Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

استخدام MouseWalker لتحديد الخلل الحركي في نموذج فأر لإصابة الحبل الشوكي

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65207
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 2
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Summary

يتم توفير خط أنابيب تجريبي لوصف النمط الحركي للفئران التي تمشي بحرية باستخدام صندوق أدوات MouseWalker (MW) ، بدءا من تسجيلات الفيديو الأولية والتتبع إلى التحليل الكمي اللاحق. يتم استخدام نموذج إصابة كدمة الحبل الشوكي في الفئران لإثبات فائدة نظام MW.

Abstract

يعتمد تنفيذ البرامج الحركية المعقدة والمنسقة للغاية ، مثل المشي والجري ، على التنشيط الإيقاعي للدوائر الشوكية وفوق الشوكية. بعد إصابة الحبل الشوكي الصدري ، يكون الاتصال بالدوائر الأولية ضعيفا. وهذا بدوره يؤدي إلى فقدان التنسيق ، مع إمكانية استرداد محدودة. وبالتالي ، لتقييم درجة الشفاء بشكل أفضل بعد تناول الأدوية أو العلاجات ، هناك حاجة إلى أدوات جديدة أكثر تفصيلا ودقة لتحديد المشي وتنسيق الأطراف والجوانب الدقيقة الأخرى للسلوك الحركي في النماذج الحيوانية لإصابة الحبل الشوكي. تم تطوير العديد من المقايسات على مر السنين لتقييم سلوك المشي الحر في القوارض كميا. ومع ذلك ، فإنها عادة ما تفتقر إلى القياسات المباشرة المتعلقة باستراتيجيات المشي التدريجي وأنماط البصمة والتنسيق. لمعالجة أوجه القصور هذه ، يتم توفير نسخة محدثة من MouseWalker ، والتي تجمع بين ممر الانعكاس الداخلي الكلي المحبط (fTIR) مع برنامج التتبع والقياس الكمي. تم تكييف هذا النظام مفتوح المصدر لاستخراج العديد من المخرجات الرسومية والمعلمات الحركية ، ويمكن أن تكون مجموعة من أدوات ما بعد القياس الكمي لتحليل بيانات المخرجات المقدمة. توضح هذه المخطوطة أيضا كيف تصف هذه الطريقة ، المتحالفة مع الاختبارات السلوكية المحددة بالفعل ، كميا، العجز الحركي بعد إصابة الحبل الشوكي.

Introduction

التنسيق الفعال لأربعة أطراف ليس فريدا للحيوانات الرباعية. يظل التنسيق بين الأطراف الأمامية والخلفية في البشر مهما لإنجاز العديد من المهام ، مثل السباحة وتغيرات السرعة أثناء المشي1. يتم الحفاظ على مختلف الأطرافالحركية 2 والبرنامج الحركي1،3،4 ، وكذلك دوائر التغذية المرتدة الحس العميق5 ، بين البشر والثدييات الأخرى ويجب أخذها في الاعتبار عند تحليل الخيارات العلاجية للاضطرابات الحركية ، مثل إصابة الحبل الشوكي (SCI)6،7،8.

من أجل المشي ، يجب توصيل العديد من وصلات العمود الفقري من الأطراف الأمامية والخلفية بشكل صحيح وتنشيطها بشكل إيقاعي ، الأمر الذي يتطلب مدخلات من الدماغ وردود فعل من النظام الحسي الجسدي2،9،10. تبلغ هذه الوصلات ذروتها في مولدات النمط المركزي (CPGs) ، والتي تقع على مستوى عنق الرحم وأسفل الظهر للأطراف الأمامية والخلفية ، على التوالي1،9،10. في كثير من الأحيان ، بعد اصابات النخاع الشوكي ، يحد انقطاع الاتصال العصبي وتشكيل ندبة دبقية مثبطة12 من استعادة الوظيفة الحركية ، مع اختلاف النتائج من الشلل التام إلى الوظيفة المقيدة لمجموعة من الأطراف اعتمادا على شدة الإصابة. تعد أدوات القياس الكمي للوظيفة الحركية بدقة بعد اصابات النخاع الشوكي ضرورية لمراقبة التعافي وتقييم آثار العلاجات أو التدخلات السريرية الأخرى6.

المقايسة المترية القياسية لنماذج كدمة الماوس ل SCI هي مقياس باسو للماوس (BMS) 13,14 ، وهي درجة غير بارامترية تأخذ في الاعتبار استقرار الجذع ، وموضع الذيل ، والخطوة الأخمصية ، والتنسيق بين الأطراف الأمامية والخلفية في ساحة المجال المفتوح. على الرغم من أن BMS موثوق للغاية في معظم الحالات ، إلا أنه يتطلب اثنين على الأقل من المقيمين ذوي الخبرة لمراقبة جميع زوايا حركة الحيوانات من أجل حساب التباين الطبيعي وتقليل التحيز.

كما تم تطوير فحوصات أخرى لتقييم الأداء الحركي بعد اصابات النخاع الشوكي كميا. وتشمل هذه اختبار الروتارود ، الذي يقيس الوقت المستغرق في أسطوانة دوارة15 ؛ السلم الأفقي ، الذي يقيس عدد السور المفقود والاستيلاء على السلم الإيجابي16,17 ؛ واختبار المشي بالشعاع ، الذي يقيس الوقت الذي يستغرقه الحيوان وعدد حالات الفشل التي يرتكبها عند عبور شعاع ضيق18. على الرغم من أنها تعكس مزيجا من العجز الحركي ، إلا أن أيا من هذه الاختبارات لا تنتج معلومات حركية مباشرة حول التنسيق بين الأطراف الأمامية والخلفية.

لتحليل سلوك المشي بشكل محدد وأكثر شمولا ، تم تطوير فحوصات أخرى لإعادة بناء دورات الخطوة واستراتيجيات المشي. أحد الأمثلة على ذلك هو اختبار البصمة ، حيث ترسم الكفوف المحبرة لحيوان نمطا على ورقة بيضاء19. على الرغم من بساطة تنفيذه ، إلا أن استخراج المعلمات الحركية مثل طول الخطوة أمر مرهق وغير دقيق. وعلاوة على ذلك، فإن الافتقار إلى بارامترات دينامية، مثل مدة دورة الخطوة أو التنسيق المحدد بتوقيت الساق، يحد من تطبيقاتها؛ في الواقع ، لا يمكن الحصول على هذه المعلمات الديناميكية إلا من خلال تحليل مقاطع الفيديو إطارا تلو الآخر للقوارض التي تمشي عبر سطح شفاف. بالنسبة لدراسات اصابات النخاع الشوكي ، قام الباحثون بتحليل سلوك المشي من وجهة نظر جانبية باستخدام جهاز المشي ، بما في ذلك إعادة بناء دورة الخطوة وقياس الاختلافات الزاوية لكل مفصل ساق4،20،21. على الرغم من أن هذا النهج يمكن أن يكون مفيدا للغاية6 ، إلا أنه يظل يركز على مجموعة محددة من الأطراف ويفتقر إلى ميزات المشي الإضافية ، مثل التنسيق.

لسد هذه الفجوات، طور هامرز وزملاؤه اختبارا كميا يعتمد على مستشعر اللمس البصري باستخدام الانعكاس الداخلي الكلي المحبط (fTIR)22. في هذه الطريقة ، ينتشر الضوء عبر الزجاج عبر الانعكاس الداخلي ، وينتشر عند الضغط على المخلب ، وأخيرا ، يتم التقاطه بواسطة كاميرا عالية السرعة. في الآونة الأخيرة ، تم توفير نسخة مفتوحة المصدر من هذه الطريقة ، تسمى MouseWalker ، ويجمع هذا النهج بين ممر fTIR وحزمة برامج التتبع والقياسالكمي 23. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمستخدم استخراج مجموعة كبيرة من المعلمات الكمية ، بما في ذلك أنماط الخطوة والمكانية والمشي ، وتحديد موضع البصمة ، والتنسيق بين الأطراف الأمامية والخلفية ، بالإضافة إلى المخرجات المرئية ، مثل أنماط البصمة (محاكاة مقايسة المخلبالمحبر 6) أو مراحل الوقوف بالنسبة لمحور الجسم. الأهم من ذلك ، نظرا لطبيعتها مفتوحة المصدر ، يمكن استخراج معلمات جديدة عن طريق تحديث حزمة البرنامج النصي MATLAB.

هنا ، يتم تحديث التجميع المنشور مسبقا لنظام MouseWalker23 . يتم توفير وصف لكيفية إعداده ، مع جميع الخطوات المطلوبة لتحقيق أفضل جودة للفيديو وظروف التتبع واكتساب المعلمات. كما تتم مشاركة أدوات إضافية لما بعد القياس الكمي لتعزيز تحليل مجموعة بيانات مخرجات MouseWalker (MW). أخيرا ، يتم توضيح فائدة هذه الأداة من خلال الحصول على قيم قابلة للقياس الكمي للأداء الحركي العام ، وتحديدا دورات الخطوة والتنسيق بين الأطراف الأمامية والخلفية ، في سياق إصابة الحبل الشوكي (SCI).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع إجراءات المناولة والرعاية الجراحية وما بعد الجراحة من قبل اللجنة الداخلية الجزيئية لمعهد الطب (ORBEA) ولجنة أخلاقيات الحيوان البرتغالية (DGAV) وفقا لإرشادات الجماعة الأوروبية (التوجيه 2010/63 / EU) والقانون البرتغالي بشأن رعاية الحيوان (DL 113/2013) بموجب الترخيص 0421/000/000/2022. تم استخدام إناث الفئران C57Bl / 6J التي تتراوح أعمارها بين 9 أسابيع في الدراسة الحالية. تم بذل كل الجهود لتقليل عدد الحيوانات وتقليل معاناة الحيوانات المستخدمة في الدراسة. البرنامج النصي MATLAB والإصدار المستقل من برنامج MW مفتوح المصدر ومتوفر في GitHub
مستودع (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). بينما تم تطوير برنامج MW في MATLAB R2012b ، فقد تم تكييفه للتشغيل في MATLAB R2022b. يوضح الشكل 1 سير عمل تحليل MW.

1. إعداد جهاز MouseWalker (MW)

  1. قم بتجميع جهاز MW كما هو موضح سابقا23 ، أو التكيف مع الاحتياجات المحددة للتصميم التجريبي (انظر جدول المواد والشكل التكميلي 1 لمزيد من التفاصيل حول الإعداد).
    ملاحظة: يمكن توسيع ساحة المشي لاستيعاب الحيوانات الكبيرة ، مثل الفئران.
  2. تحقق من أن زجاج شبكي حيث تمشي الحيوانات نظيف وخالي من الخدوش. استخدم قطعة قماش ناعمة للتنظيف ، وقلل من استخدام المذيبات العضوية مثل الأمونيا أو الإيثانول بتركيزات عالية ، والتي يمكن أن تلحق الضرر بزجاج شبكي (يوصى باستخدام 3٪ بيروكسيد الهيدروجين أو 7٪ إيثانول أو أي مطهر متوافق ومناسب لزجاج شبكي). إذا لزم الأمر ، استبدل زجاج شبكي.
  3. قم بإعداد الكاميرا عالية السرعة بعدسة سريعة وفتحة عدسة كبيرة (أي قيم F-stop أصغر) لالتقاط كمية كبيرة من الضوء ، حيث يساعد ذلك في تسجيل إشارات fTIR (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يجب ألا تولد العدسة تشوهات بصرية، خاصة عند حواف الصورة. يمكن اختبار التشوهات البصرية عن طريق تسجيل نمط معروف (على سبيل المثال ، خطوط أو مربعات) ثم قياس حجم الكتل على ImageJ / FIJI24 (استخدم أداة الخط ، ثم انقر فوق تحليل > قياس). على سبيل المثال ، يجب أن يكون للمربع بحجم 1 سم نفس أبعاد البكسل في كل من مركز الصورة وعلى الحواف. يجب أن تكون الاختلافات أصغر من 5٪.
  4. قم بإضاءة شريط إضاءة LED متعدد الألوان من صندوق إضاءة الخلفية.
  5. قم بإضاءة شريط إضاءة LED الأبيض من صندوق إضاءة الممشى.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام مؤشر LED ملون25 لتسهيل تمييز البصمة / الجسم / الخلفية.
  6. مع إطفاء أضواء الغرفة ، تحقق من شدة الضوء لصندوق إضاءة الخلفية والممر. اضبط الشدة ، إذا لزم الأمر ، باستخدام مقياس الجهد أو البلاستيك شبه غير الشفاف. يجب تحسينها بحيث تزداد كثافة البكسل بالترتيب التالي: جسم الحيوان < الخلفية < آثار الأقدام.
    1. للتحقق من كثافة البكسل لجسم الحيوان / خلفيته / آثار أقدامه ، افتح تسلسل الصورة على ImageJ / FIJI24 ، وانقر فوق تحليل > قياس. لا ينبغي أن تكون إشارة البصمة مفرطة التشبع ، لأن ذلك سيمنع تحديد حدود البصمة (أي أصابع القدم ووسادات القدم) (الشكل التكميلي 2).
  7. اضبط تباين صورة الممشى على برنامج تسجيل الفيديو. يمكن ضبط التباين بطريقتين: عن طريق تعتيم أو زيادة الإضاءة على شريط LED أو عن طريق ضبط فتحة عدسة الكاميرا.
  8. ضع العدسة بشكل صحيح لتكون على نفس الارتفاع وفي وسط المرآة العاكسة 45 درجة وعموديا (90 درجة) على الممشى. سيؤدي ذلك إلى إنشاء صورة متناسبة باستمرار على طول الممر الأيسر الأيمن.
    ملاحظة: تجنب تغيير موضع الكاميرا (المسافة والارتفاع والاتجاه) عبر جلسات التسجيل المتعددة. إذا لزم الأمر ، ضع علامة على الأرضية حيث يجب وضع الحامل ثلاثي القوائم. سيؤدي هذا إلى الحفاظ على ميزات الصورة.
  9. ركز العدسة على سطح زجاج شبكي. يمكن اختبار ذلك باستخدام جسم غير ضار يلامس سطح زجاج شبكي.
    ملاحظة: مع انخفاض قيم عدسة F-stop ، سيصبح عمق المجال أصغر ، مما يجعل التركيز البؤري أكثر صعوبة.
  10. تأكد من بقاء جميع الإعدادات دون تغيير أثناء الفحص ، لأنها قد تغير كثافة البكسل لمقاطع الفيديو المسجلة.

2. اقتناء الفيديو

  1. تأكد من أن الفئران على دراية بالغرفة والجهاز قبل الاختبار. حفظ ما لا يقل عن 1 يوم للتعود (اليوم 0). لتجنب التدريب المفرط ، قم بإجراء اختبار MW في يوم مختلف عن الاختبارات السلوكية الأخرى (يفضل أن يكون ذلك في اليوم التالي).
  2. في برنامج تسجيل الفيديو ، تأكد من أن 50 سم على الأقل من الممر مرئي.
  3. اضبط إعدادات التسجيل لاقتطاع منطقة الممشى. سيؤدي ذلك إلى تقليل حجم الفيديو وتحسين اكتساب الفيديو.
  4. التقط صورة أو مقطع فيديو قصيرا لمسطرة عادية قبل كل جلسة. سيتم استخدام عدد وحدات البكسل لكل سنتيمتر لاحقا في "نافذة الإعدادات" لمعايرة مقاطع الفيديو.
  5. ابدأ اقتناء الفيديو ، وضع الحيوان على حافة الممشى عن طريق الإمساك بقاعدة الذيل لتجنب الإصابات. تأكد من تحرك الحيوانات للأمام إلى الحافة القصوى للمنصة. قم بإجراء تسجيلات الفيديو باستخدام 100 إطار / ثانية على الأقل لضمان انتقالات مشية سلسة.
    1. إذا لزم الأمر ، حفز الحيوانات على التحرك عن طريق النقر برفق على جدار الممشى أو التقاط / تصفيق الأصابع. ومع ذلك ، تجنب الدفع الجسدي ، لأن هذا قد يؤثر على النتائج.
    2. احفظ مقاطع الفيديو مباشرة كتسلسلات صور بتنسيق TIFF (مع ضغط LZW) أو JPEG أو PNG. في حالة تسجيل الكاميرا كملف MOV خام ، قم بتحويل مقاطع الفيديو إلى تسلسلات صور عن طريق فتح الملف في ImageJ / FIJI24 والنقر فوق File > Save as > Image sequence (أو باستخدام برامج أخرى ، مثل LosslessCut25).
      ملاحظة: تبدأ معظم الحيوانات في المشي فور وضعها في الممشى. لذلك ، يوصى ببدء اقتناء الفيديو قبل وضع الحيوان.

3. إعداد مقاطع الفيديو لبرنامج تتبع MW

  1. فيلم ما يكفي من أشواط كاملة من كل الماوس الفردية. يجب تحديد عدد الحيوانات المراد تصويرها لكل حالة وعدد مرات التشغيل الكاملة وفقا لكل تصميم تجريبي. الجري الكامل هو عندما يمشي الماوس على مسافة 50 سم كاملة من الممشى دون توقف طويل (في هذه التجربة ، تم اختيار ثلاثة أشواط كاملة).
    ملاحظة: اعتمادا على برنامج الحصول على الصور ، قد تحتاج مقاطع الفيديو إلى اقتصاصها إلى أصغر عائد استثمار. سيؤدي ذلك إلى زيادة سرعة التتبع وتوليد المخرجات.
  2. في ImageJ/FIJI24، حدد الإطارات التي يظهر فيها الماوس على الشاشة بالنقر فوق Image > Stack > Tools > Make a substack. يتطلب التتبع على MW أن يكون الرأس والذيل مرئيين في جميع الإطارات. ومع ذلك ، من الممكن إنشاء عدة مكدسات فرعية من تسجيل فيديو واحد ، والذي سيمثل لاحقا كل تشغيل.
  3. احفظ كل مكدس فرعي على حدة في مجلدات مختلفة بالنقر فوق ملف > حفظ باسم تسلسل صورة >. يقوم برنامج MW لاحقا بإنشاء مجلد فرعي تلقائيا في كل دليل في كل مرة يبدأ فيها المرء في تحليل التشغيل.

4. التتبع

  1. افتح MATLAB ، وأضف المجلد الذي يحتوي على البرنامج النصي MW إلى دليل العمل ، وقم بتشغيل "MouseWalker.m" في سطر الأوامر الرئيسي.
    ملاحظة: يسمح استخدام برنامج MW ضمن MATLAB بتتبع رسائل الخطأ ليتم عرضها على وحدة التحكم الرئيسية في MATLAB وتحديد بيانات الإخراج المطلوبة (عن طريق فتح ملف البرنامج النصي الرئيسي "MouseEvaluate.m" وتغيير المخرجات إلى 1 أو 0: ملف Excel ، ومخططات الخطوات ، وآثار الموقف ، وأنماط المشي).
  2. قم بتحميل مجلد الفيديو ك "دليل الإدخال". يمكن للمرء أيضا اختيار مجلد الإخراج ؛ ومع ذلك ، هذا ليس شرطا لأن برنامج MW ينشئ مجلدا جديدا يسمى "النتائج" تلقائيا داخل "دليل الإدخال".
  3. باستخدام الأسهم "<<" و "<" و ">>" و ">" تحقق مما إذا كانت إطارات الفيديو قد تم تحميلها بشكل صحيح داخل برنامج MW.
  4. انتقل إلى "نافذة الإعدادات" حيث توجد جميع معلمات المعايرة والعتبة. يمكن أن تتغير هذه الإعدادات اعتمادا على كثافة البكسل للخلفية وآثار الأقدام ، بالإضافة إلى الحد الأدنى لحجم الجسم وآثار الأقدام ، من بين عوامل أخرى (انظر المثال في الشكل التكميلي 2). اختبر تأثير تغيير بعض المعلمات بالنقر فوق الزر معاينة .
    1. استخدم أنماط الرسم المختلفة ، بما في ذلك "الجسم + الأقدام + الذيل" و "الجسم فقط" و "الأقدام فقط" و "الذيل فقط" ، للمساعدة في تمييز أجزاء الجسم بعد ضبط معلمات العتبة.
    2. استفد من الأدوات الموجودة على اللوحة اليمنى لأخذ قياسات السطوع أو الحجم (باستخدام زري "السطوع" و "المسطرة" ، على التوالي). يمكن حفظ جميع الإعدادات على أنها "افتراضية" طالما ظلت مسافة الكاميرا كما هي.
  5. بعد ضبط معلمات الحد الأدنى ، تحقق من أن الفيديو جاهز للتتبع التلقائي. انتقل إلى الإطار الأول ، وانقر فوق تلقائي لبدء التتبع. يمكن اتباع هذه الخطوة في الوقت الفعلي ، وتستغرق بضع دقائق ، اعتمادا على حجم الفيديو وأداء الكمبيوتر.
    1. إذا قام التتبع التلقائي بتسمية ميزات الجسم بشكل غير صحيح ، فقم بإلغاء التتبع التلقائي ، وأدخل إعدادات جديدة ، وأعد تشغيل العملية.
  6. بعد اكتمال التتبع ، تحقق مما إذا كانت هناك حاجة إلى تصحيح يدوي. للتصحيح ، استخدم اللوحة الوسطى لتحديد أو إلغاء تحديد ، والإشارة إلى موقع آثار أقدام مخلب الجبهة اليمنى (RF) ، والخلف الأيمن (RH) ، والجبهة اليسرى (LF) ، والخلفية اليسرى (LH) ، والرأس والأنف والجسم (مقسمة إلى جزأين) ، ومواضع الذيل (مقسمة إلى أربعة أجزاء). احفظ التغييرات بالضغط على الزر حفظ .
    ملاحظة: تحتوي جميع الأزرار ومعظم الأوامر على اختصار مفتاح (راجع الدليل المرتبط للحصول على التفاصيل23). لتسهيل تمرير الفيديو وتنفيذ اختصارات لوحة المفاتيح ، يمكن استخدام وحدة تحكم في الأجهزة بأزرار قابلة للبرمجة وعجلة مكوك مثل Contour ShuttlePro V2.
  7. انقر فوق تقييم لإنشاء ملفات الإخراج من الفيديو المتعقب. اعتمادا على الإخراج المطلوب المحدد (انظر الخطوة 4.1) ، يمكن أن تستغرق هذه الخطوة بضع دقائق.
  8. تحقق من حفظ جميع مخططات بيانات الإخراج الرسومية في مجلد "النتائج". تحقق من دقة التتبع من خلال فحص بعض المخرجات الرسومية ، مثل "آثار الموقف" ، حيث يمكن للمرء التحقق مما إذا كانت جميع مواضع الكفوف متسقة.
    1. إذا تم تحديد خطأ ، فقم بتصحيح التتبع يدويا (إن أمكن ؛ وإلا ، فقم بإزالة مجلد "النتائج" ، وقم بإجراء التتبع التلقائي مرة أخرى بإعدادات جديدة) ، وانقر فوق الأمر تقييم مرة أخرى.
  9. تحقق من حفظ جميع القياسات الكمية التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج MW في جدول بيانات Excel وتلخيصها في "1. Info_Sheet". تأكد من تطابق خيارات Excel لترسيمات الصيغة مع البرنامج النصي. يجب أن يكون الفاصل العشري "،" ، ويجب أن يكون الفواصل الألف "؛".
  10. استخدم البرنامج النصي "MouseMultiEvaluate.m" لتجميع القياسات من جميع عمليات التشغيل في ملف جديد للتحليل.
    1. للبدء ، قم بإنشاء ملف .txt يحتوي على مسارات المجلد لجميع مقاطع الفيديو (مثل "ملفات الفيديو.txt"). تأكد من أن كل سطر يتوافق مع مقطع فيديو واحد.
    2. ثم اكتب "MouseMultiEvaluate ('Videofiles.txt')" في سطر الأوامر. سيتم إنشاء ملف Excel باسم "ResultSummary.xls" في دليل العمل (انظر مثالا في مستودع GitHub).
      ملاحظة: يمثل الشكل 2 المخرجات الرسومية التي تم الحصول عليها بواسطة برنامج MW من مقاطع الفيديو الخاصة بحيوان مسجل واحد.

5. سير عمل تحليل البيانات الحركية

  1. قم بتحرير ورقة Excel التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.10 ، والتي تحتوي على بيانات المعالجة باستخدام نصوص Python النصية المتوفرة ، وفقا للمتطلبات الأساسية التالية.
    1. في رأس العمود الأول، حدد الشرط التجريبي. قم بتسمية كل سطر بعد اسم المجموعة / الشرط (يجب أن يكون للأفراد من نفس المجموعات نفس الاسم). يجب أن تكون المجموعة الأولى هي عنصر التحكم أو خط الأساس (هذا إلزامي فقط لرسم خريطة التمثيل اللوني ، الخطوة 5.6).
    2. في العمود الثاني، حدد معرف الحيوان. هذا إلزامي ، على الرغم من أن هذه المعلومات لن تستخدم لإنشاء المؤامرة.
    3. في العمود الثالث فصاعدا ، اختر معلمات المحرك التي سيتم استخدامها للتحليل. تأكد من أن السطر الأول هو اسم المعلمة (ستظهر هذه الأسماء لاحقا في المؤامرات).
  2. افتح Anaconda Navigator ، وقم بتنفيذ Spyder لفتح نصوص Python النصية المتوفرة.
    ملاحظة: تم تطوير جميع البرامج النصية باستخدام Python 3.9.13 ، وتم تنفيذها باستخدام Spyder 5.2.2 في Anaconda Navigator 2.1.4 ، وهي متوفرة في جدول المواد ومستودع GitHub (حيث يتم تضمين مواد إضافية ، مثل مثال فيديو وملف مثال Excel ومستند الأسئلة الشائعة). من الممكن تنفيذ البرامج النصية خارج Anaconda Navigator ؛ ومع ذلك ، فإن واجهة المستخدم الرسومية هذه أكثر سهولة في الاستخدام.
  3. استخدم "Rawdata_PlotGenerator.py" لإنشاء مخططات البيانات الأولية. سيسمح ذلك بتصور كل معلمة كدالة للسرعة.
    1. افتح "Rawdata_PlotGenerator.py" في Spyder ، وقم بتشغيل الكود بالنقر فوق الزر "تشغيل ".
    2. حدد ملف Excel لتحليله واسم الورقة في النافذة التلقائية. إذا لم يتم تغيير اسم الورقة ، فاكتب "الورقة 1".
    3. ستظهر مخططات البيانات الأولية في وحدة تحكم قطعة الأرض (اللوحة اليمنى العليا). لحفظ المؤامرات ، انقر فوق الزر حفظ الصورة أو حفظ جميع الصور في وحدة التحكم في قطعة الأرض.
  4. استخدم البرنامج النصي "Residuals_DataAnalysis" لحساب المخلفات لتحليل البيانات. سيقوم هذا البرنامج النصي بإنشاء ملف CSV مع حسابات المخلفات لجميع معلمات المحرك.
    ملاحظة: تختلف العديد من معلمات المشي المقاسة المستخرجة بواسطة MW باختلاف السرعة (على سبيل المثال ، سرعة التأرجح ، وطول الخطوة ، ومدة الموقف ، واستقامة الموقف ، ومؤشرات المشي). لذلك ، يوصى بإجراء نموذج الانحدار الأنسب لكل معلمة فردية مقابل السرعة لتجربة خط الأساس ثم تحديد القيم المتبقية لكل مجموعة تجريبية فيما يتعلق بنموذج الانحدار هذا. ثم يتم التعبير عن البيانات على أنها الفرق من الخط الطبيعي المتبقي26.
    1. افتح "Residuals_DataAnalysis.py" في Spyder ، وقم بتشغيل الكود بالنقر فوق الزر "تشغيل ".
    2. حدد ملف Excel لتحليله واسم الورقة في النافذة التلقائية. إذا لم يتم تغيير اسم الورقة ، فاكتب "الورقة 1".
    3. احفظ ملف CSV في نفس مجلد البيانات. من الضروري أن يكون عنصر التحكم (أو الأساس) هو المجموعة الأولى في ملف Excel.
  5. استخدم البرنامج النصي "PCA_PlotGenerator.py" لإجراء تحليل مكون رئيسي (PCA).
    ملاحظة: يتم استخدام طريقة تقليل الأبعاد غير الخاضعة للإشراف هذه لتوليد تمثيل أكثر إيجازا27،28،29 من البيانات (الشكل 3 أ ، ب). يتضمن البرنامج النصي PCA الخطوات التالية. تتم معالجة البيانات أولا مسبقا عن طريق التوسيط والقياس ، وبعد ذلك تقوم خوارزمية PCA بحساب مصفوفة التغاير لتحديد الارتباطات بين المتغيرات وحساب المتجهات الذاتية والقيم الذاتية لمصفوفة التغاير لتحديد المكونات الرئيسية. يتم اختيار أول مكونين أو ثلاثة مكونات رئيسية لتمثيل البيانات في مؤامرات 2D أو 3D ، على التوالي. تتوافق كل نقطة في المؤامرات مع وتمثل متغيرا مجردا مختلفا. تستخدم النقاط المرمزة بالألوان لتمييز المجموعات المحددة. على هذا النحو ، تعكس مجموعات النقاط أنماط المشي المتشابهة التي يشاركها الأفراد المقابلون.
    1. افتح "PCA_PlotGenerator.py" في Spyder ، وقم بتشغيل الكود بالنقر فوق الزر "تشغيل ".
    2. حدد ملف Excel لتحليله واسم الورقة في النافذة التلقائية. إذا لم يتم تغيير اسم الورقة ، فاكتب "الورقة 1".
    3. تأكد من ظهور مؤامرات PCA 2D و 3D في وحدة التحكم في قطعة الأرض (اللوحة العلوية اليمنى). يمثل كل لون مجموعة مختلفة ، وتظهر وسيلة الإيضاح بجوار المؤامرة. لحفظ قطعة الأرض ، انقر فوق حفظ الصورة في وحدة التحكم في المؤامرة.
  6. استخدم "Heatmap_PlotGenerator.py" لإنشاء خريطة حرارية. تأكد من أن مولد خريطة الحرارة ينشئ جدولا يوضح الاختلافات الإحصائية بين مجموعة خط الأساس (أو المجموعة الضابطة) والمجموعات الأخرى لكل معلمة محرك27 (الشكل 4). يصور كل عمود مجموعة واحدة ، ويرتبط كل سطر بمعلمة محرك محددة.
    ملاحظة: تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق (للتوزيعات الطبيعية) أو اختبار Kruskal-Wallis ANOVA متبوعا باختبار Dunn اللاحق (للتوزيعات غير الطبيعية). تم استبعاد القيم المتطرفة من التحليل. يتم تمثيل قيم P برمز لون ، مع ظلال حمراء وزرقاء تشير إلى زيادة أو نقصان بالنسبة إلى التحكم (أو خط الأساس) ، على التوالي. يمثل ظل اللون الدلالة الإحصائية ، حيث تظهر الألوان الداكنة أهمية أعلى ، وتظهر الألوان الفاتحة أهمية أقل. يتوافق مع P < 0.001 ؛ ** يتوافق مع P < 0.01 ؛ و * يتوافق مع P < 0.05. يشير اللون الأبيض إلى عدم وجود اختلاف.
    1. افتح "Heatmap_PlotGenerator.py" في Spyder ، وقم بتشغيل الكود بالنقر فوق الزر "تشغيل ".
    2. حدد ملف Excel لتحليله واسم الورقة في النافذة التلقائية. إذا لم يتم تغيير اسم الورقة ، فاكتب "الورقة 1".
    3. حدد نوع البيانات في النافذة التلقائية الثانية: البيانات الأولية أو البيانات المتبقية. إذا لم يتم تحديد خيار، فإن البيانات المتبقية هي الافتراضية.
    4. ستظهر خريطة التمثيل اللوني في وحدة التحكم في قطعة الأرض (اللوحة العلوية اليمنى). لحفظ قطعة الأرض ، انقر فوق حفظ الصورة في وحدة التحكم في المؤامرة.
      ملاحظة: من الضروري أن يكون عنصر التحكم (أو الأساس) هو المجموعة الأولى في ملف Excel.
  7. استخدم "Boxplots_PlotGenerator.py" لإنشاء مخططات الصندوق. ستسمح هذه الأداة بإنشاء مخططات صندوقية تمثل توزيع القيم لجميع المعلمات الحركية لكل مجموعة (الشكل 5 والشكل 6 والشكل 7).
    ملاحظة: يحتوي كل صندوق على الوسيط كخط وسط، وتمثل الحواف السفلية والعلوية للمربعات الربعين 25٪ و75٪ على التوالي. تمثل الشعيرات نطاق مجموعة البيانات الكاملة ، باستثناء القيم المتطرفة. يتم تعريف القيم المتطرفة على أنها أي قيمة تبلغ 1.5 ضعف النطاق الربيعي أقل أو أعلى من الربعين 25٪ و 75٪ ، على التوالي.
    1. افتح "Boxplots_PlotGenerator.py" في Spyder ، وقم بتشغيل الكود بالنقر فوق الزر "تشغيل ".
    2. حدد ملف Excel لتحليله واسم الورقة في النافذة التلقائية. إذا لم يتم تغيير اسم الورقة ، فاكتب "الورقة 1".
    3. حدد نوع البيانات في النافذة التلقائية الثانية: البيانات الأولية أو البيانات المتبقية. إذا لم يتم تحديد خيار، فإن البيانات المتبقية هي الافتراضية.
    4. ستظهر مخططات المربعات في وحدة تحكم قطعة الأرض (اللوحة العلوية اليمنى). لحفظ المؤامرات ، انقر فوق الزر حفظ الصورة أو حفظ جميع الصور في وحدة التحكم في قطعة الأرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف نظام BMS القياسي العجز الحركي الإجمالي بعد SCI14. نظرا لطبيعتها الذاتية ، يتم إجراء فحوصات كمية أخرى بشكل عام جنبا إلى جنب مع BMS لإنتاج تقييم أكثر تفصيلا ودقة للحركة. ومع ذلك ، تفشل هذه الاختبارات في إظهار معلومات محددة حول دورات الخطوة ، وأنماط الخطوة ، والتنسيق بين الأطراف الأمامية والخلفية ، وهو أمر مهم للغاية في فهم كيفية حفاظ الدوائر الشوكية على وظيفتها وتكيفها مع اصابات النخاع الشوكي غير المكتملة. يوضح هذا القسم كيف يمكن أن يساعد صندوق أدوات MW في مراقبة استعادة الوظيفة الحركية بعد اصابات النخاع الشوكي وإضافة المعلومات ذات الصلة حول سلوك المشي.

تم تقسيم عينة الدراسة إلى مجموعتين من إناث الفئران C57Bl / 6J التي تتراوح أعمارها بين 9 أسابيع: مجموعة تجريبية من اصابات النخاع الشوكي (ن = 11) ، حيث خضعت الحيوانات لاستئصال الصفيحة الفقرية تليها إصابة كدمة معتدلة إلى شديدة على مستوى العمود الفقري T9 / T10 باستخدام Infinite Horizon Impactor (انظر جدول المواد) ؛ مجموعة تجريبية من SCI (ن = 11) ، حيث خضعت الحيوانات لاستئصال الصفيحة الفقرية تليها إصابة كدمة معتدلة إلى شديدة على مستوى العمود الفقري T9 / T10 باستخدام Infinite Horizon Impactor (انظر جدول المواد) ؛ مجموعة تجريبية من SCI (ن = 11) ، حيث خضعت الحيوانات لاستئصال الصفيحة الفقرية تليها إصابة كدمة معتدلة إلى شديدة على مستوى العمود الفقري T9 / T10 باستخدام Infinite Horizon Impactor (انظر جدول المواد) ؛ مجموعة تجريبية من SCI (ن = 11) ، حيث خضعت الحيوانات لاستئصال الصفيحة الفقرية تليها إصابة كدمة معتدلة إلى شديدة على مستوى العمود الفقري T9 / T10 باستخدام Infinite Horizon Impactor (انظر جدول المواد) ؛ مجموعة تجريبية من ومجموعة تحكم مصابة بجرح وهمي (ن = 10) ، حيث تم إجراء استئصال الصفيحة الفقرية فقط على نفس مستوى العمود (الشكل 1 ، الخطوة 1). تم رصد السلوك الحركي لإصابات النخاع الشوكي والحيوانات المصابة بالخداع لمدة 30 يوما. تم إجراء اختبار MW في يوم التعود قبل الجراحة (خط الأساس) و 15 يوما و 22 يوما و 30 يوما بعد الإصابة (نقطة في البوصة) (الشكل 1 ، الخطوة 2). من أجل المقارنة ، خضعت الفئران لاختبار BMS بالتوازي قبل الجراحة وعند 1 نقطة في البوصة و 3 نقطة في البوصة و 7 نقطة في البوصة و 14 نقطة في البوصة و 21 نقطة في البوصة و 30 نقطة في البوصة (الشكل التكميلي 3). بعد تتبع جميع مقاطع الفيديو التي تم الحصول عليها باستخدام MW ، تم إنشاء نوعين من ملفات الإخراج: مخرجات رسومية ، تظهر تمثيلات مرئية للعديد من المعلمات بعد كل تشغيل ، ومخرجات حركية ، تلخص جميع معلمات المحرك القابلة للقياس (الشكل 1 ، الخطوة 3 والخطوة 4).

وبالتالي ، باستخدام مجموعة من نصوص Python النصية (انظر جدول المواد ورابط مستودع GitHub) ، تم الحصول على مخططات البيانات الأولية (الشكل 1 ، الخطوة 5). نظرا لأن معظم المعلمات تتأثر بسرعة الحيوان ، فقد تم إجراء نموذج الانحدار لمجموعة خط الأساس قبل الإصابة مع القيم المتبقية المقاسة لكل حالة (الشكل 1 ، الخطوة 6). للتحقق من الملامح الحركية والاختلافات ذات الدلالة النظرية بين المجموعة الضابطة (الوهمية) والمجموعات التجريبية (SCI) ، خضعت جميع المعلمات الحركية (إجمالي 79) لتحليل مكون رئيسي ثلاثي الترتيب (PCA) ، وتم إنشاء خريطة حرارية مع مجموعة من المعلمات الحركية التي وصفت مجموعة البيانات بشكل أفضل (إجمالي 33) (الشكل 1 ، الخطوة 7 أ ، ب). أخيرا ، تمت مقارنة المعلمات الحركية المحددة التي تأثرت بعد اصابات النخاع الشوكي بخط الأساس قبل الإصابة (الشكل 1 ، الخطوة 7 ج).

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لسير عمل التحليل الخاص ب MW. (1) يتم اختيار الحيوانات لاستئصال الصفيحة الفقرية (مجموعة التحكم الوهمية) أو استئصال الصفيحة الفقرية تليها إصابة الحبل الشوكي (مجموعة تجريبية). (2) ثم تخضع الحيوانات لفحص سلوكي في اليوم السابق للإصابة وفي الأيام 15 و 22 و 30 بعد الإصابة. (3) يولد MW نوعين من بيانات المخرجات: (أ) تصورات رسومية للعديد من المعلمات ، مثل آثار الموقف ، والمشي ، وأنماط الخطوات ، و (ب) ملخص حركي لجميع معلمات المحرك القابلة للقياس. (4) يتم تجميع جميع بيانات التحكم والبيانات التجريبية في ملف واحد باستخدام البرنامج النصي "MouseMultiEvaluate.m" على MATLAB. (5) ينشئ البرنامج النصي "RawData_PlotGenerator" ل Python تمثيلا مرئيا لكيفية اختلاف جميع معلمات المحرك القابلة للقياس وفقا للسرعة. إذا كانت المعلمات لا ترتبط بالسرعة ، فيمكن للمرء أن ينتقل إلى (7) ؛ ومع ذلك ، نظرا لأن معظم المعلمات بعد SCI تعتمد بشدة على السرعة ، يجب إنشاء نموذج (6) باستخدام البرنامج النصي "Residual_DataAnalysis" ل Python. بعد توليد القيم المتبقية لكل معلمة محرك ، يتم إجراء تحليل البيانات (7): (أ) يتم إجراء تحليل للمكون الرئيسي (PCA) باستخدام مجموعة مختارة من المعلمات بخط "PCA_PlotGenerator" ؛ (ب) توضع خريطة حرارية بخط "Heatmap_PlotGenerator" لبيان الفروق ذات الدلالة الإحصائية بين الظروف لمختلف البارامترات؛ ج) يتم تقييم العديد من المعلمات الفردية التي يتم تغييرها بعد SCI باستخدام البرنامج النصي "BoxPlot_PlotGenerator". تتوفر جميع البرامج النصية في جدول المواد ورابط مستودع GitHub. تظهر النصوص باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

من بيانات الإخراج الرسومية التي تم جمعها من MW ، كان من الممكن تأكيد التغيير المفاجئ المعروف في العرض المرئي لآثار الأقدام بعد اصابات النخاع الشوكي. في اختبار "الحبر الرقمي" الناتج عن MW ، تم اكتشاف نقص في دعم backpaws (الشكل 2A) ، جنبا إلى جنب مع انخفاض في مساحة البصمة لكل من المؤخرة اليسرى واليمنى (الشكل 2B) ، والتي تم الحفاظ عليها من 15 نقطة في البوصة فصاعدا (البيانات غير معروضة). بالإضافة إلى ذلك ، في كل دورة خطوة ، يحسب MW المعلمات المتعلقة بمرحلة الوقوف (أي الوقت بين هبوط المخلب وقبل الإقلاع) ومرحلة التأرجح (أي الوقت الذي يكون فيه الطرف بعيدا عن الأرض). على هذا النحو ، يمكن ل MW إنشاء "آثار وقفة" مرئية ، والتي تأخذ في الاعتبار موضع مركز الجسم ومحوره فيما يتعلق بكل ساق ومركز بصمتها خلال مراحل الوقوف23. أظهرت آثار الموقف الإجمالية التي تم الحصول عليها لكل العديد من الميزات الفريدة (الشكل 2C). أظهرت هذه البيانات أنه بعد اصابات النخاع الشوكي ، كان للمخالب الخلفية آثار موقف أقصر وموضع مخلب عشوائي أكثر عند كل من الهبوط والإقلاع من 15 نقطة في البوصة فصاعدا (الشكل 2C).

Figure 2
الشكل 2: مخرجات رسومية تمثيلية تم الحصول عليها بواسطة برنامج MW من مقاطع فيديو التتبع. (أ) مطبوعات "بالحبر الرقمي" لحيوان اصابات النخاع الشوكي تظهر كل مخلب بلون مختلف: الأحمر (الجبهة اليمنى) والأصفر (الجبهة اليسرى) والأخضر (الخلف الأيمن) والأزرق (الخلف الأيسر) في عدة نقاط زمنية. (B) آثار أقدام للمقدمة اليسرى (LF) والخلفية اليسرى (LH) والجبهة اليمنى (RF) والخلفية اليمنى (RH) لحيوان اصابات النخاع الشوكي عند 15 نقطة في البوصة. (ج) "آثار الموقف" لحيوان اصابات النخاع الشوكي في عدة نقاط زمنية. يتم توضيح AEP و PEP لأحد الأرجل في اللوحة الأولى. يتوافق "تجميع البصمة" لكل من AEP و PEP مع الانحراف المعياري لمتوسط إحداثيات AEP أو PEP في كل فيديو. المختصرات: نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة؛ سم = سنتيمتر ؛ px = بكسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد ذلك ، تم تحليل المخرجات الحركية بعد حسابها بواسطة MW (الشكل 3 والشكل 4). للحصول على تصوير أكثر إيجازا لمجموعة البيانات واختبار ما إذا كانت المعلمات الحركية الحركية التي تم الحصول عليها من MW كافية لتصوير العجز الحركي الموجود في اصابات النخاع الشوكي عبر الزمن ، تم إجراء PCA27. بشكل ملحوظ ، يمكن تفسير 40٪ من التباين في البيانات في المكون الأول (PC1: 40.1٪) ، والذي فصل مجموعة الحيوانات التي لديها اصابات النخاع الشوكي عن الباقي ، مع قيمة p أقل من 0.001 بناء على اختبار ANOVA أحادي الاتجاه (الشكل 3A ، B) في جميع النقاط الزمنية (15 نقطة في البوصة ، 22 نقطة في البوصة ، و 30 نقطة في البوصة). كانت هناك أيضا مساهمة ضعيفة من المكونات الأخرى (PC2: 11٪ و PC3: 8.6٪). ويوضح الشكل التكميلي 4 الوزن المخصص لكل مساهمة معلمة حركية لكل مكون. علاوة على ذلك ، لم يكن التباين في مجموعة البيانات كافيا لعكس الاختلافات عبر الوقت (أي بين 15 نقطة في البوصة و 22 نقطة في البوصة و 30 نقطة في البوصة) ، مما يكرر الهضبة الموصوفة سابقا للانتعاش الحركي14. إجمالا ، تشير هذه النتائج إلى أن المعلمات الحركية التي تم الحصول عليها من MW تصف بقوة العجز الحركي الذي لوحظ بعد SCI عبر جميع النقاط الزمنية.

Figure 3
الشكل 3: تحليل المكون الرئيسي لجميع المعلمات الحركية الحركية (79) التي تم الحصول عليها بواسطة برنامج MW بعد تحليل البيانات المتبقية. (أ) تصور ثلاثي الأبعاد لتحليل PCA المكون من ثلاثة مكونات. (ب) تصور 2D مع دوائر تمثل 50٪ من البيانات التي تم جمعها. في PC1 ، الذي أوضح أكثر من 40٪ من التباين ، كانت مجموعة SCI عند 15 نقطة في البوصة و 22 نقطة في البوصة و 30 نقطة في البوصة مختلفة بشكل كبير عن المجموعة الوهمية وخط الأساس (قبل الإصابة) ، مع قيمة p < 0.001 ، على النحو الذي تحدده ANOVA. تمثل كل نقطة أو مثلث صغير فردي متوسط ثلاثة مقاطع فيديو لكل ، بينما تمثل النقاط أو المثلثات الأكبر متوسط النقطة (n = 10-11 لكل شرط ، n = 21 لمجموعة خط الأساس). يشار إلى مساهمة كل مكون في كل محور. المختصرات: نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة؛ اصابات النخاع الشوكي = إصابة الحبل الشوكي. PC = المكون الرئيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد ذلك ، تم اختيار مجموعة من المعلمات الحركية بناء على مدى قوة وصفها لمجموعة البيانات (33 في المجموع) ، وتم إنشاء خريطة حرارية (الشكل 4). في الواقع ، أظهرت معظم المعلمات الحركية تغيرا جذريا بعد اصابات النخاع الشوكي في جميع النقاط الزمنية (15 نقطة في البوصة و 22 نقطة في البوصة و 30 نقطة في البوصة) ، بينما أظهرت عناصر التحكم الوهمية المصابة تغييرات كبيرة فقط عند 30 نقطة في البوصة. يمكن تفسير هذه التغييرات في المجموعة الوهمية بانخفاض عام في سرعة التأرجح ، ربما بسبب التعود على الاختبار ، والذي سيتم مناقشته لاحقا.

كان من الملاحظ أن اصابات النخاع الشوكي سارت أبطأ من عناصر التحكم المصابة بالخداع (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، بغض النظر عن السرعة ، عند كل من 15 نقطة في البوصة و 30 نقطة في البوصة ، أظهرت اصابات النخاع الشوكي مدة تأرجح أعلى ، ومدة وقوف أقل ، ومؤشر عامل عمل أقل ، والذي يتعلق بمدة الوقوف / فترة الخطوة23. تشير هذه النتائج إلى أن التغييرات في وضع الساق الموصوفة أعلاه هي سمة من سمات اصابات النخاع الشوكي ، كما هو موضح في النماذج الحيوانية الأخرى30،31،32 ، ولا ترتبط بالتغيرات في السرعة (الشكل 4).

وتجدر الإشارة أيضا إلى أن التزامن الأيسر والأيمن لم يتأثر ، حيث لم يلاحظ تغيير كبير في مؤشرات "الطور" للأطراف الأمامية والخلفية10,23 (الشكل 4) ، مما يشير إلى اقتران سليم بين الأطراف اليسرى واليمنى.

علاوة على ذلك ، أظهرت الفئران SCI مؤشر "استقامة الموقف" أقل (الإزاحة / طول المسار) في كل من الأطراف الأمامية والخلفية (الشكل 4). تقيس هذه المعلمة مدى خطية الآثار بالنسبة للحالة المثالية ، والتي ستكون خطا مستقيما (يتراوح من 0 إلى 1 ، مما يشير إلى وجود أثر خطي)27. لذلك ، تشير هذه النتائج إلى عدم قدرة قوية على المشي بشكل مستقيم في هذه المجموعة.

لكل مرحلة من مراحل الوقوف ، يرسم MW إعادة بناء لتذبذبات الجسم ، بدءا من هبوط المخلب - الموضع الأمامي المتطرف ، أو AEP - وينتهي قبل الإقلاع - الموضع الخلفي المتطرف ، أو PEP (انظر المثال في الشكل 2C). يقيس "تجميع البصمة" لكل من AEP و PEP الانحراف المعياري لمتوسط إحداثيات AEP أو PEP في كل فيديو. أظهرت اصابات النخاع الشوكي زيادة في تجمع البصمة الخلفية ل AEP في جميع النقاط الزمنية ، ولم يلاحظ تأثير كبير إلا للمجموعة المصابة بالشام عند 15 نقطة في البوصة (الشكل 4). يوضح هذا أن اصابات النخاع الشوكي لم تستطع وضع أطرافها الخلفية بشكل صحيح عند الهبوط بعد التأرجح. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ انخفاض في "تجميع البصمة" الأمامية ل PEP ، جنبا إلى جنب مع انخفاض في تجميع البصمة الخلفية ل PEP ، عند 30 نقطة في البوصة (الشكل 4). تتوافق هذه النتائج مع ما لوحظ في "آثار الموقف" المرسومة وتشير إلى أن موضع الكفوف الأمامية يصبح أكثر تقييدا بعد الإصابة.

أخيرا ، ووفقا للتغيرات في وضع المخلب ، كانت هناك تغييرات في استراتيجيات المشي و "الضغط" الذي أثارته الكفوف ، كما تم قياسه بمتوسط السطوع على المنطقة (الشكل 4) ، والذي سيتم مناقشته بشكل أكبر.

Figure 4
الشكل 4: مخطط خريطة حرارية يوضح مجموعة من المعلمات الحركية المتغيرة بشكل كبير مقارنة بين اصابات النخاع الشوكي والحيوانات المصابة بالوهمية بالنسبة لليوم السابق للجراحة ، كما تم الحصول عليها بواسطة MW بعد تحليل البيانات المتبقية. ن = 10-11 لكل شرط ؛ تشمل مجموعة خط الأساس جميع الحيوانات في اليوم السابق للجراحة ، ن = 21. يتم التعبير عن البيانات من خلال القيمة p بعد التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق (للتوزيعات الطبيعية) أو اختبار Dunn اللاحق (للتوزيعات غير الطبيعية). يتم تمثيل قيم P برمز لون ، مع ظلال حمراء وزرقاء تشير إلى انخفاض أو زيادة بالنسبة إلى خط الأساس ، على التوالي. يمثل ظل اللون الدلالة الإحصائية ، حيث تشير الألوان الداكنة إلى أهمية أعلى والألوان الفاتحة تشير إلى أهمية أقل ؛ ف < 0.001; ** P < 0.01; *P < 0.05. يشير اللون الأبيض إلى عدم وجود اختلاف. المختصرات: نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة؛ اصابات النخاع الشوكي = إصابة الحبل الشوكي. ق = ثانية ؛ مللي ثانية = ميلي ثانية ؛ متوسط = متوسط ؛ F = الصدارة ؛ ح = هند ؛ AEP = الموقف المتطرف الأمامي ؛ PEP = الموقف الخلفي المتطرف ؛ LF = الجبهة اليسرى ؛ LH = الخلف الأيسر ؛ RF = الجبهة اليمنى ؛ RH = الخلف الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد ذلك ، سعينا إلى فهم المعلمات الفردية التي ستكون الأفضل لوصف العجز الحركي لحيوانات اصابات النخاع الشوكي في مراحل مختلفة من الإصابة (أي 15 نقطة في البوصة و 22 نقطة في البوصة و 30 نقطة في البوصة). بدأنا بفحص معلمات دورة الخطوة التي أظهرت اختلافات بين الأطراف الأمامية والخلفية مع تقدم الأطراف الخلفية من الشلل التام إلى الوظيفة الجزئية (الشكل 5). في حين أن متوسط سرعة التأرجح زاد بشكل ملحوظ بالنسبة للأطراف الأمامية بالنسبة لخط الأساس (قبل الإصابة) ، لم تتغير سرعة تأرجح الطرف الخلفي بشكل كبير (على الرغم من وجود ميل لأن تكون أقل من خط الأساس) (الشكل 5 أ ، ب). في موازاة ذلك ، انخفض متوسط طول الخطوة للأطراف الأمامية ، مع عدم وجود تغييرات كبيرة للأطراف الخلفية (الشكل 5C ، D). ليس من المستغرب أن تظهر الفئران المصابة انخفاضا في مدة تأرجح الأطراف الأمامية وزيادة عكسية في مدة تقلبات أطرافها الخلفية عند 15 نقطة في البوصة فصاعدا (الشكل 5E ، F). مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن الأطراف الأمامية اعتمدت إيقاعا أسرع ، مع دورتين أماميتين لكل دورة للأطراف الخلفية. تم وصف نسبة الدورة 2: 1 هذه سابقا بعد تشريح اصابات النخاع الشوكي في الفئران1،33 وتوضح جانبا رئيسيا من التنسيق المعيب بين الأطراف الأمامية والخلفية ، والذي لم يتم استرداده بعد 30 نقطة في البوصة في الفئران.

Figure 5
الشكل 5: معلمات دورة الخطوة للأقدام الأمامية والخلفية في عدة نقاط زمنية قبل يوم واحد من الإصابة وعند 15 نقطة في البوصة و 22 نقطة في البوصة و 30 نقطة في البوصة في اصابات النخاع الشوكي (ن = 11). (أ ، ب) متوسط سرعة التأرجح للأقدام الأمامية والخلفية بالنسبة لخط الأساس. (ج، د) متوسط طول الخطوة من forepaws و hindpaws بالنسبة لخط الأساس. (ه، و) متوسط مدة التأرجح للأقدام الأمامية والخلفية بالنسبة لخط الأساس. في المؤامرات الصندوقية ، يتم تمثيل الوسيط بالخط الأوسط ، وتمثل الحواف السفلية والعلوية للمربعات 25٪ و 75٪ من الأرباع ، على التوالي ؛ تمثل الشعيرات نطاق مجموعة البيانات الكاملة. يتم تمثيل القيم المتطرفة بنقاط مفردة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق (للتوزيعات الطبيعية) أو اختبار Dunn اللاحق (للتوزيعات غير الطبيعية). * P < 0.05 ؛ ** P < 0.01; ف < 0.001. المختصرات: نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة؛ اصابات النخاع الشوكي = إصابة الحبل الشوكي. سم = سنتيمتر ؛ ق = ثانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

برنامج MW قادر أيضا على حساب أنماط خطوات الفئران عن طريق قياس جزء الإطارات المخصصة لمجموعة معينة من الساق ، وهذا يعمل كوكيل لوجود استراتيجيات مشي محددة. عند السرعات البطيئة ، تميل الفئران غير المصابة إلى تبني "مشية المشي" ، حيث يكون لمعظم الإطارات تأرجح أحادي الساق (بغض النظر عن موضع المخلب). عند السرعات المتوسطة ، الأكثر شيوعا على المدرج ، تتغير الفئران إلى مشية الهرولة ، حيث يكون التكوين الأكثر تمثيلا هو تأرجح الساق القطري. أخيرا ، عند السرعات العالية ، تستخدم الفئران "مشية العدو" ، مع تأرجح ثلاثة أرجل في نفس الوقت23,34. تشمل التكوينات الأخرى الأقل شيوعا مشية السرعة ، والتي يتم تمثيلها في الغالب من خلال تأرجح الساق الجانبي (إما الأرجل اليسرى أو اليمنى) ، و "المشية المقيدة / القفز" ، مع تأرجح الأطراف الخلفية أو الأمامية في وقت واحد10. ومع ذلك ، يجب على المرء أن يضع في اعتباره أنه في سياق اصابات النخاع الشوكي ، يمكن لبعض هذه التكوينات ، مثل التأرجح ثلاثي الأرجل ، أن تعكس وضع مخلب الأطراف الخلفية المعيب ، وبالتالي ، لا تتطابق بدقة مع استراتيجية مشي محددة - في هذه الحالة ، العدو. لذلك ، تم تبسيط التحليل من خلال مقارنة تكوينات الساق وحدها.

بعد إجراء التحليل المتبقي ، لوحظ أن هناك انخفاضا في انتشار التقلبات القطرية المصحوبة بانخفاض في التقلبات الفردية في جميع النقاط الزمنية (الشكل 6 أ ، ب). والأكثر إثارة للاهتمام ، كان هناك زيادة في انتشار التقلبات الجانبية (الشكل 6C). المشية التي تشبه السرعة ليست نموذجية لماوس C57BL / 6J العادي ؛ ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ بالفعل عن حدوثه بعد تشريح اصابات النخاع الشوكي في الفئران1. لم يكن هذا النمط في الطور سائدا بما يكفي لتغيير مؤشر الطور الأمامي أو الخلفي (كما هو موضح في الشكل 3) ولكنه يوضح ردود الفعل المعيبة للعمود الفقري من الأطراف الخلفية إلى الأطراف الأمامية. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك زيادة طبيعية في انتشار تقلبات الأطراف الأمامية / الخلفية (الشكل 6 د) ، ربما بسبب خطوة أخمصية غير صحيحة للأطراف الخلفية ، وزيادة في تقلبات الأرجل الثلاثة (الشكل 6E).

Figure 6
الشكل 6: متوسط الفهارس لمختلف تكوينات التأرجح المتدرجة. (أ) قطري ، (ب) مفرد ، (ج) جانبي ، (د) أمامي / خلفي ، و (ه) تأرجح ثلاثي الأرجل في عدة نقاط زمنية في اصابات النخاع الشوكي (ن = 11). في المؤامرات الصندوقية ، يتم تمثيل الوسيط بالخط الأوسط ، وتمثل الحواف السفلية والعلوية للمربعات 25٪ و 75٪ من الأرباع ، على التوالي ؛ تمثل الشعيرات نطاق مجموعة البيانات الكاملة. يتم تمثيل القيم المتطرفة بنقاط مفردة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق (للتوزيعات الطبيعية) أو اختبار Dunn اللاحق (للتوزيعات غير الطبيعية). ** P < 0.01; ف < 0.001. المختصرات: نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة؛ اصابات النخاع الشوكي = إصابة الحبل الشوكي. NA = غير قابل للتطبيق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أخيرا ، هناك قراءة أخرى يمكن استخراجها من MW وهي "الضغط" كمقياس للسطوع / المساحة. مع السرعات العالية ، تنخفض مساحة التلامس مع الأرض ، ويزداد الضغط ، لذلك تم إجراء انحدار خطي لبيانات خط الأساس ، وتم قياس القيم المتبقية لكل حالة. وقد لوحظ أن الضغط على مقدمة القدم زاد بشكل ملحوظ في جميع النقاط الزمنية ، لكن قوة هذا التأثير تميل إلى الانخفاض بمرور الوقت ، حيث أن التغيير في مقدمة القدم اليسرى فقد بالفعل أهمية إحصائية عند 30 نقطة في البوصة (الشكل 7 أ ، ج). يمكن تفسير هذا التأثير المحدد على الجانب الأيسر من خلال إصابة جانبية ، والتي كان من الممكن أن تؤثر بشكل تفضيلي على الجانب الأيمن من الحبل الشوكي في هذه الدراسة. ومع ذلك ، انخفض الضغط الذي تمارسه الكفوف الخلفية في الفئران المصابة ، كما هو متوقع ، عبر جميع النقاط الزمنية ، مع عدم وجود ميل نحو الزيادة (الشكل 7 ب ، د).

Figure 7
الشكل 7: الضغط الذي تثيره الكفوف الخلفية والأمامية في عدة نقاط زمنية في اصابات النخاع الشوكي (ن = 11). الضغط الناتج عن (أ) مقدمة القدم اليسرى ، (ب) المخلب الخلفي الأيسر ، (ج) مقدمة القدم اليمنى ، و (د) المخلب الخلفي الأيمن ، يظهر كاختلافات نسبية لخط الأساس (في اليوم السابق للإصابة). في مخططات الصناديق ، يتم تمثيل الوسيط كخط وسط ، وتمثل الحواف السفلية والعلوية للمربعات 25٪ و 75٪ أرباع ، على التوالي ؛ تمثل الشعيرات نطاق مجموعة البيانات الكاملة. يتم تمثيل القيم المتطرفة بنقاط مفردة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق (للتوزيعات الطبيعية) أو اختبار Dunn اللاحق (للتوزيعات غير الطبيعية). ** P < 0.01; ف < 0.001. المختصرات: نقطة في البوصة = أيام بعد الإصابة؛ اصابات النخاع الشوكي = إصابة الحبل الشوكي. سم = سنتيمتر ؛ px = بكسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

توضح هذه الدراسة مجتمعة قوة نظام MW لوصف كميا للضعف الحركي الناجم عن اصابات النخاع الشوكي والتي يمكن تجاهلها في بعض الأحيان بسبب قيود الاختبار الأخرى. علاوة على ذلك ، فإنه يؤكد على الانتعاش الوظيفي المحدود بلا شك بمرور الوقت في نموذج فأر الكدمة ل SCI.

الشكل التكميلي 1: مكونات أجهزة MW. (أ) ينقسم هذا الإعداد على النحو التالي: I - ممر fTIR ؛ ثانيا - قاعدة الدعم والوظائف fTIR ؛ ثالثا - جدار الممشى. IV - مرآة 45 درجة ؛ و V - الخلفية الخلفية. (B) صور مقربة لقناة Base-U والخطوط الجانبية للممشى. (ج) تصميم جدار الممشى. ( د) صورة مقربة لإعداد المرآة بزاوية 45 درجة. اختصار: سم = سنتيمتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: إطار واحد لفيديو fTIR يشار فيه إلى كثافة البكسل ومناطق المنطقة. يتم عرض كثافة البكسل للجسم والخلفية وآثار الأقدام المستخدمة لتحليل الفيديو في هذه الدراسة بين قوسين ويشار إليها باللون الأحمر ، وكلها محسنة لوضوح الصورة. يجب ضبط شدة الضوء للحصول على التمييز المناسب بين المناطق المختلفة. يشار إلى المناطق النسبية من الجسم وآثار الأقدام بخطوط صفراء متقطعة. تم الحصول على كل من المناطق وكثافة البكسل في ImageJ / FIJI. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: (أ) النتيجة الإجمالية ل BMS و (ب) النتيجة الفرعية للفئران التي تم تحليلها في هذه الدراسة (n = 10-11). تم التعبير عن جميع البيانات كمتوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي بمقاييس متكررة ثنائية الاتجاه ANOVA متبوعة باختبار Bonferroni اللاحق. ف < 0.001. اختصار: BMS = مقياس الماوس باسو. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: الوزن المخصص لكل مساهمة معلمة حركية لكل مكون. الوزن المخصص لكل معلمة محرك (79 في المجموع) بعد التحليل المتبقي ل (A) PC1 و (B) PC2 و (C) PC3 في PCA. تم رسم خط القطع عند 0.04 مللي ثانية و -0.04. الاختصارات: ms = ميلي ثانية ؛ متوسط = متوسط ؛ SD = الانحراف المعياري ؛ F = الصدارة ؛ ح = هند ؛ AEP = الموقف المتطرف الأمامي ؛ PEP = الموقف الخلفي المتطرف ؛ LF = الجبهة اليسرى ؛ LH = الخلف الأيسر ؛ RF = الجبهة اليمنى ؛ RH = الخلف الأيمن ؛ اضغط = الضغط. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، يتم توضيح إمكانات طريقة MouseWalker من خلال تحليل السلوك الحركي بعد اصابات النخاع الشوكي. يوفر رؤى جديدة حول تعديلات محددة في أنماط الخطوات والبصمة والمشي التي قد تفوتها الاختبارات القياسية الأخرى. بالإضافة إلى توفير إصدار محدث من حزمة MW ، يتم أيضا وصف أدوات تحليل البيانات باستخدام نصوص Python النصية المرفقة (انظر الخطوة 5).

نظرا لأن MW يولد مجموعة بيانات كبيرة ومجموعة من المعلمات الحركية التي تعكس عملية حركية عالية الأبعاد ، فقد تم استخدام PCA. في الواقع ، تم استخدام PCA على نطاق واسع في مجموعات البيانات الحركية الأخرى المشابهة لهذه المجموعة27،35،36 (الشكل 3). تقنية تقليل الأبعاد هذه هي طريقة بسيطة وقوية مع الحد الأدنى من الافتراضات التي تسمح بتحديد الملامح الحركية كميا وتمييزها بسرعة عن ظروف التحكم أو خط الأساس. بالإضافة إلى ذلك ، تم إنشاء خرائط حرارية لتحديد المعلمات التي كانت مختلفة إحصائيا عن خط الأساس (الشكل 4) ، والتي يمكن تحليلها لاحقا بشكل فردي (الشكل 5 والشكل 6 والشكل 7).

بعد ذلك ، تبين كيف توضح المعلمات المحددة التي يمكن استخلاصها من MW العجز الحركي القوي الذي شوهد في اصابات النخاع الشوكي ، مثل التنسيق. التنسيق هو القدرة على استخدام كل طرف بطريقة منظمة لأداء مهمة. في كثير من الأحيان ، يتم قياس التنسيق بشكل غير مباشر بعدد الأخطاء / الأحداث الإيجابية على سلم 16,17 أو الوقت المستغرق في الدوار15. بشكل واضح ، يحسب MW كلا من التباين في وضع المخلب أثناء دورة الخطوة (نمط البصمة) ومؤشر "استقامة الموقف"27. وقد تبين أن كلا المعلمتين تأثرتا بشكل كبير بالإصابة (الشكل 4).

علاوة على ذلك ، يسمح MW للمستخدم باستخراج المعلمات المتعلقة بالديناميات الزمنية. شوهد اضطراب كبير في مدة التأرجح / الوقوف في اصابات النخاع الشوكي (الشكل 4) ، ووجد أن الفئران اصابات النخاع الشوكي عوضت عن فقدان الدعم على أطرافها الخلفية عن طريق تسريع دورة خطوة الطرف الأمامي ، وبالتالي تقليل طول خطوة الطرف الأمامي ومتوسط وقت التأرجح (الشكل 5). يمكن أن يرتبط هذا التأثير بالتحول في مركز الثقل ، مما يجبر مقدمة القدم على تحمل المزيد من وزن الجسم1. وبالمثل ، يمكن أن يعزى ذلك إلى فقدان المسارات الصاعدة الطويلة النخاعية ، المسؤولة عن التفاعل التآزري بين CPGs الأمامية والخلفية1،9،32 ، مما يؤدي في النهاية إلى تفكك إيقاع الأطراف الأمامية والخلفية.

يمكن أن توضح خصائص المشي التدريجي التنظيم المعياري للشبكات الحركية 1,34. على الرغم من أن أنماط الخطوات ليست وكيلا مباشرا لاستراتيجيات المشي المعتمدة في هذه الحالة23 ، لا يزال من الممكن استخلاص بعض الملاحظات المهمة. لوحظت تغييرات مهمة في أنماط خطوات الفئران اصابات النخاع الشوكي (الشكل 6). بدأت الحيوانات المصابة في تبني تقلبات جانبية (مشية تشبه السرعة) ، وكان هناك أيضا انخفاض في التقلبات القطرية. يبدو أن هذه التعديلات مرتبطة بمحاولة تنسيق الأطراف الأمامية والخلفية ، مما يدل مرة أخرى على الانفصال بين المسارات الشوكية أسفل وفوق الإصابة ، والتي لا تتعافى1،9،32.

تم التحقق أيضا من التعافي المحدود بعد اصابات النخاع الشوكي من خلال انخفاض في قوة العضلات في الأطراف الخلفية ، كما تم قياسه بمتوسط الضغط (الشكل 7). وبالتالي ، تضطر الأطراف الأمامية إلى دعم المزيد من وزن الجسم ، مما يزيد من الضغط. في حين لم يتم تحليل العديد من المعلمات المتعلقة بديناميكيات العضلات هنا (أي تنسيق العضلات المثنية والباسطة 7,21) ، يمكن أن يوفر هذا القياس الكمي قراءة مباشرة لمقدار دعم الأطراف.

يمكن أيضا مشاركة تحليل MW هذا مع اختبار BMS القياسي ، والذي يقيس دوران الأطراف ، ووضع المخلب ، وموضع الذيل ، وأخطاء الخطوة. بشكل عام ، تحقق فئران اصابات النخاع الشوكي درجة قصوى من 4-5 ، بحد أقصى 3 نقاط فرعية ، مما يعني أنها يمكن أن تؤدي خطوات عرضية إلى متكررة ولكنها تدور في الغالب عند رفع المخلب و / أو الهبوط14 (الشكل التكميلي 2). يصبح من الواضح لماذا تم تغيير قيم AEP للمخالب الخلفية بشكل كبير في مجموعة SCI ، حيث أن الوضع غير المتوازي للأطراف أثناء مرحلة التأرجح قد يؤثر على إحداثيات المخلب. بالإضافة إلى ذلك ، في BMS ، عادة ما يتم تصنيف الجذع على أنه شديد بسبب وجود حالات أو أحداث تمنع الخطوة ، مثل المؤخرة لأسفل والقفز14. على الرغم من أنه لم يكن من الممكن تحديد سلوك المؤخرة أو الحالات التي حالت دون الدوس ، فقد تم اكتشاف خطوات مؤخرة مقيدة في MW ، مع زيادة مدة التأرجح (الشكل 5F) ، وزيادة تأرجح الساق ثلاث مرات (الشكل 6E) ، وانخفاض الضغط (الشكل 7B-D). بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت زيادة كبيرة في التقلبات الأمامية / الخلفية (الشكل 6 د). يمكن أن يكون هناك تفسيران متكاملان لهذا المظهر السلوكي. أولا ، تم قياس المشية الشبيهة بالقفز ، والتي يمكن ملاحظتها بالفعل في اختبار BMS. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا السلوك مرتبطا أيضا بعدم وجود خطوة أخمصية صحيحة في كلا الطرفين الخلفيين ، مما يؤدي إلى سحب القدم أو وضع الظهر. بشكل عام ، تدعم هذه الملاحظات الادعاء بأن استقرار الجذع قد تضرر بشدة بعد اصابات النخاع الشوكي. أخيرا ، أحد متطلبات الحصول على درجة أعلى من 5 في اختبار BMS هو التنسيق14 ، ولهذا ، يجب مراعاة ثلاثة تصاريح يمكن الوصول إليها على الأقل من قبل المقيمين أثناء الاختبار. من بين هؤلاء ، يجب تصنيف اثنين من أصل ثلاثة أو أكثر من الممرات التي يمكن الوصول إليها على أنها منسقة (أي الأطراف الأمامية والأطراف الخلفية بالتناوب). من بيانات MW ، يمكن للمرء استخراج قياسات موضوعية ، ومؤشر استقامة الموقف ، وتجميع البصمة ، والتي تحدد التنسيق بشكل مباشر بشكل مستقل عن سرعة الحيوان أو المرور الذي يمكن الوصول إليه (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس التناوب بين الأطراف بشكل موضوعي عن طريق قياس استراتيجيات الخطوة (الشكل 6). توضح هذه المعلمات بوضوح أن فئران اصابات النخاع الشوكي لا تستطيع المشي باستمرار في خطوط مستقيمة وتضيع أطرافها الخلفية.

في حين أن مجموعة أدوات MW هي استراتيجية مفيدة لدراسة العيوب الحركية بعد اصابات النخاع الشوكي ، يجب على المرء أن يفكر في بعض قيودها. أولا ، من الأهمية بمكان أن تظل متسقة مع معلمات الاستحواذ (أي موضع الكاميرا والتركيز وشدة الضوء) بحيث يتم الحفاظ على ميزات الصورة بين النقاط الزمنية. ثانيا ، لوحظ أن التكرار أدى إلى التعود ، مما أدى بدوره إلى انخفاض السرعة. ساهم هذا أيضا في زيادة سلوكيات التربية / الاستمالة والتوقف في منتصف المدى. بالنسبة للحيوانات المصابة ، كان هناك أيضا ميل للاتكاء على جدران الممشى وعدد متزايد من التوقفات في منتصف الطريق. نظرا لأن هذه السلوكيات ليست جزءا من التقييم الحركي ، فلا يجب أخذها في الاعتبار. بشكل تفضيلي ، يجب على الباحثين اختيار مقاطع الفيديو التي تمشي فيها الحيوانات باستمرار ورؤوسها تشير إلى مستقيم. لمواجهة تأثير هذه السلوكيات على نتائج هذه الدراسة ، تم تسجيل الفئران بشكل مستمر لمدة أربعة أو خمسة أشواط على الأقل وسمح لها بالركض في أي من الاتجاهين على طول الممشى. بعد ذلك ، تم اختيار أفضل ثلاثة أشواط مسجلة وتعديلها إلى نفس الاتجاه على ImageJ / FIJI24 (دوران 180 درجة). وهكذا ، تم تمثيل كل بمتوسط ثلاثة أشواط مجمعة معا لكل نقطة زمنية. يمكن أن يؤدي وجود عدد أكبر من الحيوانات لكل حالة إلى تقليل التباين المتوقع. علاوة على ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن هذا الاختبار الحركي موصى به فقط بعد تحقيق الخطوة الأخمصية ، حيث تم تصميم نظام التتبع للتقييم الحركي الدقيق. في هذه الدراسة ، لوحظ أنه قبل 15 نقطة في البوصة ، لم يكن اختبار MW مفيدا للتقييم الحركي بسبب زيادة سحب القدم ووضع أخمصي غير صحيح ، مما قد يؤثر على التتبع (البيانات غير معروضة). أخيرا ، بعض المعلمات (مثل تجميع البصمة) حساسة للغاية للاستقراء الذي تم إجراؤه بواسطة نموذج الانحدار الذي تم إنشاؤه. لذلك ، تم تعديل التعليمات البرمجية وفقا لذلك (راجع الوثائق الموجودة في البرنامج النصي في ارتباط GitHub).

بشكل عام ، تبين أن MW يمكن أن يميز بشدة اصابات النخاع الشوكي من الضوابط المصابة بالوهمية ، ويمكن أيضا مشاركة MW مع الاختبارات المعمول بها كطريقة قيمة لدراسة العيوب الحركية بعد اصابات النخاع الشوكي. علاوة على ذلك ، تبين أنه يمكن توليد المخرجات الكمية بسهولة من مجموعة بيانات MW باستخدام نصوص Python الموردة. توفر هذه الأدوات خط أنابيب تجريبي فعال لتوليد مجموعة غنية ومتنوعة من المخرجات الكمية والرسومية التي تكمل ملفات مخرجات MW الأصلية ويمكن تغييرها لتحقيق أهداف الباحث من حيث نوع التحليل والتمثيل البياني.

يعد صندوق الأدوات هذا طريقة قيمة لدراسة الأمراض الأخرى المرتبطة بالحركة أو الاختلالات الحركية ، وليس فقط تلك المتعلقة بإصابة الحبل الشوكي. أثبت Skarlatou et al.10 بالفعل أن طفرة معينة في Afadin ، وهو بروتين سقالة مهم أثناء التطور ، تسببت في نمط ظاهري شاذ في الحبل الشوكي عن طريق توليد قناتين مركزيتين. أدى هذا العيب إلى فقدان تناوب الأطراف اليمنى واليسرى وارتفاع معدل انتشار تزامن الأطراف ، وهو نموذجي لمشية القفز. أوضح Stauch et al.10 أيضا أنه يمكن تكييف هذا النوع من الأنظمة وفقا لاحتياجات المستخدم. في هذه الحالة ، تم تطبيقه لدراسة العجز السلوكي المحدد في نموذج مرض باركنسون الفئران. وبالتالي ، فإن صندوق الأدوات هذا يحتوي على مجموعة واسعة من التطبيقات في نماذج مختلفة يتوقع فيها حدوث اضطرابات حركية ويمكن دمجها مع بروتوكولات السلوك المعمول بها بالفعل في هذا المجال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

يشكر المؤلفان لورا تاكر وناتاسا لونكاريفيتش على تعليقاتهما على المخطوطة والدعم الذي قدمه مرفق القوارض التابع لمعهد الطب الجزيئي جواو لوبو أنتونيس. يريد المؤلفون الاعتراف بالدعم المالي المقدم من Prémios Santa Casa Neurociências - جائزة Melo e Castro لأبحاث إصابات الحبل الشوكي (MC-36/2020) إلى L.S. و CSM تم دعم هذا العمل من قبل Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC / BIA-COM / 0151/2020) ، iNOVA4Health (UIDB / 04462/2020 و UIDP / 04462/2020) ، و LS4FUTURE (LA / P / 0087/2020) إلى C.S.M. L.S. تم دعمه بعقد باحث رئيسي فردي من CEEC (2021.02253.CEECIND). تم دعم AFI من خلال زمالة الدكتوراه من FCT (2020.08168.BD). تم دعم A.M.M. من خلال زمالة الدكتوراه من FCT (PD / BD / 128445 / 2017). تم دعم IM من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من FCT (SFRH / BPD / 118051 / 2016). تم دعم D.N.S. من خلال زمالة الدكتوراه من FCT (SFRH / BD / 138636 / 2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
45º Mirror 
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side Misumi
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side Misumi
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long Misumi
87 x 23 cm mirror General glass supplier 
black cardboard filler  General stationery supplier We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror
Background backlight
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side Misumi
multicolor LED strip General hardware supplier
white opaque paper to cover the plexyglass General stationery supplier
fTIR Support base and posts
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height Misumi
60 x 30 cm metric breadboard Edmund Optics  #54-641
M6 12 mm screws Edmund Optics 
M6 hex nuts and wahers Edmund Optics 
fTIR Walkway 
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) General hardware supplier 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side Misumi
black cardboard filler  General stationery supplier we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges
M6 12 mm screws Edmund Optics 
High speed camera (on a tripod)
Blackfly S USB3 FLIR #BFS-U3-32S4M-C This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second
Infinite Horizon Impactor 
Infinite Horizon Impactor  Precision Systems and Instrumentation, LLC. #0400
Lens
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm Nikon #1929 This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals
Software
MATLAB R2022b MathWorks
Python 3.9.13  Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4 Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5  Spyder Project Contributors
Walkway wall 
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm Any bricolage convenience store
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height Any bricolage convenience store
GitHub Materials
Folder name URL
Boxplots https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots Script to create Boxplots
Docs https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs Additional documents
Heatmap https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps Script to create heatmap
Matlat script https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script MouseWalker matlab script
PCA https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots Script to perform Principal Component Analysis
Raw data Plots https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots Script to create Raw data plots
Residual Analysis https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis Code to compute residuals from Raw data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
  2. Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
  3. Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
  4. Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
  5. Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
  6. Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
  7. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  8. Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
  9. Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
  10. Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
  11. Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
  12. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
  13. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  14. Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  15. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  16. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
  17. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  18. Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
  19. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  20. Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
  21. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  22. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  23. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
  26. Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
  27. Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
  28. Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
  29. vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
  30. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
  31. Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
  32. Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
  33. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  34. Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
  35. Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
  36. Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 193 ، MouseWalker ، السلوك ، الاختبار الحركي ، العجز الحركي ، التعافي الحركي ، إصابة الحبل الشوكي ، نموذج كدمة الماوس
استخدام MouseWalker لتحديد الخلل الحركي في نموذج فأر لإصابة الحبل الشوكي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Isidro, A. F., Medeiros, A. M.,… More

Isidro, A. F., Medeiros, A. M., Martins, I., Neves-Silva, D., Saúde, L., Mendes, C. S. Using the MouseWalker to Quantify Locomotor Dysfunction in a Mouse Model of Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (193), e65207, doi:10.3791/65207 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter