Een workflow voor lipide nanodeeltjes (LNP) formuleringsoptimalisatie met behulp van ontworpen mengselprocesexperimenten en zelfgevalideerde ensemblemodellen (SVEM)

Summary

Dit protocol biedt een benadering voor formuleringsoptimalisatie over mengsel-, continue en categorische studiefactoren die subjectieve keuzes in de experimentele ontwerpconstructie minimaliseren. Voor de analysefase wordt een effectieve en eenvoudig te gebruiken modelleringsprocedure gebruikt.

Abstract

We presenteren een Quality by Design (QbD) -achtige aanpak voor het optimaliseren van lipide nanodeeltjes (LNP) formuleringen, met als doel wetenschappers een toegankelijke workflow te bieden. De inherente beperking in deze studies, waarbij de molaire verhoudingen van ioniseerbare, helper- en PEG-lipiden tot 100% moeten oplopen, vereist gespecialiseerde ontwerp- en analysemethoden om aan deze mengselbeperking tegemoet te komen. Door ons te concentreren op lipide- en procesfactoren die vaak worden gebruikt bij LNP-ontwerpoptimalisatie, bieden we stappen die veel van de problemen vermijden die zich traditioneel voordoen bij het ontwerp en de analyse van mengselprocesexperimenten door gebruik te maken van ruimtevullende ontwerpen en gebruik te maken van het onlangs ontwikkelde statistische kader van zelfgevalideerde ensemblemodellen (SVEM). Naast het produceren van kandidaat-optimale formuleringen, bouwt de workflow ook grafische samenvattingen van de aangepaste statistische modellen die de interpretatie van de resultaten vereenvoudigen. De nieuw geïdentificeerde kandidaatformuleringen worden beoordeeld met bevestigingsruns en kunnen optioneel worden uitgevoerd in het kader van een uitgebreidere tweedefasestudie.

Introduction

Lipide nanodeeltjes (LNP) formuleringen voor in vivo genafgiftesystemen omvatten over het algemeen vier samenstellende lipiden uit de categorieën ioniseerbare, helper- en PEG-lipiden ^1,2,3. Of deze lipiden nu alleen of gelijktijdig met andere niet-mengselfactoren worden bestudeerd, experimenten voor deze formuleringen vereisen "mengsel" -ontwerpen omdat - gegeven een kandidaat-formulering - het verhogen of verlagen van de verhouding van een van de lipiden noodzakelijkerwijs leidt tot een overeenkomstige afname of toename van de som van de verhoudingen van de andere drie lipiden.

Ter illustratie wordt verondersteld dat we een LNP-formulering optimaliseren die momenteel een vast recept gebruikt dat als benchmark zal worden behandeld. Het doel is om de potentie van de LNP te maximaliseren en tegelijkertijd de gemiddelde deeltjesgrootte te minimaliseren. De studiefactoren die in het experiment worden gevarieerd, zijn de molaire verhoudingen van de vier samenstellende lipiden (ioniseerbaar, cholesterol, DOPE, PEG), de N: P-verhouding, de stroomsnelheid en het ioniseerbare lipidetype. De ioniseerbare en helperlipiden (inclusief cholesterol) mogen variëren over een breder bereik van molaire verhouding, 10-60%, dan PEG, die in deze illustratie zal variëren van 1-5%. Het referentieformuleringsrecept en de bereiken van de andere factoren en hun afrondingsgranulariteit worden gespecificeerd in aanvullend dossier 1. Voor dit voorbeeld zijn de wetenschappers in staat om 23 runs (unieke batches deeltjes) op één dag uit te voeren en willen dat als hun steekproefgrootte gebruiken als deze aan de minimumvereisten voldoet. Gesimuleerde resultaten voor dit experiment zijn opgenomen in Aanvullend Dossier 2 en Aanvullend Dossier 3.

Rampado en Peer⁴ hebben een recent overzichtsartikel gepubliceerd over het onderwerp van ontworpen experimenten voor de optimalisatie van op nanodeeltjes gebaseerde medicijnafgiftesystemen. Kauffman et ^al.5 beschouwden LNP-optimalisatiestudies met behulp van fractionele factoriële en definitieve screeningsontwerpen⁶; Dit soort ontwerpen kan echter geen mengselbeperking opvangen zonder toevlucht te nemen tot het gebruik van inefficiënte "spelingsvariabelen"7 en worden meestal niet gebruikt wanneer mengselfactoren aanwezig zijn ^7,8. In plaats daarvan worden "optimale ontwerpen" die in staat zijn om een mengselbeperking op te nemen, traditioneel gebruikt voor experimenten met mengselprocessen⁹. Deze ontwerpen richten zich op een door de gebruiker gespecificeerde functie van de studiefactoren en zijn alleen optimaal (in een van een aantal mogelijke betekenissen) als deze functie de ware relatie tussen de studiefactoren en responsen vastlegt. Merk op dat er in de tekst een onderscheid is tussen "optimale ontwerpen" en "optimale formuleringskandidaten", waarbij de laatste verwijst naar de beste formuleringen die door een statistisch model worden geïdentificeerd. Optimale ontwerpen hebben drie belangrijke nadelen voor experimenten met mengselprocessen. Ten eerste, als de wetenschapper niet anticipeert op een interactie van de studiefactoren bij het specificeren van het doelmodel, dan zal het resulterende model bevooroordeeld zijn en inferieure kandidaatformuleringen kunnen produceren. Ten tweede plaatsen optimale ontwerpen de meeste runs op de buitengrens van de factorruimte. In LNP-studies kan dit leiden tot een groot aantal verloren runs als de deeltjes zich niet correct vormen aan uitersten van de lipide- of procesinstellingen. Ten derde geven wetenschappers vaak de voorkeur aan experimentele runs op het binnenste van de factorruimte om een modelonafhankelijk gevoel van het responsoppervlak te krijgen en het proces direct te observeren in voorheen onontgonnen gebieden van de factorruimte.

Een alternatief ontwerpprincipe is om te streven naar een geschatte uniforme dekking van de (mengselbeperkte) factorruimte met een ruimtevullend ontwerp¹⁰. Deze ontwerpen offeren enige experimentele efficiëntie op ten opzichte van optimale ontwerpen⁹ (ervan uitgaande dat de hele factorruimte leidt tot geldige formuleringen), maar bieden verschillende voordelen in een afweging die nuttig zijn in deze toepassing. Het ruimtevullende ontwerp maakt geen a priori aannames over de structuur van het responsoppervlak; Dit geeft het de flexibiliteit om onverwachte relaties tussen de studiefactoren vast te leggen. Dit stroomlijnt ook de ontwerpgeneratie omdat het niet nodig is om beslissingen te nemen over welke regressietermen moeten worden toegevoegd of verwijderd als de gewenste rungrootte wordt aangepast. Wanneer sommige ontwerppunten (recepten) leiden tot mislukte formuleringen, maken ruimtevullende ontwerpen het mogelijk om de faalgrens over de studiefactoren te modelleren, terwijl ook statistische modellen voor de studieresponsen over de succesvolle factorcombinaties worden ondersteund. Ten slotte maakt de binnendekking van de factorruimte modelonafhankelijke grafische verkenning van het responsoppervlak mogelijk.

Om de mengselfactorsubruimte van een mengselprocesexperiment te visualiseren, worden gespecialiseerde driehoekige "ternaire percelen" gebruikt. Figuur 1 motiveert dit gebruik: in de kubus van punten waar drie ingrediënten elk van 0 tot 1 mogen variëren, worden de punten die voldoen aan een beperking dat de som van de ingrediënten gelijk is aan 1 rood gemarkeerd. De mengselbeperking op de drie ingrediënten reduceert de haalbare factorruimte tot een driehoek. In LNP-toepassingen met vier mengselingrediënten produceren we zes verschillende ternaire plots om de factorruimte weer te geven door twee lipiden tegelijk uit te zetten tegen een "Anderen" -as die de som van de andere lipiden vertegenwoordigt.

Figuur 1: Driehoeksfactorgebieden. In de ruimtevullende plot in de kubus vertegenwoordigen de kleine grijze stippen formuleringen die niet consistent zijn met de mengselbeperking. De grotere rode punten liggen op een driehoek die in de kubus is ingeschreven en vertegenwoordigen formuleringen waarvoor aan de mengselbeperking is voldaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naast de lipidemengselfactoren zijn er vaak een of meer continue procesfactoren zoals N:P-verhouding, bufferconcentratie of stroomsnelheid. Categorische factoren kunnen aanwezig zijn, zoals ioniseerbaar lipidentype, helperlipidentype of buffertype. Het doel is om een formulering te vinden (een mengsel van lipiden en instellingen voor procesfactoren) die een zekere mate van potentie maximaliseert en / of fysiochemische kenmerken verbetert, zoals het minimaliseren van deeltjesgrootte en PDI (polydispersiteitsindex), het maximaliseren van procentuele inkapseling en het minimaliseren van bijwerkingen - zoals gewichtsverlies - in in vivo studies. Zelfs wanneer wordt uitgegaan van een redelijk benchmarkrecept, kan er interesse zijn in heroptimalisatie gezien een verandering in de genetische lading of bij het overwegen van veranderingen in de procesfactoren of lipidetypen.

Cornell⁷ biedt een definitieve tekst over de statistische aspecten van mengsel- en mengselprocesexperimenten, waarbij Myers et ^al.9 een uitstekende samenvatting geven van de meest relevante mengselontwerp- en analyseonderwerpen voor optimalisatie. Deze werken kunnen wetenschappers echter overladen met statistische details en met gespecialiseerde terminologie. Moderne software voor het ontwerpen en analyseren van experimenten biedt een robuuste oplossing die de meeste LNP-optimalisatieproblemen voldoende ondersteunt zonder een beroep te hoeven doen op de relevante theorie. Hoewel meer gecompliceerde of prioritaire studies nog steeds baat zullen hebben bij samenwerking met een statisticus en optimale in plaats van ruimtevullende ontwerpen kunnen gebruiken, is ons doel om het comfortniveau van wetenschappers te verbeteren en optimalisatie van LNP-formuleringen aan te moedigen zonder een beroep te doen op inefficiënte one-factor-at-a-time (OFAT) testen¹¹ of gewoon genoegen te nemen met de eerste formulering die voldoet aan de specificaties.

In dit artikel wordt een workflow gepresenteerd die statistische software gebruikt om een generiek LNP-formuleringsprobleem te optimaliseren, waarbij ontwerp- en analyseproblemen worden aangepakt in de volgorde waarin ze zullen worden aangetroffen. In feite zal de methode werken voor algemene optimalisatieproblemen en is niet beperkt tot LNP's. Onderweg worden verschillende veelgestelde vragen die zich voordoen behandeld en worden aanbevelingen gedaan die zijn gebaseerd op ervaring en op simulatieresultaten¹². Het recent ontwikkelde raamwerk van zelfgevalideerde ensemblemodellen (SVEM)¹³ heeft de anders fragiele benadering van het analyseren van resultaten van mengselprocesexperimenten sterk verbeterd, en we gebruiken deze aanpak om een vereenvoudigde strategie voor formuleringsoptimalisatie te bieden. Hoewel de workflow is opgebouwd op een algemene manier die kan worden gevolgd met behulp van andere softwarepakketten, is JMP 17 Pro uniek in het aanbieden van SVEM samen met de grafische samenvattingstools die we nodig hebben gevonden om de anders geheimzinnige analyse van mengselprocesexperimenten te vereenvoudigen. Als gevolg hiervan zijn JMP-specifieke instructies ook opgenomen in het protocol.

SVEM maakt gebruik van dezelfde lineaire regressiemodelbasis als de traditionele benadering, maar het stelt ons in staat om vervelende wijzigingen te voorkomen die nodig zijn om een "volledig model" van kandidaat-effecten te passen door een voorwaartse selectie of een bestrafte selectie (Lasso) basisbenadering te gebruiken. Bovendien biedt SVEM een verbeterde "gereduceerde model" -pasvorm die het potentieel voor het opnemen van ruis (proces plus analytische variantie) die in de gegevens wordt weergegeven, minimaliseert. Het werkt door het gemiddelde te nemen van de voorspelde modellen die het resultaat zijn van het herhaaldelijk herwegen van het relatieve belang van elke run in het model 13,14,15,16,17,18. SVEM biedt een raamwerk voor het modelleren van mengselprocesexperimenten dat zowel gemakkelijker te implementeren is als traditionele single-shot regressie en betere kwaliteit optimale formuleringskandidaten oplevert^12,13. De wiskundige details van SVEM vallen buiten het bestek van dit artikel en zelfs een vluchtige samenvatting buiten het relevante literatuuronderzoek zou afleiden van het belangrijkste voordeel in deze toepassing: het maakt een eenvoudige, robuuste en nauwkeurige klik-en-klaar-procedure voor beoefenaars mogelijk.

De gepresenteerde workflow is consistent met de Quality by Design (QbD)^{19-benadering} van farmaceutische ontwikkeling²⁰. Het resultaat van de studie zal een goed begrip zijn van de functionele relatie die de materiaalattributen en procesparameters koppelt aan kritische kwaliteitsattributen (CQAs)²¹. Daniel et ^al.22 bespreken het gebruik van een QbD-framework specifiek voor RNA-platformproductie: onze workflow kan binnen dit kader als hulpmiddel worden gebruikt.

Protocol

Het experiment beschreven in de sectie Representatieve resultaten werd uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die zijn vastgesteld door onze Institutionele Commissie voor de verzorging en het gebruik van dieren (IACUC). 6-8 weken oude vrouwelijke Balb / C-muizen werden commercieel verkregen. Dieren kregen ad libitum standaard chow en water en werden gehuisvest onder standaardomstandigheden met 12 uur licht / donker cycli, bij een temperatuur van 65-75 ° F (~ 18-23 ° C) met 40-60% vochtigheid.

1. Registratie van het onderzoeksdoel, de reacties en de factoren

OPMERKING: In dit protocol wordt JMP 17 Pro gebruikt voor het ontwerpen en analyseren van het experiment. Gelijkwaardige software kan worden gebruikt volgens vergelijkbare stappen. Voor voorbeelden en verdere instructies voor alle stappen die in sectie 1 worden uitgevoerd, raadpleegt u Aanvullend dossier 1.

1. Vat het doel van het experiment samen in een document met een datumstempel.
2. Maak een lijst van de primaire responsen (CQA's) die tijdens het experiment worden gemeten.
3. Maak een lijst van eventuele secundaire responsen (bv. downstreambeperkingen op fysisch-chemische eigenschappen) die kunnen worden gemeten.
4. Maak een lijst van procesparameters die mogelijk verband houden met de antwoorden, inclusief de parameters die het meest relevant zijn voor het doel van het onderzoek.
5. Als de studie over meerdere dagen wordt uitgevoerd, neem dan een dag categorische "blokkerende" factor op.
   OPMERKING: Dit brengt factorinstellingen over dagen in evenwicht om te voorkomen dat verschuivingen op dagniveau in het procesgemiddelde worden verward met de studiefactoren.
6. Selecteer de factoren die tijdens het onderzoek moeten worden gevarieerd en de factoren die constant moeten worden gehouden.
   OPMERKING: Gebruik hulpmiddelen voor risicoprioritering zoals faalmoduseffectanalyses²⁰ voor het selecteren van de meest relevante subset van factoren (figuur 2). Meestal moeten alle lipiden kunnen variëren; hoewel het in sommige gevallen met beperkte budgetten redelijk is om PEG op een vaste verhouding te vergrendelen.
7. Stel de bereiken vast voor de verschillende factoren en de relevante decimale precisie voor elk.
8. Bepaal de grootte van de onderzoeksopzet (het aantal unieke batches deeltjes) met behulp van de minimale en maximale heuristieken. Handmatig inbegrepen besturingsbenchmarkruns tellen niet mee voor de rungrootte die wordt aanbevolen door de heuristieken.
   OPMERKING: De volgende heuristieken gaan ervan uit dat de reacties continu zijn. De minimale heuristiek gaat ervan uit dat het mogelijk zal zijn om, indien nodig, een vervolgstudie uit te voeren, naast het uitvoeren van bevestigingsruns voor kandidaat-optimale formuleringen. Als het alleen haalbaar is om bevestigingsruns uit te voeren, is het beter om te budgetteren voor het aantal runs dat wordt verkregen uit de maximale heuristiek. Zoek voor binaire primaire antwoorden hulp bij een statisticus om het juiste aantal runs te bepalen.
   1. Minimale heuristiek: Wijs drie runs toe per mengselfactor, twee per continue procesfactor en één per niveau van elke categorische factor.
      OPMERKING: Voor een studie met vier lipidefactoren, twee continue en één drieweg categorische procesvariabele, leidt dit tot een suggestie van (3 x 4) + (2 x 2) + 3 = 19 ruimtevullende runs. Voeg extra runs toe als sommige waarschijnlijk zullen mislukken vanwege formulerings- of meetproblemen.
   2. Maximale heuristiek: Start de software voor het bouwen van optimale ontwerpen en voer de vereiste parameters in voor een tweede orde (inclusief hoofdeffecten, tweerichtingsinteracties tussen alle effecten en kwadratische effecten voor continue procesfactoren). Bereken de minimale rungrootte volgens het algoritme van de software. Voeg 1 toe aan het resultaat verkregen uit de software om de maximale heuristiek te definiëren.
      OPMERKING: Raadpleeg Aanvullend dossier 1 voor gedetailleerde instructies over het uitvoeren van deze stappen. Een voorbeeldgeval met vier lipidefactoren, twee continue en één drieweg categorische procesvariabele, leidt tot een aanbevolen rungrootte van 34 (33 van softwareaanbeveling + 1). Alle runs daarbuiten zouden waarschijnlijk beter kunnen worden gebruikt voor bevestigings- of vervolgstudies.

Figuur 2: Oorzaak en gevolg diagram. Het diagram toont gemeenschappelijke factoren in een LNP-formuleringsoptimalisatieprobleem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Creatie van de ontwerptafel met een ruimtevullend ontwerp

1. Open JMP en navigeer door de menubalk naar DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
2. Voer de onderzoeksreacties in (zie Aanvullend Dossier 1).
3. Optioneel: voeg kolommen toe voor aanvullende reacties, waarbij wordt aangegeven of elke kolom moet worden gemaximaliseerd, geminimaliseerd of getarget door op Reactie toevoegen te klikken.
   OPMERKING: Deze instellingen kunnen later worden gewijzigd en hebben geen invloed op het ontwerp. Op dezelfde manier kunnen extra kolommen voor aanvullende reacties worden toegevoegd na het maken van de ontwerptabel.
4. Voer de studiefactoren en de bijbehorende bereiken in. Gebruik de knop Mengsel om mengselfactoren toe te voegen, de knop Continu om continue factoren toe te voegen of de knop Categorisch om categorische factoren toe te voegen.
   OPMERKING: Deze voorbeeldstudie maakt gebruik van de factoren en bereiken die worden geïllustreerd in figuur 3, waaronder de ioniseerbare molaire verhouding (variërend tussen 0,1 en 0,6), de helper-molaire verhouding (ook tussen 0,1 en 0,6), de cholesterolmolaire verhouding (tussen 0,1 en 0,6), de PEG-molaire verhouding (van 0,01 tot 0,05) en het ioniseerbare lipidetype (dat H101 kan zijn, H102, of H103).
5. Voer het vooraf bepaalde aantal runs voor het ontwerp in het veld Number of Runs in.
6. Optioneel: Verhoog de gemiddelde clustergrootte van de standaardwaarde van 50 naar 2000 via het rode driehoekmenu naast de koptekst Ontwerp voor ruimtevulling en in het submenu Geavanceerde opties .
   OPMERKING: Dit is een instelling voor het ruimtevullende algoritme dat kan leiden tot een iets betere ontwerpconstructie ten koste van extra rekentijd.
7. Genereer de ruimtevullende ontwerptabel voor de gekozen factoren en rungrootte. Klik op ' Snel flexibel vullen' en klik vervolgens op ' Maak tabel'.
   OPMERKING: De eerste twee runs van een voorbeeldontwerp worden weergegeven in figuur 4.
8. Voeg een kolom Notities toe aan de tabel voor het annoteren van handmatig gemaakte uitvoeringen. Dubbelklik op de eerste lege kolomkop om een kolom toe te voegen en dubbelklik vervolgens op de nieuwe kolomkop om de naam te bewerken.
9. Neem, indien van toepassing, handmatig benchmarkbesturingsruns op in de ontwerptabel. Neem een replicatie op voor een van de controlebenchmarks. Markeer de benchmarknaam in de kolom Opmerkingen en geef de rijen voor de replicatie van de benchmark een kleurcode voor eenvoudige grafiekidentificatie.
   1. Voeg een nieuwe rij toe door te dubbelklikken op de eerste lege rijkop en voer de instellingen van de benchmarkfactor in. Dupliceer deze rij om een replicatie van de benchmark te maken. Markeer beide rijen en navigeer naar Rijen > kleuren om een kleur toe te wijzen voor grafische doeleinden.
      OPMERKING: De replicatie biedt een modelonafhankelijke schatting van het proces plus analytische variantie en biedt extra grafisch inzicht.
10. Als een benchmarkcontrole het bereik van de onderzoeksfactoren overschrijdt, geeft u dit aan in de kolom "Opmerkingen" voor toekomstige uitsluiting van analyse.
11. Rond de mengselfactoren af tot de juiste granulariteit. Om dit te doen,
    1. Markeer de kolomkoppen voor de mengselfactoren, klik met de rechtermuisknop op een van de kolomkoppen en navigeer naar Nieuwe formulekolom > Transformeer > rond..., voer het juiste afrondingsinterval in en klik op OK.
    2. Zorg ervoor dat er geen rijen zijn geselecteerd door op het onderste driehoekje op het snijpunt van rij- en kolomkoppen te klikken.
    3. Kopieer de waarden uit de nieuw gemaakte afgeronde kolommen (Ctrl + C) en plak (Ctrl + V) in de oorspronkelijke mengselkolommen. Verwijder ten slotte de tijdelijke kolommen met afgeronde waarden.
12. Nadat u de lipidenverhoudingen hebt afgerond, controleert u of hun som gelijk is aan 100% door de kolomkoppen voor de mengselfactoren te selecteren, er met de rechtermuisknop op te klikken en naar Nieuwe formulekolom te gaan > > som combineren. Als de som van een rij niet gelijk is aan 1, past u handmatig een van de mengselfactoren aan, zodat de factorinstelling binnen het factorbereik blijft. Verwijder de somkolom nadat de aanpassingen zijn voltooid.
13. Volg dezelfde procedure die wordt gebruikt voor het afronden van de mengselfactoren om de procesfactoren af te ronden op hun respectieve granulariteit.
14. Maak de lipidenkolommen op om weer te geven als percentages met het gewenste aantal decimalen: selecteer de kolomkoppen, klik met de rechtermuisknop en kies Kenmerken standaardiseren.... Stel in het volgende venster Opmaak in op Percentage en pas het aantal decimalen zo nodig aan.
15. Als handmatige uitvoeringen worden toegevoegd, zoals benchmarks, moet u de volgorde van de tabelrij opnieuw willekeurig maken: voeg een nieuwe kolom met willekeurige waarden toe (klik met de rechtermuisknop op de laatste kolomkop en selecteer Nieuwe formulekolom > Willekeurig > Willekeurig normaal). Sorteer deze kolom in oplopende volgorde door met de rechtermuisknop op de kolomkop te klikken en verwijder de kolom.
16. Optioneel: voeg een Run ID-kolom toe . Vul dit in met de huidige datum, experimentnaam en rijnummer uit de tabel.
    OPMERKING: Zie (Figuur 5) voor een voorbeeld.
17. Genereer ternaire plots om de ontwerppunten over de lipidefactoren te visualiseren (figuur 6). Onderzoek ook de runverdeling over de procesfactoren (Figuur 7): selecteer Grafiek > Ternaire Plot. Selecteer alleen de mengselfactoren voor X, Plotting.
18. Als u de verdeling over de procesfactoren wilt onderzoeken, selecteert u Analyseren > distributie en voert u de procesfactoren voor Y, kolommen in.
    OPMERKING: De formuleringswetenschapper moet de haalbaarheid van alle runs bevestigen. Als er onhaalbare uitvoeringen bestaan, start u het ontwerp opnieuw op, rekening houdend met de nieuw ontdekte beperkingen.

Figuur 3: Studiefactoren en -bereiken. Screenshots van instellingen in experimentele software zijn handig voor het reproduceren van de onderzoeksopstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Initiële uitvoer voor een ruimtevullend ontwerp. Als u de eerste twee rijen van de tabel weergeeft, moeten de instellingen met de gewenste precisie worden afgerond, terwijl u er ook voor zorgt dat de lipidebedragen optellen tot 1. De benchmark is handmatig aan de tabel toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Opgemaakte studietabel. De factorniveaus zijn afgerond en opgemaakt en er is een Run ID-kolom toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Ontwerppunten op een ternair perceel. De 23 formuleringen worden weergegeven als een functie van de overeenkomstige ioniseerbare, helper- en "anderen" (cholesterol + PEG) verhoudingen. Het groene punt in het midden vertegenwoordigt de benchmark 33:33:33:1 molaire verhouding van Ioniseerbaar (H101):Cholesterol:Helper (DOPE):P EG. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Verdeling van niet-mengselprocesfactoren in het experiment. De histogrammen laten zien hoe de experimentele runs zijn verdeeld over Ionisable Lipid Type, N: P ratio en Flow Rate. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Het experiment uitvoeren

1. Voer het experiment uit in de volgorde die wordt opgegeven door de ontwerptabel. Noteer de uitlezingen in de kolommen die in de experimentele tabel zijn ingebouwd.
2. Als er meerdere testen worden uitgevoerd voor dezelfde respons op een identieke formuleringsbatch, bereken dan een gemiddelde voor deze resultaten binnen elke batch. Voeg een kolom voor elke testmeting toe aan de tabel.
   1. Als u een gemiddelde wilt verkrijgen, selecteert u alle gerelateerde kolommen, klikt u met de rechtermuisknop op een van de geselecteerde kolomkoppen en kiest u Nieuwe formulekolom > Combineren > gemiddelde. Gebruik deze kolom Gemiddelde voor toekomstige responsanalyses.
      OPMERKING: Zonder het recept opnieuw te starten, vangen herhaalde assaymetingen alleen assayvariantie op en vormen ze geen onafhankelijke replicaties.
3. Documenteer elk optreden van formuleringsneerslag of in vivo verdraagbaarheidsproblemen (zoals ernstig verlies van lichaamsgewicht of overlijden) met binaire (0/1) indicatoren in een nieuwe kolom voor elk type probleem.

4. Analyse van de experimentele resultaten

1. Plot de metingen en onderzoek de verdelingen van de antwoorden: open Graph > Graph Builder en sleep elk antwoord naar het Y-gebied voor afzonderlijke plots. Herhaal dit voor alle reacties.
2. Controleer de relatieve afstand tussen de kleurgecodeerde replicatieruns, als er een is opgenomen. Dit maakt het mogelijk om inzicht te krijgen in de totale (proces- en analytische) variatie op de benchmark in vergelijking met de variabiliteit als gevolg van veranderingen in de factorinstellingen over de gehele factorruimte (figuur 8).
3. Bepaal of de onbewerkte respons moet worden gemodelleerd of dat in plaats daarvan een transformatie moet worden gebruikt. Voor responsen die beperkt zijn tot positief zijn, maar hierboven onbegrensd zijn (bijv. Potentie), passen zowel een normale verdeling als een lognormale verdeling aan bij de experimentele resultaten. Als de lognormale verdeling beter past bij een lagere AICc (gecorrigeerd Akaike's Information Criterion), neem dan een logtransformatie van die reactie.
   1. Navigeer naar Analyseer > distributie en selecteer het antwoord voor Y, Kolommen. Klik in het resulterende distributierapport op het rode driehoekje naast de naam van de reactie en kies Continu passend > Normaal aanpassen en Continu aanpassen > Lognormaal aanpassen in het vervolgkeuzemenu. Controleer in het daaropvolgende rapport Distributies vergelijken de AICc-waarden om te bepalen welke verdeling beter bij de respons past.
   2. Als u een logboektransformatie wilt uitvoeren, klikt u met de rechtermuisknop op de kolomkop van de antwoordkolom en selecteert u Nieuwe formulekolom > logboek > logboek. Wanneer een model is gebouwd en een voorspellingskolom op de logboekschaal is opgeslagen, transformeert u het antwoord terug naar de oorspronkelijke schaal door Nieuwe formulekolom > Logboek > Exp te selecteren.
   3. Voor verhoudingsreacties tussen 0 en 1 vergelijkt u de pasvorm van een normale en bètaverdeling. Als de bètadistributie een lagere AICc heeft, voert u een logittransformatie uit. Kies in het rapport Distributie voor het antwoord de optie Continuous Fit > Fit Normal en Continuous Fit > Fit Beta.
      1. Klik voor de logittransformatie met de rechtermuisknop op de kolomkop van het antwoord in de gegevenstabel en selecteer Nieuwe formulekolom > Specialiteit > Logit. Na het bouwen van modellen slaat u de voorspellingskolom op. Als u wilt terugkeren naar de oorspronkelijke schaal, gebruikt u de kolom Nieuwe formule > Specialiteit > Logistiek.
         OPMERKING: De op regressie gebaseerde SVEM-analyse is robuust voor afwijkingen van de normaliteit in de responsverdeling. Deze transformaties kunnen echter leiden tot een eenvoudigere interpretatie van de resultaten en tot een betere pasvorm van de modellen.
4. Grafiek de runs op een ternaire plot. Kleur de punten volgens de antwoorden (of de getransformeerde reacties als een transformatie is toegepast): open Graph > Ternary Plot. Selecteer alleen de mengselfactoren voor X, Plotting. Klik met de rechtermuisknop op een van de resulterende grafieken, selecteer Rijlegenda en selecteer vervolgens de (getransformeerde) antwoordkolom.
   OPMERKING: Het kleuren van de punten op basis van antwoorden geeft een modelonafhankelijk visueel perspectief van gedrag in relatie tot mengselfactoren.
5. Verwijder het modelscript dat is gegenereerd door het ontwerp voor het vullen van spatie.
6. Bouw een onafhankelijk model voor elke respons als functie van de onderzoeksfactoren en herhaal de volgende stappen voor elke respons.
   OPMERKING: In het geval van een secundaire binaire respons (bijv. Formuleringsfalen of muizendood), modelleer deze respons ook. Wijzig de doelverdelingsinstelling van Normaal in Binomiaal.
7. Construeer een "volledig" model dat alle kandidaat-effecten omvat. Dit model moet de belangrijkste effecten van elke factor omvatten, twee- en drieweginteracties, kwadratische en partiële kubische termen in de procesfactoren en Scheffé kubische termen voor de mengselfactoren^23,24.
   OPMERKING: Gebruik dezelfde set kandidaat-effecten voor elke reactie. De SREM-modelselectietechniek zal de modellen voor elke respons onafhankelijk verfijnen, wat mogelijk resulteert in unieke gereduceerde modellen voor elke respons. Figuur 9 illustreert enkele van deze kandidaat-effecten. In de volgende substappen wordt dit proces beschreven.
   1. Selecteer Analyseren > passend model.
   2. Zorg ervoor dat blokkerende factoren (bijv. Dag) niet mogen interageren met andere onderzoeksfactoren. Selecteer eventuele blokkeringsfactoren en klik op Toevoegen. Neem deze factoren niet op in een van de volgende substappen.
      OPMERKING: Blokkerende factoren zijn belangrijk om rekening mee te houden in het model, maar blokkerende factoren mogen niet worden toegestaan om te interageren met andere onderzoeksfactoren. Het belangrijkste doel van blokkerende factoren is om de variabiliteit van het experiment te helpen beheersen en de gevoeligheid van het experiment te verbeteren.
   3. Benadruk alle studiefactoren. Wijzig de veldwaarde Graad in 3 (deze is standaard ingesteld op 2). Klik op Factorial to Degree.
      OPMERKING: Deze actie omvat de belangrijkste effecten en twee- en drieweginteracties in het model.
   4. Selecteer alleen de niet-mengselfactoren in het selectievenster. Klik op Macro's > gedeeltelijke kubus.
      OPMERKING: Deze actie introduceert kwadratische effecten voor de continue procesfactoren en hun interactie met andere niet-mengselfactoren in het model.
   5. Kies alleen de mengselfactoren uit de selectielijst. Klik op Macro's > Scheffe Cubic. Deactiveer de standaardoptie Geen onderschepping (zie Figuur 9).
      OPMERKING: Het opnemen van een interceptie in het model is een essentiële stap bij het gebruik van Lasso-methoden en is ook nuttig in de context van voorwaartse selectie. De traditionele standaardinstelling No Intercept is meestal aanwezig omdat het gelijktijdig aanbrengen van een intercept met alle hoofdeffecten van het mengsel, zonder wijzigingen zoals de SVEM-benadering, niet haalbaar is met de reguliere regressieprocedure van de kleinste kwadraten¹².
   6. Geef de antwoordkolom op: markeer de antwoordkolom en klik op Y.
   7. Wijzig de persoonlijkheidsinstelling in Gegeneraliseerde regressie. Houd Distributie ingesteld op Normaal.
   8. Sla deze modelinstellingen op in de gegevenstabel voor gebruik met aanvullende antwoorden door op het rode driehoekmenu naast Modelspecificatie te klikken en Opslaan in gegevenstabel te selecteren.
8. Pas de SVEM-voorwaartse selectiemethode toe op het gereduceerde model, zonder verplichte opname van de belangrijkste effecten van de mengselfactor, en sla de kolom met de voorspellingsformule op in de gegevenstabel.
   1. Klik in het dialoogvenster Model aanpassen op Uitvoeren.
   2. Selecteer voor de schattingsmethode de optie SVEM-voorwaartse selectie.
   3. Vouw de menu's Geavanceerde besturingselementen > Termen forceren uit en schakel de selectievakjes uit die zijn gekoppeld aan de belangrijkste effecten van het mengsel. Alleen het vakje Intercept-term moet aangevinkt blijven. Figuur 10 toont de standaardinstelling waarbij de belangrijkste effecten worden geforceerd. Voor deze stap moeten deze vakjes worden uitgeschakeld om het model in staat te stellen deze effecten op te nemen of uit te sluiten op basis van de voorwaartse selectieprocedure.
   4. Klik op Ga om de SVEM Forward Selection-procedure uit te voeren.
9. Plot de werkelijke reacties door de voorspelde reacties van het SVEM-model om een redelijk voorspellend vermogen te verifiëren. (Figuur 11). Klik op het rode driehoekje naast SVEM Forward Selection en selecteer Diagnostic Plots > Plot Actual by Predicted.
10. Klik op het rode driehoekje naast SVEM Forward Selection en selecteer Kolommen opslaan > Voorspellingsformule opslaan om een nieuwe kolom te maken met de voorspellingsformule in de gegevenstabel.
11. Optioneel: Herhaal de bovenstaande stappen met SVEM Lasso als schattingsmethode om te bepalen of een ander optimaal recept wordt voorgesteld na het uitvoeren van de volgende stappen. Als dat het geval is, voer dan beide recepten uit als bevestigingsruns (besproken in sectie 5) om te zien welke het beste presteert in praktijk¹².
12. Herhaal de stappen voor het bouwen van modellen voor elke reactie.
13. Zodra voorspellingskolommen voor alle reacties zijn opgeslagen in de gegevenstabel, geeft u de responstraceringen voor alle voorspelde responskolommen weer met behulp van het Profiler-platform: Selecteer Grafiek > Profiler en selecteer alle voorspellingskolommen die in de vorige stap zijn gemaakt voor Y, Voorspellingsformule, en klik op OK (Afbeelding 12).
14. Identificeer de optimale formulering(en) van de kandidaat.
    1. Definieer de "wenselijkheidsfunctie" voor elk antwoord en geef aan of het antwoord moet worden gemaximaliseerd, geminimaliseerd of gekoppeld aan een doel. Stel primaire reacties in op een belangrijkheidsgewicht van 1,0 en eventuele secundaire reacties op een belangrijkheidsgewicht van 0,2. Selecteer in het rode driehoekmenu van Prediction Profiler de optie Optimalisatie en wenselijkheid > Wenselijkheidsfuncties en vervolgens Optimalisatie en wenselijkheid > Wenselijkheid instellen. Voer de instellingen in de volgende vensters in.
       OPMERKING: De belangrijke gewichten zijn relatief en subjectief, dus het is de moeite waard om de gevoeligheid van het gecombineerde optimum voor veranderingen in deze gewichten binnen een redelijk bereik te controleren (bijvoorbeeld van gelijke weging tot 1:5 weging).
    2. Geef de Profiler opdracht om de optimale factorinstellingen te vinden die de wenselijkheidsfunctie maximaliseren (Afbeelding 12): selecteer in de Profiler Optimalisatie en wenselijkheid > Wenselijkheid maximaliseren.
       OPMERKING: De voorspelde waarden van de antwoorden bij de optimale kandidaten kunnen de waarde van rechts-scheve antwoorden zoals potentie overschatten; De bevestigingsruns zullen echter nauwkeurigere observaties van deze kandidaatformuleringen opleveren. Het belangrijkste doel is om de optimale formulering (de instellingen van het optimale recept) te vinden.
    3. Noteer de optimale factorinstellingen en noteer de belangrijke wegingen die voor elke reactie worden gebruikt: selecteer in het menu Voorspellingsprofiel de optie Factorinstellingen > Onthoud instellingen.
15. Optioneel: Zoek voor categorische factoren zoals het ioniseerbare lipidetype de voorwaardelijk optimale formuleringen voor elk factorniveau.
    1. Stel eerst het gewenste niveau van de factor in de profiler in, houd vervolgens de Ctrl-toets ingedrukt en klik met de linkermuisknop in de grafiek van die factor en selecteer Vergrendelingsfactoren instellen. Selecteer Optimalisatie en wenselijkheid > Wenselijkheid maximaliseren om het voorwaardelijke optimum te vinden met deze factor vergrendeld op de huidige instelling.
    2. Ontgrendel de factorinstellingen voordat u doorgaat, met behulp van hetzelfde menu dat wordt gebruikt om de factorinstellingen te vergrendelen.
16. Herhaal het optimalisatieproces na het aanpassen van de belangrijkheidsgewichten van de antwoorden (met behulp van Optimalisatie en wenselijkheid > Wenselijkheid instellen), misschien alleen het optimaliseren van de primaire respons (en) of het instellen van enkele van de secundaire antwoorden om meer of minder belangrijkheidsgewicht te hebben, of het doel van de secundaire antwoorden instellen op Geen (Figuur 13).
17. Noteer de nieuwe optimale kandidaat (selecteer in het menu Voorspellingsprofiel de optie Factorinstellingen > Onthoud instellingen.)
18. Maak grafische samenvattingen van de optimale gebieden van de factorruimte: genereer een gegevenstabel met 50.000 rijen gevuld met willekeurig gegenereerde factoreninstellingen binnen de toegestane factorruimte, samen met de bijbehorende voorspelde waarden uit het gereduceerde model voor elk van de antwoorden en de gezamenlijke wenselijkheidsfunctie.
    1. Selecteer in de Profiler de optie Willekeurige uitvoertabel. Stel Hoeveel runs te simuleren? in op 50.000 en klik op OK .
       OPMERKING: Dit genereert een nieuwe tabel met de voorspelde waarden van de responsen bij elk van de 50.000 formuleringen. De kolom Wenselijkheid is afhankelijk van de belangrijkheidsgewichten voor de antwoorden die aanwezig zijn wanneer de optie Willekeurige uitvoertabel is geselecteerd.
    2. Voeg in de nieuw gemaakte tabel een nieuwe kolom toe waarmee het percentiel van de kolom Wenselijkheid wordt berekend. Gebruik deze percentielkolom in de ternaire plots in plaats van de onbewerkte kolom Wenselijkheid. Klik met de rechtermuisknop op de kolomkop Wenselijkheid en selecteer Nieuwe formulekolom > Verdelings- > cumulatieve waarschijnlijkheid om een nieuwe kolom Cumulatieve waarschijnlijkheid[Wenselijkheid] te maken.
    3. Genereer de afbeeldingen die in de volgende stappen worden beschreven. Wijzig herhaaldelijk het kleurenschema van de afbeeldingen om de voorspellingen voor elke reactie en voor de kolom Cumulatieve waarschijnlijkheid[Wenselijkheid] weer te geven.
    4. Bouw ternaire percelen voor de vier lipidefactoren. Navigeer in de tabel naar Grafiek > ternaire plot, selecteer de mengselfactoren voor X, Plotting en klik op OK. Klik met de rechtermuisknop in een van de resulterende grafieken, selecteer Rijlegenda en selecteer vervolgens de kolom voorspelde reactie. Wijzig de vervolgkeuzelijst Kleuren in Jet.
       OPMERKING: Dit geeft de best en slechtst presterende regio's weer met betrekking tot de lipidefactoren. Figuur 14 toont de percentielen van de gezamenlijke wenselijkheid bij het overwegen van het maximaliseren van potentie (importance = 1) en het minimaliseren van grootte (importance = 0,2), terwijl het gemiddelde wordt genomen over alle factoren die niet op de ternaire plotassen worden weergegeven. Figuur 15 toont de ruwe voorspelde grootte. Het is ook redelijk om deze grafieken voorwaardelijk op te splitsen op andere factoren, zoals het maken van een afzonderlijke set ternaire plots voor elk ioniseerbaar lipidetype met een lokaal gegevensfilter (beschikbaar in het rode driehoekmenu naast Ternaire plot).
    5. Gebruik op dezelfde manier Graph > Graph Builder om de 50.000 kleurgecodeerde punten (die unieke formuleringen vertegenwoordigen) uit te zetten tegen de niet-mengselprocesfactoren, individueel of gezamenlijk, en zoek naar relaties tussen de respons (en) en de factor (en). Zoek naar de factorinstellingen die de hoogste wenselijkheid opleveren. Verken verschillende combinaties van factoren in de afbeeldingen.
       OPMERKING: Gebruik bij het inkleuren van grafieken Cumulatieve waarschijnlijkheid[ Wenselijkheid], maar gebruik bij het uitzetten van de wenselijkheid op de verticale as tegen procesfactoren de onbewerkte kolom Wenselijkheid . De kolom Wenselijkheid kan ook op een as van de Graph > Scatterplot 3D-visualisatie worden geplaatst, samen met twee andere procesfactoren voor multivariate exploratie. Figuur 16 toont de gezamenlijke wenselijkheid van alle formuleringen die kunnen worden gevormd met elk van de drie ioniseerbare lipidetypen. De meest wenselijke formuleringen gebruiken H102, waarbij H101 enkele potentieel concurrerende alternatieven biedt.
    6. Sla de Profiler en de onthouden instellingen weer op in de gegevenstabel. Klik op het rode driehoekje naast Profiler en selecteer Script opslaan > in gegevenstabel....

Figuur 8: Waargenomen potentiemetingen van het experiment. De punten tonen de potentiewaarden die werden waargenomen uit de 23 runs; De gerepliceerde benchmarkruns worden in het groen weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Softwaredialoogvenster voor het initiëren van de analyse. De kandidaat-effecten zijn ingevoerd samen met de doelpotentierespons en de optie Geen onderschepping is uitgeschakeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10. Extra dialoogvenster voor het opgeven van SVEM-opties. Standaard worden de belangrijkste effecten van de lipiden in het model geforceerd. Omdat een interceptie is inbegrepen, raden we aan deze vakjes uit te schakelen om de effecten niet te forceren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Actueel per voorspelde plot. Deze figuur zet de waargenomen potentie af tegen de waarde die voor elke formulering door het SVEM-model wordt voorspeld. De correlatie hoeft niet zo sterk te zijn als in dit voorbeeld, maar de verwachting is om op zijn minst een gematigde correlatie te zien en te controleren op uitschieters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12: Voorspellingsprofiler. De bovenste twee rijen grafieken tonen de segmenten van de voorspelde responsfunctie bij de optimale formulering (zoals geïdentificeerd door de SVEM-benadering). De onderste rij grafieken toont de gewogen "wenselijkheid" van de formulering, wat een functie is van de laatste kolom met grafieken die laat zien dat de potentie moet worden gemaximaliseerd en de grootte moet worden geminimaliseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 13: Drie optimale formuleringskandidaten uit SVEM-Forward Selection. Het veranderen van de relatieve belangrijkheidsweging van de antwoorden kan leiden tot verschillende optimale formuleringen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 14: Ternaire plots voor het percentiel van wenselijkheid. De plot toont de 50.000 formuleringen kleurgecodeerd door percentiel van wenselijkheid, waarbij de wenselijkheid is ingesteld met een belangrijkheidsgewicht van 1,0 voor het maximaliseren van de potentie en 0,2 voor het minimaliseren van de grootte, deze plots laten zien dat het optimale gebied van formuleringen bestaat uit lagere percentages ioniseerbare lipide en hogere percentages PEG. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 15: Ternaire plot voor de voorspelde grootte. De grafiek toont de groottevoorspellingen van het SVEM-model voor elk van de 50.000 formuleringen. Grootte wordt geminimaliseerd met hogere percentages helperlipide en gemaximaliseerd met lagere percentages helper. Aangezien de andere factoren vrij variëren tussen de 50.000 uitgezette formuleringen, impliceert dit dat deze relatie geldt voor de bereiken van de andere factoren (PEG, stroomsnelheid, enz.). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 16: Vioolplots voor de wenselijkheid van formuleringen met de drie verschillende ioniseerbare lipidetypen. Elk van de 50.000 punten vertegenwoordigt een unieke formulering uit de hele toegestane factorruimte. De pieken van deze verdelingen zijn de maximale waarden van wenselijkheid die analytisch worden berekend met de voorspellingsprofiler. H102 heeft de grootste piek en produceert dus de optimale formulering. De SVEM-benadering voor het bouwen van het model dat deze output genereert, filtert automatisch statistisch onbeduidende factoren uit: het doel van deze grafiek is om praktische significantie over de factorniveaus te beschouwen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Bevestiging loopt

1. Maak een tabel met de optimale kandidaten die eerder zijn geïdentificeerd (figuur 17).
   OPMERKING: De True Potency en True Size waarden in Figuur 17 worden ingevuld met behulp van de gesimuleerde genererende functies: in de praktijk zullen deze worden verkregen door het formuleren en vervolgens meten van de prestaties van deze recepten.
   1. Voeg de benchmarkcontrole toe aan de reeks kandidaatruns die worden geformuleerd en gemeten.
   2. Als een van de formuleringen uit het experiment wenselijke resultaten bleek op te leveren, misschien door beter te presteren dan de benchmark, selecteert u de beste om toe te voegen aan de kandidaattabel en test u opnieuw samen met nieuwe formuleringen.
      OPMERKING: Voeg handmatig de gewenste runs toe aan de kandidatentabel of gebruik de Instellingen onthouden van het Profiler-venster als deze runs afkomstig zijn uit het vorige experiment. Identificeer het rijnummer van de run, navigeer naar Voorspellingsprofiel > Factorinstellingen > Instellen op Gegevens in rij en voer het rijnummer in. Kies vervolgens Voorspellingsprofiel > Factorinstellingen > Onthoud instellingen en label de juiste labels (bijvoorbeeld "benchmark" of "beste uitvoering van het vorige experiment").
   3. Klik met de rechtermuisknop op de tabel Onthouden instellingen in de Profiler en selecteer Maken in gegevenstabel.
      OPMERKING: Afhankelijk van de prioriteit en het budget van het onderzoek, kunt u overwegen replica's uit te voeren voor elke bevestigingsrun, vooral als u de benchmark vervangt. Maak en analyseer elke formulering twee keer, met behulp van het gemiddelde resultaat voor rangschikking. Besteed aandacht aan kandidaten met een breed responsbereik over de twee replicaties, omdat dit kan wijzen op een hoge procesvariantie.
   4. Indien nodig vanwege budgetbeperkingen, downselect uit de geïdentificeerde kandidaten om het experimentele budget te evenaren of om overbodige kandidaten te elimineren.
2. Voer de bevestigingsruns uit. Construeer de formuleringen en verzamel de uitlezingen.
3. Controleer op consistentie tussen de resultaten van het oorspronkelijke experiment en de resultaten voor de bevestigingsbatch voor benchmarks of andere herhaalde recepten. Als er een grote en onverwachte verschuiving is, overweeg dan wat mogelijk heeft bijgedragen aan de verschuiving en of het mogelijk is dat alle runs van de bevestigingsbatch zijn beïnvloed.
4. Vergelijk de prestaties van de kandidaat optimale formuleringen. Onderzoek of nieuwe kandidaten beter presteerden dan de benchmark.
5. Optioneel: Voeg het resultaat van de bevestigingsruns toe aan de experimentele tabel en voer de analyse in sectie 4 opnieuw uit.
   OPMERKING: De volgende stap van de workflow bevat instructies voor het samenstellen van een vervolgstudie, samen met deze uitvoeringen indien gewenst.

Figuur 17: Tabel met tien optimale kandidaten die moeten worden uitgevoerd als bevestigingsruns. De True Potency en True Size zijn ingevuld vanuit de simulatie genererende functies (zonder toegevoegde proces- of analytische variatie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Optioneel: Het ontwerpen van een vervolgstudie die gelijktijdig met de bevestigingsruns moet worden uitgevoerd

1. Beoordeel de noodzaak van een vervolgonderzoek aan de hand van de volgende criteria:
   1. Bepaal of de optimale formulering langs een van de factorgrenzen ligt en of een tweede experiment gewenst is om ten minste één van de factorbereiken uit te breiden.
   2. Evalueer of het eerste experiment een relatief kleine rungrootte of relatief grote factorbereiken gebruikte en of het nodig is om in te zoomen op het geïdentificeerde optimale gebied met extra runs en bijgewerkte analyse.
   3. Controleer of er een extra factor wordt geïntroduceerd. Dit kan een niveau van een categorische factor zijn, zoals een extra ioniseerbaar lipide of een factor die constant bleef in de eerste studie, bijvoorbeeld bufferconcentratie.
   4. Als aan geen van de bovenstaande voorwaarden is voldaan, gaat u verder met stap 7.
2. Bereid u voor op extra experimentele runs die gelijktijdig met de bevestigingsruns moeten worden uitgevoerd.
   1. Definieer de factorlimieten die zorgen voor een gedeeltelijke overlapping met de regio uit de eerste studie. Als er geen overlap is, moet een nieuw onderzoek worden opgezet.
   2. Ontwikkel de nieuwe experimentele runs met een ruimtevullend ontwerp. Selecteer DOE > speciaal doel > ruimtevullend ontwerp.
      OPMERKING: Voor gevorderde gebruikers, overweeg een D-optimaal ontwerp via DOE > Custom Design.
   3. Nadat de ruimtevullende runs zijn gegenereerd, neemt u handmatig twee of drie runs uit het oorspronkelijke experiment op die binnen de nieuwe factorruimte liggen. Verdeel deze runs willekeurig binnen de experimentele tabel met behulp van de stappen die worden beschreven in sectie 2 om rijen toe te voegen en vervolgens de rijvolgorde willekeurig te maken.
      OPMERKING: Deze zullen worden gebruikt om een eventuele verschuiving in de responsmiddelen tussen blokken te schatten.
   4. Voeg de bevestigingsruns samen en de nieuwe spatievulling wordt uitgevoerd in één tabel en randomiseer de uitvoeringsvolgorde. Gebruik Tabellen > Samenvoegen en maak en sorteer vervolgens een nieuwe willekeurige kolom om de uitvoeringsvolgorde willekeurig te maken, zoals beschreven in sectie 2.
3. Formuleer de nieuwe recepten en verzamel de resultaten.
4. Voeg de nieuwe experimentele runs en resultaten samen met de oorspronkelijke experimentgegevenstabel en introduceer een kolom experiment-ID om de bron van elk resultaat aan te geven. Gebruik Tabellen > Samenvoegen en selecteer de optie Bronkolom maken.
5. Controleer of de kolomeigenschappen voor elke factor het gecombineerde bereik over beide onderzoeken weergeven: klik met de rechtermuisknop op de kolomkop voor elke factor en bekijk de eigenschappenbereiken Codering en Mengsel , indien aanwezig.
6. Begin met de analyse van de resultaten van het nieuwe experiment.
   1. Neem de kolom experiment-ID op als een term in het model om als blokkeringsfactor te dienen. Zorg ervoor dat deze term geen interactie heeft met de studiefactoren. Voer het dialoogvensterscript Model aanpassen uit dat is opgeslagen in de tabel in sectie 4, selecteer de kolom experiment-ID en klik op Toevoegen om het op te nemen in de lijst met kandidaat-effecten.
   2. Voer dit dialoogvenster Fit Model uit op de aaneengeschakelde gegevenstabel om gezamenlijk de resultaten van het nieuwe experiment en het eerste onderzoek te analyseren. Volg eerdere instructies om bijgewerkte optimale formuleringskandidaten en grafische samenvattingen te genereren.
   3. Voor validatie analyseert u onafhankelijk de resultaten van het nieuwe experiment, met uitzondering van de resultaten van het eerste experiment. Dat wil zeggen, voer de stappen uit die worden beschreven in sectie 4 op de nieuwe experimentele tabel.
   4. Zorg ervoor dat de optimale formuleringen die door deze modellen worden geïdentificeerd, nauw aansluiten bij de formuleringen die door de gezamenlijke analyse worden herkend.
   5. Bekijk grafische samenvattingen om te bevestigen dat zowel de gezamenlijke als individuele analyses van de nieuwe experimentele resultaten vergelijkbaar responsoppervlakgedrag vertonen (wat betekent dat er een vergelijkbare relatie is tussen de respons (en) en de factoren).
   6. Vergelijk de gecombineerde en individuele analyses van nieuwe resultaten met het eerste experiment voor consistentie. Gebruik vergelijkbare grafiekstructuren voor vergelijking en onderzoek de geïdentificeerde optimale recepten voor verschillen.

7. Documenteren van de wetenschappelijke eindconclusies van de studie

1. Als de benchmarkcontrole verandert in een nieuw geïdentificeerd recept als gevolg van het onderzoek, registreert u de nieuwe instelling en specificeert u de ontwerp- en analysebestanden die de oorsprong ervan registreren.
2. Bewaar alle experimentele tabellen en analysesamenvattingen, bij voorkeur met bestandsnamen met datumstempel, voor toekomstig gebruik.

Representative Results

Deze benadering is gevalideerd voor beide breed geclassificeerde lipidentypen: MC3-achtige klassieke lipiden en lipidoids (bijv. C12-200), over het algemeen afgeleid van combinatorische chemie. Vergeleken met een benchmark LNP-formulering die is ontwikkeld met behulp van een One Factor at a Time (OFAT) -methode, vertonen de kandidaatformuleringen die via onze workflow worden gegenereerd vaak potentieverbeteringen van 4- tot 5-voudig op een logaritmische schaal, zoals weergegeven in de luciferasemetingen van de muizenlever in figuur 18. Tabel 1 toont de overeenkomstige verbeteringen in de luciferase-expressie van muizenlever die zijn waargenomen ten opzichte van de benchmarkcontroleprestaties gedurende twee optimalisatiefasen (een eerste studie en een daaropvolgende follow-upstudie). In de eerste fase lag de focus op het optimaliseren van de lipidenverhoudingen terwijl andere factoren constant bleven. In de vervolgstudie werd een extra helperlipidentype geïntroduceerd en optimalisatie uitgevoerd, rekening houdend met zowel de lipidenverhoudingssamenstelling als het helperlipidentype. Daarom werd het nieuw geïntroduceerde helperlipidentype geselecteerd om te worden gebruikt met de bijbehorende geoptimaliseerde lipidensamenstelling. De aanzienlijke verbetering van de potentie suggereert dat deze geoptimaliseerde samenstellingen superieure endosomale ontsnappingsmogelijkheden kunnen vertonen²⁵.

Simulaties kunnen worden gebruikt om de verwachte kwaliteit van de optimale kandidaat die door deze procedure wordt geproduceerd, aan te tonen. In het kader van het voorbeeldexperiment dat in het protocol wordt gebruikt, kunnen we de simulatie vele malen herhalen voor verschillende rungroottes en de resultaten evalueren volgens de gesimuleerde procesgenererende functie. Een JMP-script voor dit doel is opgenomen in aanvullend bestand 4. In het bijzonder werd een ruimtevullend ontwerp gegenereerd en de responskolommen werden gevuld met waarden van onze generatorfuncties, plus ruis die analytische en procesvariatie vertegenwoordigt. We passen deze gesimuleerde antwoorden toe met verschillende analysetechnieken (waaronder SVEM Forward Selection) om een bijbehorend kandidaat-optimaal recept te produceren. De kandidaten van elke analysemethode worden vervolgens vergeleken met de waarde van het ware optimum uit de genererende functies. Figuur 19 illustreert het gemiddelde percentage van de maximale theoretische respons dat wordt bereikt door elk van de drie analysemethoden met behulp van ruimtevullende ontwerpen van grootte gegeven op de horizontale as. Het volledige model, dat alle kandidaat-effecten omvat en het model niet vermindert op basis van de statistische significantie van die effecten, presteert het slechtst. Veel van het extra werk dat traditioneel wordt besteed aan het aanpassen van regressiemodellen voor mengselprocesexperimenten omvat modificaties (het verwijderen van de intercept, het forceren van de belangrijkste effecten van het mengsel, het uitsluiten van het gebruik van zuivere kwadratische mengseleffecten, enz.) die nodig zijn om in dit volledige model⁹ te passen, en vanuit dit perspectief zijn die procedures onnodig¹². Bovendien kan dit model pas worden aangepast als de ontwerpgrootte het aantal effecten in het model bereikt. Bij kleinere experimentele groottes kunnen we de traditionele voorwaartse selectiemethode toepassen, die beter presteert dan het volledige model met betrekking tot de gemiddelde prestaties van de optimale kandidaatformulering voor elke vaste experimentele grootte. Ook de SVEM-aanpassing aan deze forward selectie-aanpak verbetert de prestaties van de optimale kandidaten verder. Deze plot onthult dat het gebruik van SVEM-Forward Selection^12,13 om een 24-run ruimtevullend experiment te analyseren dezelfde gemiddelde kwaliteit bereikt die meestal 50 runs vereist wanneer geanalyseerd met een traditioneel forward selection (gericht op minimaal AICc) model. Hoewel de werkelijke prestaties van proces tot proces zullen verschillen, toont deze simulatie - samen met gepubliceerde resultaten op SVEM 12,13,16,17,26 - het potentieel van deze modelleringsprocedure voor formuleringsoptimalisatie.

Figuur 18: Verbetering van de expressie van luciferase in de lever na twee experimenteerrondes. Ronde 0 toont de lever luciferase meting voor de benchmarkformulering; Ronde 1 toont de lever luciferase meting na het eerste experiment die de LNP bestanddeel lipide molaire verhoudingen optimaliseert; Ronde 2 toont de lever luciferase meting na het tweede experiment die de samenstellende molaire verhoudingen verder optimaliseert, terwijl ook een extra helper lipidetype wordt overwogen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 19: Kwaliteit van optimale formulering als functie van experimentele grootte en statistisch model. De verticale as vertegenwoordigt het percentage van de theoretische maximale wenselijkheid en de horizontale as vertegenwoordigt de grootte van het ruimtevullende ontwerp. Elk punt toont het gemiddelde over 150 simulaties. De blauwe lijn (driehoeken) vertegenwoordigt het volledige model (zonder enige eliminatie van statistisch onbeduidende effecten), de oranje (cirkels) lijn vertegenwoordigt het traditionele AICc-gebaseerde voorwaartse selectiemodel (met een intercept en zonder het mengsel te forceren hoofdeffecten), en de groene lijn (omgekeerde driehoeken) vertegenwoordigt het SVEM-gebaseerde voorwaartse selectiemodel (met een intercept en zonder het mengsel te forceren hoofdeffecten). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Rond	Deeltjes-ID	Luciferase expressie in de lever (foton/sec)
0	Controlebenchmark	8.E+06
1	Geoptimaliseerd over lipidenverhoudingen	2.E + 09
2	Geoptimaliseerd over lipidenverhoudingen en helperlipidentype	8.E+10

Tabel 1: Systematische verbetering in luciferase expressie door Design of Experiment (DOE) optimalisatie. Deze tabel illustreert de significante verbetering in de expressie van luciferase, met een tot 10.000-voudige verbetering op de foton/secondeschaal, van de initiële benchmark tot de uiteindelijke "optimale kandidaat".

Aanvullend dossier 1: 04APR2023 Samenvatting.docx - Dit document geeft een verslag van het onderzoek, inclusief het doel ervan, de beoordeelde antwoorden, de overwogen factoren en het totale aantal uitgevoerde runs. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: 23_run_simulated_experiment.jmp - Een JMP-bestand met het gesimuleerde experiment en de resultaten ervan. Dit bestand bevat ook bijgevoegde analysescripts die compatibel zijn met JMP 17 Pro. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: 23_run_simulated_experiment.xlsx - Een Excel-bestand met het gesimuleerde experiment en de resultaten ervan, geschikt voor lezers die mogelijk geen toegang hebben tot JMP. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: mengselsimulatie 20DEC22.jsl - Dit is een JMP 17 Pro-script dat wordt gebruikt om LNP-formuleringsexperimenten te simuleren en de prestaties van verschillende analysemethoden te evalueren. Het script maakt gebruik van de SVEM-Forward Selection (no intercept)-benadering, de belangrijkste analysemethode die in deze workflow wordt gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Moderne software voor het ontwerp en de analyse van mengselprocesexperimenten maakt het voor wetenschappers mogelijk om hun lipide nanodeeltjesformuleringen te verbeteren in een gestructureerde workflow die inefficiënte OFAT-experimenten vermijdt. De recent ontwikkelde SREM-modelleringsbenadering elimineert veel van de geheimzinnige regressiemodificaties en modelreductiestrategieën die wetenschappers eerder mogelijk hebben afgeleid met externe statistische overwegingen. Zodra de resultaten zijn verzameld, biedt het SVEM-analysekader een aanpak die zowel gemakkelijker te implementeren is als de neiging heeft om betere modellen te produceren dan traditionele modelleringsbenaderingen¹³. Bovendien zijn de grafische analyses die zijn gebaseerd op de voorspellingsformules voor elke respons gemakkelijk te interpreteren door wetenschappers, waardoor een duidelijke samenvatting wordt gegeven van het marginale gedrag van de respons over individuele factoren en kleine groepen factoren zonder de interpretatie van sterk gecorreleerde parameterschattingen van een regressiemodel. Dit stelt wetenschappers in staat om zich te concentreren op het beoordelen van praktische significantie over studiefactoren nadat SVEM automatisch statistisch onbeduidende effecten heeft verwijderd.

De workflow is in de praktijk gebruikt om systematisch lipidensamenstelling en formuleringsparameters zoals N / P-verhouding, stroomsnelheid en mengverhouding te variëren voor optimalisatie en om de beste helperlipidetypen, ioniseerbare lipidetypen en buffertypen te selecteren. De doelen in deze voorbeelden omvatten meestal het maximaliseren van in vivo of in vitro potentie en het inkapselen van verschillende ladingen zoals mRNA of DNA voor relevante in vivo doelen zoals levercellen, of soms over meerdere celtypen in het geval van in vitro toepassingen. Voor specifieke toepassingen moeten we mogelijk biofysische eigenschappen zoals grootte, PDI, zeta-potentiaal en procentuele inkapseling in evenwicht brengen tijdens het onderzoeken van in vivo potentie. Bovendien is het doel om een krachtige, maar goed verdragen formulering te vinden en dus kunnen we reacties zoals verandering in lichaamsgewicht, cytokinerespons of elicitatie van leverenzymen zoals ASAT / ALT in de analyse opnemen. Uit talloze LNP-experimenten zijn patronen naar voren gekomen. Met name veranderingen in de molaire verhouding van het ioniseerbare lipide en de N / P-verhouding lijken een aanzienlijke invloed te hebben op de RNA-inkapseling. Bovendien lijken veranderingen in de PEG-molaire verhouding de stabiliteit van de deeltjes te beïnvloeden, zoals aangegeven door invloeden op grootte en PDI. Over het algemeen heeft een teveel aan PEG in de LNP-kern de neiging om een nadelig effect te hebben op de potentie bij muizen.

Prestatieverbeteringen zijn vooral merkbaar wanneer meer dan één respons wordt gericht: zelfs als de benchmark al goed presteert met betrekking tot de primaire respons (bijv. Potentie), handhaaft of verbetert gewrichtsoptimalisatie meestal het gedrag met betrekking tot de primaire respons, terwijl tegelijkertijd het gedrag met betrekking tot andere reacties wordt verbeterd (het minimaliseren van PDI, grootte of verlies van lichaamsgewicht). We valideren de authenticiteit van deze verbeteringen met bevestigingsruns, waarin we de benchmarkformulering (eventueel met een replicatie) en nieuwe kandidaatformuleringen voorbereiden en direct vergelijken.

De ontwerpfase van deze workflow bestaat uit verschillende kritieke stappen. Zorg er eerst voor dat de factoren en hun bereik correct worden ingevoerd in het ruimtevullende ontwerpplatform. Ten tweede, gebruik afbeeldingen en kennis van het onderwerp om de haalbaarheid van elke resulterende formulering te bevestigen voordat u het experiment start. Voer ten slotte het experiment uit volgens de willekeurige volgorde die is opgegeven in de ontwerptabel. Het vasthouden aan deze volgorde helpt voorkomen dat niet-gemeten covarianten - zoals de volgorde van formuleringsproductie of omgevingstemperatuur - de onderzochte factoren verstoren. De ruimtevullende ontwerpen zijn gemakkelijker te construeren - met minder kans op gebruikersfouten dan optimale mengselprocesontwerpen, die extra beslissingen vereisen tijdens de installatie die onervaren gebruikers kunnen frustreren en hen kunnen ontmoedigen om ontworpen experimenten te gebruiken. Niettemin kunnen wetenschappers, na het doorwerken van dit protocol, baat hebben bij aanvullende lectuur over hoe optimale ontwerpen mogelijk ruimtevullende ontwerpen in het protocol kunnen vervangen, zoals beschreven in hoofdstuk 6 van Goos en Jones (2011) ²⁷. Vooral voor vervolgstudies die "inzoomen" op een optimaal gebied - waar er minder bezorgdheid is over storingen langs de mengselgrenzen - kunnen D-optimale ontwerpen efficiënter zijn dan ruimtevullende ontwerpen.

Evenzo heeft de analysefase van deze workflow verschillende kritieke stappen. Zorg er eerst voor dat het model een geschikte set kandidaat-effecten specificeert, inclusief interacties, in plaats van alleen de belangrijkste (eerste orde) effecten van de factoren. Ten tweede, gebruik SVEM Forward Selection als het modelleringskader. Ten derde, schakel de standaard No Intercept-optie uit en vermijd het forceren van de belangrijkste effecten van het mengsel. Stel ten slotte de wenselijkheidsfuncties voor de antwoorden correct in voordat u de optimalisatie start. Voor gebruikers zonder toegang tot SVEM is de beste aanpak om traditionele voorwaartse selectie (gericht op minimale AICc) te gebruiken voor het regressieprobleem¹². Het protocol vermeldt dat het ook mogelijk is om SVEM Lasso te gebruiken: gemiddeld geeft deze aanpak vergelijkbare resultaten als SVEM Forward Selection, hoewel voor bepaalde datasets de twee benaderingen enigszins verschillende optimale formuleringen kunnen opleveren die kunnen worden vergeleken met bevestigingsruns¹². SVEM Lasso geeft echter inferieure modelleringsresultaten als de gebruiker de gemakkelijke fout maakt om te vergeten de standaard No Intercept-optie ¹² uit te schakelen: om deze reden hebben we SVEM Forward Selection als standaardmethode gebruikt, omdat deze robuuster is voor deze optie.

De belangrijkste beperking van deze methode is dat er af en toe studies met een grotere complexiteit zullen zijn die baat zullen hebben bij de hulp van een statisticus voor ontwerp en analyse. Situaties waarin het runbudget beperkter is dan normaal (onder de minimale heuristiek), de antwoorden binair zijn, er een groot aantal categorische factoren of niveaus van een enkele categorische factor zijn, waarbij een onderzoeksdoel is om te overwegen een of meer mengselfactoren uit het recept te verwijderen, of waar er extra beperkingen zijn op de factorruimte kan anders worden benaderd door een statisticus, Bijvoorbeeld door gebruik te maken van optimale of hybride^12,28 ontwerpen of door extra structuur aan het ontwerp toe te voegen. In het bijzonder kan een hybride ontwerp worden gevormd door een ruimtevullend ontwerp te maken met de meeste gebudgetteerde runs en vervolgens het ontwerp te "vergroten" met de resterende runs (meestal 2-4) met behulp van een D-optimaal criterium. Een andere hybride benadering is om een ruimtevullend ontwerp te genereren over het mengsel (lipide) en continue (proces) factoren, en vervolgens om categorische factoren toe te voegen met behulp van een "optimale" toewijzing van factorniveaus. Niettemin is de vereenvoudigde ontwerpbenadering voor het vullen van ruimtes in het protocol de afgelopen jaren ontwikkeld in het proces van het uitvoeren van tientallen LNP-formuleringsoptimalisatie-experimenten, en we geloven dat het een robuuste aanpak biedt die in de meeste gevallen met succes zal werken, terwijl het wetenschappers ook vertrouwen geeft in hun vermogen om ontworpen experimenten te gebruiken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP Pro 17.1	JMP Statistical Discovery LLC