Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שימוש בהליכון עכבר לכימות תפקוד לקוי של מנוע עכבר במודל עכבר של פגיעה בחוט השדרה

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65207
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 2
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Summary

צינור ניסיוני לתיאור כמותי של דפוס הלוקומוטור של עכברים ההולכים בחופשיות באמצעות ארגז הכלים MouseWalker (MW) מסופק, החל מהקלטות וידאו ראשוניות ומעקב ועד ניתוח לאחר כימות. מודל פגיעה בחוט השדרה בעכברים משמש כדי להדגים את התועלת של מערכת MW.

Abstract

ביצוע תוכניות מוטוריות מורכבות ומתואמות מאוד, כגון הליכה וריצה, תלוי בהפעלה קצבית של מעגלים בעמוד השדרה ובמעגלים העל-שדרתיים. לאחר פגיעה בעמוד השדרה החזי, התקשורת עם מעגלים במעלה הזרם נפגעת. זה, בתורו, מוביל לאובדן קואורדינציה, עם פוטנציאל התאוששות מוגבל. לפיכך, כדי להעריך טוב יותר את מידת ההחלמה לאחר מתן תרופות או טיפולים, יש צורך בכלים חדשים, מפורטים ומדויקים יותר לכימות הליכה, תיאום גפיים והיבטים עדינים אחרים של התנהגות מוטורית במודלים של בעלי חיים של פגיעה בחוט השדרה. במהלך השנים פותחו מספר בדיקות להערכה כמותית של התנהגות הליכה חופשית במכרסמים; עם זאת, הם בדרך כלל חסרים מדידות ישירות הקשורות לאסטרטגיות הליכה צעד, דפוסי טביעת רגל וקואורדינציה. כדי להתמודד עם חסרונות אלה, מסופקת גרסה מעודכנת של MouseWalker, המשלבת מסלול הליכה מתוסכל של השתקפות פנימית כוללת (fTIR) עם תוכנת מעקב וכימות. מערכת קוד פתוח זו הותאמה לחילוץ מספר פלטים גרפיים ופרמטרים קינמטיים, ומערכת של כלים לאחר כימות יכולה להיות לנתח את נתוני הפלט שסופקו. כתב יד זה גם מדגים כיצד שיטה זו, בשילוב עם מבחנים התנהגותיים שכבר נקבעו, מתארת כמותית ליקויים מוטוריים בעקבות פגיעה בחוט השדרה.

Introduction

התיאום היעיל של ארבע גפיים אינו ייחודי לבעלי חיים מרובעים. תיאום פורלימב-גפיים אחוריות בבני אדם נותר חשוב לביצוע מספר משימות, כגון שחייה ושינויים במהירות תוך כדי הליכה1. קינמטיגפיים שונים 2 ותוכנית מוטורית 1,3,4, כמו גם מעגלי משוב פרופריוצפטיביים5, נשמרים בין בני אדם ליונקים אחרים ויש לשקול אותם בעת ניתוח אפשרויות טיפוליות להפרעות מוטוריות, כגון פגיעה בחוט השדרה (SCI)6,7,8.

על מנת ללכת, מספר קשרים בעמוד השדרה מהגפיים הקדמיות והאחוריות צריכים להיות מחווטים כראוי ומופעלים בקצב, מה שדורש קלט מהמוח ומשוב מהמערכת הסומטוסנסורית 2,9,10. קשרים אלה מגיעים לשיאם במחוללי הדפוסים המרכזיים (CPGs), הממוקמים ברמה צווארית ומותנית עבור הגפיים הקדמיות והאחוריות, בהתאמה 1,9,10. לעתים קרובות, לאחר SCI, שיבוש הקישוריות העצבית והיווצרות צלקת גלייה מעכבת12 מגבילים את התאוששות התפקוד המוטורי, כאשר התוצאות משתנות משיתוק מוחלט לתפקוד מוגבל של קבוצת גפיים בהתאם לחומרת הפציעה. כלים לכימות מדויק של תפקוד לוקומוטורי לאחר SCI הם קריטיים למעקב אחר התאוששות והערכת ההשפעות של טיפולים או התערבויות קליניות אחרות6.

המבחן המטרי הסטנדרטי עבור מודלים של קונטוזיה של עכבר SCI הוא סולם עכבר באסו (BMS)13,14, ציון לא פרמטרי הלוקח בחשבון את יציבות תא המטען, מיקום הזנב, דריכה פלנטרית וקואורדינציה בין הגפיים הקדמיות לגפיים האחוריות בזירת שדה פתוח. למרות BMS הוא אמין ביותר עבור רוב המקרים, זה דורש לפחות שני מעריכים מנוסים כדי לבחון את כל זוויות התנועה של בעלי חיים על מנת להסביר את השונות הטבעית ולהפחית הטיה.

בדיקות אחרות פותחו גם כדי להעריך את הביצועים המוטוריים לאחר SCI באופן כמותי. אלה כוללים את מבחן rotarod, אשר מודד את הזמן המושקע על גליל מסתובב15; הסולם האופקי, המודד את מספר המעקות שהוחמצו והסולם החיובי תופס16,17; ומבחן הליכת הקרן, המודד את הזמן שלוקח לבעל חיים ואת מספר הכשלים שהוא עושה בעת חציית קורה צרה18. למרות שהן משקפות שילוב של ליקויים מוטוריים, אף אחת מהבדיקות הללו אינה מייצרת מידע מוטורי ישיר על תיאום הגפיים הקדמיות-אחוריות.

כדי לנתח באופן ספציפי ויסודי יותר את התנהגות ההליכה, פותחו בדיקות אחרות כדי לשחזר מחזורי צעדים ואסטרטגיות הליכה. דוגמה אחת היא מבחן טביעת הרגל, שבו כפות הדיו של בעל חיים מציירות תבנית על גיליון נייר לבן19. למרות שהוא פשוט בביצועו, חילוץ פרמטרים קינמטיים כגון אורך צעד הוא מסורבל ולא מדויק. יתר על כן, היעדר פרמטרים דינמיים, כגון משך מחזור הצעדים או תיאום בתזמון רגליים, מגביל את יישומיו; ואכן, פרמטרים דינמיים אלה ניתן לרכוש רק על ידי ניתוח פריים אחר פריים קטעי וידאו של מכרסמים הולכים על משטח שקוף. עבור מחקרי SCI, החוקרים ניתחו התנהגות הליכה מנקודת מבט רוחבית באמצעות הליכון, כולל שחזור מחזור הצעדים ומדידת השינויים הזוויתיים של כל מפרק רגל 4,20,21. למרות שגישה זו יכולה להיות אינפורמטיבית ביותר6, היא נשארת ממוקדת בקבוצה ספציפית של גפיים וחסרה תכונות הליכה נוספות, כגון קואורדינציה.

כדי למלא את הפערים הללו, פיתחו המרס ועמיתיו מבחן כמותי המבוסס על חיישן מגע אופטי באמצעות fTIR (fTIR)22 מתוסכל. בשיטה זו, האור מתפשט דרך זכוכית באמצעות השתקפות פנימית, מתפזר בלחיצת כפות, ולבסוף נלכד על ידי מצלמה במהירות גבוהה. לאחרונה, גרסת קוד פתוח של שיטה זו, בשם MouseWalker, הפכה זמינה, וגישה זו משלבת מסלול fTIR עם חבילת תוכנת מעקב וכימות23. באמצעות שיטה זו, המשתמש יכול לחלץ קבוצה גדולה של פרמטרים כמותיים, כולל דפוסי צעד, מרחב והליכה, מיקום טביעת רגל ותיאום גפיים קדמיות-אחוריות, כמו גם פלטים חזותיים, כגון דפוסי טביעת רגל (המחקים את בדיקת כף הדיו6) או שלבי עמידה ביחס לציר הגוף. חשוב לציין, בשל אופי הקוד הפתוח שלו, ניתן לחלץ פרמטרים חדשים על ידי עדכון חבילת הסקריפט של MATLAB.

כאן, ההרכבה שפורסמה בעבר של מערכת MouseWalker23 מתעדכנת. תיאור כיצד להגדיר אותו מסופק, עם כל השלבים הנדרשים כדי להשיג את איכות הווידאו הטובה ביותר, תנאי מעקב ורכישת פרמטרים. כלים נוספים לאחר הכימות משותפים גם כדי לשפר את הניתוח של ערכת נתוני הפלט של MouseWalker (MW). לבסוף, התועלת של כלי זה מודגמת על ידי קבלת ערכים הניתנים לכימות עבור ביצועים מוטוריים כלליים, במיוחד מחזורי צעדים ותיאום גפיים קדמיות-אחוריות, בהקשר של פגיעה בחוט השדרה (SCI).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הליכי הטיפול, הניתוח והטיפול שלאחר הניתוח אושרו על ידי הוועדה הפנימית המולקולרית של המכון הרפואי (ORBEA) וועדת האתיקה הפורטוגזית לבעלי חיים (DGAV) בהתאם להנחיות הקהילה האירופית (הנחיה 2010/63/EU) והחוק הפורטוגלי לטיפול בבעלי חיים (DL 113/2013) תחת רישיון 0421/000/000/2022. נקבות עכברי C57Bl/6J בנות 9 שבועות שימשו במחקר הנוכחי. כל המאמצים נעשו כדי למזער את מספר בעלי החיים ולהפחית את סבלם של בעלי החיים ששימשו במחקר. סקריפט MATLAB והגרסה העצמאית של תוכנת MW הם קוד פתוח וזמינים ב- GitHub
מאגר (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). בעוד שתוכנת MW פותחה ב-MATLAB R2012b, היא הותאמה לפעול ב-MATLAB R2022b. איור 1 ממחיש את זרימת העבודה של ה-MW.

1. הגדרת מנגנון MouseWalker (MW)

  1. להרכיב את מנגנון MW כפי שתואר קודם לכן23, או להתאים לצרכים הספציפיים של תכנון הניסוי (ראה טבלת חומרים ואיור משלים 1 לפרטים נוספים על ההתקנה).
    הערה: ניתן להרחיב את זירת ההליכה כדי להכיל בעלי חיים גדולים יותר, כגון חולדות.
  2. ודאו שהפרספקס שבו החיות הולכות נקי וללא שריטות. השתמשו במטלית ניקוי חלקה, וצמצמו את השימוש בממסים אורגניים כגון אמוניה או אתנול בריכוזים גבוהים, העלולים לפגוע בפרספקס (מומלץ 3% מי חמצן, 7% אתנול או כל חומר חיטוי תואם ומתאים לפרספקס). במידת הצורך, החלף את הפרספקס.
  3. הגדר את המצלמה במהירות גבוהה עם עדשה מהירה וצמצם גדול (כלומר, ערכי F-stop קטנים יותר) כדי ללכוד כמות גדולה של אור, מכיוון שהדבר מסייע להקליט את אותות fTIR (ראה רשימת חומרים).
    הערה: העדשה לא אמורה ליצור עיוותים אופטיים, במיוחד בקצות התמונה. ניתן לבדוק עיוותים אופטיים על ידי הקלטת תבנית ידועה (למשל, פסים או ריבועים) ולאחר מכן מדידת גודל הבלוקים ב- ImageJ/FIJI24 (השתמש בכלי הקו ולאחר מכן לחץ על נתח > מדידה). לדוגמה, ריבוע בגודל 1 ס"מ צריך להיות בעל מידות פיקסלים זהות הן במרכז התמונה והן בקצוות. הווריאציות צריכות להיות קטנות מ-5%.
  4. האירו את פס תאורת ה-LED הצבעוני מקופסת תאורת הרקע.
  5. האירו את פס תאורת הלד הלבן מקופסת תאורת השביל.
    הערה: ניתן להשתמש גם בנורית LED צבעונית25 כדי להקל על ההבחנה בין טביעת הרגל/גוף/רקע.
  6. כאשר אורות החדר כבויים, ודא את עוצמת האור של תיבת תאורת הרקע והשביל. התאימו את העוצמה, במידת הצורך, באמצעות פוטנציומטר או פלסטיק אטום למחצה. אלה חייבים להיות ממוטבים כך שעוצמת הפיקסלים תגדל בסדר הבא: גוף החיה < רקע < טביעות רגל.
    1. כדי לבדוק את עוצמת הפיקסלים של הגוף/רקע/טביעות הרגל של החיה, פתחו את רצף התמונות ב-ImageJ/FIJI24 ולחצו על Analyze > Measure. אות טביעת הרגל לא צריך להיות רווי יתר על המידה, שכן זה ימנע את הגדרת גבולות טביעת הרגל (כלומר, בהונות וכריות כף הרגל) (איור משלים 2).
  7. התאם את ניגודיות התמונה של השביל בתוכנת הקלטת הווידאו. ניתן לכוונן את הניגודיות בשתי דרכים: על ידי עמעום או הגדלת התאורה על פס ה-LED או על ידי התאמת מפתח הצמצם של עדשת המצלמה.
  8. מקם את העדשה בצורה נכונה כך שתהיה באותו גובה ובמרכז המראה המשקפת 45° ובניצב (90°) לשביל. זה ייצור תמונה פרופורציונלית כל הזמן לאורך שביל שמאל-ימין.
    הערה: הימנע משינוי מיקום המצלמה (מרחק, גובה וכיוון) במהלך הפעלות ההקלטה המרובות. במידת הצורך, סמנו את הרצפה שבה יש להציב את החצובה. פעולה זו תשמור על תכונות התמונה.
  9. מקדו את העדשה על פני הפרספקס. ניתן לבדוק זאת באמצעות חפץ שאינו מזיק הנוגע בפני השטח של הפרספקס.
    הערה: עם ערכי עדשת F-stop נמוכים יותר, עומק השדה יקטן יותר, ובכך יקשה על המיקוד.
  10. ודא שכל ההגדרות נשארות ללא שינוי במהלך הבדיקה, מכיוון שהן עשויות לשנות את עוצמת הפיקסלים של הסרטונים המוקלטים.

2. רכישת וידאו

  1. ודאו שהעכברים מכירים את החדר ואת המכשיר לפני הבדיקה. שמור לפחות יום אחד להרגלה (יום 0). כדי להימנע מאימון מוגזם, בצעו את מבחן MW ביום שונה משאר מבחני ההתנהגות (רצוי ביום שאחרי).
  2. בתוכנת הקלטת הווידיאו, ודא שלפחות 50 ס"מ מהשביל גלוי.
  3. התאם את הגדרות ההקלטה כדי לחתוך את אזור השביל. פעולה זו תקטין את גודל הווידיאו ותייעל את רכישת הווידאו.
  4. צלם תמונה או סרטון וידאו קצר של סרגל רגיל לפני כל הפעלה. מספר הפיקסלים לסנטימטר ישמש מאוחר יותר ב"חלון ההגדרות "כדי לכייל את הסרטונים.
  5. התחל את רכישת הווידאו, והנח את בעל החיים על קצה השביל על ידי אחיזה בבסיס הזנב כדי למנוע פציעות. ודא שבעלי החיים נעים קדימה לקצה הקיצוני של הרציף. בצע את הקלטות הווידאו עם לפחות 100 פריימים לשנייה כדי להבטיח מעברי הליכה חלקים.
    1. במידת הצורך, הניעו את בעלי החיים לנוע על ידי הקשה עדינה על קיר השביל או הצמדה/מחיאת כפיים באצבעות. עם זאת, הימנע נדנוד פיזי, שכן זה עלול להשפיע על התוצאות.
    2. שמור את הסרטונים ישירות כרצפי תמונות בתבנית TIFF (עם דחיסת LZW), JPEG או PNG. במקרה שהמצלמה מקליטה כקובץ MOV גולמי, המירו את הסרטונים לרצפי תמונות על ידי פתיחת הקובץ ב- ImageJ / FIJI24 ולחיצה על קובץ > שמירה כרצף תמונה > (או באמצעות תוכנה אחרת, כגון LosslessCut25).
      הערה: רוב בעלי החיים מתחילים ללכת מיד לאחר שהוכנסו לשביל; לכן, מומלץ להתחיל את רכישת הווידאו לפני הצבת החיה.

3. הכנת הסרטונים לתוכנת המעקב MW

  1. צלם מספיק ריצות שלמות של כל עכבר בודד. מספר בעלי החיים שיש לצלם בכל מצב ומספר הריצות השלמות חייבים להיקבע בהתאם לכל תכנון ניסוי. ריצה מלאה היא כאשר העכבר הולך את כל 50 הס"מ של השביל ללא עצירות ממושכות (בניסוי זה נבחרו שלוש ריצות שלמות).
    הערה: בהתאם לתוכנה לרכישת תמונות, ייתכן שיהיה צורך לחתוך סרטונים להחזר ההשקעה הקטן ביותר. זה יגדיל את מהירות המעקב וייצור הפלט.
  2. ב- ImageJ/FIJI24, בחר את המסגרות שבהן העכבר נמצא על המסך על-ידי לחיצה על Image > Stack > Tools > Make a substack. המעקב על MW דורש את הראש ואת הזנב להיות גלוי בכל המסגרות. ניתן, עם זאת, ליצור מספר ערימות משנה מהקלטת וידאו אחת, שתייצג מאוחר יותר כל ריצה.
  3. שמור כל ערימת משנה בנפרד בתיקיות שונות על-ידי לחיצה על File > Save as > Image sequence. תוכנת MW יוצרת מאוחר יותר תיקיית משנה באופן אוטומטי בכל ספרייה בכל פעם שמתחילים לנתח ריצה.

4. מעקב

  1. פתח את MATLAB, הוסף את התיקיה המכילה את סקריפט MW לספריית העבודה והפעל את "MouseWalker.m" בשורת הפקודה הראשית.
    הערה: השימוש בתוכנת MW תחת MATLAB מאפשר להציג הודעות שגיאה עוקבות במסוף הראשי של MATLAB ולבחור את נתוני הפלט הרצויים (על ידי פתיחת קובץ הסקריפט הראשי "MouseEvaluate.m" ושינוי היציאות ל- 1 או 0: קובץ Excel, תרשימי צעד, עקבות עמידה ודפוסי הליכה).
  2. טען את תיקיית הווידאו כ"ספריית קלט". אפשר גם לבחור את תיקיית הפלט; עם זאת, זו אינה דרישה מכיוון שתוכנת MW יוצרת תיקייה חדשה בשם "תוצאות" באופן אוטומטי בתוך "ספריית הקלט".
  3. באמצעות החצים "<<", "<", ">>" ו- ">" בדוק אם מסגרות הווידאו נטענות כראוי בתוך תוכנת MW.
  4. עבור אל "חלון הגדרות" שבו נמצאים כל פרמטרי הכיול והסף. הגדרות אלה יכולות להשתנות בהתאם לעוצמת הפיקסלים של הרקע וטביעות הרגל, כמו גם לגודל המינימלי של הגוף וטביעות הרגל, בין גורמים אחרים (ראו דוגמה באיור משלים 2). בדוק את ההשפעה של שינוי פרמטרים מסוימים על ידי לחיצה על תצוגה מקדימה לחצן.
    1. השתמש בסגנונות העלילה השונים, כולל "גוף + רגליים + זנב", "גוף בלבד", "רגליים בלבד" ו"זנב בלבד", כדי לסייע בהבחנה בין חלקי גוף לאחר התאמת פרמטרי הסף.
    2. נצל את הכלים בחלונית הימנית כדי למדוד את הבהירות או הגודל (באמצעות לחצני "בהירות" ו"סרגל", בהתאמה). ניתן לשמור את כל ההגדרות כ"ברירת מחדל" כל עוד מרחק המצלמה נשאר זהה.
  5. לאחר התאמת פרמטרי הסף, בדוק שהסרטון מוכן למעקב אוטומטי. עבור למסגרת הראשונה ולחץ על אוטומטי כדי להתחיל לעקוב. ניתן לבצע שלב זה בזמן אמת, והוא אורך מספר דקות, בהתאם לגודל הווידאו וביצועי המחשב.
    1. אם המעקב האוטומטי מתייג באופן שגוי את תכונות הגוף, בטל את המעקב האוטומטי, הזן הגדרות חדשות והפעל מחדש את התהליך.
  6. לאחר השלמת המעקב, בדוק אם יש צורך בתיקון ידני. לתיקון, השתמש בחלונית האמצעית כדי לבחור או לבטל את הבחירה, וציין את המיקום של טביעות כף הרגל הימנית הקדמית (RF), האחורית הימנית (RH), השמאלית הקדמית (LF) והשמאלית האחורית (LH), הראש, האף, הגוף (מחולקים לשני מקטעים) ומיקום הזנב (מחולק לארבעה מקטעים). שמור את השינויים על-ידי לחיצה על להציל לחצן.
    הערה: כל הלחצנים ורוב הפקודות כוללים קיצור מקשים (עיין במדריך המשויך לקבלת פרטים23). כדי להקל על גלילת וידאו וביצוע קיצורי מקשים, ניתן להשתמש בבקר חומרה עם לחצנים הניתנים לתכנות וגלגל מעבורת כמו Contour ShuttlePro V2.
  7. לחץ על הערכה כדי ליצור את קבצי הפלט מהסרטון במעקב. בהתאם לפלט הרצוי שנבחר (ראה שלב 4.1), שלב זה עשוי להימשך מספר דקות.
  8. ודא שכל חלקות נתוני הפלט הגרפיות נשמרות בתיקייה "תוצאות". ודא את דיוק המעקב על ידי בחינת חלק מהיציאות הגרפיות, כגון "עקבות עמידה", שם ניתן לבדוק אם כל תנוחות הכפות עקביות.
    1. אם מזוהה שגיאה, תקן ידנית את המעקב (אם ניתן; אחרת, בטל את התיקיה "תוצאות" ובצע שוב את המעקב האוטומטי עם הגדרות חדשות) ולחץ שוב על הפקודה הערכה .
  9. בדוק שכל המדידות הכמותיות שנוצרו על ידי תוכנת MW נשמרות בגיליון אקסל ומסוכמות ב- "1. Info_Sheet". ודא שאפשרויות Excel עבור תיחום הנוסחאות תואמות לקובץ ה- Script. המפריד העשרוני חייב להיות ",", ומפרידי אלף חייב להיות ";".
  10. השתמש בסקריפט "MouseMultiEvaluate.m" כדי לרכז את המדידות מכל הריצות לקובץ חדש לניתוח.
    1. כדי להתחיל, צור קובץ .txt המכיל את נתיבי התיקיות עבור כל הסרטונים (לדוגמה, "Videofiles.txt"). ודא שכל שורה תואמת לסרטון יחיד.
    2. לאחר מכן, כתוב "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" בשורת הפקודה. קובץ Excel בשם "ResultSummary.xls" ייווצר בספריית העבודה (ראה דוגמה במאגר GitHub).
      הערה: איור 2 מייצג את התפוקות הגרפיות המתקבלות על-ידי תוכנת MW מסרטוני הווידיאו של חיה מוקלטת אחת.

5. זרימת עבודה של ניתוח נתונים קינמטיים

  1. ערוך את גיליון Excel שנוצר בשלב 4.10, המכיל את הנתונים לעיבוד באמצעות סקריפטים Python שסופקו, בהתאם לדרישות המוקדמות הבאות.
    1. בכותרת העמודה הראשונה, ציין את תנאי הניסוי. תן שם לכל שורה לאחר שם הקבוצה/תנאי (אנשים מאותן קבוצות חייבים להיות בעלי שם זהה). הקבוצה הראשונה חייבת להיות הבקרה או הבסיס (זה חובה רק עבור התוויית מפת חום, שלב 5.6).
    2. בעמודה השניה, ציין את מזהה החיה. זה חובה, אם כי מידע זה לא ישמש ליצירת העלילה.
    3. בעמודה השלישית ואילך, בחר את הפרמטרים המוטוריים שישמשו לניתוח. ודא שהשורה הראשונה היא שם הפרמטר (שמות אלה יופיעו מאוחר יותר בחלקות).
  2. פתח את Anaconda Navigator, והפעל את Spyder כדי לפתוח את סקריפטי Python שסופקו.
    הערה: כל הסקריפטים פותחו עם Python 3.9.13, בוצעו עם Spyder 5.2.2 ב- Anaconda Navigator 2.1.4, והם זמינים בטבלת החומרים ובמאגר GitHub (שם כלולים חומרים נוספים, כגון דוגמת וידאו, קובץ דוגמה של Excel ומסמך שאלות נפוצות). ניתן לבצע את הסקריפטים מחוץ לנווט אנקונדה; עם זאת, ממשק משתמש גרפי זה ידידותי יותר למשתמש.
  3. השתמש ב- "Rawdata_PlotGenerator.py" כדי ליצור את חלקות הנתונים הגולמיים. זה יאפשר הדמיה של כל פרמטר כפונקציה של מהירות.
    1. פתח את "Rawdata_PlotGenerator.py" בספיידר, והפעל את הקוד על ידי לחיצה על כפתור Play .
    2. בחר את קובץ Excel לניתוח ואת שם הגיליון בחלון האוטומטי. אם שם הגיליון לא השתנה, כתוב "גיליון1".
    3. תרשימי הנתונים הגולמיים יופיעו במסוף ההתוויית (הלוח הימני העליון). כדי לשמור את המגרשים, לחץ על שמור תמונה או שמור את כל התמונות כפתור במסוף העלילה.
  4. השתמש בסקריפט "Residuals_DataAnalysis" כדי לחשב את השאריות לניתוח נתונים. סקריפט זה ייצור קובץ CSV עם חישובי השאריות עבור כל הפרמטרים המוטוריים.
    הערה: רבים מפרמטרי ההליכה הנמדדים על ידי MW משתנים עם המהירות (למשל, מהירות נדנדה, אורך צעד, משך עמידה, ישר עמידה ומדדי הליכה). לכן, מומלץ לבצע מודל רגרסיה המתאים ביותר של כל פרמטר בודד לעומת מהירות עבור הניסוי הבסיסי ולאחר מכן לקבוע את הערכים השיוריים עבור כל קבוצת ניסוי ביחס למודל רגרסיה זה. הנתונים מבוטאים אז כהפרש מהקו השיורי המנורמל26.
    1. פתח את "Residuals_DataAnalysis.py" בספיידר והפעל את הקוד על ידי לחיצה על כפתור Play .
    2. בחר את קובץ Excel לניתוח ואת שם הגיליון בחלון האוטומטי. אם שם הגיליון לא השתנה, כתוב "גיליון1".
    3. שמור את קובץ ה- CSV באותה תיקיה שבה נמצאים הנתונים. חובה שהפקד (או תוכנית הבסיס) יהיה הקבוצה הראשונה בקובץ Excel.
  5. השתמש בסקריפט "PCA_PlotGenerator.py" כדי לבצע ניתוח רכיבים ראשי (PCA).
    הערה: שיטת הפחתת ממדיות בלתי מפוקחת זו משמשת ליצירת ייצוג תמציתי יותר של 27,28,29 מהנתונים (איור 3A, B). קובץ ה-script של PCA כולל את השלבים הבאים. הנתונים מעובדים תחילה מראש על ידי מרכוז וקנה מידה, ולאחר מכן אלגוריתם PCA מחשב את מטריצת השונות המשותפת כדי לקבוע את המתאמים בין המשתנים ולחשב את הווקטורים העצמיים והערכים העצמיים של מטריצת השונות המשותפת כדי לזהות את המרכיבים העיקריים. שניים או שלושה המרכיבים העיקריים הראשונים נבחרים לייצוג הנתונים במגרשים דו-ממדיים או תלת-ממדיים, בהתאמה. כל נקודה בחלקות מתאימה לחיה ומייצגת משתנה מופשט אחר. נקודות מקודדות בצבע משמשות להבחנה בין הקבוצות הספציפיות. ככאלה, אשכולות של נקודות משקפים דפוסי הליכה דומים המשותפים לאנשים המתאימים.
    1. פתח את "PCA_PlotGenerator.py" בספיידר, והפעל את הקוד על ידי לחיצה על כפתור Play .
    2. בחר את קובץ Excel לניתוח ואת שם הגיליון בחלון האוטומטי. אם שם הגיליון לא השתנה, כתוב "גיליון1".
    3. ודא שהתרשימים דו-ממדיים ותלת-ממדיים של PCA מופיעים במסוף ההתוויית (לוח ימני עליון). כל צבע מייצג קבוצה אחרת, והמקרא מופיע ליד העלילה. כדי לשמור את העלילה, לחץ על שמור תמונה במסוף העלילה.
  6. השתמש "Heatmap_PlotGenerator.py" כדי ליצור מפת חום. ודא שמחולל מפת החום יוצר טבלה המציגה את ההבדלים הסטטיסטיים בין קבוצת הבסיס (או קבוצת הביקורת) לבין הקבוצות האחרות עבור כל פרמטר מוטורי27 (איור 4). כל עמודה מתארת קבוצה אחת, וכל שורה מתייחסת לפרמטר מוטורי מסוים.
    הערה: ניתוח סטטיסטי נערך עם ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey (עבור התפלגויות נורמליות) או ANOVA Kruskal-Wallis ואחריו מבחן פוסט-הוק של דאן (עבור התפלגות לא נורמלית). חריגים לא נכללו בניתוח. ערכי P מיוצגים על-ידי קוד צבע, כאשר גווני אדום וכחול מציינים עלייה או ירידה ביחס לבקרה (או לקו הבסיס), בהתאמה. גוון הצבע מייצג את המובהקות הסטטיסטית, כאשר צבעים כהים יותר מציגים מובהקות גבוהה יותר, וצבעים בהירים יותר מציגים מובהקות נמוכה יותר. מתאים P < 0.001; ** מתאים ל - P < 0.01; ו- * מתאים ל - P < 0.05. לבן מציין שאין וריאציה.
    1. פתח את "Heatmap_PlotGenerator.py" בספיידר, והפעל את הקוד על ידי לחיצה על כפתור Play .
    2. בחר את קובץ Excel לניתוח ואת שם הגיליון בחלון האוטומטי. אם שם הגיליון לא השתנה, כתוב "גיליון1".
    3. בחר את סוג הנתונים בחלון האוטומטי השני: נתונים גולמיים או נתונים שיוריים. אם אפשרות לא נבחרה, נתוני השארית הם ברירת המחדל.
    4. מפת החום תופיע במסוף העלילה (פאנל ימני עליון). כדי לשמור את העלילה, לחץ על שמור תמונה במסוף העלילה.
      הערה: חובה שהפקד (או התוכנית הבסיסית) יהיה הקבוצה הראשונה בקובץ Excel.
  7. השתמש "Boxplots_PlotGenerator.py" כדי ליצור את boxplots. כלי זה יאפשר יצירת קופסאות המייצגות את התפלגות הערכים עבור כל הפרמטרים המוטוריים עבור כל קבוצה (איור 5, איור 6 ואיור 7).
    הערה: כל תיבה מכילה את החציון כקו האמצעי, והקצוות התחתונים והעליונים של התיבות מייצגים את הרבעונים 25% ו- 75%, בהתאמה. השפם מייצג את טווח הנתונים המלא, למעט חריגים. חריגים מוגדרים ככל ערך שהוא פי 1.5 מהטווח הבין-רבעוני מתחת או מעל הרבעונים 25% ו-75%, בהתאמה.
    1. פתח את "Boxplots_PlotGenerator.py" בספיידר, והפעל את הקוד על ידי לחיצה על כפתור Play .
    2. בחר את קובץ Excel לניתוח ואת שם הגיליון בחלון האוטומטי. אם שם הגיליון לא השתנה, כתוב "גיליון1".
    3. בחר את סוג הנתונים בחלון האוטומטי השני: נתונים גולמיים או נתונים שיוריים. אם אפשרות לא נבחרה, נתוני השארית הם ברירת המחדל.
    4. הקופסאות יופיעו במסוף העלילה (פאנל ימני עליון). כדי לשמור את המגרשים, לחץ על שמור תמונה או שמור את כל התמונות כפתור במסוף העלילה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מערכת BMS סטנדרטית מתארת את הגירעונות המוטוריים ברוטו לאחר SCI14. בשל אופיו הסובייקטיבי, בדיקות כמותיות אחרות מבוצעות בדרך כלל לצד BMS כדי לייצר הערכה מפורטת ועדינה יותר של תנועה. עם זאת, בדיקות אלה אינן מראות מידע ספציפי על מחזורי צעדים, דפוסי דריכה ותיאום בין הגפיים הקדמיות לגפיים האחוריות, שהוא חשוב ביותר להבנת האופן שבו מעגלי עמוד השדרה שומרים על תפקוד ומסתגלים למדע בדיוני חלקי. סעיף זה מראה כיצד ארגז הכלים של MW יכול לסייע בניטור התאוששות תפקוד המנוע לאחר SCI ולהוסיף מידע רלוונטי על התנהגות הליכה.

מדגם המחקר חולק לשתי קבוצות של נקבות עכברי C57Bl/6J בנות 9 שבועות: קבוצת ניסוי SCI (n = 11), שבה החיות עברו למינקטומיה ואחריה פגיעה בינונית עד חמורה ברמת עמוד השדרה T9/T10 באמצעות Infinite Horizon Impactor (ראה טבלת חומרים); וקבוצת ביקורת פגועת דמה (n = 10), שבה רק כריתת הלמינקטומיה בוצעה באותה רמת עמודה (איור 1, שלב 1). ההתנהגות המוטורית של SCI ובעלי חיים פגועי דמה נוטרה במשך 30 יום. בדיקת MW בוצעה ביום ההתרגלות שלפני הניתוח (נקודת ההתחלה) ו-15 יום, 22 יום ו-30 יום לאחר הפציעה (dpi) (איור 1, שלב 2). לשם השוואה, העכברים עברו את בדיקת BMS במקביל לפני הניתוח וברזולוציה של 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi ו-30 dpi (איור משלים 3). לאחר מעקב אחר כל הסרטונים שהתקבלו עם MW, נוצרו שני סוגים של קבצי פלט: פלטים גרפיים, המציגים ייצוגים חזותיים של מספר פרמטרים לאחר כל ריצה, ופלטים קינמטיים, המסכמים את כל הפרמטרים המוטוריים הניתנים למדידה (איור 1, שלב 3 ושלב 4).

כתוצאה מכך, באמצעות קבוצה של סקריפטים של Python (ראה טבלת חומרים והקישור למאגר GitHub), התקבלו תרשימי הנתונים הגולמיים (איור 1, שלב 5). מאחר שרוב הפרמטרים מושפעים ממהירות החיה, בוצע מודל רגרסיה של קבוצת הבסיס לפני הפציעה יחד עם הערכים השיוריים שנמדדו עבור כל מצב (איור 1, שלב 6). כדי לבדוק פרופילים קינמטיים והבדלים משמעותיים בין קבוצת הבקרה (דמה) לקבוצות הניסוי (SCI), כל הפרמטרים הקינמטיים (סה"כ 79) עברו ניתוח רכיבים ראשיים מסדר שלישי (PCA), ונוצרה מפת חום עם אוסף של פרמטרים מוטוריים שתיארו בצורה הטובה ביותר את מערך הנתונים (סה"כ 33) (איור 1, שלב 7a,b). לבסוף, פרמטרים מוטוריים ספציפיים שהושפעו לאחר ה-SCI הושוו לקו הבסיס לפני הפציעה (איור 1, שלב 7c).

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של תהליך הניתוח של MW. (1) בעלי החיים נבחרים לכריתת למינקטומיה (קבוצת ביקורת דמה) או למינקטומיה ואחריה פגיעה בחוט השדרה (קבוצת ניסוי). (2) בעלי החיים עוברים בדיקה התנהגותית יום לפני הפציעה ובימים 15, 22 ו-30 לאחר הפציעה. (3) MW מייצר שני סוגים של נתוני פלט: (א) הדמיות גרפיות של מספר פרמטרים, כגון עקבות עמידה, דפוסי הליכה ודריכה, ו-(ב) סיכום קינמטי של כל הפרמטרים המוטוריים הניתנים למדידה. (4) כל נתוני הבקרה והניסוי מרוכזים לקובץ אחד באמצעות סקריפט "MouseMultiEvaluate.m" ב- MATLAB. (5) סקריפט "RawData_PlotGenerator" עבור Python יוצר ייצוג חזותי של האופן שבו כל הפרמטרים המוטוריים הניתנים למדידה משתנים בהתאם למהירות. אם הפרמטרים אינם תואמים את המהירות, אפשר לדלג ל-(7); עם זאת, מכיוון שרוב הפרמטרים לאחר SCI תלויים מאוד במהירות, יש ליצור מודל (6) באמצעות סקריפט "Residual_DataAnalysis" עבור Python. לאחר יצירת הערכים השיוריים עבור כל פרמטר מנועי, מתבצע ניתוח נתונים (7): (א) ניתוח רכיב עיקרי (PCA) מבוצע באמצעות מבחר פרמטרים עם סקריפט "PCA_PlotGenerator"; (ב) מפת חום נוצרת עם סקריפט "Heatmap_PlotGenerator", כדי להראות את ההבדלים המשמעותיים סטטיסטית בין תנאים עבור פרמטרים שונים; ו-ג) מספר פרמטרים בודדים המשתנים לאחר הערכת SCI באמצעות סקריפט "BoxPlot_PlotGenerator". כל הסקריפטים זמינים בקישור Table of Materials ובמאגר GitHub. הסקריפטים מוצגים באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מנתוני הפלט הגרפיים שנאספו מה- MW ניתן היה לאשר את השינוי הפתאומי הידוע בתצוגה החזותית של טביעות הרגל לאחר SCI. בבדיקת "דיו דיגיטלי" שנוצר על-ידי MW זוהה חוסר תמיכה של הכפות האחוריות (איור 2A), יחד עם ירידה בשטח טביעת הרגל של כפות הרגליים האחוריות השמאלית והימנית (איור 2B), אשר נשמרה מ-15 dpi ואילך (הנתונים לא מוצגים). בנוסף, בתוך כל מחזור צעד, MW מחשב פרמטרים הקשורים לשלב העמידה (כלומר, הזמן בין הטאצ'דאון של הכף ולפני ההמראה) ולשלב הנדנדה (כלומר, הזמן שבו הגפה יורדת מהקרקע). ככזה, MW יכול לייצר "עקבות עמידה" חזותיים, אשר לוקחים בחשבון את המיקום של מרכז הגוף ואת הציר ביחס לכל רגל ואת מרכז טביעת הרגל שלהם במהלך שלבי העמידה23. עקבות העמדה הכוללת שהתקבלו עבור כל חיה הציגו כמה מאפיינים ייחודיים (איור 2C). הנתונים האלה הראו שאחרי SCI, לכפות האחוריות היו עקבות עמידה קצרות יותר ומיקום כפות אקראי יותר הן בטאצ'דאון והן בהרמה מ-15 dpi ואילך (איור 2C).

Figure 2
איור 2: תפוקות גרפיות מייצגות שהתקבלו על-ידי תוכנת MW מסרטוני המעקב. (A) הדפסת "דיו דיגיטלי" עבור חיית SCI אחת המציגה כל כפה בצבע שונה: אדום (קדמי ימני), צהוב (קדמי שמאלי), ירוק (אחורי ימני) וכחול (אחורי שמאלי) במספר נקודות זמן. (B) טביעות רגל עבור החזית השמאלית (LF), השמאלית האחורית (LH), הקדמית הימנית (RF) והאחורית הימנית (RH) של חיית SCI אחת ברזולוציה של 15 dpi. (ג) "עקבות עמדה" עבור חיית SCI אחת בכמה נקודות זמן. AEP ו PEP עבור אחת הרגליים מתוארים בלוח הראשון. "אשכולות טביעת הרגל" עבור AEP ו- PEP תואמים את סטיית התקן של קואורדינטות AEP או PEP הממוצע בכל סרטון. קיצורים: dpi = ימים לאחר הפציעה; ס"מ = סנטימטר; px = פיקסל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר מכן, התפוקות הקינמטיות נותחו לאחר שחושבו על-ידי MW (איור 3 ואיור 4). כדי לקבל תיאור תמציתי יותר של מערך הנתונים ולבדוק אם הפרמטרים המוטוריים הקינמטיים שהתקבלו מה- MW הספיקו כדי לתאר ליקויים מוטוריים שנמצאו בבעלי חיים SCI לאורך זמן, בוצע PCA27. באופן ניכר, 40% מהשונות בנתונים יכולה להיות מוסברת ברכיב הראשון (PC1: 40.1%), אשר הפריד את קבוצת החיות שהיו להן SCI מהשאר, עם ערך p נמוך מ-0.001 בהתבסס על בדיקת ANOVA חד-כיוונית (איור 3A,B) בכל נקודות הזמן (15 dpi, 22 dpi ו-30 dpi). הייתה גם תרומה נמוכה משאר המרכיבים (PC2: 11% ו- PC3: 8.6%). המשקל המוקצה של כל תרומה של פרמטר מוטורי עבור כל רכיב מומחש באיור משלים 4. יתר על כן, השונות במערך הנתונים לא הספיקה כדי לשקף הבדלים לאורך זמן (כלומר, בין 15 dpi, 22 dpi ו- 30 dpi), מה שמשכפל את הרמה שתוארה קודם לכן של שחזור מנוע14. בסך הכל, תוצאות אלה מצביעות על כך שהפרמטרים הקינמטיים המתקבלים מה- MW מתארים היטב את הליקויים המוטוריים שנצפו לאחר SCI בכל נקודות הזמן.

Figure 3
איור 3: ניתוח רכיבים עיקריים של כל הפרמטרים המוטוריים הקינמטיים (79) שהתקבלו על-ידי תוכנת MW לאחר ניתוח הנתונים השיוריים. (A) הדמיה תלת-ממדית של ניתוח PCA בעל שלושה רכיבים. (B) הדמיה דו-ממדית עם עיגולים המייצגים 50% מהנתונים שנאספו. ב-PC1, שהסביר יותר מ-40% מהשונות, קבוצת SCI ב-15 dpi, 22 dpi ו-30 dpi הייתה שונה באופן משמעותי מקבוצת הדמה וקו הבסיס (לפני הפציעה), עם ערך p <-0.001, כפי שנקבע על ידי ANOVA חד-כיוונית. כל נקודה קטנה או משולש מייצג את הממוצע של שלושה סרטונים עבור כל חיה, בעוד שהנקודות או המשולשים הגדולים יותר מייצגים את הנקודה הממוצעת (n = 10-11 לכל תנאי, n = 21 עבור קבוצת קווי הבסיס). תרומתו של כל רכיב מסומנת בכל ציר. קיצורים: dpi = ימים לאחר הפציעה; SCI = פגיעה בחוט השדרה; PC = רכיב עיקרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר מכן, נבחר אוסף של פרמטרים מוטוריים בהתבסס על עוצמת התיאור של מערך הנתונים (33 בסך הכל), ונוצרה מפת חום (איור 4). ואכן, רוב הפרמטרים המוטוריים הראו שינוי דרסטי לאחר SCI בכל נקודות הזמן (15 dpi, 22 dpi ו- 30 dpi), בעוד שהבקרות שנפגעו מזויפות הראו שינויים משמעותיים רק ב- 30 dpi. שינויים אלה בקבוצת הדמה יכולים להיות מוסברים על ידי ירידה כללית במהירות הנדנדה, אולי בשל התרגלות המבחן, אשר יידונו בהמשך.

היה ניכר כי חיות SCI הלכו לאט יותר מאשר קבוצת הביקורת שנפגעה בדמה (הנתונים לא הוצגו). עם זאת, ללא קשר למהירות, הן ב- 15 dpi והן ב- 30 dpi, בעלי החיים של SCI הציגו משך נדנדה גבוה יותר, משך עמידה נמוך יותר ומדד מקדם חובה נמוך יותר, המתייחס למשך העמידה / תקופת הצעד23. תוצאות אלה מצביעות על כך שהשינויים במיקום הרגליים שתוארו לעיל אופייניים ל-SCI, כפי שניתן לראות במודלים אחרים של בעלי חיים30,31,32, ואינם קשורים לשינויים בקצב (איור 4).

כמו כן יש לציין כי הסנכרון השמאלי והימני לא הושפע, שכן לא נצפה שינוי משמעותי במדדי ה"פאזה" של הגפיים הקדמיות והאחוריות10,23 (איור 4), המצביע על צימוד תקין בין הגפה השמאלית והימנית.

יתר על כן, עכברי SCI הציגו מדד נמוך יותר של "ישרות עמידה" (אורך תזוזה/נתיב) הן בגפיים הקדמיות והן בגפיים האחוריות (איור 4). פרמטר זה מודד עד כמה ליניאריים העקבות ביחס למצב האידיאלי, שיהיה קו ישר (הנע בין 0 ל -1, המציין עקבה ליניארית)27. לכן, תוצאות אלה מצביעות על חוסר יכולת חזק ללכת ישר בקבוצה זו.

עבור כל שלב עמידה, ה-MW מצייר שחזור של תנודות הגוף, החל מ-paw touchdown - המיקום הקיצוני הקדמי, או AEP - וכלה לפני ההמראה - המיקום הקיצוני האחורי, או PEP (ראו דוגמה באיור 2C). "אשכולות טביעת הרגל" של AEP ו- PEP מודדים את סטיית התקן של קואורדינטות AEP או PEP הממוצעות בכל סרטון. חיות ה-SCI הראו עלייה בהתקבצות טביעות הרגל האחוריות עבור AEP בכל נקודות הזמן, והשפעה משמעותית נצפתה רק עבור הקבוצה שנפגעה בדמה ב-15 dpi (איור 4). זה ממחיש שחיות SCI לא יכלו למקם נכון את הגפיים האחוריות שלהם בטאצ'דאון לאחר הנדנדה. נוסף על כך, נצפתה ירידה ב"אשכולות טביעת הרגל" של כפות הרגליים הקדמיות עבור PEP, יחד עם ירידה באשכולות טביעת הרגל האחורית עבור PEP, ב-30 dpi (איור 4). תוצאות אלה תואמות את מה שנצפה ב"עקבות העמידה" המשורטטים ומצביעות על כך שמיקום הכפות הקדמיות הופך מוגבל יותר לאחר הפציעה.

לבסוף, ובהתאם לשינויים במיקום הכפות, חלו שינויים באסטרטגיות ההליכה וב"לחץ" שעוררו הכפות, כפי שנמדד על-ידי הבהירות הממוצעת על פני השטח (איור 4), עליהם נדון בהמשך.

Figure 4
איור 4: תרשים מפת חום המציג אוסף של פרמטרים מוטוריים שהשתנו באופן משמעותי בהשוואה בין חיות SCI לבעלי חיים פצועי דמה ביחס ליום שלפני הניתוח, כפי שהתקבלו על-ידי MW לאחר ניתוח נתונים שיורית. n = 10-11 לכל מצב; קבוצת הבסיס כוללת את כל בעלי החיים יום לפני הניתוח, n = 21. הנתונים מבוטאים על ידי ערך p לאחר ניתוח סטטיסטי עם ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי (עבור התפלגויות נורמליות) או מבחן פוסט-הוק של דאן (עבור התפלגויות לא נורמליות). ערכי P מיוצגים על-ידי קוד צבע, כאשר גווני אדום וכחול מציינים ירידה או עלייה ביחס לקו הבסיס, בהתאמה. גוון הצבע מייצג את המובהקות הסטטיסטית, כאשר צבעים כהים יותר מציינים מובהקות גבוהה יותר וצבעים בהירים יותר מציינים מובהקות נמוכה יותר; P < 0.001; **P < 0.01; *P < 0.05. לבן מציין שאין וריאציה. קיצורים: dpi = ימים לאחר הפציעה; SCI = פגיעה בחוט השדרה; s = שני; ms = אלפית השנייה; ממוצע = ממוצע; F = קדימה; H = אחורי; AEP = מיקום קיצוני קדמי; PEP = מיקום קיצוני אחורי; LF = חזית שמאלית; LH = שמאל מאחור; RF = ימין קדימה; RH = אחורי ימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר מכן, ביקשנו להבין אילו פרמטרים בודדים יהיו הטובים ביותר לתאר את הליקויים המוטוריים של חיות SCI בשלבים שונים של הפציעה (כלומר, 15 dpi, 22 dpi ו- 30 dpi). התחלנו בבחינת הפרמטרים של מחזור הצעדים שהראו הבדלים בין הגפיים הקדמיות והאחוריות ככל שהגפיים האחוריות התקדמו משיתוק מוחלט לתפקוד חלקי (איור 5). בעוד שמהירות הנדנדה הממוצעת עלתה משמעותית עבור הגפיים הקדמיות ביחס לקו הבסיס (לפני הפציעה), מהירות הנדנדה של הגפיים האחוריות לא השתנתה באופן משמעותי (אם כי הייתה נטייה שהיא הייתה נמוכה יותר מקו הבסיס) (איור 5A,B). במקביל, אורך הצעד הממוצע של הגפיים הקדמיות ירד, ללא שינויים משמעותיים בגפיים האחוריות (איור 5C,D). באופן לא מפתיע, העכברים הפגועים הראו ירידה במשך הנדנדה של הגפיים הקדמיות ועלייה הפוכה במשך התנודות בגפיים האחוריות שלהם ב-15 dpi ואילך (איור 5E,F). יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שהגפיים הקדמיות אימצו קצב מהיר יותר, עם שני מחזורי גפיים קדמיות לכל מחזור גפיים אחוריות. יחס מחזור זה של 2:1 תואר בעבר לאחר המיסקציה SCI בחולדות 1,33 ומדגים היבט מרכזי של תיאום פגום בין הגפיים הקדמיות לגפיים האחוריות, שאינו מתאושש לאחר 30 dpi בעכברים.

Figure 5
איור 5: פרמטרים של מחזור הצעדים עבור הכפות הקדמיות והכפות האחוריות במספר נקודות זמן יום אחד לפני הפציעה וב-15 dpi, 22 dpi ו-30 dpi בחיות SCI (n = 11). (A,B) מהירות הנדנדה הממוצעת של הכפות הקדמיות והאחוריות ביחס לקו הבסיס. (ג,ד) אורך המדרגה הממוצע של הכפות הקדמיות והאחוריות ביחס לקו הבסיס. (ה,ו) משך הנדנדה הממוצע של הכפות הקדמיות והאחוריות ביחס לקו הבסיס. בחלקות הקופסאות, החציון מיוצג על ידי הקו האמצעי, והקצוות התחתונים והעליונים של התיבות מייצגים את הרבעונים 25% ו- 75%, בהתאמה; השפם מייצג את טווח ערכת הנתונים המלאה. חריגים מיוצגים על ידי נקודות בודדות. ניתוח סטטיסטי נערך עם ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי (להתפלגויות נורמליות) או מבחן פוסט-הוק של דאן (להתפלגויות לא נורמליות). *P < 0.05; **P < 0.01; P < 0.001. קיצורים: dpi = ימים לאחר הפציעה; SCI = פגיעה בחוט השדרה; ס"מ = סנטימטר; s = שני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוכנת MW מסוגלת גם לחשב את דפוסי הצעד של עכברים על ידי מדידת שבר המסגרות שהוקצו לשילוב רגליים מסוים, וזה עובד כפרוקסי לנוכחות של אסטרטגיות הליכה ספציפיות. במהירויות איטיות יותר, עכברים שלא נפגעו נוטים לאמץ "הליכה מהלכת", שבה לרוב המסגרות יש נדנדה של רגל אחת (ללא קשר לתנוחת הכפה). במהירויות ביניים, הנפוצות ביותר על המסלול, עכברים משתנים להליכה טרוט, שבה התצורה המייצגת ביותר היא נדנדת הרגל האלכסונית. לבסוף, במהירויות גבוהות יותר, עכברים משתמשים ב"הליכה דוהרת", עם שלוש רגליים מתנדנדות בו זמנית23,34. תצורות אחרות פחות נפוצות כוללות את ההליכה הקצבית, המיוצגת בעיקר על ידי נדנדת הרגל הצידית (שתי רגלי שמאל או ימין), ו"הליכה קשורה/מקפיצה", כאשר שתי הגפיים האחוריות או הקדמיות מתנדנדות בו זמנית10. עם זאת, יש לזכור כי בהקשר של SCI, חלק מהתצורות הללו, כגון נדנדה של שלוש רגליים, יכולות לשקף מיקום כף גפיים אחוריות פגום, ולכן אינן תואמות במדויק לאסטרטגיית הליכה ספציפית - במקרה זה, הדהירה. לכן, הניתוח היה פשוט יותר על ידי השוואת תצורות הרגליים בלבד.

לאחר ביצוע הניתוח השיורי הבחינו כי חלה ירידה בשכיחות התנודות האלכסוניות המלווה בירידה בתנודות בודדות בכל נקודות הזמן (איור 6A,B). באופן מעניין יותר, חלה עלייה בשכיחות של תנודות רוחביות (איור 6C). ההליכה דמוית הקצב אינה אופיינית לעכבר C57BL/6J רגיל; עם זאת, כבר דווח כי היא מתרחשת לאחר המיסקציה SCI בחולדות1. דפוס פאזה זה לא היה נפוץ מספיק כדי לשנות את מדד הפאזה של הגפה הקדמית או האחורית (כפי שניתן לראות באיור 3), אך הוא מדגים משוב פגום בעמוד השדרה מהגפיים האחוריות לגפיים הקדמיות. נוסף על כך, נצפתה עלייה טבעית בשכיחות של נדנדות גפיים קדמיות/אחוריות (איור 6D), אולי כתוצאה מדריכה פלנטרית שגויה בגפיים האחוריות, ועלייה בנדנדות של שלוש רגליים (איור 6E).

Figure 6
איור 6: האינדקסים הממוצעים עבור תצורות שונות של נדנדת צעד. (A) נדנדה אלכסונית, (B) יחידה, (C) רוחבית, (D) קדמית/אחורית ו-(E) נדנדה תלת-רגלית במספר נקודות זמן בחיות SCI (n = 11). בחלקות הקופסאות, החציון מיוצג על ידי הקו האמצעי, והקצוות התחתונים והעליונים של התיבות מייצגים את הרבעונים 25% ו- 75%, בהתאמה; השפם מייצג את טווח ערכת הנתונים המלאה. חריגים מיוצגים על ידי נקודות בודדות. ניתוח סטטיסטי בוצע עם ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי (להתפלגויות נורמליות) או מבחן פוסט-הוק של דאן (להתפלגויות לא נורמליות). **P < 0.01; P < 0.001. קיצורים: dpi = ימים לאחר הפציעה; SCI = פגיעה בחוט השדרה; NA = לא ישים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לבסוף, קריאה נוספת שניתן לחלץ מה-MW היא "לחץ" כמדד לבהירות/שטח. עם מהירויות גבוהות יותר, שטח המגע עם הקרקע פוחת, והלחץ עולה, ולכן בוצעה רגרסיה ליניארית של נתוני הבסיס, ונמדדו הערכים השיוריים עבור כל תנאי. הבחינו כי הלחץ על הכפות הקדמיות גדל באופן משמעותי בכל נקודות הזמן, אך עוצמת השפעה זו נטתה לרדת עם הזמן, שכן השינוי עבור הכף הקדמית השמאלית כבר איבד מובהקות סטטיסטית של 30 dpi (איור 7A,C). השפעה ספציפית זו על צד שמאל יכולה להיות מוסברת על ידי פגיעה רוחבית, אשר יכול היה להשפיע באופן מועדף על הצד הימני של חוט השדרה במחקר זה. עם זאת, הלחץ שהפעילו הכפות האחוריות פחת כצפוי בעכברים פצועים בכל נקודות הזמן, ללא נטייה לעלייה (איור 7B,D).

Figure 7
איור 7: לחץ שנוצר על-ידי הכפות האחוריות והקדמיות בכמה נקודות זמן בחיות SCI (n = 11). לחץ שנוצר על ידי (A) כף קדמית שמאלית, (B) כף אחורית שמאלית, (C) כף קדמית ימנית ו-(D) כף אחורית ימנית, מוצג כהבדלים יחסיים לקו הבסיס (יום לפני הפציעה). בחלקות הקופסאות, החציון מיוצג כקו האמצעי, והקצוות התחתונים והעליונים של התיבות מייצגים את הרבעונים 25% ו- 75%, בהתאמה; השפם מייצג את טווח ערכת הנתונים המלאה. חריגים מיוצגים על ידי נקודות בודדות. ניתוח סטטיסטי בוצע עם ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי (להתפלגויות נורמליות) או מבחן פוסט-הוק של דאן (להתפלגויות לא נורמליות). **P < 0.01; P < 0.001. קיצורים: dpi = ימים לאחר הפציעה; SCI = פגיעה בחוט השדרה; ס"מ = סנטימטר; px = פיקסל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

יחד, מחקר זה ממחיש את כוחה של מערכת MW לתיאור כמותי של ליקויים מוטוריים הנגרמים על ידי SCI שלעיתים ניתן להתעלם מהם בשל מגבלות בדיקה אחרות. יתר על כן, הוא מדגיש את ההתאוששות התפקודית המוגבלת ללא ספק לאורך זמן במודל עכבר החבלה של SCI.

תרשים משלים 1: רכיבי החומרה של MW. (א) מערך זה מחולק באופן הבא: I - fTIR walkway; II - בסיס תמיכה fTIR והודעות; III - קיר שביל; IV - מראה 45°; ו- V - תאורה אחורית ברקע. (B) תמונות תקריב של ערוץ Base-U ושולי השביל. (ג) תכנון קיר השביל. (D) תמונת תקריב של מערך המראה של 45°. קיצור: ס"מ = סנטימטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: פריים בודד של סרטון fTIR שבו מצוינים עוצמת הפיקסלים ואזורי האזור. עוצמות הפיקסלים של הגוף, הרקע וטביעות הרגל המשמשות לניתוח הווידאו במחקר זה מוצגות בין סוגריים מרובעים ומסומנות באדום, כולן ממוטבות לבהירות תמונה. יש לכוונן את עוצמת האור כדי להשיג הבחנה נאותה בין האזורים השונים. אזורים יחסיים של הגוף וטביעות הרגל מסומנים בקווים צהובים מקווקוים. הן האזורים והן עוצמת הפיקסלים נרכשו ב- ImageJ/FIJI. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 3: (A) ציון כולל של BMS ו-(B) תת-ציון של העכברים שנותחו במחקר זה (n = 10-11). כל הנתונים בוטאו כממוצע ± SEM. הניתוח הסטטיסטי בוצע במדידה דו-כיוונית חוזרת ANOVA ואחריה מבחן פוסט-הוק של בונפרוני; P < 0.001. קיצור: BMS = סולם עכבר באסו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 4: המשקל המוקצה של כל תרומה של פרמטר מוטורי עבור כל רכיב. המשקל המוקצה של כל פרמטר מנוע (79 בסך הכל) לאחר הניתוח השיורי עבור (A) PC1, (B) PC2 ו- (C) PC3 ב- PCA. קו החיתוך שורטט ב-0.04 אלפיות השנייה וב-0.04-. קיצורים: ms = אלפית השנייה; ממוצע = ממוצע; SD = סטיית תקן; F = קדימה; H = אחורי; AEP = מיקום קיצוני קדמי; PEP = מיקום קיצוני אחורי; LF = חזית שמאלית; LH = שמאל מאחור; RF = ימין קדימה; RH = אחורי ימני; לחץ = לחץ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, הפוטנציאל של שיטת MouseWalker מודגם על ידי ניתוח התנהגות לוקומוטורית לאחר SCI. הוא מספק תובנות חדשות לגבי שינויים ספציפיים בדפוסי דריכה, טביעת רגל והליכה שאחרת היו מתפספסים במבחנים סטנדרטיים אחרים. בנוסף לאספקת גרסה מעודכנת של חבילת MW, כלי ניתוח נתונים מתוארים גם באמצעות סקריפטים Python שסופקו (ראה שלב 5).

מכיוון שה- MW מייצר מערך נתונים גדול ואוסף של פרמטרים קינמטיים המשקפים תהליך לוקומוטורי ממדי מאוד, נעשה שימוש ב- PCA; ואכן, PCA נמצא בשימוש נרחב במערכי נתונים קינמטיים אחרים הדומים לזה 27,35,36 (איור 3). טכניקת הפחתת ממדיות זו היא שיטה פשוטה וחזקה עם הנחות מינימליות המאפשרת זיהוי כמותי של פרופילים קינמטיים והבדילם במהירות מתנאי בקרה או בסיס. נוסף על כך, מפות חום נוצרו כדי לזהות באופן מיידי את הפרמטרים שהיו שונים סטטיסטית מקו הבסיס (איור 4), שמאוחר יותר ניתן היה לנתח בנפרד (איור 5, איור 6 ואיור 7).

לאחר מכן, הוכח כיצד פרמטרים ספציפיים שניתן לחלץ מה- MW ממחישים את הליקויים המוטוריים החזקים הנראים בבעלי חיים של SCI, כגון קואורדינציה. קואורדינציה היא היכולת להשתמש בכל איבר בצורה מאורגנת לביצוע משימה. לעתים קרובות, קואורדינציה נמדדת בעקיפין על ידי מספר הטעויות / אירועים חיוביים על סולם 16,17 או הזמן שהוקדש על רוטרוד15. באופן מובהק, MW מחשב הן את השונות במיקום הכפות במהלך מחזור הצעדים (תבנית טביעת רגל) והן את מדד "ישרות העמידה"27. נמצא כי שני הפרמטרים הושפעו באופן משמעותי מהפגיעה (איור 4).

יתר על כן, MW מאפשר למשתמש לחלץ פרמטרים הקשורים דינמיקה זמנית. נצפה שיבוש משמעותי במשך הנדנדה/עמידה בחיות SCI (איור 4), ונמצא שעכברי SCI פיצו על אובדן התמיכה בגפיים האחוריות שלהם על-ידי האצת מחזור צעדי הגפיים הקדמיות שלהם, ובכך הפחיתו את אורך צעד הגפה הקדמית ואת זמן הנדנדה הממוצע (איור 5). השפעה זו יכולה להתייחס לשינוי במרכז הכובד, אשר מאלץ את הכפות הקדמיות לסבול יותר משקל גוף1. כמו כן, ניתן לייחס זאת לאובדן המסלולים הפרופריוספינליים העולים הארוכים, אשר אחראים לאינטראקציה הסינרגטית בין הגפה הקדמית והגפה האחורית CPGs 1,9,32, מה שמוביל בסופו של דבר לדיסוציאציה של קצב הגפיים הקדמיות-אחוריות.

המאפיינים של הליכה דורכת יכולים להמחיש את הארגון המודולרי של רשתות לוקומוטוריות 1,34. למרות שדפוסי דריכה אינם מייצגים ישירות את אסטרטגיות ההליכה שאומצו במקרה זה23, עדיין ניתן להסיק כמה תצפיות חשובות. שינויים חשובים נצפו בדפוסי הדריכה של עכברי SCI (איור 6). החיות הפגועות החלו לאמץ נדנדות רוחביות (הליכה דמוית קצב), וחלה גם ירידה בנדנדות אלכסוניות. נראה כי התאמות אלה קשורות לניסיון לתאם את הגפיים הקדמיות והאחוריות, מה שמדגים שוב את הדיסוציאציה בין פסי עמוד השדרה מתחת ומעל הפציעה, שאינה מחלימה 1,9,32.

ההתאוששות המוגבלת לאחר SCI אומתה גם על ידי ירידה במרץ השרירים בגפיים האחוריות, כפי שנמדד על ידי הלחץ הממוצע (איור 7). כתוצאה מכך, הגפיים הקדמיות נאלצות לתמוך במשקל גוף רב יותר, מה שמגביר את הלחץ. בעוד פרמטרים רבים הקשורים לדינמיקת שרירים לא נותחו כאן (כלומר, קואורדינציה שרירית מכופף ומרחיב 7,21), מדידה כמותית זו יכולה לספק קריאה ישירה של כמות התמיכה בגפיים.

ניתוח MW זה יכול להיות משולב גם עם מבחן BMS סטנדרטי, אשר מודד סיבוב גפיים, מיקום כפות, מיקום זנב, וטעויות צעד. באופן כללי, עכברי SCI משיגים ציון מקסימלי של 4-5, עם תוצאת משנה מקסימלית של 3, כלומר הם יכולים לבצע צעדים מזדמנים עד תכופים, אבל בעיקר מסתובבים בהרמת הכף ו/או טאצ'דאון14 (איור משלים 2). מתברר מדוע ערכי AEP עבור הכפות האחוריות השתנו באופן משמעותי בקבוצת SCI, שכן המיקום הלא מקביל של הגפיים במהלך שלב הנדנדה עשוי להשפיע על קואורדינטות הכפות. בנוסף, ב BMS, תא המטען מסווג בדרך כלל חמור בשל נוכחות של מקרים או אירועים המונעים דריכה, כגון קת למטה מקפץ14. אף על פי שלא ניתן היה לכמת התנהגות של ישבן כלפי מטה או מקרים שמנעו דריכה, זוהתה דריכה מוגבלת של כף אחורית ב-MW, עם משך נדנדה גבוה יותר (איור 5F), עלייה בשלוש נדנדות רגליים (איור 6E) ולחץ נמוך יותר (איור 7B-D). בנוסף, נצפתה עלייה משמעותית בתנודות קדימה/אחורית (איור 6D). יכולים להיות שני הסברים משלימים לביטוי התנהגותי זה. ראשית, נמדדה ההליכה דמוית הדילוג, אשר ניתן היה לראות כבר במבחן BMS. עם זאת, התנהגות זו יכולה להיות קשורה גם לחוסר דריכה פלנטרית נכונה בשתי הגפיים האחוריות, וכתוצאה מכך גרירת רגליים או מיקום גבי. בסך הכל, תצפיות אלה תומכות בטענה כי יציבות תא המטען נפגעת קשות לאחר SCI. לבסוף, אחת הדרישות לציון גבוה מ -5 במבחן BMS היא תיאום14, ולשם כך יש להקפיד על לפחות שלושה מעברים נגישים על ידי המעריכים במהלך הבחינה. מתוכם, שניים מתוך שלושת המעברים הנגישים או יותר צריכים להיות מסווגים כמתואמים (כלומר, גפיים קדמיות וגפיים אחוריות לסירוגין). מנתוני MW ניתן לחלץ מדידות אובייקטיביות, את מדד ישרות העמידה ואת אשכולות טביעת הרגל, אשר מכמתים ישירות את התיאום ללא תלות במהירות בעלי החיים או במעבר נגיש (איור 4). נוסף על כך, ניתן לכמת את ההחלפה בין הגפיים באופן אובייקטיבי על-ידי מדידת אסטרטגיות הדריכה (איור 6). פרמטרים אלה ממחישים בבירור כי עכברי SCI באופן עקבי אינם יכולים ללכת בקווים ישרים ולמקם את הגפיים האחוריות שלהם בצורה שגויה.

בעוד ארגז הכלים MW הוא אסטרטגיה מועילה לחקר פגמים מוטוריים לאחר SCI, יש לשקול כמה ממגבלותיו. ראשית, קריטי לשמור על עקביות עם פרמטרי הרכישה (כלומר, מיקום המצלמה, המיקוד, עוצמת האור) כך שתכונות התמונה בין נקודות הזמן יישמרו. שנית, הבחינו כי חזרה הובילה להרגלה, אשר, בתורו, הוביל לירידה במהירות. זה גם תרם להתנהגויות גידול / טיפוח מוגברות ועצירות באמצע הריצה. עבור בעלי חיים פצועים, הייתה גם נטייה להישען על קירות השביל ומספר מוגבר של עצירות באמצע הריצה. מכיוון שהתנהגויות אלה אינן חלק מההערכה המוטורית, אין לקחת אותן בחשבון. באופן מועדף, החוקרים צריכים לבחור סרטונים שבהם החיות הולכות ברציפות כשראשיהן מופנים ישר. כדי לנטרל את ההשפעה של התנהגויות אלה על תוצאות מחקר זה, עכברים תועדו ברציפות במשך ארבע או חמש ריצות לפחות והורשו לרוץ לשני הכיוונים לאורך השביל. לאחר מכן, שלוש הריצות המתועדות הטובות ביותר נבחרו והותאמו לאותו כיוון ב-ImageJ/FIJI24 (סיבוב של 180°). לפיכך, כל חיה יוצגה על ידי ממוצע של שלוש ריצות שאוגדו יחד בכל נקודת זמן. מספר גדול יותר של בעלי חיים בכל מצב יכול גם להקטין את השונות הצפויה. יתר על כן, יש לציין כי מבחן לוקומוטור זה מומלץ רק לאחר צעד plantar מושגת, כמו מערכת המעקב תוכנן עבור הערכת לוקומוטור מכוונן היטב. במחקר זה, צוין כי לפני 15 dpi, מבחן MW לא היה יתרון עבור הערכת לוקומוטור בשל גרר רגליים מוגבר מיקום plantar שגוי, אשר יכול להשפיע על המעקב (נתונים לא מוצגים). לבסוף, פרמטרים מסוימים (כגון אשכולות טביעת רגל) רגישים מאוד לאקסטרפולציות שנעשו על ידי מודל הרגרסיה שנוצר. לכן, הקוד הותאם בהתאם (עיין בתיעוד בסקריפט בקישור GitHub).

בסך הכל, הוכח כי MW יכול להבחין מאוד בין חיות SCI לבקרות פגועות דמה, ו- MW יכול גם להיות שותף עם בדיקות מבוססות כשיטה רבת ערך לחקר פגמים מוטוריים לאחר SCI. יתר על כן, הוכח כי ניתן להפיק בקלות תפוקות כמותיות ממערך הנתונים של MW באמצעות סקריפטים של Python שסופקו. כלים אלה מספקים צנרת ניסוי יעילה ליצירת מערך עשיר ומגוון של תפוקות כמותיות וגרפיות המשלימות את קבצי הפלט המקוריים של MW וניתנות לשינוי כדי להגשים את מטרות החוקר מבחינת סוג הניתוח והייצוג הגרפי.

ארגז כלים זה הוא שיטה רבת ערך לחקר מחלות מוטוריות אחרות או הפרעות בתפקוד המוטורי, לא רק אלה הקשורות לפגיעה בחוט השדרה. Skarlatou et al.10 כבר הוכיחו כי מוטציה ספציפית באפדין, חלבון פיגום חשוב במהלך הפיתוח, גרמה לפנוטיפ חריג בחוט השדרה על ידי יצירת שתי תעלות מרכזיות. פגם זה גרם לאובדן חילופי גפיים ימניות-שמאליות ולשכיחות גבוהה יותר של סנכרון גפיים, האופייני להליכה מקפיצה. Stauch et al.10 גם המחישו כי סוג זה של מערכת יכול להיות מותאם על פי הצרכים של המשתמש. במקרה זה, הוא יושם כדי לחקור ליקויים התנהגותיים ספציפיים במודל מחלת פרקינסון חולדה. כך, לארגז כלים זה מגוון רחב של יישומים במודלים שונים בהם צפויות הפרעות מוטוריות וניתן לשלב אותן עם פרוטוקולי התנהגות שכבר נקבעו בשטח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים ללאורה טאקר ונטשה לונקרביץ' על הערותיהם על כתב היד ועל התמיכה שניתנה על ידי מתקן המכרסמים של המכון המולקולרי לרפואה ז'ואאו לובו אנטונס. המחברים רוצים להודות על תמיכה כספית מ- Prémios Santa Casa Neurociências - Prize Melo e Castro for Spinal Cord Injury Research (MC-36/2020) ל- L.S. ו- C.S.M. עבודה זו נתמכה על ידי Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 ו- UIDP/04462/2020) ו- LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) ל- C.S.M. L.S. נתמכה על ידי חוזה חוקר ראשי פרטני של CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ FCT (2020.08168.BD). A.M.M. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ- FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מ-FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. נתמך על ידי מלגת דוקטורט מ- FCT (SFRH/BD/138636/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
45º Mirror 
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side Misumi
2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side Misumi
1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long Misumi
87 x 23 cm mirror General glass supplier 
black cardboard filler  General stationery supplier We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror
Background backlight
109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side Misumi
multicolor LED strip General hardware supplier
white opaque paper to cover the plexyglass General stationery supplier
fTIR Support base and posts
2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height Misumi
60 x 30 cm metric breadboard Edmund Optics  #54-641
M6 12 mm screws Edmund Optics 
M6 hex nuts and wahers Edmund Optics 
fTIR Walkway 
109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) General hardware supplier 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick)
109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) General hardware supplier
2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side Misumi
black cardboard filler  General stationery supplier we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges
M6 12 mm screws Edmund Optics 
High speed camera (on a tripod)
Blackfly S USB3 FLIR #BFS-U3-32S4M-C This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second
Infinite Horizon Impactor 
Infinite Horizon Impactor  Precision Systems and Instrumentation, LLC. #0400
Lens
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm Nikon #1929 This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals
Software
MATLAB R2022b MathWorks
Python 3.9.13  Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4 Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5  Spyder Project Contributors
Walkway wall 
2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm Any bricolage convenience store
2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height Any bricolage convenience store
GitHub Materials
Folder name URL
Boxplots https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots Script to create Boxplots
Docs https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs Additional documents
Heatmap https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps Script to create heatmap
Matlat script https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script MouseWalker matlab script
PCA https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots Script to perform Principal Component Analysis
Raw data Plots https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots Script to create Raw data plots
Residual Analysis https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis Code to compute residuals from Raw data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
  2. Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
  3. Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
  4. Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
  5. Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
  6. Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
  7. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  8. Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
  9. Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
  10. Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
  11. Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
  12. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
  13. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  14. Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  15. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  16. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
  17. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  18. Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
  19. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  20. Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
  21. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  22. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  23. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
  26. Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
  27. Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
  28. Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
  29. vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
  30. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
  31. Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
  32. Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
  33. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  34. Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
  35. Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
  36. Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 193 MouseWalker התנהגות מבחן לוקומוטורי ליקויים מוטוריים התאוששות לוקומוטורית פגיעה בעמוד השדרה מודל חבלה בעכבר
שימוש בהליכון עכבר לכימות תפקוד לקוי של מנוע עכבר במודל עכבר של פגיעה בחוט השדרה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Isidro, A. F., Medeiros, A. M.,… More

Isidro, A. F., Medeiros, A. M., Martins, I., Neves-Silva, D., Saúde, L., Mendes, C. S. Using the MouseWalker to Quantify Locomotor Dysfunction in a Mouse Model of Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (193), e65207, doi:10.3791/65207 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter