (zie materiaaltabel) toe aan elk. Kies twee afzonderlijke kolonies met een pipetpunt van 10 μL en voeg ze toe aan de shakers. Incubeer de kolonies 's nachts bij 220 tpm bij 37 °C.
- Secundaire activering: Neem de volgende dag twee 50 ml schudkolven met elk 20 ml MH (B) medium. Verwijder 200 μl bacteriële oplossing uit de schudder met de eerste geactiveerde bacteriën, voeg toe aan de twee nieuwe kolven met 20 ml MH (B) medium en incubeer gedurende 5 uur bij 37 °C en 220 tpm.
- Verzamel de tweede geactiveerde bacteriële oplossing in een centrifugebuis van 50 ml, scheid gedurende 20 minuten bij 3.000 x g en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeerde de neergeslagen bacteriën in 40 ml zoutoplossing.
- Meet de OD600-waarde van de bacteriële oplossing en stel deze met zoutoplossing in op 1. Op dit moment was de bacteriële hoeveelheid MRSA252 in ons experiment 2 x 109 CFU / ml.
- Verdun de bacteriële oplossing met een OD600 van 1 tot een concentratie van 1 x 109 kve/ml.
- Verdeel willekeurig 48 Balb/c muizen in vier groepen (n=12).
OPMERKING: Groep I: PBS-groep; Groep II: BNE-controlegroep; Groep III: naïeve antigeen [eiwit] groep; Groep IV: nano-emulsieadjuvante vaccingroep. - Verdoof de muizen door intraperitoneale injectie van 100 mg/kg 1% pentobarbital natrium.
- Bestraal de muizen met een infrarood fysiotherapielamp (zie tabel met materialen) gedurende ongeveer 1 minuut om vaatverwijding van de staartader te veroorzaken.
- Daag de muizen uit met injectie van de verdunde bacteriële oplossing (stap 5.7) in de staartader, 100 μL per muis.
- Plaats de muizen onder de infrarood fysiotherapie lamp totdat ze weer normaal kunnen werken.
- Observeer en registreer de overleving van muizen elke 12 uur gedurende 10 dagen.
- Euthanaseer de muizen die de aanval overleefden door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg 1% natriumpentobarbital.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol voor de bereiding van het nano-emulsieadjuvansvaccin en in vitro en in vivo tests van dit vaccin werd geëvalueerd. TEM, AFM en DLS werden gebruikt om de belangrijke kenmerken van de zetapotentiaal en deeltjesgrootte op het oppervlak van dit monster te bepalen (figuur 1). SDS-PAGE en western blotting toonden aan dat de hoeveelheid antigeen in het neerslag en supernatant niet significant afnam na centrifugatie, wat aangaf dat het vaccin structureel intact, specifiek en immunogeen was (figuur 2). Het nano-emulsieadjuvansvaccin verhoogde de totale IgG-, IgG1- en IgG 2a-antilichaamtiters aanzienlijk. De immunogeniciteit van het vaccin was significant verbeterd (figuur 3A-C). De serum IgG2b OD-waarden bij 450 nm van de antigeengroep waren het hoogst (verdund bij 1:500 PBS) (figuur 3D). Het dodelijke MRSA252 muismodel weerspiegelde het meest direct dat het nano-emulsieadjuvansvaccin een goed beschermend effect vertoonde en bacteriële infectie met MRSA252 effectief remde, waardoor de overlevingskans van geïnfecteerde muizen verbeterde (figuur 4).
Figuur 1: Fysische kenmerken van het nieuwe nano-emulsie-adjuvansvaccin . (A) Transmissie-elektronenmicrografie. (B) Microscopiemicrografie van atoomkracht. (C) Grootte, diameter en verdeling. (D) Zeta-potentieel en -distributie. De figuur is gereproduceerd uit Sun, H.W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Oorspronkelijk gepubliceerd door en gebruikt met toestemming van Dove Medical Press Ltd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fysische stabiliteit van het nieuwe nano-emulsieadjuvansvaccin . (A) Structurele integriteit van de antigene eiwitten. B) Structurele specificiteit van het antigeeneiwit. Baan 3: blanco nano-emulsiebehandeld supernatant; Baan 4: blanco nano-emulsiebehandeling neerslag; Rijstrook 5: voorgekauwde markering; Baan 6: vaccin supernatant; Baan 7: vaccin neerslaan; Baan 8: vaccinbehandeling supernatant; Baan 9: vaccinbehandeling neerslaan; Baan 10: inheems eiwitmiddel; (A) en (B) gemengde term. Duidelijk gedefinieerde eiwitkanalen worden gemarkeerd door zwarte vierkanten. Zwarte pijlen duiden op antigene eiwitten. De figuur is gereproduceerd uit Sun, H.W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Oorspronkelijk gepubliceerd door en gebruikt met toestemming van Dove Medical Press Ltd.Sun et al. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: IgG en zijn subgroep antilichaamniveaus na intramusculaire injectie met het nano-emulsieadjuvansvaccin. (A) Log2-waarde van de IgG-titers. B) 450 nm optische dichtheid van serum IgG1. (C) 450 nm optische dichtheid van serum IgG2a. (D) 450 nm optische dichtheid van serum IgG2b. De figuur is gereproduceerd uit Sun, H.W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Oorspronkelijk gepubliceerd door en gebruikt met toestemming van Dove Medical Press Ltd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Beschermend effect in het dodelijke model van MRSA252 bacteriële infectie. De overlevingsratio van muizen als reactie op systemische MRSA-infectie. De figuur is gereproduceerd uit Sun, H.W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015)11. Oorspronkelijk gepubliceerd door en gebruikt met toestemming van Dove Medical Press Ltd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: ELISA-spievolgorde- en verdunningssjabloon. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IsdB, een bacterieel celwandverankerd en ijzergereguleerd oppervlakte-eiwit, speelt een belangrijke rol in het proces van het verkrijgen van heemijzer15. Hla, alfatoxine, is een van de meest effectieve bacteriële toxines die bekend zijn bij MRSA en kan poriën vormen in eukaryote cellen en interfereren met adhesie- en epitheelcellen16. In onze studie werd een nieuw recombinatie MRSA-antigeeneiwit (HI) geconstrueerd en tot expressie gebracht met gentechnologietechnologie op basis van de antigeengenen van IsdB en Hla. Vervolgens werd een nano-emulsievaccin ontwikkeld met behulp van de laagenergetische emulgeringsmethode en werden de stabiliteit en effectiviteit van dit vaccin geëvalueerd. Sommige kenmerken, zoals stabiliteit op lange termijn, structuur, vorm, absorptie en effect in vivo, worden bijvoorbeeld sterk beïnvloed door de grootte van de emulsiedruppel7. De resultaten toonden aan dat deeltjesgrootte een belangrijke factor was die het transport van nano-emulsies in vivo en hun fagocytose door antigeen-presenterende cellen beïnvloedde17. Wat cytofagocytose betreft, worden nanodeeltjes kleiner dan 1 μm gemakkelijker gefagocyteerd door dendritische cellen (DC's) en macrofagen en hebben ze de meeste kans om systemische immuniteit te stimuleren18.
Wat het transport van deeltjes betreft, hebben nanodeeltjes kleiner dan 100 nm meer kans om te worden overgedragen via lymfevaten om het immuuneffect te versterken; Kleine nanodeeltjes infiltreren echter in bloedvaten, terwijl grote nanodeeltjes hun transportsnelheid in lymfevaten vertragen19. De optimale deeltjesgrootte ligt dus in het bereik van 20-50 nm. Daarom is het van cruciaal belang om de fysieke kenmerken van nanodeeltjes te bestuderen, inclusief vorm, grootte en zeta-potentieel. TEM, met zijn hoge precisie, is een belangrijk en basisinstrument geworden voor het begrijpen van de eigenschappen van nano-emulsie-adjuvante vaccins. Bovendien wordt de technologie al enkele jaren op grote schaal toegepast op vele gebieden. Een andere nanomechanische karakteriseringstool met 3D- en nanoschaalinformatie met hoge resolutie, AFM, werd ook gebruikt om het nano-emulsievaccinte evalueren 13. Belangrijk is dat DLS, dat tegelijkertijd zowel de grootte als de lading20 onthult, belangrijke informatie kan bieden, zoals de aggregatietoestand van nano-emulsievaccindeeltjes in oplossing. Volgens de literatuur is een hoge zeta-potentiaalwaarde onmisbaar voor de fysische en chemische stabiliteit van colloïdale suspensies, omdat een grote afstotende kracht vaak aggregatie voorkomt die wordt veroorzaakt door incidentele botsingen met aangrenzende nanodeeltjes. Daarom hebben we in ons onderzoek deze schema's opgezet en hun fysische en chemische eigenschappen geëvalueerd met TEM, AFM en DLS.
Eiwitvaccins spelen een belangrijke rol bij de preventie en behandeling van belangrijke infectieziekten21. Eiwitvaccins hebben zich de afgelopen jaren snel ontwikkeld, maar er blijven ernstige uitdagingen bestaan in de werkzaamheid en persistentie van het immuunsysteem. De fundamentele redenen hiervoor zijn slechte eiwitstabiliteit, kleine distributiecoëfficiënt, korte biologische halfwaardetijd van antigenen en hoge klaringssnelheden in vivo22. In dit protocol werd de stabiliteit van het nieuwe nano-emulsievaccin geëvalueerd en werd er geen antigeenafbraak waargenomen door SDS-PAGE of western blot.
Een veilig, effectief en verhandelbaar eiwitvaccin moet worden aangevuld met een geschikt immuunadjuvans om de immunogeniciteit van het eiwitantigeen en het type beschermende immuunrespons20 aanzienlijk te verbeteren om de optimale immuunbescherming van het vaccin te verkrijgen. Het antilichaamniveau gestimuleerd door een eiwitvaccin is een van de belangrijke indicatoren voor de effectieve preventie en behandeling van infectie, en de antilichaamtiter is een belangrijke index om te evalueren of het nieuwe nano-emulsieadjuvans de immunogeniciteit van het naakte antigeen kan verbeteren. Nieuwe immuunadjuvantia kunnen het lichaam aanzienlijk stimuleren om de humorale en cellulaire immuunresponsniveaus te verbeteren, en het verrijken van de soorten immuunrespons en immuunbeschermende werkzaamheid van vaccins is een belangrijke ontwikkelingsrichting en de component van toekomstig onderzoek en de ontwikkeling van nieuwe vaccins23. Daarom werden in dit protocol antilichaamtiters van muisserumspecifiek IgG, IgG1, IgG2a en IgG2b met het nieuwe nano-emulsieadjuvansvaccin gedetecteerd. Het dodelijke muismodel24 is de gouden standaard voor het evalueren van vaccins en in ons protocol werd een dodelijk MRSA252 muismodel gebruikt om het beschermende effect te evalueren. De resultaten toonden aan dat het nieuwe nano-emulsie-adjuvansvaccin de overlevingskans van Balb / c-muizen geïnfecteerd met MRSA effectief verbeterde.
Dit protocol is niet voldoende voor de stabiliteitsevaluatie van nano-emulsievaccins. Circulair dichroïsme is een geschikte methode als het kan worden toegepast om de ruimtelijke structuur van vaccineiwitten op een eenvoudige en snelle manier te detecteren. Hoewel de overlevingskans van muizen die door de aanval zijn getest de gouden standaard is voor het evalueren van de in vivo test en effectiviteit van het vaccin, zou het overtuigender zijn als de hoeveelheid bacteriële kolonisatie van de organen van muizen na een aanval kon worden gemeten. Daarom zijn er nog steeds enkele tekortkomingen in het huidige protocol om de immuunrespons van het nano-emulsieadjuvansvaccin te evalueren, en het bovenstaande experiment moet worden aangevuld in latere relevante experimenten voor evaluatie.
Kortom, het is noodzakelijk om een reeks evaluaties van fysieke eigenschappen, stabiliteit, specifieke immuunrespons en uitdagingsbescherming vast te stellen. Het voltooien van deze schema's zal essentiële experimentele fundamenten bieden voor de toepassing en ontwikkeling van nieuwe nano-emulsie-adjuvante vaccins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben in dit werk.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door nr. 2021YFC2302603 van het National Key Research and Development Program van China, nr. 32070924 en 32000651 van de NSFC, en nr. 2019jcyjA-msxmx0159 van het Natural Science Foundation Project Program van Chongqing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
References
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. Chinese Pharmacopoeia. , China Medical Science and Technology Press. Beijing. 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D.
- Saeed, K., et al.
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J.
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).
