Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Оценка иммунного ответа наноэмульсионной адъювантной вакцины против метициллин-резистентной инфекции золотистого стафилококка (MRSA)

Published: September 1, 2023 doi: 10.3791/65152
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

Summary

Настоящий протокол подготавливает и оценивает физические свойства, иммунный ответ и защитный эффект in vivo новой наноэмульсионной адъювантной вакцины.

Abstract

Наноэмульсионные адъювантные вакцины привлекли большое внимание из-за их небольшого размера частиц, высокой термической стабильности и способности вызывать иммунные реакции. Тем не менее, создание ряда всеобъемлющих протоколов для оценки иммунного ответа новой наноэмульсионной адъювантной вакцины имеет жизненно важное значение. Таким образом, в этой статье представлена строгая процедура определения физико-химических характеристик вакцины (с помощью просвечивающей электронной микроскопии [TEM], атомно-силовой микроскопии [AFM] и динамического рассеяния света [DLS]), стабильности антигена и системы вакцины (с помощью высокоскоростного центрифужного теста, теста термодинамической стабильности, SDS-PAGE и вестерн-блоттинга) и специфического иммунного ответа (IgG1, IgG2a и IgG2b). Используя этот подход, исследователи могут точно оценить защитный эффект новой наноэмульсионной адъювантной вакцины на летальной модели MRSA252 мыши. С помощью этих протоколов может быть идентифицирован наиболее перспективный адъювант для наноэмульсионной вакцины с точки зрения эффективного адъювантного потенциала. Кроме того, эти методы могут помочь оптимизировать новые вакцины для будущей разработки.

Introduction

Метициллин-резистентный золотистый стафилококк (MRSA) является условно-патогенным микроорганизмом с одним из самых высоких показателей инфицирования в отделенияхинтенсивной терапии (ОИТ) 1, кардиологических отделениях и ожоговых отделениях во всем мире. MRSA демонстрирует высокие показатели инфицирования, смертности и широкой лекарственной устойчивости, что представляет большие трудности в клиническом лечении2. В Глобальном приоритетном списке устойчивых к антибиотикам бактерий, опубликованном Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 2017 году, MRSA был включен в наиболее критическую категорию3. Поэтому срочно необходима вакцина против инфекции MRSA.

Алюминиевый адъювант используется уже давно, а вспомогательный механизм адъюванта относительно чист, безопасен, эффективен и хорошо переносится4. Алюминиевые адъюванты в настоящее время являются широко используемым типом адъюванта. Обычно считается, что антигены, адсорбированные на частицах соли алюминия, могут улучшить стабильность и повысить способность места инъекции поглощать антигены, обеспечивая хорошую абсорбцию и медленное высвобождение5. В настоящее время основным недостатком алюминиевых адъювантов является то, что они не обладают адъювантным эффектом или проявляют лишь слабое адъювантное действие на некоторые антигены-кандидаты в вакцину6. Кроме того, алюминиевые адъюванты индуцируют IgE-опосредованные реакции гиперчувствительности5. Поэтому необходимо разработать новые адъюванты для стимуляции более сильного иммунного ответа.

Наноэмульсионные адъюванты представляют собой коллоидные дисперсионные системы, состоящие из масла, воды, поверхностно-активных веществ и поверхностно-активных веществ7. Кроме того, адъюванты являются термодинамически стабильными и изотропными, могут быть автоклавированы или стабилизированы высокоскоростным центрифугированием и могут образовываться спонтанно в мягких условиях приготовления. Несколько эмульсионных адъювантов (таких как серии MF59, NB001-002, AS01-04 и т. д.) в настоящее время представлены на рынке или находятся на стадии клинических исследований, но их размеры частиц превышают 160нм 8. Следовательно, преимущества наноразмерных (1-100 нм) лекарственных препаратов (т.е. большая удельная поверхность, малый размер частиц, поверхностный эффект, высокая поверхностная энергия, эффект малого размера и эффект макроквантового туннелирования) не могут быть полностью использованы. В настоящем протоколе сообщается, что новый адъювант, основанный на технологии наноэмульсии, с размером диаметра 1-100 нм проявляет хорошую адъювантную активность9. Мы протестировали белок антигена вакцины рекомбинационной субъединицы HI (мутант α-гемолизина [Hla] и ион Fe, определяющий поверхностный фактор B [IsdB], субъединица N2, белок слияния активных фрагментов N2); Был создан ряд процедур для изучения физических свойств и стабильности, оценки ее специфического ответа антител после внутримышечного введения и проверки защитного эффекта вакцины с использованием модели системной инфекции мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты на животных проводились на основе руководства по использованию и уходу за подопытными животными и были одобрены Комитетом по благополучию и этике лабораторных животных Третьего военно-медицинского университета. Для настоящего исследования были использованы самки мышей Balb/c в возрасте 6-8 недель. Животные были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).

1. Получение белка-антигена MRSA HI

  1. Получение клонов IsdB и Hla из коммерческих источников (см. Таблицу материалов), проведение амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации генов IsdB и Hla и связывание их продуктов с плазмидой PGEX-6P-2 (полученной коммерчески; см. Таблицу материалов). Экран с векторным Xl/синим штаммом Escherichia coli10.
  2. Трансформируйте положительный клон в компетентные клетки E. coli BL21 (см. Таблицу материалов) и амплифицируйте с помощью культуры акул10.
  3. Экспрессируют антиген и изолят после индукции изопропил-β-D-1-меркаптогалактопиранозидом и наборамиизолятов 11 для мультимодальной хроматографии (ММК) (см. Таблицу материалов).
  4. Охарактеризуйте белок антигена и очистите его с помощью полностью автоматизированного очистителя11.
    1. Аффинно-очищенные белки, меченные гутатион-S-трансферазой (GST), из очищенных лизатов с использованием коммерчески доступной смолы аффинной хроматографии (см. Таблицу материалов).
    2. Очистите рекомбинантные белки MMC11.
    3. Удалите эндотоксин методом разделения фаз Triton X-11411. Вкратце, смешайте 1% Triton X-114 с элюатом рекомбинантного белка при 0 ° C в течение 5 мин, чтобы получить однородный раствор, и инкубируйте при 37 ° C в течение 5 мин, чтобы образовались две фазы.
  5. Используйте методтестирования бактериального эндотоксина 11 с наборами Turtle (см. Таблицу материалов) для определения концентрации эндотоксина. Содержание эндотоксина в белковом антигене составляет 0,06 ЕЭ/мкг, что ниже международного стандарта (1,5 ЕС/мкг)10.
    1. Проведите интерференционный тест, чтобы исключить возможное влияние испытуемого продукта на обнаружение эндотоксина11.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно Приложению 2020 Китайской фармакопеи12, содержание эндотоксина должно быть менее 5 ЕС/доза. Чувствительность лизата Limulus (λ0,25 ЕС/мл) и максимальный эффективный коэффициент разведения, равный 33,3, были рассчитаны12 на основе MVD = кл/λ, где L - предельное значение бактериального эндотоксина для испытуемого изделия, c - концентрация раствора исследуемого изделия, а когда L выражается в ЕС/м, c равно 1,0 мг/мл. λ - меченая чувствительность (ЕС / мл) реагента мечехвоста в гелевом методе.
  6. Рекомбинируйте антиген (48 кДа, определяемый 12% электрофорезом в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида [SDS-PAGE]) в дозе 1,5 мг/мл в стерильной воде без эндотоксина или фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) (метод дихлората натрия)11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время пика белка составляло 13,843 мин, чистота составляла 99,4% (высокоэффективный метод жидкостной хроматографии), а белок хранился при -70 ° C10. В качестве ПЦР-матрицы использовали геномную ДНК, выделенную из штамма S. aureus MRSA252 (см. Таблицу материалов). Ген IsdB амплифицировали с помощью прямого праймера 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
    С-39 и обратный капсюль 59-ТТТТТТТТТТГГГ
    CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39. Ген Hla амплифицировали с использованием прямого праймера PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATATTAATTAAAACC) и обратного праймера PHLAR (TAAGCGGCCGCTTAT
    CAATTTGTCATTTCTTC).

2. Приготовление наноэмульсионной вакцины

  1. В соответствии с массовым соотношением 1:6:3 (мас./мас.) последовательно добавьте три вида вспомогательных веществ (изопропилмиристат, полиоксиэтиленкасторовое масло и пропиленгликоль; см. Таблицу материалов) в раствор белка антигена HI (10 мг/мл) и хорошо перемешайте. Затем постепенно добавляйте стерилизованную чистую воду до конечного объема 10 мл и перемешивайте при 500 об/мин и 25 ° C в течение примерно 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наноэмульсия, приготовленная в этом протоколе, имеет объем 10 мл, а массы трех вспомогательных веществ составляют 0,34 г, 2 г и 1 г соответственно. Белковый раствор здесь является рабочим раствором, концентрация которого в 10 раз превышает концентрацию конечного раствора.
  2. Приготовьте наноэмульсионную адъювантную вакцину (1 мг/мл белка) методами низкоэнергетического эмульгирования13 для получения прозрачного и прозрачного жидкого раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пустая наноэмульсия (BNE) была получена аналогичными методами, за исключением того, что вода была заменена HI. Обычный метод эмульгирования включает нагревание наружной и внутренней фаз примерно до 80 °C для эмульгирования, а затем постепенное перемешивание и охлаждение. В этом процессе расходуется большое количество энергии, и, наконец, получается эмульсия.

3. Физическая характеристика и стабильность наноэмульсионной адъювантной вакцины

  1. Размер частиц, дзета-потенциал и характеристика индекса дисперсии полимера (PDI).
    1. Приготовьте 100 мкл наноэмульсионной адъювантной вакцины и разбавьте в 50 раз водой для инъекций. Добавьте 2 мл образца для обнаружения.
    2. Наблюдайте за размерами частиц, дзета-потенциалом и PDI при 25 °C с помощью нанодзетазайзера (ZS; см. Таблицу материалов).
  2. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
    1. 10 мкл наноэмульсионной вакцины разбавить водой в 50 раз, поместить на медную сетку размером 100 меш с углеродным покрытием и покрасить 1% фосфовольфрамовой кислотой (см. Таблицу материалов) в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Удалите излишки раствора фосфовольфрамовой кислоты фильтровальной бумагой.
    3. Наблюдайте морфологию под просвечивающим электронным микроскопом (см. Таблицу материалов). Проверьте, являются ли готовые продукты почти стабильными и круглыми в поле зрения электронного микроскопа и проявляют ли они хорошую дисперсию.
  3. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
    1. Разбавьте 10 мкл наноэмульсионной адъювантной вакцины в 50 раз водой, капните 10 мкл предварительно разбавленных образцов на кремниевую пластину и поместите в инкубатор с термостатом 37 °C на 24 часа.
    2. Распылите подготовленную платину на кремний в течение 40 с и остудите до комнатной температуры.
    3. Наблюдайте морфологические свойства подготовленных образцов под сканирующим электронным микроскопом высокого разрешения (см. Таблицу материалов). Определите, являются ли образцы почти стабильными, сферическими и хорошо диспергированными в поле зрения под электронным микроскопом.
  4. Морфологическая стабильность
    1. Поместите 1 мл образцов наноэмульсионной вакцины в микроцентрифужные пробирки и оцените стабильность свежих образцов центрифугированием в течение 30 мин при 13 000 x g при комнатной температуре (25 °).
    2. Наблюдайте за внешним видом этих свежих образцов, а затем проведите испытание на термодинамическую стабильность шести температурных циклов (один цикл: хранение при 4 °C в течение 48 часов, 25 °C в течение 48 ч и 37 °C в течение 48 часов).
    3. После центрифугирования дайте образцам постоять в течение 15 минут, чтобы определить, существует ли эффект Тиндаля (является ли образец прозрачным и прозрачным на свету) и произошло ли деэмульгирование (показано четкой стратификацией после деэмульгирования).
  5. SDS-PAGE и вестерн-блоттинг
    1. Встряхните образцы, смешайте раствор 0,6 мл абсолютного этанола и 0,3 мл вакцины и центрифугу (13 000 x g, 30 мин при комнатной температуре, 25 °C).
    2. Переложите надосадочную жидкость раствора в чистую пробирку и растворите осадок 0,3 мл воды. Получают надосадочную жидкость и растворы осадка (как холостую наноэмульсию, так и вакцину) после обработки абсолютным этанолом и раствором дистиллированной воды и проводят такое же 50-кратное разведение.
    3. Смешайте 2,5 мл разделительного геля А и 2,5 мл разделительного геля В (см. Таблицу материалов), добавьте 50 мкл 10% персульфата аммония и быстро поместите раствор в стеклянную пластину с помощью пипетки. Смешайте 1 мл концентрированного геля А и 1 мл концентрированного геля В, добавьте 20 мкл 10% персульфата аммония в стеклянную пластину, вставьте гребень соответствующего размера и дождитесь затвердевания.
    4. Добавьте в общей сложности 5 мкл буферного раствора с 5-кратной загрузкой белка в разбавленный образец, полученный на этапе 3.5.2, и прокипятите образец в течение 5 мин.
    5. Добавьте 10 мкл нагретого белка в соответствующую лунку и добавьте 5 мкл белкового маркера в маркерную лунку.
    6. Подключите электрод, включите измеритель электрофореза (см. Таблицу материалов) и отрегулируйте напряжение до 300 В. Выключите питание, когда электрофорез достигнет 1 см от нижней части резины PAGE.
    7. Удалите гель и смойте ddH2O. Добавьте красящий раствор Coomassie ярко-синего цвета G-250 (см. Таблицу материалов) на 10 мин. Вылейте окрашивающий раствор и дважды смойте гель ddH2O.
    8. Добавьте имеющийся в продаже раствор для обесцвечивания и разогрейте гель в микроволновой печи в течение 1 минуты. Встряхните гель в течение 10 минут и несколько раз меняйте раствор для обесцвечивания, пока гель-фон не станет прозрачным. Затем выполните гелевую визуализацию (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вестерн-блоттинг был предварительно обработан, как описано в шагах 3.5.1-3.5.6.
    9. Пропитайте три блока фильтровальной бумаги буфером для переноса электрофореза. Замочите мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) в метаноле на 30 с и перенесите с помощью полусухого инструмента для переноса геля (два слоя фильтровальной бумаги, мембрана PVDF, гель для электрофореза и один слой фильтровальной бумаги). Используйте напряжение 23 В для переноса мембраны в течение 23 мин.
    10. После переноса снимите мембрану PVDF и один раз промойте трис-буферизованным физиологическим раствором-Tween 20 (TBST).
    11. Поместите мембрану PVDF в герметизирующий раствор (5% раствор сухого обезжиренного молока) и запечатайте на ночь при температуре 4 °C.
    12. Снимите мембрану PVDF и промойте три раза TBST или по 10 минут.
    13. Инкубируют с первичным антителом (от иммунизированных мышей с положительной сывороткой). Разбавьте первичное антитело11 (см. Таблицу материалов) для тестирования в 500 раз (100-кратно) с помощью TBST. Поместите заблокированную мембрану PVDF в первичное антитело и инкубируйте при 37 ° C в течение 1 часа.
    14. Снимите мембрану PVDF и трижды промойте TBST по 10 минут каждый.
    15. Инкубировать с вторичным антителом (см. Таблицу материалов). Разбавленные вторичные антитела против мышей, меченные щелочной фосфатазой (AP), в 5,000 раз с TBST. Поместите мембрану PVDF во вторичное антитело и инкубируйте при 37 ° C в течение 40 мин.
    16. Снимите мембрану PVDF и промойте четыре раза TBST по 10 минут каждый.
    17. Погрузите мембраны PVDF в смесь (ровно настолько, чтобы пропитать мембрану) субстрата AP нитро синего тетразола (NBT) и BCIP (5-бром-4-хлор-3'-индолфосфатная-толуидиновая соль) (см. Таблицу материалов) для окрашивания. Положительный результат – фиолетовый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты должны быть прозрачной фиолетовой полосой, а полоска образца и молекулярная масса антигена должны находиться в одном и том же помеченном положении.

4. Оценка иммунного ответа антител к этой вакцине после внутримышечного введения

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были иммунизированы путем внутримышечной инъекции наноэмульсионной вакцины после опубликованного отчета11. Мышам вводили PBS в качестве отрицательного контроля. Через 1 неделю после завершения трех иммунизаций умышей 11 была собрана сыворотка. Сывороточные уровни IgG и подклассов IgG1, IgG2a и IgG2b количественно определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).

  1. Антигенное покрытие: Разбавьте антиген белка HI до 10 мкг/мл раствором оболочки и добавьте в планшет ИФА со скоростью 100 мкл / лунка. Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор покрытия готовят путем растворения 1,6 г безводного карбоната натрия и 2,9 г бикарбоната натрия в 1 л деионизированной воды.
  2. Герметизация: Вымойте пластину (три цикла, каждый цикл 300 мкл). Добавьте 300 мкл герметизирующего раствора в каждую лунку и герметизируйте лунки в течение 2 ч при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Герметизирующий раствор готовят путем добавления Tween-20 и бычьего сывороточного альбумина (BSA) к PBS. Содержание БСА в растворе ПБСТ составляет 1%.
  3. Разбавление сыворотки: Разбавьте образец сыворотки мышей в 100 раз PBST (возьмите 3 мкл сыворотки и добавьте его к 297 мкл PBST и вихря) и используйте 100 мкл для каждого образца сыворотки. Разбавьте положительную сыворотку и отрицательную контрольную сыворотку в 100 раз PBST, добавив 4 мкл к 396 мкл PBST, а затем смешав вихревым движением.
  4. Двойное разбавление: Добавьте 200 мкл вышеуказанной разбавленной экспериментальной сыворотки в первый ряд планшета ИФА с покрытием и добавьте 100 мкл PBST во все лунки, кроме первого и12-го рядов. Выполняйте разведение 1:2 последовательно из первого ряда: отрегулируйте пипетку до 100 мкл, перенесите 100 мкл из первого ряда во второй ряд и смешайте с пипеткой 10 раз.
  5. Разбавьте сыворотку до 11-го ряда в нескольких соотношениях и вылейте 100 мкл жидкости.
  6. Добавьте разбавленную отрицательную и положительную сыворотку в соответствующие лунки в ряду 12 в соответствии с шаблоном образца (см. Таблицу 1) -100 мкл / лунка.
  7. Запечатайте планшеты ИФА полиэтиленовой пленкой и выдерживайте при 37 °C в течение 1 часа.
  8. Разбавьте вторичные антитела против мыши IgG-HRP (см. Таблицу материалов) PBST в соотношении 1:10 000.
  9. Вымойте тарелку (три цикла, каждый цикл 300 мкл). Затем добавьте 100 мкл разбавленного вторичного антитела в каждую лунку и инкубируйте планшет при 37 ° C в течение 40 минут.
  10. Окрашивание и окончание: Вымойте пластину (пять циклов, каждый цикл 300 мкл). Добавьте в каждую лунку раствор для окрашивания 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (ТМБ) (100 мкл; см. Таблицу материалов). Поместите планшеты при температуре 37 °C на 10 минут вдали от света, а затем немедленно завершите реакцию 50 мкл 2 M H2SO4.
  11. Определите значение оптической плотности (OD 450) с помощью ферментного маркера (считайте значение OD450 в течение 15 минут после прекращения).

5. Оценка эффектов in vivo новых адъювантных вакцин

ПРИМЕЧАНИЕ: Защитный эффект этой наноэмульсионной вакцины был оценен на коммерчески полученной модели летального MRSA252 мыши (см. Таблицу материалов). Согласно предыдущим результатам нашей исследовательской группы 14, 1 x10 8 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мышь является лучшей дозой для оценки защитного эффекта летальной модели MRSA252 бактериальной инфекции.

  1. Восстановление штамма: Получите пробирку с замороженным MRSA252, инокулируйте бактерии на планшеты Мюллера Хинтона (MH) (A) (см. Таблицу материалов) «трехлинейным методом» и культивируйте в течение ночи при 37 ° C. Выполните шаги «трехлинейного метода», как указано ниже:
    1. Держа инокуляционное кольцо в правой руке, прижигают и охлаждают его до получения кольца бактериальной жидкости.
    2. Держите агаровую тарелку в левой руке (держа крышку на столе) над передней левой областью пламени спиртовой лампы так, чтобы тарелка была обращена к пламени, предотвращая попадание бактерий в воздух. Правой рукой перемещайте инокуляционное кольцо инфицированных бактерий вперед и назад по поверхности агара плотным, но неперекрывающимся способом, покрывая площадь примерно 1/5-1/6 всей пластины, которая является первой зоной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инокуляционное кольцо и агар должны находиться в мягком контакте под углом 30°-40°; Повреждения агара можно избежать, скользя силой запястья.
    3. Прижигайте лишние бактерии на инокуляционном кольце (прижигать или стерилизовать каждую область зависит от количества бактерий в образце). После остывания повторите предпоследние ряды 2-3 в конце и нарисуйте второй участок (примерно 1/4 площади тарелки).
    4. После того, как вторая зона будет закончена, прижгите кольцо и таким же образом нарисуйте третью зону, чтобы заполнить всю тарелку.
    5. После того, как линии проведены, поместите тарелку на крышку блюда, отметьте тарелку и инкубируйте в инкубаторе с температурой 37 °C в течение 18-24 часов, чтобы наблюдать за распределением колоний на поверхности агара. Сосредоточьте внимание на том, выделена ли одна колония, и наблюдайте за характеристиками колонии (такими как размер, форма, прозрачность и пигментация).
  2. Бактериальная активация: На следующий день возьмите две колбы шейкера по 50 мл и добавьте в каждую по 20 мл среды MH (B) (см. Таблицу материалов). Выберите две отдельные колонии наконечником пипетки объемом 10 мкл и добавьте их в шейкеры. Инкубируйте колонии в течение ночи при 220 об/мин при 37 °C.
  3. Вторичная активация: На следующий день возьмите две колбы шейкера по 50 мл, каждая из которых содержит 20 мл среды MH (B). Удалить 200 мкл бактериального раствора из шейкера, содержащего первые активированные бактерии, добавить в две новые колбы, содержащие 20 мл среды MH (B), и инкубировать при 37 °C и 220 об/мин в течение 5 часов.
  4. Соберите второй активированный бактериальный раствор в центрифужную пробирку объемом 50 мл, разделите при 3000 x g в течение 20 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Ресуспендировать осажденные бактерии в 40 мл физиологического раствора.
  6. Измерьте значение OD600 бактериального раствора и отрегулируйте до 1 с физиологическим раствором. В это время бактериальное количество MRSA252 в нашем эксперименте составляло 2 x 109 КОЕ/мл.
  7. Разбавьте бактериальный раствор OD600 1 до концентрации 1 x 109 КОЕ/мл.
  8. Случайным образом разделите 48 мышей Balb/c на четыре группы (n = 12).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Группа I: группа PBS; Группа II: контрольная группа BNE; III группа: группа наивных антигенов [белков]; Группа IV: группа наноэмульсионных адъювантных вакцин.
  9. Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией 100 мг/кг 1% пентобарбитала натрия.
  10. Облучайте мышей инфракрасной физиотерапевтической лампой (см. Таблицу материалов) в течение примерно 1 мин, чтобы вызвать вазодилатацию хвостовой вены.
  11. Бросьте вызов мышам с помощью инъекции разбавленного бактериального раствора (шаг 5.7) в хвостовую вену, 100 мкл на мышь.
  12. Поместите мышей под инфракрасную физиотерапевтическую лампу, пока они не вернутся к нормальной активности.
  13. Наблюдайте и записывайте выживаемость мышей каждые 12 ч в течение 10 дней.
  14. Усыпить мышей, переживших нападение, путем внутрибрюшинной инъекции 100 мг / кг 1% пентобарбитала натрия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Проведена оценка протокола приготовления наноэмульсионной адъювантной вакцины и испытаний этой вакцины in vitro и in vivo. TEM, AFM и DLS были использованы для определения важных характеристик дзета-потенциала и размера частиц на поверхности этого образца (рис. 1). SDS-PAGE и вестерн-блоттинг показали, что количество антигена в осадке и надосадочной жидкости значительно не деградировало после центрифугирования, что указывало на то, что вакцина была структурно интактной, специфичной и иммуногенной (рис. 2). Наноэмульсионная адъювантная вакцина значительно увеличила общие титры антител IgG, IgG1 и IgG 2a. Иммуногенность вакцины была значительно улучшена (рис. 3A-C). Сывороточные значения IgG2b OD при длине волны 450 нм группы антигена были самыми высокими (разбавление при 1:500 PBS) (рис. 3D). Летальная модель MRSA252 мыши наиболее непосредственно отражала, что наноэмульсионная адъювантная вакцина показала хороший защитный эффект и эффективно ингибировала бактериальную инфекцию MRSA252, улучшая выживаемость инфицированных мышей (рис. 4).

Figure 1
Рисунок 1: Физические характеристики новой наноэмульсионной адъювантной вакцины . (A) Просвечивающая электронная микрофотография. (B) Микрофотография атомно-силовой микроскопии. (C) Размер, диаметр и распределение. (D) Дзета-потенциал и распределение. Рисунок воспроизведен из Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10. 7275-7290 (2015)11. Первоначально опубликовано и использовано с разрешения Dove Medical Press Ltd. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Физическая стабильность новой наноэмульсионной адъювантной вакцины . (А) Структурная целостность антигенных белков. (B) Структурная специфичность белка антигена. Полоса 3: пустая надосадочная жидкость, обработанная наноэмульсией; Полоса 4: пустой осадок для обработки наноэмульсией; Полоса 5: окрашенный маркер; Полоса 6: надосадочная жидкость вакцины; Полоса 7: осадок вакцины; Полоса 8: супернатант для лечения вакциной; Полоса 9: осадок для лечения вакциной; Полоса 10: нативный белковый агент; (А) и (В) смешанный термин. Четко очерченные белковые каналы отмечены черными квадратами. Черными стрелками обозначены антигенные белки. Рисунок воспроизведен из Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10. 7275-7290 (2015)11. Первоначально опубликовано и использовано с разрешения Dove Medical Press Ltd.Sun et al. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Уровни антител IgG и его подгруппы после внутримышечного введения наноэмульсионной адъювантной вакцины . (A) Значение Log2 титров IgG. (B) 450 нм оптическая плотность сывороточного IgG1. (C) 450 нм оптическая плотность сывороточного IgG2a. (D) 450 нм оптическая плотность сывороточного IgG2b. Рисунок воспроизведен из Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10. 7275-7290 (2015)11. Первоначально опубликовано и использовано с разрешения Dove Medical Press Ltd. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Защитный эффект в летальной модели MRSA252 бактериальной инфекции. Коэффициент выживаемости мышей в ответ на системную инфекцию MRSA. Рисунок воспроизведен из Sun, H. W. et al. International Journal of Nanomedicine. 10. 7275-7290 (2015)11. Первоначально опубликовано и использовано с разрешения Dove Medical Press Ltd. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Последовательность пиков ИФА и шаблон разбавления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IsdB, поверхностный белок, закрепленный на клеточной стенке бактерий и регулируемый железом, играет важную роль в процессе получения гемового железа15. Hla, альфа-токсин, является одним из наиболее эффективных бактериальных токсинов, известных в MRSA, и может образовывать поры в эукариотических клетках и мешать адгезии и эпителиальным клеткам16. В нашем исследовании новый рекомбинационный белок антигена MRSA (HI) был построен и экспрессирован с помощью технологии генной инженерии на основе антигенных генов IsdB и Hla. Затем методом низкоэнергетического эмульгирования была разработана наноэмульсионная вакцина, и была проведена оценка стабильности и эффективности этой вакцины. Например, на некоторые характеристики, такие как долговременная стабильность, структура, форма, абсорбция и эффект in vivo, сильно влияет размер каплиэмульсии 7. Результаты показали, что размер частиц является важным фактором, влияющим на транспорт наноэмульсий in vivo и их фагоцитоз антигенпрезентирующими клетками17. Что касается цитофагоцитоза, наночастицы размером менее 1 мкм легче фагоцитируются дендритными клетками (ДК) и макрофагами и, скорее всего, стимулируют системный иммунитет18.

Что касается транспорта частиц, наночастицы размером менее 100 нм с большей вероятностью будут передаваться через лимфатические сосуды для усиления иммунного эффекта; Однако мелкие наночастицы проникают в кровеносные сосуды, в то время как крупные наночастицы замедляют скорость своего транспорта в лимфатических сосудах19. Таким образом, оптимальный размер частиц находится в диапазоне 20-50 нм. Следовательно, крайне важно изучать физические характеристики наночастиц, включая форму, размер и дзета-потенциал. ПЭМ, обладая высокой точностью, стала важным и базовым инструментом для понимания свойств наноэмульсионных адъювантных вакцин. Кроме того, технология уже несколько лет широко применяется во многих областях. Другой инструмент наномеханической характеристики с 3D и наноразмерной информацией с высоким разрешением, AFM, также использовался для оценки наноэмульсионной вакцины13. Важно отметить, что DLS, который одновременно показывает как размер, так и заряд20, может предоставить ключевую информацию, такую как состояние агрегации частиц наноэмульсионной вакцины в растворе. Согласно литературе, высокое значение дзета-потенциала необходимо для физической и химической стабильности коллоидных суспензий, поскольку большая сила отталкивания часто предотвращает агрегацию, вызванную случайными столкновениями с соседними наночастицами. Поэтому в нашем исследовании мы создали эти схемы и оценили их физико-химические свойства с помощью TEM, AFM и DLS.

Белковые вакцины играют важную роль в профилактике и лечении основных инфекционных заболеваний21. В последние годы белковые вакцины развиваются быстрыми темпами, но остаются серьезные проблемы с иммунной эффективностью и стойкостью. Основными причинами этого являются плохая стабильность белка, малый коэффициент распределения, короткий биологический период полураспада антигенов и высокие показатели клиренса in vivo22. В этом протоколе была оценена стабильность новой наноэмульсионной вакцины, и деградация антигена не наблюдалась с помощью SDS-PAGE или вестерн-блоттинга.

Безопасная, эффективная и рыночная белковая вакцина должна быть дополнена соответствующим иммунным адъювантом для значительного повышения иммуногенности белкового антигена и типа защитного иммунного ответа20 для получения оптимальной иммунной защиты вакцины. Уровень антител, стимулируемый белковой вакциной, является одним из важных показателей для эффективной профилактики и лечения инфекции, а титр антител является важным показателем для оценки того, может ли новый наноэмульсионный адъювант улучшить иммуногенность голого антигена. Новые иммунные адъюванты могут значительно стимулировать организм к повышению уровня гуморального и клеточного иммунного ответа, а обогащение типов иммунного ответа и иммунозащитной эффективности вакцин является важным направлением развития и компонентом будущих исследований и разработки новых вакцин23. Таким образом, в этом протоколе были обнаружены титры антител мышиных сывороточных IgG, IgG1, IgG2a и IgG2b с новой наноэмульсионной адъювантной вакциной. Летальная мышная модель24 является золотым стандартом для оценки вакцин, и в нашем протоколе для оценки защитного эффекта использовалась модель летального MRSA252 мыши. Результаты показали, что новая наноэмульсионная адъювантная вакцина эффективно улучшила выживаемость мышей Balb/c, инфицированных MRSA.

Этот протокол недостаточен для оценки стабильности наноэмульсионных вакцин. Циркулярный дихроизм является подходящим методом, если он может быть применен для обнаружения пространственной структуры вакцинных белков простым и быстрым методом. Хотя выживаемость мышей, подвергшихся нападению, является золотым стандартом для оценки теста in vivo и эффективности вакцины, было бы более убедительно, если бы можно было измерить количество бактериальной колонизации органов мышей после нападения. Таким образом, в настоящем протоколе все еще есть некоторые недостатки для оценки иммунного ответа наноэмульсионной адъювантной вакцины, и вышеупомянутый эксперимент необходимо дополнить в последующих соответствующих экспериментах для оценки.

В заключение необходимо провести ряд оценок физических свойств, стабильности, специфического иммунного ответа и защиты от вызовов. Завершение этих схем обеспечит жизненно важные экспериментальные основы для применения и разработки новых наноэмульсионных адъювантных вакцин.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов в этой работе.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано No 2021YFC2302603 Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая, No 32070924 и 32000651 NSFC и No 2019jcyjA-msxmx0159 Проектной программы Фонда естественных наук Чунцина.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 Eppendorf, Germany  5424000495
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
AFM Dimension FastScan BRUKER, Germany  null
Alcohol lamp Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China YBS-AA-11408
Balb/c mice  Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. 
BCIP/NBT Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA null
BL21 Competent Cell Merck millipore,Germany 70232-3CN
BSA-100G Sigma-Aldrich, USA B2064-100G
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solution MIKX,China DB236
Decolorization solution BOSTER,China AR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China null
Electrophoresis apparatus Beijing Liuyi Instrument Factory, China DYCZ-25D
Gel image Tanon, USA null
Glutathione-Sepharose Resin GST Mei5bio,China affinity chromatography resin
H2SO4 Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China 7664-93-9
HI recombinant protein Third Military Medical University,China 110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgG Biodragon, China BF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1 Biodragon, China BF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2a Biodragon, China BF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2b Biodragon, China BF03004R
Inoculation loop Haimen Feiyue Co.,LTD,China YR-JZH-1UL
IsdB and Hla clones Shanghai Jereh Biotechnology Co,China null
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) SEPPIC, France null
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside fdbio,China FD3278-1
LB bouillon culture-medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-136
Lnfrared physiotherapy lamp Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China 7600
Low temperature refrigerated centrifuge Eppendorf, Germany  null
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK null
MH(A) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-051
MH(B) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-052
Micro plate washing machine 405 LSRS Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USA null
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China 1658030
MMC packing TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD 0022818
MRSA252 USA, ATCC null
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo Scientific, USA null
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit DAKEWE, China 8012011
PBS biosharp, China null
PCR, Amplifier Thermal Cycler, USA null
pGEX-target gene recombinant plasmid Shanghai Jereh Biotechnology Co,China B3528G
Phosphotungstic acid G-CLONE, China CS1231-25g
pipette Eppendorf, Germany  3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) Aladdin, China K400327-1kg
Primary antibody Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera null See Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) Sigma-Aldrich, USA P4347-500ML
Protein Marker Thermo Scientufuc, USA 26616
PVDF TRANSFER MEMBRANE Invitrogen,USA 88518
Scanning Electron Microscope JEOL,Japan JSM-IT800
Sodium pentobarbital Merck,Germany Tc-P8411
Talos L120C TEM Thermo Fisher, USA null
TMB color solution TIAN GEN, China PA107-01
Turtle kits Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD ES80545
Tween-20 Macklin, China 9005-64-5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
  2. Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
  3. Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
  4. Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
  5. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  6. Geoghegan, S., O'Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
  7. Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
  8. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  9. Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
  10. Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
  11. Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  12. National Pharmacopoeia Committee. Chinese Pharmacopoeia. , China Medical Science and Technology Press. Beijing. 1088 (2020).
  13. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  14. Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
  15. Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
  16. Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
  17. Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
  18. Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
  19. Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
  20. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  21. Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
  22. Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
  23. Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
  24. Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 199
Оценка иммунного ответа наноэмульсионной адъювантной вакцины против метициллин-резистентной <em>инфекции золотистого стафилококка</em> (MRSA)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeng, X., Sun, H., Ye, Y., Luo, X.,… More

Zeng, X., Sun, H., Ye, Y., Luo, X., Cai, D., Yang, Y., Chen, T., Sun, C., Zhang, S., Zeng, H. Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection. J. Vis. Exp. (199), e65152, doi:10.3791/65152 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter