En arbeidsflyt for optimalisering av lipidnanopartikler (LNP) formulering ved bruk av designede blandingsprosesseksperimenter og selvvaliderte ensemblemodeller (SVEM)

Summary

Denne protokollen gir en tilnærming til formuleringsoptimalisering over blandings-, kontinuerlige og kategoriske studiefaktorer som minimerer subjektive valg i den eksperimentelle designkonstruksjonen. For analysefasen benyttes en effektiv og brukervennlig modelleringstilpasningsprosedyre.

Abstract

Vi presenterer en Quality by Design (QbD) stylet tilnærming for optimalisering av lipid nanopartikkel (LNP) formuleringer, med sikte på å tilby forskere en tilgjengelig arbeidsflyt. Den iboende begrensningen i disse studiene, hvor molforholdet mellom ioniserbare, hjelper- og PEG-lipider må legge opp til 100%, krever spesialiserte design- og analysemetoder for å imøtekomme denne blandingsbegrensningen. Med fokus på lipid- og prosessfaktorer som ofte brukes i LNP-designoptimalisering, tilbyr vi trinn som unngår mange av vanskelighetene som tradisjonelt oppstår i design og analyse av blandingsprosesseksperimenter ved å bruke romfyllingsdesign og utnytte det nylig utviklede statistiske rammeverket for selvvaliderte ensemblemodeller (SVEM). I tillegg til å produsere kandidatoptimale formuleringer, bygger arbeidsflyten også grafiske sammendrag av de monterte statistiske modellene som forenkler tolkningen av resultatene. De nylig identifiserte kandidatformuleringene vurderes med bekreftelseskjøringer og kan eventuelt gjennomføres i sammenheng med en mer omfattende andrefasestudie.

Introduction

Lipid nanopartikkel (LNP) formuleringer for in vivo genleveringssystemer involverer generelt fire bestanddeler lipider fra kategoriene ioniserbare, hjelper- og PEG-lipider ^1,2,3. Hvorvidt disse lipidene blir studert alene eller samtidig med andre ikke-blandingsfaktorer, krever eksperimenter for disse formuleringene "blanding" -design fordi - gitt en kandidatformulering - økning eller reduksjon av forholdet mellom en av lipidene nødvendigvis fører til en tilsvarende reduksjon eller økning i summen av forholdene mellom de tre andre lipidene.

For illustrasjon antas det at vi optimaliserer en LNP-formulering som for tiden bruker en fast oppskrift som vil bli behandlet som referanseindeksen. Målet er å maksimere styrken av LNP mens sekundært sikte på å minimere gjennomsnittlig partikkelstørrelse. Studiefaktorene som er varierte i forsøket er molforholdene mellom de fire bestanddelene lipider (ioniserbar, kolesterol, DOPE, PEG), N: P-forholdet, strømningshastigheten og den ioniserbare lipidtypen. De ioniserbare og hjelperlipidene (inkludert kolesterol) får lov til å variere over et bredere spekter av molforhold, 10-60%, enn PEG, som vil bli variert fra 1-5% i denne illustrasjonen. Referanseformuleringsoppskriften og områdene for de andre faktorene og deres avrundingsgranularitet er spesifisert i tilleggsfil 1. For dette eksempelet kan forskerne utføre 23 løp (unike grupper av partikler) på en enkelt dag og vil gjerne bruke det som prøvestørrelse hvis det oppfyller minimumskravene. Simulerte resultater for dette eksperimentet finnes i tilleggsfil 2 og tilleggsfil 3.

Rampado og Peer⁴ har publisert et nylig gjennomgangspapir om temaet designede eksperimenter for optimalisering av nanopartikkelbaserte legemiddelleveringssystemer. Kauffman et ^al.5 vurderte LNP-optimaliseringsstudier ved bruk av fraksjonelle faktorielle og definitive screeningdesign⁶; Imidlertid kan disse typer design ikke imøtekomme en blandingsbegrensning uten å ty til bruk av ineffektive "slakkvariabler"7 og brukes vanligvis ikke når blandingsfaktorer er tilstede ^7,8. I stedet brukes "optimale design" som er i stand til å inkorporere en blandingsbegrensning, tradisjonelt til blandingsprosesseksperimenter⁹. Disse designene retter seg mot en brukerspesifisert funksjon av studiefaktorene og er bare optimale (i en av flere mulige sanser) hvis denne funksjonen fanger det sanne forholdet mellom studiefaktorene og responsene. Merk at det er et skille i teksten mellom "optimale design" og "optimale formuleringskandidater", der sistnevnte refererer til de beste formuleringene identifisert av en statistisk modell. Optimale design har tre hovedulemper for blandingsprosesseksperimenter. For det første, hvis forskeren ikke klarer å forutse en interaksjon av studiefaktorene ved spesifisering av målmodellen, vil den resulterende modellen være partisk og kan produsere dårligere kandidatformuleringer. For det andre plasserer optimale design de fleste løpene på den ytre grensen til faktorrommet. I LNP-studier kan dette føre til et stort antall tapte løp hvis partiklene ikke dannes riktig i noen ytterpunkter av lipid- eller prosessinnstillingene. For det tredje foretrekker forskere ofte å ha eksperimentelle løp på det indre av faktorrommet for å få en modelluavhengig følelse av responsflaten og å observere prosessen direkte i tidligere uutforskede regioner av faktorrommet.

Et alternativt designprinsipp er å sikte mot en tilnærmet jevn dekning av (blandingsbegrenset) faktorrom med en plassfyllingsdesign¹⁰. Disse designene ofrer noe eksperimentell effektivitet i forhold til optimale design⁹ (forutsatt at hele faktorrommet fører til gyldige formuleringer), men presenterer flere fordeler i en avveining som er nyttige i denne applikasjonen. Romfyllingsdesignet gjør ingen a priori antagelser om strukturen til responsflaten; Dette gir den fleksibilitet til å fange opp uventede forhold mellom studiefaktorene. Dette strømlinjeformer også designgenereringen fordi det ikke krever å ta beslutninger om hvilke regresjonstermer som skal legges til eller fjernes etter hvert som ønsket kjørestørrelse justeres. Når noen designpunkter (oppskrifter) fører til mislykkede formuleringer, gjør plassfyllingsdesign det mulig å modellere feilgrensen over studiefaktorene, samtidig som de støtter statistiske modeller for studieresponsene over de vellykkede faktorkombinasjonene. Til slutt gir den indre dekningen av faktorrommet mulighet for modelluavhengig grafisk utforskning av responsflaten.

For å visualisere blandingsfaktorens underrom i et blandingsprosesseksperiment, brukes spesialiserte trekantede "ternære tomter". Figur 1 motiverer denne bruken: I kuben av punkter der tre ingredienser hver får lov til å variere fra 0 til 1, er punktene som tilfredsstiller en begrensning om at summen av ingrediensene er lik 1, uthevet i rødt. Blandingsbegrensningen på de tre ingrediensene reduserer det mulige faktorrommet til en trekant. I LNP-applikasjoner med fire blandingsingredienser produserer vi seks forskjellige ternære plott for å representere faktorrommet ved å plotte to lipider om gangen mot en "Andre" -akse som representerer summen av de andre lipidene.

Figur 1: Trekantede faktorregioner. I romfyllingsplottet i kuben representerer de små grå prikkene formuleringer som ikke stemmer overens med blandingsbegrensningen. De større røde punktene ligger på en trekant innskrevet i kuben og representerer formuleringer som blandingsbegrensningen er tilfredsstilt for. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I tillegg til lipidblandingsfaktorene er det ofte en eller flere kontinuerlige prosessfaktorer som N:P-forhold, bufferkonsentrasjon eller strømningshastighet. Kategoriske faktorer kan være til stede, for eksempel ioniserbar lipidtype, hjelperlipidtype eller buffertype. Målet er å finne en formulering (en blanding av lipider og innstillinger for prosessfaktorer) som maksimerer noe mål på potens og / eller forbedrer fysiokjemiske egenskaper som å minimere partikkelstørrelse og PDI (polydispersitetsindeks), maksimere prosentvis innkapsling og minimere bivirkninger - som kroppsvekt tap - i in vivo-studier . Selv når man starter fra en rimelig referanseoppskrift, kan det være interesse for å optimalisere på nytt gitt en endring i den genetiske nyttelasten eller når man vurderer endringer i prosessfaktorene eller lipidtypene.

Cornell⁷ gir en definitiv tekst om de statistiske aspektene ved blandings- og blandingsprosesseksperimenter, med Myers et ^al.9 som gir et utmerket sammendrag av de mest relevante blandingsdesign- og analyseemnene for optimalisering. Imidlertid kan disse arbeidene overbelaste forskere med statistiske detaljer og med spesialisert terminologi. Moderne programvare for design og analyse av eksperimenter gir en robust løsning som tilstrekkelig støtter de fleste LNP-optimaliseringsproblemer uten å måtte appellere til den aktuelle teorien. Mens mer kompliserte eller høyt prioriterte studier fortsatt vil ha nytte av samarbeid med en statistiker og kan bruke optimale snarere enn plassfyllende design, er vårt mål å forbedre komfortnivået til forskere og oppmuntre til optimalisering av LNP-formuleringer uten å appellere til ineffektiv enfaktor-om-gangen (OFAT) testing¹¹ eller bare nøye seg med den første formuleringen som tilfredsstiller spesifikasjonene.

I denne artikkelen presenteres en arbeidsflyt som bruker statistisk programvare for å optimalisere et generisk LNP-formuleringsproblem, som adresserer design- og analyseproblemer i den rekkefølgen de vil bli møtt. Faktisk vil metoden fungere for generelle optimaliseringsproblemer og er ikke begrenset til LNP. Underveis blir flere vanlige spørsmål som dukker opp adressert og anbefalinger gitt som er forankret i erfaring og i simuleringsresultater¹². Det nylig utviklede rammeverket av selvvaliderte ensemblemodeller (SVEM)¹³ har forbedret den ellers skjøre tilnærmingen til å analysere resultater fra blandingsprosesseksperimenter, og vi bruker denne tilnærmingen til å gi en forenklet strategi for formuleringsoptimalisering. Mens arbeidsflyten er konstruert på en generell måte som kan følges ved hjelp av andre programvarepakker, er JMP 17 Pro unik i å tilby SVEM sammen med de grafiske sammendragsverktøyene som vi har funnet å være nødvendige for å forenkle den ellers uforståelige analysen av blandingsprosesseksperimenter. Som et resultat er JMP-spesifikke instruksjoner også gitt i protokollen.

SVEM bruker det samme lineære regresjonsmodellgrunnlaget som den tradisjonelle tilnærmingen, men det tillater oss å unngå kjedelige modifikasjoner som kreves for å passe til en "full modell" av kandidateffekter ved å bruke enten en fremovervalg eller en straffet seleksjon (Lasso) basetilnærming. I tillegg gir SVEM en forbedret tilpasning av "redusert modell" som minimerer potensialet for å innlemme støy (prosess pluss analytisk varians) som vises i dataene. Det fungerer ved å beregne gjennomsnittet av de predikerte modellene som følge av gjentatte ganger å vekte den relative betydningen av hver kjøring i modellen 13,14,15,16,17,18. SVEM gir et rammeverk for modellering av blandingsprosesseksperimenter som både er enklere å implementere enn tradisjonell single-shot regresjon og gir bedre kvalitet optimal formulering kandidater^12,13. De matematiske detaljene i SVEM er utenfor omfanget av denne artikkelen, og selv et overfladisk sammendrag utover den relevante litteraturgjennomgangen vil distrahere fra den største fordelen i denne applikasjonen: det tillater en enkel, robust og nøyaktig klikk-og-bruk-prosedyre for utøvere.

Den presenterte arbeidsflyten er i samsvar med Quality by Design (QbD)^{19-tilnærmingen} til farmasøytisk utvikling²⁰. Resultatet av studien vil være en forståelse av det funksjonelle forholdet som knytter materialattributtene og prosessparametrene til kritiske kvalitetsattributter (CQAs)²¹. Daniel et ^al.22 diskuterer bruk av et QbD-rammeverk spesielt for RNA-plattformproduksjon: arbeidsflyten vår kan brukes som et verktøy innenfor dette rammeverket.

Protocol

Forsøket beskrevet i avsnittet om representative resultater ble utført i samsvar med veiledningen for pleie og bruk av forsøksdyr, og prosedyrene ble utført etter retningslinjer fastsatt av vår institusjonelle dyrepleie- og brukskomité (IACUC). 6-8 uker gamle kvinnelige Balb / C mus ble kommersielt oppnådd. Dyrene fikk ad libitum standard chow og vann og ble plassert under standardforhold med 12 timers lys / mørke sykluser, ved en temperatur på 65-75 ° F (~ 18-23 ° C) med 40-60% fuktighet.

1. Registrering av studiens formål, svar og faktorer

MERK: Gjennom denne protokollen brukes JMP 17 Pro til å designe og analysere eksperimentet. Tilsvarende programvare kan brukes ved å følge lignende trinn. For eksempler og ytterligere instruksjoner for alle trinnene som utføres i avsnitt 1, se tilleggsfil 1.

1. Oppsummer formålet med eksperimentet i et datostemplet dokument.
2. Oppgi de primære svarene (CQA) som skal måles under eksperimentet.
3. Oppgi eventuelle sekundære responser (f.eks. nedstrøms restriksjoner på fysiokjemiske egenskaper) som kan måles.
4. List opp prosessparametere som kan være relatert til svarene, inkludert de som er mest relevante for formålet med studien.
5. Hvis studien vil løpe over flere dager, inkluderer en dag kategorisk "blokkering" faktor.
   MERK: Dette balanserer faktorinnstillinger på tvers av dager for å forhindre dagnivåendringer i prosessmiddelet fra å bli forvirret med studiefaktorene.
6. Velg faktorene som skal varieres og de som skal holdes konstant under studien.
   MERK: Bruk risikoprioriteringsverktøy som feilmoduseffektanalyser²⁰ for å velge det mest relevante delsettet av faktorer (figur 2). Vanligvis bør alle lipider få lov til å variere; selv om det i noen budsjettbegrensede tilfeller er rimelig å låse PEG i et fast forhold.
7. Etabler områdene for de forskjellige faktorene og den relevante desimalpresisjonen for hver.
8. Bestem studiedesignstørrelsen (antall unike partier av partikler) ved hjelp av minimum og maksimum heuristikk. Manuelt inkluderte referansekjøringer for kontroll teller ikke mot kjørestørrelsen som anbefales av heuristikken.
   MERK: Følgende heuristikker antar at svarene er kontinuerlige. Minimumsheuristikken forutsetter at det vil være mulig å utføre en oppfølgingsstudie, om nødvendig, i tillegg til å utføre bekreftelseskjøringer for kandidatoptimale formuleringer. Hvis det bare vil være mulig å utføre bekreftelseskjøringer, er det bedre å budsjettere for antall kjøringer oppnådd fra maksimal heuristikk. For binære primære svar, søk hjelp fra en statistiker for å bestemme riktig antall kjøringer.
   1. Minimum heuristikk: Fordel tre kjøringer per blandingsfaktor, to per kontinuerlig prosessfaktor og en per nivå av hver kategoriske faktor.
      MERK: For en studie med fire lipidfaktorer, to kontinuerlige og en treveis kategorisk prosessvariabel, fører dette til et forslag på (3 x 4) + (2 x 2) + 3 = 19 romfyllingskjøringer. Legg til flere kjøringer hvis noen sannsynligvis mislykkes på grunn av formulerings- eller måleproblemer.
   2. Maksimal heuristikk: Start programvaren for å bygge optimale design og skriv inn de nødvendige parametrene for en andre ordre (inkludert hovedeffekter, toveis interaksjoner mellom alle effekter og kvadratiske effekter for kontinuerlige prosessfaktorer). Beregn minimum kjørestørrelse i henhold til programvarens algoritme. Legg 1 til resultatet oppnådd fra programvaren for å definere maksimal heuristikk.
      MERK: Se tilleggsfil 1 for detaljerte instruksjoner om hvordan du utfører disse trinnene. Et prøvetilfelle med fire lipidfaktorer, to kontinuerlige og en treveis kategorisk prosessvariabel, fører til en anbefalt kjørestørrelse på 34 (33 fra programvareanbefaling + 1). Eventuelle løp utover dette vil trolig bli bedre brukt til bekreftelses- eller oppfølgingsstudier.

Figur 2: Årsaks- og virkningsdiagram. Diagrammet viser vanlige faktorer i et problem med optimalisering av LNP-formulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Opprettelse av designbordet med plassfyllende design

1. Åpne JMP og naviger i menylinjen til DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
2. Skriv inn studiesvarene (se tilleggsfil 1).
3. Valgfritt: Legg til kolonner for flere svar, som angir om hver av dem skal maksimeres, minimeres eller målrettes, ved å klikke på Legg til svar.
   MERK: Disse innstillingene kan endres senere og påvirker ikke designet. På samme måte kan flere kolonner for flere svar legges til etter at du har opprettet utformingstabellen.
4. Skriv inn studiefaktorene og de tilsvarende områdene. Bruk Blanding-knappen for å legge til blandingsfaktorer, Kontinuerlig-knappen for å legge til kontinuerlige faktorer eller Kategorisk-knappen for å legge til kategoriske faktorer.
   MERK: Denne eksempelstudien bruker faktorene og områdene illustrert i figur 3, som inkluderer det ioniserbare molforholdet (mellom 0,1 og 0,6), hjelpermolforholdet (også mellom 0,1 og 0,6), kolesterolmolforholdet (mellom 0,1 og 0,6), PEG-molforholdet (fra 0,01 til 0,05) og den ioniserbare lipidtypen (som kan være H101, H102, eller H103).
5. Skriv inn det forhåndsbestemte antallet kjøringer for utformingen i feltet Antall kjøringer .
6. Valgfritt: Øk den gjennomsnittlige klyngestørrelsen fra standardverdien 50 til 2000 via den røde trekantmenyen ved siden av utformingshodet for plassfyll og på undermenyen Avanserte alternativer .
   MERK: Dette er en innstilling for romfyllingsalgoritmen som kan føre til litt bedre designkonstruksjon på bekostning av ekstra beregningstid.
7. Generer utformingstabellen for plassfylling for de valgte faktorene og kjørestørrelsen. Klikk på Raskt fleksibelt fyll, og klikk deretter på Lag tabell.
   MERK: De to første løpene fra et eksempeldesign er vist i figur 4.
8. Legg til en Notes-kolonne i tabellen for å kommentere eventuelle manuelt opprettede kjøringer. Dobbeltklikk den første tomme kolonneoverskriften for å legge til en kolonne, og dobbeltklikk deretter den nye kolonneoverskriften for å redigere navnet.
9. Hvis det er aktuelt, kjøres manuelt innlemme referansekontroll i utformingstabellen. Inkluder en replikering for en av kontrollreferansene. Merk referansenavnet i Notes-kolonnen og fargekode referanseindeksreplikeringsradene for enkel grafidentifikasjon.
   1. Legg til en ny rad ved å dobbeltklikke på den første tomme radoverskriften og angi innstillingene for referansefaktor. Dupliser denne raden for å opprette en replikasjon av referanseindeksen. Merk begge radene og naviger til Rader > farger for å tilordne en farge til grafiske formål.
      MERK: Repliseringen gir et modelluavhengig estimat av prosessen pluss analytisk varians og vil gi ytterligere grafisk innsikt.
10. Hvis noen referansekontrollkjøringer overskrider omfanget av studiefaktorene, angir du dette i kolonnen "Notater" for fremtidig ekskludering fra analyse.
11. Rund blandingsfaktorene til riktig granularitet. For å gjøre det,
    1. Merk kolonneoverskriftene for blandingsfaktorene, høyreklikk en av kolonneoverskriftene, og naviger til Ny formelkolonne > Transformer > avrunding..., skriv inn riktig avrundingsintervall og klikk OK.
    2. Kontroller at ingen rader er merket ved å klikke den nederste trekanten i skjæringspunktet mellom rad- og kolonneoverskrifter.
    3. Kopier verdiene fra de nylig opprettede avrundede kolonnene (Ctrl + C) og lim inn (Ctrl + V) i de opprinnelige blandingskolonnene. Til slutt sletter du kolonnene for midlertidig avrundede verdier.
12. Etter avrunding av lipidforholdene, kontroller at summen er lik 100% ved å velge kolonneoverskriftene for blandingsfaktorene, høyreklikke på en og gå til Ny formelkolonne > Kombiner > sum. Hvis summen av en rad ikke er lik 1, må du manuelt justere en av blandingsfaktorene, slik at faktorinnstillingen holder seg innenfor faktorområdet. Slett sumkolonnen etter at justeringene er gjort.
13. Følg samme prosedyre som brukes for avrunding av blandingsfaktorene for å runde prosessfaktorene til deres respektive granularitet.
14. Formater lipidkolonnene slik at de vises som prosenter med ønsket antall desimaler: velg kolonneoverskriftene, høyreklikk og velg Standardiser attributter.... I det neste vinduet setter du Format til Prosent og justerer antall desimaler etter behov.
15. Hvis manuelle kjøringer legges til, for eksempel referansemålinger, tilfeldiggjør du tabellradrekkefølgen på nytt: legg til en ny kolonne med tilfeldige verdier (høyreklikk den siste kolonneoverskriften, og velg Ny formelkolonne > tilfeldig > tilfeldig normal). Sorter denne kolonnen i stigende rekkefølge ved å høyreklikke kolonneoverskriften, og slett deretter kolonnen.
16. Valgfritt: Legg til en Kjør-ID-kolonne . Fyll ut dette med gjeldende dato, eksperimentnavn og radnummer fra tabellen.
    MERK: Se (figur 5) for et eksempel.
17. Generer ternære plott for å visualisere designpunktene over lipidfaktorene (figur 6). Undersøk også kjørefordelingen over prosessfaktorene (figur 7): velg Graf > Ternærplott. Velg bare blandingsfaktorene for X, Plotting.
18. Hvis du vil undersøke fordelingen over prosessfaktorene, velger du Analyser > distribusjon og angir prosessfaktorene for Y, kolonner.
    MERK: Formuleringsforskeren bør bekrefte gjennomførbarheten av alle løp. Hvis det ikke finnes gjennomførbare kjøringer, start designet på nytt med tanke på de nylig oppdagede begrensningene.

Figur 3: Studiefaktorer og spredning. Skjermbilder av innstillinger i eksperimentell programvare er nyttige for å reprodusere studieoppsettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Første utdata for en plassfyllende design. Når du viser de to første radene i tabellen, må innstillingene avrundes til ønsket presisjon samtidig som lipidmengdene summeres til 1. Referanseindeksen ble lagt til i tabellen manuelt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Formatert studietabell. Faktornivåene er avrundet og formatert, og en Kjør-ID-kolonne er lagt til. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Designpunkter på en ternær tomt. De 23 formuleringene er vist som en funksjon av de tilsvarende Ionizable, Helper og "Andre" (Kolesterol + PEG) forhold. Det grønne punktet i midten representerer referanseindeksen 33:33:33:1 molforholdet Ionizable (H101):Cholesterol:Helper (DOPE):P EG. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Fordeling av ikke-blandede prosessfaktorer i forsøket. Histogrammene viser hvordan eksperimentelle kjøringer er fordelt på tvers av ioniserbar lipidtype, N: P-forhold og strømningshastighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Kjøre eksperimentet

1. Kjør eksperimentet i den rekkefølgen som angis av utformingstabellen. Registrer avlesningene i kolonnene som er innebygd i den eksperimentelle tabellen.
2. Hvis flere analyser utføres for samme respons på en identisk formuleringsbatch, beregner du et gjennomsnitt for disse resultatene i hver batch. Legg til en kolonne for hver analysemåling i tabellen.
   1. For å få et gjennomsnitt, velg alle relaterte kolonner, høyreklikk på en av de valgte kolonneoverskriftene og velg Ny formelkolonne > Kombiner > gjennomsnitt. Bruk denne Gjennomsnitt-kolonnen for fremtidig svaranalyse.
      MERK: Uten å starte oppskriften på nytt, registrerer gjentatte analysemålinger bare analysevariansen og utgjør ikke uavhengige replikater.
3. Dokumenter enhver forekomst av formulering, utfelling eller in vivo toleranseproblemer (for eksempel alvorlig vekttap eller død) med binære (0/1) indikatorer i en ny kolonne for hver type problem.

4. Analysere eksperimentelle resultater

1. Plott avlesningene og undersøk fordelingen av svarene: åpne Graph > Graph Builder og dra hvert svar til Y-området for individuelle plott. Gjenta dette for alle svar.
2. Undersøk den relative avstanden mellom de fargekodede replikasjonsløpene, hvis en ble inkludert. Dette gjør det mulig å forstå den totale (prosess- og analytiske) variasjonen ved referanseindeksen sammenlignet med variabiliteten på grunn av endringer i faktorinnstillingene over hele faktorrommet (figur 8).
3. Bestem om råresponsen skal modelleres eller om en transformasjon skal brukes i stedet. For responser som er begrenset til å være positive, men som er ubegrensede ovenfor (f.eks. styrke), passer både en normalfordeling og en lognormal fordeling til de eksperimentelle resultatene. Hvis den lognormale fordelingen passer bedre med en lavere AICc (korrigert Akaikes informasjonskriterium), så ta en loggtransformasjon av det svaret.
   1. Naviger til Analyser > distribusjon og velg svaret for Y, Kolonner. I den resulterende distribusjonsrapporten klikker du på den røde trekanten ved siden av svarnavnet og velger Continuous Fit > Fit Normal og Continuous Fit > Fit Lognormal fra rullegardinmenyen. I den påfølgende Sammenlign distribusjoner-rapporten kontrollerer du AICc-verdiene for å finne ut hvilken distribusjon som passer best til svaret.
   2. Hvis du vil utføre en loggtransformering, høyreklikker du kolonneoverskriften for svaret og velger Ny formelkolonne > Logg > logg. Når en modell bygges og en prediksjonskolonne på loggskalaen lagres, transformerer du svaret tilbake til den opprinnelige skalaen ved å velge Ny formelkolonne > Logg > Utg.
   3. For proporsjonsresponser avgrenset mellom 0 og 1, sammenlign tilpasningen til en normal- og betafordeling. Hvis betadistribusjonen har en lavere AICc, utfør en logit-transformering. I distribusjonsrapporten for svaret velger du Continuous Fit > Fit Normal og Continuous Fit > Fit Beta.
      1. For logit-transformeringen høyreklikker du kolonneoverskriften for svar i datatabellen og velger Ny formelkolonne > spesialitet > logit. Post modellbygging, lagre prediksjonskolonnen. Hvis du vil gå tilbake til den opprinnelige skalaen, bruker du Ny formelkolonne > Spesialitet > Logistikk.
         MERK: Den regresjonsbaserte SVEM-analysen er robust for avvik fra normalitet i svarfordelingen. Disse transformasjonene kan imidlertid føre til enklere tolkning av resultatene og til en forbedret tilpasning av modellene.
4. Graf løpene på en ternær tomt. Fargelegg punktene i henhold til svarene (eller de transformerte svarene hvis en transformasjon ble brukt): åpne Graf > Ternær plott. Velg bare blandingsfaktorene for X, Plotting. Høyreklikk på en av de resulterende grafene, velg Radforklaring og velg deretter (transformert) svarkolonne.
   MERK: Fargelegging av punktene i henhold til svar gir et modelluavhengig visuelt perspektiv på atferd i forhold til blandingsfaktorer.
5. Slett modellskriptet som er generert av utformingen for plassfylling.
6. Bygg en uavhengig modell for hvert svar som en funksjon av studiefaktorene, og gjenta følgende trinn for hvert svar.
   MERK: I tilfelle av en sekundær binær respons (f.eks. formuleringsfeil eller musedød), modeller også dette svaret. Endre innstillingen for målfordeling fra Normal til Binomisk.
7. Konstruer en "full" modell som omfatter alle kandidateffekter. Denne modellen bør inkludere hovedeffektene av hver faktor, to- og treveis interaksjoner, kvadratiske og partielle kubiske termer i prosessfaktorene, og Scheffés kubiske termer for blandingsfaktorene^23,24.
   MERK: Bruk samme sett med kandidateffekter for hvert svar. SVEM-modellvalgsteknikken vil uavhengig avgrense modellene for hver respons, noe som potensielt kan resultere i unike reduserte modeller for hver enkelt. Figur 9 illustrerer noen av disse kandidateffektene. Følgende undertrinn beskriver denne prosessen.
   1. Velg Analyser > tilpass-modellen.
   2. Sørg for at blokkerende faktorer (f.eks. Dag) ikke får lov til å samhandle med andre studiefaktorer. Velg eventuelle blokkeringsfaktorer, og klikk Legg til. Ikke ta med disse faktorene i noen av de påfølgende deltrinnene.
      MERK: Blokkerende faktorer er viktige å ta hensyn til i modellen, men blokkerende faktorer bør ikke tillates å samhandle med andre studiefaktorer. Hovedformålet med blokkerende faktorer er å bidra til å kontrollere eksperimentets variabilitet og forbedre eksperimentets følsomhet.
   3. Fremhev alle studiefaktorene. Endre Grad-feltverdien til 3 (den er satt til 2 som standard). Klikk på Fakultet til grad.
      MERK: Denne handlingen inkluderer hovedeffekter samt to- og treveis interaksjoner i modellen.
   4. Velg bare de ikke-blandingsfaktorene i valgvinduet. Klikk Makroer > delvis kubikk.
      MERK: Denne handlingen introduserer kvadratiske effekter for de kontinuerlige prosessfaktorene og deres interaksjon med andre ikke-blandingsfaktorer i modellen.
   5. Velg bare blandingsfaktorene fra valglisten. Klikk Makroer > Scheffe Cubic. Deaktiver standardvalget Ingen skjæringspunkt (se figur 9).
      MERK: Å inkludere et skjæringspunkt i modellen er et viktig trinn når du bruker Lasso-metoder, og er også nyttig i fremovervalgskonteksten. Den tradisjonelle standardinnstillingen No Intercept er vanligvis på plass fordi det ikke er mulig å tilpasse et skjæringspunkt samtidig med alle blandingens hovedeffekter, uten modifikasjoner som SVEM-tilnærmingen, med den vanlige minste kvadraters regresjonsprosedyren¹².
   6. Spesifiser svarkolonnen: Merk svarkolonnen og klikk på Y.
   7. Endre innstillingen Personlighet til Generalisert regresjon. La Distribusjon være satt til Normal.
   8. Lagre dette modelloppsettet i datatabellen for bruk med flere svar ved å klikke på den røde trekantmenyen ved siden av Modellspesifikasjon og velge Lagre i datatabell.
8. Bruk fremovervalgmetoden SVEM slik at den passer til den reduserte modellen, uten obligatorisk inkludering av hovedeffektene for blandingsfaktoren, og lagre kolonnen for prediksjonsformel i datatabellen.
   1. Fra dialogboksen Tilpass modell klikker du på Kjør.
   2. For estimeringsmetoden velger du SVEM Forward Selection.
   3. Utvid menyene Advanced Controls > Force Terms , og fjern merket for boksene som er knyttet til blandingens hovedeffekter. Bare boksen Avskjæringsterm skal forbli avmerket. Figur 10 viser standardoppsettet der hovedeffektene tvinges. I dette trinnet må det ikke merkes av for disse boksene for å tillate at modellen inkluderer eller utelater disse effektene basert på prosedyren for fremovervalg.
   4. Klikk Gå til for å kjøre prosedyren for SVEM fremovervalg.
9. Plott de faktiske svarene ved hjelp av de forutsagte svarene fra SVEM-modellen for å verifisere en rimelig prediktiv evne. (Figur 11). Klikk på den røde trekanten ved siden av SVEM fremovervalg , og velg Diagnoseplott > Plott faktisk etter forutsigelse.
10. Klikk på den røde trekanten ved siden av Markering av SVEM fremover, og velg Lagre kolonner > Lagre prediksjonsformel for å opprette en ny kolonne som inneholder prediksjonsformelen i datatabellen.
11. Valgfritt: Gjenta trinnene ovenfor ved å bruke SVEM-lasso som estimeringsmetode for å finne ut om en annen optimal oppskrift foreslås etter å ha utført de påfølgende trinnene. I så fall kjører du begge oppskriftene som bekreftelseskjøringer (omtalt i avsnitt 5) for å se hvilke som fungerer best i praksis¹².
12. Gjenta trinnene for modellbygging for hvert svar.
13. Når prediksjonskolonner for alle svar er lagret i datatabellen, lager du diagrammer av svarsporingene for alle kolonner for forventet svar ved hjelp av Profiler-plattformen: Velg Graf > Profiler, velg alle prediksjonskolonnene som ble opprettet i forrige trinn for Y, Prediksjonsformel, og klikk OK (figur 12).
14. Identifiser kandidatens optimale formulering(er).
    1. Definer "ønskelighetsfunksjonen" for hvert svar, og spesifiser om svaret skal maksimeres, minimeres eller matches til et mål. Sett eventuelle primære svar til å bruke en viktighetsvekt på 1,0 og eventuelle sekundære svar til å bruke en viktighetsvekt på 0,2. Fra den røde trekantmenyen Prediction Profiler velger du Optimalisering og ønskelighet > ønskelighetsfunksjoner, deretter Optimalisering og ønskelighet > Angi ønskeligheter. Skriv inn innstillingene i de påfølgende vinduene.
       MERK: De viktige vektene er relative og subjektive, så det er verdt å sjekke sensitiviteten til det kombinerte optimale for endringer i disse vektene innenfor et rimelig område (f.eks. fra lik vekting til 1:5-vekting).
    2. Kommando Profiler for å finne de optimale faktorinnstillingene som maksimerer ønskelighetsfunksjonen (figur 12): Fra Profiler velger du Optimalisering og ønskelighet > Maksimer ønskelighet.
       MERK: De predikerte verdiene av svarene på de optimale kandidatene kan overvurdere verdien av høyreskjeve svar som styrke; Bekreftelsesløpene vil imidlertid gi mer nøyaktige observasjoner av disse kandidatformuleringene. Hovedmålet er å finne den optimale formuleringen ( innstillingene for den optimale oppskriften).
    3. Registrer de optimale faktorinnstillingene og noter de viktige vektingene som brukes for hvert svar: Fra menyen Prediksjonsprofilering velger du Faktorinnstillinger > Husk innstillinger.
15. Valgfritt: For kategoriske faktorer som ioniserbar lipidtype, finn de betinget optimale formuleringene for hvert faktornivå.
    1. Angi først ønsket nivå for faktoren i profileringsverktøyet, hold deretter Ctrl-tasten og venstreklikk i grafen til den faktoren og velg Lås faktorinnstilling. Velg Optimalisering og ønskelighet > Maksimer ønskelighet for å finne det betingede optimale med denne faktoren låst ved gjeldende innstilling.
    2. Lås opp faktorinnstillingene før du fortsetter, ved å bruke den samme menyen som brukes til å låse faktorinnstillingene.
16. Gjenta optimaliseringsprosessen etter å ha justert viktighetsvektene til svarene (ved hjelp av Optimalisering og ønskelighet > Angi ønskeligheter), kanskje bare optimalisere primærresponsen(e) eller sette noen av de sekundære svarene til å ha mer eller mindre viktighetsvekt, eller sette målet for de sekundære svarene på Ingen (figur 13).
17. Registrer den nye optimale kandidaten (fra menyen Prediksjonsprofil velger du Faktorinnstillinger > Husk innstillinger.)
18. Produser grafiske sammendrag av de optimale områdene i faktorrommet: generer en datatabell med 50 000 rader fylt med tilfeldig genererte faktorinnstillinger innenfor det tillatte faktorrommet, sammen med de tilsvarende predikerte verdiene fra den reduserte modellen for hvert av svarene og funksjonen for felles ønskelighet.
    1. I profileringen velger du Tilfeldig utdatatabell. Sett Hvor mange kjøringer som skal simuleres? til 50 000, og klikk OK.
       MERK: Dette genererer en ny tabell med de forutsagte verdiene av svarene ved hver av de 50 000 formuleringene. Kolonnen Ønskelighet avhenger av viktighetsvektene for svarene som er på plass når alternativet Tilfeldig tabell for utdata er valgt.
    2. I den nyopprettede tabellen legger du til en ny kolonne som beregner persentilen til Ønskelighet-kolonnen. Bruk denne persentilkolonnen i ternærplottene i stedet for den rå Ønskelighet-kolonnen. Høyreklikk kolonneoverskriften Ønskelighet, og velg Ny formelkolonne > Fordelingsmessig > kumulativ sannsynlighet for å opprette en ny kolonne for kumulativ sannsynlighet[ønskelig].
    3. Generer grafikken som er beskrevet i trinnene nedenfor. Endre fargevalget for grafikken gjentatte ganger for å vise prognosene for hvert svar og for kolonnen Kumulativ sannsynlighet[ønskelig].
    4. Konstruer ternære tomter for de fire lipidfaktorene. Naviger til Graf > ternærplott i tabellen, velg blandingsfaktorene for X, Plotting og klikk OK. Høyreklikk i en av de resulterende diagrammene, velg Radforklaring, og velg deretter kolonnen for forventet svar. Endre rullegardinmenyen Farger til Jet.
       MERK: Dette viser de beste og dårligste resultatene med hensyn til lipidfaktorene. Figur 14 viser persentilene av leddønsket når man vurderer å maksimere potens (viktighet = 1) og minimere størrelse (viktighet = 0,2), mens gjennomsnitt over faktorer som ikke er vist på ternærplottaksene. Figur 15 viser den rå predikerte størrelsen. Det er også rimelig å bryte ned disse grafene betinget av andre faktorer, for eksempel å skape et distinkt sett med ternære plott for hver ioniserbar lipidtype med et lokalt datafilter (tilgjengelig fra den røde trekantmenyen ved siden av Ternary Plot).
    5. På samme måte kan du bruke Graph > Graph Builder til å plotte de 50 000 fargekodede punktene (som representerer unike formuleringer) mot de ikke-blandede prosessfaktorene, enten individuelt eller i fellesskap, og søke etter forhold mellom responsen (e) og faktoren (e). Se etter faktorinnstillingene som gir høyest ønskelighet. Utforsk ulike kombinasjoner av faktorer i grafikken.
       MERK: Når du fargelegger grafer, bruk kumulativ sannsynlighet [ønskelighet] , men når du plotter ønskeligheten på den vertikale aksen mot prosessfaktorer, bruk den rå Desirability-kolonnen . Desirability-kolonnen kan også plasseres på en akse i Graph > Scatterplot 3D-visualisering sammen med to andre prosessfaktorer for multivariabel utforskning. Figur 16 viser felles ønskelighet av alle formuleringene som kan dannes med hver av de tre ioniserbare lipidtyper. De mest ønskelige formuleringene bruker H102, med H101 som gir noen potensielt konkurransedyktige alternativer.
    6. Lagre profileringen og de huskede innstillingene tilbake i datatabellen. Klikk på den røde trekanten ved siden av Profiler, og velg Lagre skript > datatabell ....

Figur 8: Observerte potensavlesninger fra eksperimentet. Punktene viser potensverdiene som ble observert fra de 23 løpene; De replikerte referansekjøringene vises i grønt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: Programvaredialog for å starte analysen. Kandidateffektene er lagt inn sammen med målstyrkeresponsen, og alternativet Ingen avskjæring er ikke merket av. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 10. Ytterligere dialogboks for å angi SVEM-alternativer. Som standard blir lipidens hovedeffekter tvunget inn i modellen. Fordi et skjæringspunkt er inkludert, anbefaler vi at du fjerner merket for disse boksene for ikke å tvinge effektene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 11: Faktisk etter predikert plott. Denne figuren plotter den observerte styrken mot verdien som forutsies for hver formulering av SVEM-modellen. Sammenhengen trenger ikke være så sterk som den er i dette eksemplet, men forventningen er å se minst en moderat sammenheng og å kontrollere for uteliggere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 12: Prediksjonsprofiler. De to øverste radene med grafer viser stykkene til den predikerte responsfunksjonen ved den optimale formuleringen (som identifisert av SVEM-tilnærmingen). Den nederste raden av grafer viser vektet "ønskelighet" av formuleringen, som er en funksjon av den siste kolonnen av grafer som viser at Potency bør maksimeres, og Størrelse bør minimeres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 13: Tre optimale formuleringskandidater fra SVEM-Forward Selection. Endring av den relative viktighetsvektingen av svarene kan føre til ulike optimale formuleringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 14: Ternære plott for persentilen av ønskelighet. Plottet viser de 50.000 formuleringene fargekodet etter persentil av ønskelighet, hvor ønskeligheten er satt med vektvekt på 1,0 for å maksimere potens og 0,2 for å minimere størrelsen, disse plottene viser at det optimale området av formuleringer består av lavere prosentandeler ioniserbar lipid og høyere prosentandeler av PEG. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 15: Ternær plott for den forutsagte størrelsen. Plottet viser størrelsesprediksjonene fra SVEM-modellen for hver av de 50 000 formuleringene. Størrelsen minimeres med høyere prosentandeler av hjelperlipid og maksimeres med lavere prosentandeler av hjelperen. Siden de andre faktorene varierer fritt over de 50 000 plottede formuleringene, innebærer dette at dette forholdet holder over områdene til de andre faktorene (PEG, strømningshastighet, etc.). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 16: Fiolinplott for ønskeligheten av formuleringer som involverer de tre forskjellige ioniserbare lipidtyper. Hvert av de 50 000 punktene representerer en unik formulering fra hele det tillatte faktorrommet. Toppene i disse fordelingene er de maksimale verdiene for ønskelighet som beregnes analytisk med prediksjonsprofilen. H102 har den største toppen og gir dermed den optimale formuleringen. SVEM-tilnærmingen til å bygge modellen som genererer denne produksjonen filtrerer automatisk ut statistisk ubetydelige faktorer: formålet med denne grafen er å vurdere praktisk signifikans på tvers av faktornivåene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Bekreftelsen går

1. Lag en tabell som viser de optimale kandidatene som er identifisert tidligere (figur 17).
   MERK: Verdiene for sann styrke og sann størrelse i figur 17 fylles ut ved hjelp av de simulerte genereringsfunksjonene: i praksis vil disse oppnås ved å formulere og deretter måle ytelsen til disse oppskriftene.
   1. Inkluder referansekontrollen med settet med kandidatkjøringer som skal formuleres og måles.
   2. Hvis noen av formuleringene fra eksperimentet ble funnet å gi ønskelige resultater, kanskje ved å overgå referanseindeksen, velg det beste for å legge til kandidattabellen og test på nytt sammen med nye formuleringer.
      MERK: Legg enten til ønskede kjøringer manuelt i kandidattabellen, eller bruk Profiler-vinduets huskede innstillinger hvis disse kjøringene er fra forrige eksperiment. Identifiser radnummeret for kjøringen, naviger til Prediksjonsprofilering > Faktorinnstillinger > Sett til Data i rad, og skriv inn radnummeret. Velg deretter Prediksjonsprofilering > Faktorinnstillinger > Husk innstillinger , og merk etiketten på riktig måte (f.eks.
   3. Høyreklikk på tabellen Huskede innstillinger i Profiler og velg Lag til datatabell.
      MERK: Avhengig av studiens prioritet og budsjett, bør du vurdere å kjøre replikater for hver bekreftelseskjøring, spesielt hvis du erstatter referanseindeksen. Lag og analyser hver formulering to ganger, ved hjelp av gjennomsnittlig resultat for rangering. Vær oppmerksom på eventuelle kandidater med et bredt svarområde på tvers av de to replikatene, da dette kan indikere høy prosessvarians.
   4. Hvis det er nødvendig på grunn av budsjettbegrensninger, kan du redusere valget blant de identifiserte kandidatene for å samsvare med eksperimentbudsjettet eller for å eliminere overflødige kandidater.
2. Utfør bekreftelsesløpene. Konstruer formuleringene og samle avlesningene.
3. Kontroller at resultatene fra det opprinnelige eksperimentet er konsekvente og resultatene for bekreftelsespartiet for referansemålinger eller andre gjentatte oppskrifter. Hvis det er et stort og uventet skifte, bør du vurdere hva som kan ha bidratt til skiftet, og om det er mulig at alle kjøringer fra bekreftelsespartiet ble påvirket.
4. Sammenlign ytelsen til kandidatens optimale formuleringer. Undersøk om noen nye kandidater overgikk referanseindeksen.
5. Valgfritt: Legg til resultatet av bekreftelseskjøringene i den eksperimentelle tabellen, og kjør analysen på nytt i del 4.
   MERK: Det neste trinnet i arbeidsflyten inneholder instruksjoner for å lage en oppfølgingsstudie sammen med disse kjøringene hvis ønskelig.

Figur 17: Tabell over ti optimale kandidater som skal kjøres som bekreftelsesløp. True Potency og True Size har blitt fylt ut fra simuleringsgenererende funksjoner (uten noen ekstra prosess eller analytisk variasjon). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Valgfritt: Utforme en oppfølgingsstudie som skal kjøres samtidig med bekreftelseskjøringene

1. Vurder behovet for en oppfølgingsstudie med følgende kriterier i betraktning:
   1. Bestem om den optimale formuleringen ligger langs en av faktorgrensene, og om et annet eksperiment er ønsket for å utvide minst ett av faktorområdene.
   2. Evaluer om det første eksperimentet brukte en relativt liten opplagsstørrelse eller relativt store faktorområder, og om det er behov for å "zoome inn" på det identifiserte optimale området med flere kjøringer og oppdatert analyse.
   3. Sjekk om en tilleggsfaktor blir introdusert. Dette kan være et nivå av en kategorisk faktor som et ekstra ioniserbart lipid eller en faktor som forblir konstant i den første studien, for eksempel bufferkonsentrasjon.
   4. Hvis ingen av betingelsene ovenfor er oppfylt, går du videre til trinn 7.
2. Forbered deg på at flere eksperimentelle kjøringer kan utføres samtidig med bekreftelseskjøringene.
   1. Definer faktorgrensene for å sikre en delvis overlapping med regionen fra den første studien. Dersom det ikke foreligger overlapp, må det utformes en ny studie.
   2. Utvikle de nye eksperimentelle løpene med et design som fyller rommet. Velg DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
      MERK: For avanserte brukere, vurder en D-optimal design via DOE > Custom Design.
   3. Når plassfyllingskjøringene er generert, kan du manuelt innlemme to eller tre kjøringer fra det opprinnelige eksperimentet som ligger innenfor det nye faktorrommet. Fordel disse kjøringene tilfeldig i den eksperimentelle tabellen ved hjelp av trinnene beskrevet i del 2 for å legge til rader og deretter randomisere radrekkefølgen.
      MERK: Disse vil bli brukt til å estimere eventuelle endringer i responsmiddelet mellom blokker.
   4. Kjede sammen bekreftelseskjøringene, og den nye plassfyllingen kjøres i én enkelt tabell og tilfeldiggjør kjørerekkefølgen. Bruk tabeller > kjede sammen , og opprett og sorter deretter etter en ny tilfeldig kolonne for å tilfeldig kjøre kjørerekkefølgen, som beskrevet i del 2.
3. Formuler de nye oppskriftene og samle resultatene.
4. Sett sammen de nye eksperimentelle kjøringene og resultatene til den opprinnelige eksperimentdatatabellen, og introduser en eksperiment-ID-kolonne for å angi kilden for hvert resultat. Bruk Tabeller > Kjede sammen, og velg alternativet Opprett kildekolonne.
5. Kontroller at kolonneegenskapene for hver faktor viser det kombinerte området over begge studiene: høyreklikk på kolonneoverskriften for hver faktor og undersøk egenskapsområdene for koding og blanding , hvis de finnes.
6. Begynn analysen av resultatene fra det nye eksperimentet.
   1. Inkluder kolonnen eksperiment-ID som et begrep i modellen for å fungere som en blokkeringsfaktor. Sørg for at dette begrepet ikke samhandler med studiefaktorene. Kjør Tilpass modell-dialogskriptet som er lagret i tabellen i Seksjon 4, velg kolonnen for eksperiment-ID og klikk på Legg til for å inkludere den i listen over kandidateffekter.
   2. Kjør denne Fit Model-dialogen på den sammenkjedede datatabellen for å analysere resultatene fra det nye eksperimentet og den første studien i fellesskap. Følg tidligere instruksjoner for å generere oppdaterte optimale formuleringskandidater og grafiske sammendrag.
   3. For validering, analyser uavhengig resultatene fra det nye eksperimentet, unntatt resultater fra det første eksperimentet. Det vil si, utfør trinnene beskrevet i avsnitt 4 på den nye eksperimentelle tabellen.
   4. Sikre at optimale formuleringer identifisert av disse modellene stemmer godt overens med de som gjenkjennes av den felles analysen.
   5. Gjennomgå grafiske sammendrag for å bekrefte at både felles og individuelle analyser av de nye eksperimentelle resultatene viser lignende responsoverflateadferd (noe som betyr at det er et lignende forhold mellom responsen (e) og faktorene).
   6. Sammenlign de kombinerte og individuelle analysene av nye resultater med det første eksperimentet for konsistens. Bruk lignende grafstrukturer for sammenligning og undersøk de identifiserte optimale oppskriftene på forskjeller.

7. Dokumentasjon av studiens endelige vitenskapelige konklusjoner

1. Hvis referansekontrollen endres til en nylig identifisert oppskrift på grunn av studien, logger du den nye innstillingen og angir design- og analysefilene som registrerer opprinnelsen.
2. Vedlikehold alle eksperimentelle tabeller og analysesammendrag, helst med datostemplede filnavn, for fremtidig referanse.

Representative Results

Denne tilnærmingen har blitt validert på tvers av begge bredt klassifiserte lipidtyper: MC3-lignende klassiske lipider og lipidoider (f.eks. C12-200), generelt avledet fra kombinatorisk kjemi. Sammenlignet med en benchmark LNP-formulering utviklet ved hjelp av en One Factor at a Time (OFAT) -metode, viser kandidatformuleringene generert gjennom vår arbeidsflyt ofte potensforbedringer på 4 til 5 ganger på en logaritmisk skala, som vist i museleverens luciferaseavlesninger i figur 18. Tabell 1 viser de tilsvarende forbedringene i luciferase-uttrykk fra mus observert over referansekontrollytelsen gjennom to optimaliseringsfaser (en innledende studie og en påfølgende oppfølgingsstudie). I den første fasen var fokus på å optimalisere lipidforholdene mens andre faktorer ble holdt konstant. I oppfølgingsstudien ble en ekstra hjelperlipidtype introdusert og optimalisering ble utført med tanke på både lipidforholdssammensetningen og hjelperlipidtypen. Følgelig ble den nylig introduserte hjelperlipidtypen valgt for å brukes med den tilhørende optimaliserte lipidsammensetningen. Den betydelige forbedringen i potens antyder at disse optimaliserte komposisjonene kan vise overlegne endosomale rømningsevner²⁵.

Simuleringer kan brukes til å vise den forventede kvaliteten på den optimale kandidaten produsert av denne prosedyren. Innenfor rammen av eksempeleksperimentet som brukes i protokollen, kan vi gjenta simuleringen mange ganger for forskjellige kjørestørrelser og evaluere resultatene i henhold til den simulerte prosessgenererende funksjonen. Et JMP-skript for dette formålet finnes i tilleggsfil 4. Spesifikt ble det generert et romfyllingsdesign, og responskolonnene ble fylt med verdier fra generatorfunksjonene våre, pluss støy som representerer analytisk variasjon og prosessvariasjon. Vi tilpasser disse simulerte svarene med ulike analyseteknikker (inkludert SVEM Forward Selection) for å produsere en tilsvarende kandidatoptimal oppskrift. Kandidatene fra hver analysemetode sammenlignes deretter med verdien av det sanne optimale fra de genererende funksjonene. Figur 19 illustrerer den gjennomsnittlige prosentandelen av den maksimale teoretiske responsen som oppnås ved hver av de tre analysemetodene ved hjelp av romfyllingsdesign av størrelse gitt på den horisontale aksen. Den fullstendige modellen, som inkluderer alle kandidateffekter og ikke reduserer modellen basert på den statistiske signifikansen av disse effektene, utfører det verste. Mye av det ekstra arbeidet som tradisjonelt går inn i å tilpasse regresjonsmodeller for blandingsprosesseksperimenter, innebærer modifikasjoner (fjerning av skjæringspunktet, tvinge blandingens hovedeffekter, utelukke bruk av rene kvadratiske blandingseffekter, etc.) som kreves for å passe denne fulle modell⁹, og fra dette perspektivet er disse prosedyrene unødvendige¹². Videre kan denne modellen ikke passe før designstørrelsen når antall effekter i modellen. Ved mindre eksperimentelle størrelser kan vi tilpasse den tradisjonelle fremoverseleksjonsmetoden, som overgår hele modellen med hensyn til gjennomsnittlig ytelse for den optimale kandidatformuleringen for hver fast eksperimentell størrelse. På samme måte forbedrer SVEM-modifikasjonen til denne fremoverutvelgelsesmetoden ytterligere ytelsen til de optimale kandidatene. Dette plottet viser at bruk av SVEM-Forward Selection^12,13 for å analysere et 24-run space-fyllingseksperiment oppnår samme gjennomsnittlige kvalitet som vanligvis krever 50 kjøringer når det analyseres med en tradisjonell fremovervalg (målretting minimum AICc) modell. Selv om den faktiske ytelsen vil variere fra prosess til prosess, demonstrerer denne simuleringen - sammen med publiserte resultater på SVEM 12,13,16,17,26 - potensialet i denne modelleringsprosedyren for formuleringsoptimalisering.

Figur 18: Forbedring i lever luciferase uttrykk etter to runder med eksperimentering. Runde 0 viser leveren luciferase lesing for referansen formulering; Runde 1 viser leverluciferaseavlesningen etter det første eksperimentet som optimaliserer LNP-bestanddelene lipidmolforhold; Runde 2 viser leveren luciferase lesing etter det andre eksperimentet som ytterligere optimaliserer bestanddelene molare forhold samtidig som man vurderer en ekstra hjelper lipid type. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 19: Kvalitet på optimal formulering som funksjon av eksperimentell størrelse og statistisk modell. Den vertikale aksen representerer prosentandelen av teoretisk maksimal ønskelighet, og den horisontale aksen representerer størrelsen på romfyllingsdesignet. Hvert punkt viser gjennomsnittet over 150 simuleringer. Den blå linjen (trekanter) representerer hele modellen (uten eliminering av statistisk usignifikante effekter), den gule (sirkler) linjen representerer den tradisjonelle AICc-baserte fremovervalgsmodellen (med et skjæringspunkt og uten å tvinge blandingens hovedeffekter), og den grønne linjen (opp ned trekanter) representerer den SVEM-baserte fremovervalgsmodellen (med et skjæringspunkt og uten å tvinge blandingens hovedeffekter). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Rund	Partikkel-ID	Luciferase-uttrykk i leveren (foton/sek)
0	Referanseindeks for kontroll	8.E+06
1	Optimalisert over lipidforhold	2.E+09
2	Optimalisert over lipidforhold og hjelperlipidtype	8.E+10

Tabell 1: Systematisk forbedring av luciferase-uttrykk gjennom optimalisering av design av eksperiment (DOE). Denne tabellen illustrerer den betydelige forbedringen i uttrykket av luciferase, med en opptil 10.000 ganger forbedring på foton/sekundskalaen, fra den opprinnelige referanseindeksen til den endelige "optimale kandidaten".

Tilleggsfil 1: 04APR2023 Sammendrag.docx - Dette dokumentet gir en oversikt over studien, inkludert formålet, svarene som ble vurdert, faktorene som ble vurdert og det totale antallet kjøringer som ble utført. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: 23_run_simulated_experiment.jmp - En JMP-fil med det simulerte eksperimentet og dets resultater. Denne filen inneholder også vedlagte analyseskript som er kompatible med JMP 17 Pro. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: 23_run_simulated_experiment.xlsx - En Excel-fil som inneholder det simulerte eksperimentet og dets resultater, egnet for lesere som kanskje ikke har tilgang til JMP. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: blandingssimulering 20DEC22.jsl - Dette er et JMP 17 Pro-skript som brukes til å simulere LNP-formuleringseksperimenter og evaluere ytelsen til forskjellige analysemetoder. Skriptet bruker tilnærmingen SVEM-Forward Selection (ingen skjæringspunkt), som er den viktigste analysemetoden som brukes i denne arbeidsflyten. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Moderne programvare for design og analyse av blandingsprosesseksperimenter gjør det mulig for forskere å forbedre lipidnanopartikkelformuleringene i en strukturert arbeidsflyt som unngår ineffektiv OFAT-eksperimentering. Den nylig utviklede SVEM-modelleringstilnærmingen eliminerer mange av de uforståelige regresjonsmodifikasjonene og modellreduksjonsstrategiene som tidligere kan ha distrahert forskere med fremmede statistiske hensyn. Når resultatene er samlet inn, tilbyr SVEM-analyserammeverket en tilnærming som både er enklere å implementere og har en tendens til å produsere bedre modeller enn tradisjonelle modelleringstilnærminger¹³. Videre er de grafiske analysene som er basert på prediksjonsformlene for hvert svar lett tolkbare av forskere, noe som gir en klar oppsummering av responsens marginale oppførsel over individuelle faktorer, så vel som små grupper av faktorer uten å kreve tolkning av høyt korrelerte parameterestimater fra en regresjonsmodell. Dette gjør det mulig for forskere å fokusere på å vurdere praktisk betydning på tvers av studiefaktorer etter at SVEM automatisk har fjernet statistisk ubetydelige effekter.

Arbeidsflyten har blitt brukt i praksis for systematisk å variere lipidsammensetning og formuleringsparametere som N / P-forhold, strømningshastighet og blandingsforhold for optimalisering og å velge de beste hjelperlipidtypene, ioniserbare lipidtyper og buffertyper. Målene på tvers av disse eksemplene inkluderer vanligvis maksimering av in vivo eller in vitro-potens og innkapsling av varierende nyttelaster som mRNA eller DNA for relevante in vivo-mål som leverceller, eller noen ganger på tvers av flere celletyper når det gjelder in vitro-applikasjoner. For spesifikke applikasjoner må vi kanskje balansere biofysiske egenskaper som størrelse, PDI, zetapotensial og prosentvis innkapsling mens vi undersøker in vivo-styrke. I tillegg er målet å finne en potent, men likevel godt tolerert formulering, og vi kan derfor inkludere responser som endring i kroppsvekt, cytokinrespons eller fremkalling av leverenzymer som ASAT / ALT i analysen. Mønstre har dukket opp fra mange LNP-eksperimenter. Spesielt synes endringer i molforholdet mellom det ioniserbare lipidet og N / P-forholdet å påvirke RNA-innkapslingen betydelig. Videre synes endringer i PEG-molforholdet å påvirke partikkelstabiliteten, som indikert ved påvirkning på størrelse og PDI. Generelt har et overskudd av PEG i LNP-kjernen en tendens til å ha en skadelig effekt på styrken hos mus.

Ytelsesforbedringer er spesielt merkbare når mer enn ett svar er målrettet: selv om referanseindeksen allerede fungerer bra med hensyn til den primære responsen (f.eks. Styrke), opprettholder eller forbedrer leddoptimalisering vanligvis atferden med hensyn til den primære responsen, samtidig som atferden forbedres med hensyn til andre responser (minimerer PDI, størrelse eller tap av kroppsvekt). Vi validerer ektheten av disse forbedringene med bekreftelseskjøringer, der vi forbereder og direkte sammenligner referanseformuleringen (muligens med en replikat) og nye kandidatformuleringer.

Utformingsfasen av denne arbeidsflyten har flere kritiske trinn. Først må du sørge for at faktorene og deres områder er riktig angitt i romfyllingsdesignplattformen. For det andre, bruk grafikk og emnekunnskap for å bekrefte gjennomførbarheten av hver resulterende formulering før eksperimentet starter. Til slutt utfører du eksperimentet i den tilfeldige rekkefølgen som er angitt i designtabellen. Å følge denne sekvensen bidrar til å forhindre at umålte kovariater - for eksempel rekkefølgen av formuleringsproduksjon eller omgivelsestemperatur - forstyrrer faktorene som studeres. Plassfyllingsdesignene er enklere å konstruere - med mindre potensial for brukerfeil enn optimale blandingsprosessdesign, som krever ekstra beslutninger under oppsettet som kan frustrere uerfarne brukere og motvirke dem fra å bruke designede eksperimenter. Likevel, etter å ha jobbet gjennom denne protokollen, kan forskere ha nytte av ytterligere lesing om hvordan optimale design potensielt kan erstatte romfyllingsdesign i protokollen, som beskrevet i kapittel 6 i Goos and Jones (2011) ²⁷. Spesielt for oppfølgingsstudier som "zoomer inn" på et optimalt område - der det er mindre bekymring for feil langs blandingsgrensene - kan D-optimale design være mer effektive enn plassfyllingsdesign.

På samme måte har analysefasen av denne arbeidsflyten flere kritiske trinn. Først må du sørge for at modellen spesifiserer et passende sett med kandidateffekter, inkludert interaksjoner, i stedet for bare de viktigste (førsteordens) effektene av faktorene. For det andre, bruk SVEM Forward Selection som modelleringsrammeverk. For det tredje, deaktiver standard No Intercept-alternativet og unngå å tvinge blandingens hovedeffekter. Til slutt, still inn ønskelighetsfunksjonene for svarene riktig før du starter optimaliseringen. For brukere uten tilgang til SVEM er den beste tilnærmingen å bruke tradisjonell fremovervalg (målretting minimum AICc) for regresjonsproblemet¹². Protokollen nevner at det også er mulig å bruke SVEM Lasso: i gjennomsnitt gir denne tilnærmingen lignende resultater som SVEM Forward Selection, men for bestemte datasett kan de to tilnærmingene produsere litt forskjellige optimale formuleringer som kan sammenlignes med bekreftelsesløp¹². SVEM Lasso vil imidlertid gi dårligere modelleringsresultater hvis brukeren gjør den enkle feilen å glemme å deaktivere standard No Intercept-alternativ ¹²: av denne grunn har vi brukt SVEM Forward Selection som standardmetode, siden den er mer robust for dette alternativet.

Den primære begrensningen av denne metoden er at det vil være sporadiske studier med større kompleksitet som vil ha nytte av hjelp fra en statistiker for design og analyse. Situasjoner der driftsbudsjettet er mer begrenset enn vanlig (under minimumsheuristikken), svarene er binære, det er et stort antall kategoriske faktorer eller nivåer av en enkelt kategorisk faktor, der et forskningsmål er å vurdere å eliminere en eller flere blandingsfaktorer fra oppskriften, eller der det er ytterligere begrensninger på faktorrommet kan tilnærmes annerledes av en statistiker, for eksempel ved å bruke optimale eller hybrid^12,28 design eller ved å legge til ekstra struktur til designet. Spesielt kan en hybriddesign dannes ved å skape en plassfyllende design med de fleste budsjetterte kjøringer og deretter "forsterke" designet med de gjenværende løpene (vanligvis 2-4) ved hjelp av et D-optimalt kriterium. En annen hybrid tilnærming er å generere en plassfyllingsdesign over blandings- (lipid) og kontinuerlige (prosess) faktorer, og deretter legge til eventuelle kategoriske faktorer ved å bruke en "optimal" fordeling av faktornivåer. Likevel har den forenklede romfyllingsdesigntilnærmingen i protokollen blitt utviklet de siste årene i ferd med å kjøre dusinvis av LNP-formuleringsoptimaliseringseksperimenter, og vi tror det gir en robust tilnærming som vil fungere vellykket i de fleste tilfeller, samtidig som forskerne får tillit til deres evne til å utnytte designede eksperimenter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP Pro 17.1	JMP Statistical Discovery LLC