Summary
Denne protokol beskriver krystalliseringsscreening med høj kapacitet, der spænder fra 1,536 mikroassaypladeforberedelse til slutningen af et 6 ugers eksperimentelt tidsvindue. Detaljer er inkluderet om prøveopsætningen, den opnåede billeddannelse, og hvordan brugerne kan udføre analyser ved hjælp af en kunstig intelligens-aktiveret grafisk brugergrænseflade til hurtigt og effektivt at identificere makromolekylære krystalliseringsbetingelser.
Abstract
Røntgenkrystallografi er den mest almindeligt anvendte teknik til at skelne makromolekylære strukturer, men det afgørende trin i krystallisering af et protein til et ordnet gitter, der kan diffraktioneres, forbliver udfordrende. Krystalliseringen af biomolekyler er stort set eksperimentelt defineret, og denne proces kan være arbejdskrævende og uoverkommelig for forskere ved ressourcebegrænsede institutioner. På National High-Throughput Crystallization (HTX) Center er der implementeret meget reproducerbare metoder til at lette krystalvækst, herunder en automatiseret high-throughput 1.536-brønd mikrobatch-under-oliepladeopsætning designet til at prøve en bred bredde af krystalliseringsparametre. Plader overvåges ved hjælp af state-of-the-art billedbehandlingsmetoder i løbet af 6 uger for at give indsigt i krystalvækst samt for nøjagtigt at skelne værdifulde krystalhits. Desuden strømliner implementeringen af en trænet kunstig intelligens scoringsalgoritme til identifikation af krystalhits kombineret med en open source, brugervenlig grænseflade til visning af eksperimentelle billeder processen med at analysere krystalvækstbilleder. Her beskrives nøgleprocedurer og instrumentering til fremstilling af cocktails og krystalliseringsplader, billeddannelse af pladerne og identifikation af hits på en måde, der sikrer reproducerbarhed og øger sandsynligheden for vellykket krystallisering.
Introduction
Selv i en tid med enorme fremskridt inden for strukturelle biologiske metoder er røntgenkrystallografi fortsat en pålidelig og populær metode til generering af strukturelle modeller af makromolekyler af høj kvalitet. Over 85% af alle tredimensionelle strukturelle modeller, der er deponeret i Protein Data Bank (PDB), er fra krystalbaserede strukturelle metoder (pr. januar 2023). 1 Desuden er røntgenkrystallografi fortsat uundværlig for at løse protein-ligandstrukturer, en afgørende komponent i lægemiddelopdagelses- og udviklingsprocessen2. På trods af at proteinkrystallisering har været den dominerende strukturelle biologiske teknik i over et halvt århundrede, er metoder til at forudsige krystalliseringssandsynlighed baseret på fysiske egenskaber3 eller sekvens 4,5 stadig i deres barndom.
Forudsigelsen af krystalliseringsbetingelser er endnu mere uklar; Der er gjort begrænsede fremskridt med at forudsige sandsynlige krystalliseringsbetingelser, selv for modelproteiner 6,7. Andre undersøgelser har forsøgt at identificere krystalliseringsbetingelser baseret på proteinhomologi og betingelser udvundet fra PDB 8,9,10. Den forudsigelseskraft, der findes i PDB, er imidlertid begrænset, da kun de endelige, vellykkede krystalliseringsbetingelser er deponeret, hvilket nødvendigvis savner de ofte omfattende optimeringseksperimenter, der kræves for at finjustere krystalvækst. Desuden mangler mange PDB-poster metadata, der indeholder disse detaljer, herunder cocktailformler, krystalliseringsformat, temperatur og tid til at krystallisere11,12. Derfor er den mest tilgængelige måde at bestemme krystallisationsbetingelserne eksperimentelt for mange proteiner af interesse ved hjælp af så mange betingelser som muligt på tværs af en bred vifte af kemiske muligheder.
Flere tilgange til at gøre krystalliseringsscreening så frugtbar og grundig som muligt er blevet undersøgt med stor effekt, herunder sparsomme matricer13, ufuldstændig faktorscreening 14, additiver15,16, såning 17 og nukleeringsmidler 18. National HTX Center ved Hauptman-Woodward Medical Research Institute (HWI) har udviklet en effektiv pipeline til krystalliseringsscreening ved hjælp af mikrobatch-under-olie-tilgangen19, som anvender automatiseret væskehåndtering og billeddannelsesmetoder til at strømline identifikationen af indledende krystalliseringsbetingelser ved hjælp af forholdsvis minimale prøve- og cocktailvolumener (figur 1). Sættet med 1.536 unikke cocktails er baseret på forhold, der tidligere er bestemt til at være befordrende for proteinkrystalvækst og er designet til at være kemisk forskellige for at prøve en lang række mulige krystalliseringsbetingelser20,21,22. Den brede prøveudtagning af krystalliseringsbetingelser øger sandsynligheden for at observere en eller flere krystallisationsledninger.
Få formelle analyser af, hvor mange betingelser der er nødvendige for screening, er dukket op i litteraturen. En undersøgelse fokuserede på prøveudtagningslayoutet af forskellige skærmbilleder og viste, at tilfældig prøveudtagning af komponenter (svarende til en ufuldstændig faktor) repræsenterede den mest grundige og effektive prøveudtagningsmetode23. En anden undersøgelse af screening bemærkede, at der har været adskillige tilfælde, hvor den meget grundige 1.536 skærm kun har givet et enkelt krystal hit24, og en meget nylig undersøgelse fremhævede, at de fleste kommercielle skærme undersampler krystalliseringsrummet, der vides at være forbundet med screening hits25. Ikke alle krystalliseringsledninger vil give en diffraktionskvalitetskrystal, der er egnet til dataindsamling på grund af iboende lidelse i krystallen, diffraktionsbegrænsninger eller krystalfejl; Derfor har støbning af et bredere net for forhold den yderligere fordel at give alternative krystalformer til optimering.
Formatet af proteinkrystalliseringseksperimenter har også indflydelse på skærmens succes. Dampdiffusion er den mest almindeligt anvendte opsætning til krystalliseringsapplikationer med høj kapacitet og bruges på avancerede krystalliseringscentre, herunder EMBL Hamburg og Institut Pasteur screeningscentre med høj kapacitet26,27,28. HTX Center bruger mikrobatch-under-olie-metoden; Selvom det er mindre almindeligt anvendt, er det en robust metode, der minimerer forbruget af prøve- og krystalliseringscocktails20,21,22. En fordel ved mikrobatch-under-olie-metoden, især når der anvendes en paraffinolie med høj viskositet, er, at der kun sker let fordampning inden for dråben under eksperimentet, hvilket betyder, at ligevægtskoncentrationen opnås ved dråbeblanding. Hvis der observeres positive krystallisationsresultater i mikrobatch-under-olie-metoden, er reproduktionen af disse betingelser typisk mere ligetil end i dampdiffusionsopsætninger, hvor krystallisation sker på et udefineret punkt under ligevægten mellem krystallisationsfaldet og reservoiret. Reproducerbarheden af hits er ønskelig for krystalliseringsmetoder med høj kapacitet, som producerer uoverkommeligt små proteinkrystaller, der typisk skal optimeres til enkeltkrystal røntgeneksperimenter.
Krystalliseringsskærmen med høj kapacitet for opløselige proteiner består af cocktails, der tilberedes internt, færdige kommercielle skærme og internt modificerede kommercielle skærme22. Cocktailsene blev oprindeligt udviklet ved hjælp af den ufuldstændige faktorstrategi ved hjælp af tidligere vellykkede krystalliseringscocktails20. Reagenserne i skærmen, der er kommercielt tilgængelige, omfatter arrays af polymerer, krystallisationssalte, PEG og ionkombinationer og skærme, der anvender sparsom matrix og ufuldstændige faktorielle tilgange. Der er også reagenser, der modificeres før optagelse i skærmen: en additiv skærm, en pH- og bufferskærm, en ionisk flydende additivskærm og en polymerskærm.
Kraften i kendte krystalliseringsbetingelser og strategier er blevet udnyttet i de 1.536 krystalliseringscocktails sammen med fordelene ved mikrobatch-under-olie-systemet til at generere en rørledning, der anvender automatiseret væskehåndtering, automatiseret brightfield-billeddannelse og anden ordens ikke-lineær billeddannelse af chirale krystaller (SONICC). Automatiseringen af både væskehåndtering og billeddannelse giver fordelene ved færre våde laboratorietimer og højere reproducerbarhed. Den automatiserede krystalliseringsscreenings høje kapacitet nødvendiggør automatisering af processen med overvågning af krystalvækst. Disse fremskridt opnås med state-of-the-art billeddannelsesteknologier til at hjælpe med at identificere positive krystalhits. Både standard brightfield-billeddannelse af plader såvel som multifotonmetoder til forbedret detektion anvendes via et krystalbilleddannelsessystem med SONICC (figur 2). SONICC kombinerer anden harmonisk generation (SHG)29 mikroskopi og ultraviolet to-foton exciteret fluorescens (UV-TPEF)30 mikroskopi for at detektere meget små krystaller, såvel som dem, der er skjult af bundfald. SONIC-billeddannelsen informerer om, hvorvidt brøndene indeholder protein (via UV-TPEF) og krystaller (via SHG). Ud over den positive identifikation af proteinkrystaller kan yderligere oplysninger også opnås ved hjælp af state-of-the-art billeddannelsesmetoder. Billeddannelse kun med cocktails før tilsætning af prøver fungerer som en negativ kontrol; Disse billeder kan identificere brøndens udseende inden tilsætning af prøver, herunder med hensyn til saltkrystaller og snavs. Derudover hjælper SHG- og UV-TPEF-billeddannelse med at differentiere proteinkrystaller fra saltkrystaller og kan bruges til visualisering af proteinnukleinsyrekomplekst materiale31.
Krystalliseringseksperimenter med høj kapacitet, der gennemgår gentagen overvågning via billeddannelse, resulterer i en meget stor mængde billeder, der skal undersøges. Automatiserede krystalscoringsmetoder er blevet udviklet for at reducere byrden for brugeren og øge sandsynligheden for at identificere positive krystalhits. HTX Center deltog i udviklingen af MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO) scoringsalgoritme, en trænet dyb convolutional neural netværksarkitektur udviklet af et konsortium af akademiske, non-profit, offentlige og industrielle partnere til at klassificere brightfield brøndbilleder32. Algoritmen blev trænet på næsten en halv million brightfield-billeder fra krystalliseringseksperimenter fra flere institutioner ved hjælp af forskellige krystalliseringsmetoder og forskellige billeddannere. Algoritmen udsender en sandsynlighedsscore, der angiver, om et givet billede falder i fire mulige billedklasser: "krystal", "klar", "bundfald" og "andet". MARCO har en rapporteret klassificeringsnøjagtighed på 94,5%. Krystaldetektion forbedres yderligere med software, der implementerer algoritmen og giver en grafisk brugergrænseflade (GUI) til tilgængelig og enkel billedvisning, aktiveret med de AI-aktiverede scoringsfunktioner32,33. MARCO Polo GUI er designet til at fungere problemfrit med opsætningen af billedbehandlings- og datastyringssystemet i HTX Center for at identificere hits i skærmen med 1.536 brønde med menneskelig engagement for at undersøge outputtet af sorterede lister. Derudover er GUI'en som open source-software, der er tilgængelig på GitHub, let tilgængelig til ændring for at afspejle de specifikke behov hos andre laboratoriegrupper.
Her beskrives processen med at etablere et high-throughput microbatch-under-oil eksperiment ved hjælp af robotvæskehåndtering til at levere både cocktail og protein. HTX Center har et unikt udvalg af instrumenter og ressourcer, der ikke findes på andre institutioner, med det formål at levere screeningstjenester og uddannelsesressourcer til interesserede brugere. Demonstration af metoder og evner i robotik-aktiverede high-throughput teknikker vil gøre det muligt for samfundet at have viden om tilgængelige teknologier og træffe beslutninger for deres egen strukturbestemmelsesindsats.
Protocol
1. Forberedelse eller køb af cocktails til seksten 96-brønds dybe brøndblokke
- Tilbered internt genererede kemiske cocktails ved at dispensere i 96-brønds dybe brøndblokke (DW). Brug en robotvæskehåndterer til at dispensere og blande stamopløsninger af salte, buffere, polymerer og vand.
- Tilbered internt modificerede kemiske cocktails ved hjælp af en robotvæskehåndterer eller multikanalpipette for at tilføje yderligere komponenter til DW-blokskærme med 96 brønde, der er købt kommercielt.
- Køb kommercielt tilgængelige DW-blokke.
- Opbevares mærket DW-blokke med 96 brønde ved -20 °C i 12-18 måneder.
BEMÆRK: Cocktails tilberedt i trin 1.1. og 1.2. fyld 10/16 DW-blokke med 96 brønde, og DW-blokke med 5/16 96 brønde bruges som købt. En DW-blok med 96 brønde i skærmen er opsat på tidspunktet for dispensering af 1.536-brøndspladen for at undgå udfældning af additivskærmen (se afsnit 3).
2. Dispensering af cocktails til tallerkener med 384 brønde
- DW-blokkene med 96 brønde skal tøs op ved 4 °C natten over. Bring til stuetemperatur (20-23 °C), inden forberedelsen af pladerne med 384 brønde påbegyndes.
BEMÆRK: Stuetemperatur er velegnet til tilberedning af cocktailpladerne. Den største bekymring ved fremstilling af disse plader er at undgå bundfald, som kan tilstoppe væskehåndteringsanordninger og føre til uforudsigelige ændringer i koncentrationerne af cocktailingredienserne. - Blokkene blandes grundigt ved invertering efter behov for at opløse ethvert vedvarende uigennemsigtigt bundfald. Hvis nogle huller indeholder bundfald, opvarmes blokkene til 30 °C for at opløses.
- Lever 50 μL cocktailopløsning fra fire DW-blokke med 96 brønde til en plade med 384 brønde ved hjælp af en væskehåndteringsrobot udstyret med en 96 sprøjte eller pipetterhoved. De fire DW-blokke med 96 brønde er stemplet ud i 384-brøndspladen, således at kvadranter fyldes (f.eks. A1 af 96-DW1 til A1 af 384-plade1, A1 af 96-DW2 til B1 af 384-plade1 osv.) (Figur 3).
- Aflever 15 af DW-blokkene med 16 96 brønde til 384-brøndsplader til opbevaring.
- Opbevar pladerne med 384 brønde ved -20 °C i op til 6 måneder til brug ved klargøring af pladerne med 1.536 brønde.
3. Klargøring af pladerne med 1.536 brønde med olie- og krystalliseringscocktails
- Aflever 5 μL paraffinolie til hver brønd i en plade med 1.536 brønde ved hjælp af et robotvæskehåndteringssystem med kapacitet til langsom aspiration og levering. Opbevar oliepladerne ved 4 °C i op til 6 måneder.
- 384-brøndpladerne tøs op fra sektion 2 ved 4 °C natten over. Inverter pladerne for at blande opløsningerne og opløse bundfaldet. Pladerne inkuberes ved 30 °C for at opløse persistente bundfald.
- Til fremstilling af additivskærmkomponenterne skal du bruge den endelige DW-blok med 96 huller, der indeholder 0,1 M HEPES pH 6,8, 30 % PEG3350, til at blande med den kommercielle additivskærm ved hjælp af enten en væskehåndteringsrobot eller en multikanalpipette.
- Additivskærmopløsningerne fremstilles ved at dispensere en 1:1-blanding af den bufferede PEG3350-opløsning fremstillet i trin 3.3 og additivskærmen til et slutvolumen på 50 μl i den relevante plade med 384 huller.
- Brug en væskehåndteringsrobot udstyret med en 384 sprøjte eller pipetterhoved til at levere 200 nL cocktailopløsning i hver brønd på pladen med 1.536 brønde. Stempel fire 384-brøndsplader ud i 1.536-brøndpladen, således at kvadranter fyldes (f.eks. A1 af 384-plade1 til A1 af 1.536-brøndpladen, A2 af 384-plade1 til A3 af 1.536-brøndpladen osv.) (Figur 3).
- Pladerne centrifugeres ved 150 × g i 5 minutter inden opbevaring ved 4 °C i op til 4 uger.
4. Indsendelse af prøver
- For at indsende en prøve skal du sende en reservations-e-mail inden reservationsfristen for den kommende screeningskørsel. Angiv antallet af screeningsforsøg, navn, PI og institution samt eventuelle særlige håndteringskrav til prøven. Screeningskørsler udføres cirka en gang om måneden, hvilket resulterer i 12 kørsler årligt.
- Udfyld en formular til indsendelse af prøven, inden du sender prøven.
- For nye brugere skal du vælge en adgangskode , der skal bruges til at downloade krystalliseringsbillederne i afsnit 7.
- For etablerede brugere skal du bruge en eksisterende adgangskode eller ændre adgangskoden på dette trin.
- Indsend prøven i et 1,5 ml rør. Sørg for, at makromolekylet er homogent og tilstrækkeligt koncentreret til at fremme krystallisering. Brug en prækrystallisationstest, typisk sammensat af ammoniumsulfat eller PEG 4.000, til at undersøge den passende prøvekoncentration ved at observere, om de testede prøvekoncentrationer resulterer i klare dråber eller bundfald34.
BEMÆRK: Egnede kvalitetstest, der kan udføres inden indsendelse af prøver for at kontrollere renhed og homogenitet, omfatter blandt andet SDS-PAGE, gelfiltrering og dynamisk lysspredning (DLS). Krystallisation kan påvirkes af tilstedeværelsen af selv mindre urenheder. Der kræves i øjeblikket et prøvevolumen på 500 μL for at oprette en plade med 1.536 brønde. Testning er i gang for at reducere kravet til prøvevolumen.- Undgå at bruge bufferkoncentrationer større end 50 mM samt fosfater, som kan krystallisere inden for skærmen.
- Undgå overdrevne opløselige midler, herunder glycerolkoncentrationer større end 10% w / v.
- Pak prøven for sikkert at opretholde en passende temperatur ved hjælp af tøris, vådis eller kølepakker i en forseglet beholder.
- Skibsprøveprioritet natten over på en mandag-onsdag under kørslen.
- Send sporingsnummeret via e-mail, når prøven er afsendt.
5. Prøveopsætning i de forberedte plader med 1.536 brønde
- Udpak prøverne og inkuber straks ved den temperatur, brugeren har anmodet om.
- Når prøven er optøet, centrifugeres den ved 10.000 × g i 2 minutter ved stuetemperatur. Observer visuelt prøven for at identificere udfældning, farve og tilstand af prøven inden opsætning.
- Pladen med 1.536 huller opvarmes til 23 °C og centrifugeres ved 150 × g i 5 minutter. Afbild tallerkenen, der kun er cocktail, ved hjælp af brightfield-billeddannelse som en negativ kontrol.
BEMÆRK: Alle plader er afbildet med brightfield-billeddannelse inden prøveopsætning, hvilket muliggør identifikation af brønde, der allerede har krystaller eller snavs i dem, før prøvetilsætning som en negativ kontrol. Desuden muliggør det identifikation af brønde, hvor krystalliseringscocktailen ikke er leveret. Opvarmning af pladen til stuetemperatur eliminerer kondens på pladeoverfladen, hvilket fører til klare billeder. - Dispenser 200 nL prøve til hver brønd i 1.536-brøndpladen ved hjælp af en væskehåndteringsrobot. Centrifugeringspladen anbringes ved 150 × g og inkubationspladerne ved 4 °C, 14 °C eller 23 °C.
BEMÆRK: Microbatch under-olie-eksperimenter kan opstilles manuelt ved at dispensere proteinet og cocktailen under den ønskede olie. Det anbefales dog at bruge ikke mindre end 1 μL af hvert protein og cocktail for at opnå reproducerbare resultater.
6. Overvåg plader med 1.536 brønde for krystaldannelse
- Når prøven er føjet til pladerne med 1.536 brønde, afbildes billedet med brightfield-billeddannelse på dag 1 og uge 1, uge 2, uge 3, uge 4 og uge 6.
- Der skal udføres sonisk billeddannelse med SHG og UV-TPEF på 4-ugerstidspunktet for plader, der inkuberes ved 23 °C, og på 6-ugerstidspunktet for plader, der inkuberes ved 14 °C eller 4 °C.
BEMÆRK: Tidspunktet for SONIC-billeddannelsen er planlagt til 4 ugers og 6 ugers tidspunkter for 1.536 mikroassaypladen med høj kapacitet, fordi krystaller typisk vises ved disse tidspunkter. For modifikation til en 96-brønds mikrobatch under olie- eller dampdiffusionseksperimenter anbefales det at udføre SONIC-billeddannelsen tidligere i tidsvinduet. - Få adgang til de eksperimentelle billeder, der automatisk er overført til brugerkontoen ved hjælp af et internt LIMS-system. Underret brugerne via en automatiseret htslab-e-mail-dæmon om, at billeddannelse har fundet sted.
7. Billedanalyse
- Hent screeningsbillederne fra HWI-ftp-stedet for hver .rar fil.
BEMÆRK: Billedoutputtet fra 1.536-skærmen resulterer i et antal filer, der indeholder brightfield-billeder, SHG-billeder og UV-TPEF-billeder. Hver billedbehandlingsmodalitet eller -tid er en separat .rar fil. Hver .rar fil, når den pakkes ud, indeholder et billede fra hver brønd af 1.536-brøndpladen på et bestemt tidspunkt ved hjælp af en specifik billedbehandlingsmodalitet.- Brug FileZilla-klienten eller andre muligheder for at få adgang til ftp-dataene.
BEMÆRK: FileZilla-klienten er den anbefalede måde at administrere den store filoverførselsvolumen for at minimere beregningsnedbrud.- Hvis FileZilla Client skal installeres på brugerens computer, skal du downloade FileZilla-softwaren.
- Hvis FileZilla Client allerede er installeret eller efter installationen, skal du klikke på FileZilla-ikonet for at åbne softwaren.
- Log ind på den eksterne ftp-server fra FileZilla ved at indtaste værts-ftp-webstedet, brugernavnet og adgangskoden.
- Download de .rar filer til den ønskede mappe.
- Brug FileZilla-klienten eller andre muligheder for at få adgang til ftp-dataene.
- Brug den AI-aktiverede open source-GUI til at se, score og analysere krystalliseringsbillederne.
BEMÆRK: GUI'en kan bruges på de fleste Windows-, Mac- og Linux-operativsystemer (OS), og OS-specifikke instruktioner til download findes på GitHub-webstedet. MARCO Polo er en open source GUI, der inkorporerer metadata fra high-throughput 1,536 krystalliseringsskærmen implementeret på HTX Center. Den er tilgængelig for alle at downloade fra GitHub til ændring for at afspejle de specifikke behov hos andre laboratoriegrupper.- Åbn .rar filen i GUI'en, når filen er downloadet (se supplerende figur S1).
- Klik på Importer, vælg Billeder i rullemenuen, og vælg derefter Fra Rar Arkiv / Bibliotek.
- Klik på Søg efter mappe i popup-vinduet, og naviger derefter til mappen, der indeholder billederne.
- Vælg den eller de ønskede filer, og importer til GUI ved at klikke på Åbn. Vent på, at filen/filerne vises i vinduet Valgte kurver . Vælg en eller flere filer, der skal downloades til GUI'en, og klik på Importer kørsler.
- Se billedet for den første brønd i vinduet i Slideshow Viewer i GUI ved at klikke på > -symbolet til venstre for eksempelnavnet og derefter vælge den relevante læsning ved at dobbeltklikke på den (læsninger er angivet efter dato og type billede-brightfield, UV-TPEF eller SHG).
- Forstør billedet ved at ændre størrelsen på hele vinduet. Feltet Billeddetaljer indeholder oplysninger om billedet, herunder pointoplysninger (tomt, indtil læsningen er blevet scoret). Feltet Cocktaildetaljer indeholder metadata om cocktailkomponenterne.
- Gå til den næste brønd ved at klikke på knappen Næste i navigationspanelet eller trykke på højre piletast på tastaturet. Naviger til en bestemt brønd ved at indtaste brøndnummeret i vinduet Efter brøndnummer .
- Se alle læsninger (af dem, der er importeret til GUI) ved at markere afkrydsningsfeltet Vis alle datoer .
- Se alle spektre (af dem, der importeres til GUI) ved at markere afkrydsningsfeltet Vis alle spektre . Klik på knappen Byt spektrum for at se hvert spektrumbillede individuelt.
- Åbn .rar filen i GUI'en, når filen er downloadet (se supplerende figur S1).
- Scor krystalbillederne ved hjælp af MARCO-algoritmen ved først at fremhæve et bestemt løb fra listen i venstre side af vinduet. Klik derefter på knappen Klassificer valgt kørsel . Se MARCO-scoringsoplysningerne i vinduet Billeddetaljer , når der er scoret en billedaflæsning for alle 1.536 brønde.
BEMÆRK: Klassificering vil typisk tage mellem 2-5 minutter, afhængigt af computerens hastighed og tilgængelige hukommelse. Algoritmen genererer scores, der klassificerer indholdet i "krystal", "klar", "bundfald" eller "andre" klasser. De numeriske værdier, der er knyttet til hver brønds klassificering, afspejler sandsynligheden for, at brønden indeholder genstande af den pågældende klasse.- Se et undersæt af de scorede billeder ved at markere de(t) ønskede felt(er) i panelet Billedfiltrering og klikke på knappen Send filtre . Se f.eks. kun de billeder, der er klassificeret af MARCO som krystaller, ved at markere felterne Krystaller og MARCO og klikke på Send filtre.
- Bedøm krystalbillederne manuelt for at generere sættet "human scored". Tildel en score til en brønd ved at klikke på den relevante knap (knapperne "krystal", "klar", "bundfald" eller "anden" er placeret i klassificeringspanelet nederst i vinduet). Alternativt kan du bruge det numeriske tastatur på tastaturet til at tildele scoren (1 = "krystal", 2 = "klar", 3 = "bundfald", 4 = "andet"). Angiv et billede med menneskelig score som en "favorit" ved at markere favoritten? æske.
BEMÆRK: Se kun de billeder, der er klassificeret af et menneske som krystaller ved at markere felterne Krystaller og Mennesker og klikke på Send filtre. Hvis du klikker på boksen Favoritter i panelet Filtrering, indsnævres de returnerede billeder yderligere, så der kun returneres krystalbilleder med menneskeligt score, som også er favoritter. - Brug fanen Pladefremviser til at få vist flere brønde på én gang. På den anden fane Pladefremviser i kontrolpanelet skal du vælge 16, 64 eller 96 billeder i rullemenuen i afsnittet Billeder pr. plade . Brug fanen Billedfiltrering til at nedtone billeder, der ikke er interessante. Vælg feltet Anvend filter for at filtrere billederne.
BEMÆRK: Vælg for eksempel boksene "menneske" og "krystal", og kun de brønde, der blev scoret som en krystal af et menneske, vil være let synlige.- Naviger i fanen Pladefremviser ved at klikke på knappen Næste for at se det næste sæt 16/64/96-billeder. Som standard er billeder, der er scoret som krystaller, røde, de, der scores som klare, er blå, dem, der scores som bundfald, er grønne, og dem, der scores som andre, er orange. Skift farverne ved hjælp af rullemenuerne.
- Vælg de oplysninger, der skal vises i brøndene, ved at markere forskellige felter under fanen Etiketter .
- Klik på Gem visning for at gemme en billedfil af den aktuelle visning.
- Klik på Byt spektrum for at skifte mellem brightfield-, SHG- og UV-TPEF-billeder til billedet med flere brønde.
- Klik på Eksporter, og vælg den relevante filtype i rullemenuen for at eksportere de scorede filer til brug i andre programmer.
BEMÆRK: CSV-filer (kommaseparerede værdier) er kompatible med regnearksprogrammer som Microsoft Excel eller Google Sheets. JSON-filer (JavaScript Object Notation) kan åbnes med de fleste teksteditorer. PPTX (PowerPoint-præsentation) kan bruges til at vise billeder fra Polo, herunder en sammenligning af brightfield-, UV-TPEF- og SHG-billeder. Filer gemmes i .xtal-format for at blive genåbnet i MARCO Polo GUI.- Gem en fil i .xtal-format ved at klikke på Filer øverst på siden og derefter vælge enten Gem kørsel eller Gem kørsel som. Angiv et filnavn og en mappeplacering.
- Åbn filer i .xtal-format ved at klikke på Importer og vælge Billeder og derefter Fra gemt kørsel. Søg efter den relevante filplacering, klik på filnavnet, og klik derefter på Åbn.
Representative Results
Resultaterne af 1.536-brønds krystalscreeningseksperimentet består af syv komplette brightfield-billedsæt indsamlet på dag 0 (negativ kontrol), dag 1, uge 1, uge 2, uge 3, uge 4 og uge 6 (figur 4). SONIC-billeder indsamles på 4-ugerstidspunktet for plader, der er inkuberet ved 23 °C, og på 6-ugers-tidspunktet for plader, der er inkuberet ved 4 °C eller 14 °C. Alt i alt, når en prøve er afsendt, kan brugerne forvente at få deres plader sat op inden for 1 dag efter ankomst. Billederne uploades, efterhånden som de indsamles. Krystalliseringsscreeningseksperimentet afsluttes efter 6 uger.
Pladeopsætningen med 1.536 brønde gør det muligt at udføre alle screeningseksperimenter inden for samme plade, hvilket begrænser prøveforbruget og letter billeddannelse og direkte sammenligning mellem billedbehandlingsmetoder. Repræsentative resultater for tidsforløbet for krystalvækst for en enkelt cocktailtilstand er vist i figur 4. Automatiseret pladebilleddannelse i løbet af eksperimentet gør det muligt at identificere både hurtigt og langsomt voksende krystaller ved brightfield-billeddannelse. UV-TPEF- og SHG-billeddannelsen tillader krydsvalidering af de hits, der observeres ved brightfield-billeddannelse, og indikerer, at de observerede krystaller er henholdsvis proteinholdige og krystallinske (figur 5A, B). Desuden gør SONICC-billeddannelse det muligt at identificere krystaller, der er visuelt skjult af bundfald eller film (figur 5C) eller mikrokrystaller, der ellers kan forveksles med bundfald (figur 5D). For nogle krystaller er mangel på SHG-signal ikke diskvalificerende, da nogle punktgrupper ikke producerer et SHG-signal35,36, som eksemplificeret ved den tetragonale thaumatinkrystal i figur 5C. Omvendt bør der forventes mangel på UV-TPEF-signal for proteiner, der mangler tryptophanrester. Observationen af UV-TPEF- og SHG-signaler letter også identifikationen af ikke-proteinsaltkrystaller, som vil dukke op i brightfield og udvise et stærkt positivt SHG-signal, men vil mangle et UV-TPEF-signal (figur 5E).
Billedanalyse til pladeopsætningen strømlines med MARCO Polo GUI, som også bundter ftp-dataoverførslen fra HWI-serverne (som et alternativ til overførsel af filer med FileZilla). MARCO Polo GUI giver mulighed for let navigerbar plade- og billedvisning og udfører beregningsmæssig billedscoring ved hjælp af MARCO-algoritmen, så billedresultaterne hurtigt kan downloades, ses og analyseres fra HTX Center. MARCO-scoringsalgoritmen, som implementeret i MARCO Polo GUI, er i stand til at score billeder fra hele pladen med 1.536 brønde på mindre end 5 minutter. Billeder, der er markeret som krystallinske af MARCO-algoritmen, kan efterfølgende sorteres af Polo GUI til visning. Da MARCO-algoritmen blev optimeret til krystalidentifikation og minimering af falske negativer for ikke at gå glip af positive hits, kan scoringen resultere i falske positive flag. Ikke desto mindre resulterer MARCOS evne til at begrænse det sæt billeder, der skal undersøges, ved at fokusere opmærksomheden på brønde med stor sandsynlighed for at indeholde krystaller i en betydelig reduktion af databehandlingsbyrden for brugerne. Den praktiske implementering af algoritmen i den brugervenlige MARCO Polo-visningsplatform med dens evne til at sortere billeder baseret på MARCO-score forbedrer i høj grad brugerens evne til hurtigt at analysere datasættet og nøjagtigt bestemme krystalhits.
Figur 1: Skematisk oversigt over et screeningsforsøg med krystallisering med høj kapacitet på 1.536 brønde udført på HTX Center. (1) I dette trin tilsættes 5 μL paraffinolie og 200 nL cocktail til hvert hul (protokoltrin 3.1 og trin 3.5). En tegneserieillustration af en brønd, der kun indeholder olie og cocktail, og et repræsentativt billede vises til højre. (2) Prøverne ankommer til HTX Center (protokoltrin 5.1). 3) I dette trin tilsættes 200 nL prøve til hver brønd (protokoltrin 5.4). (4) Alle 1.536 brønde overvåges over tid ved hjælp af brightfield-billeddannelse, 5) samt UV-TPEF- og SHG-modaliteterne (protokoltrin 6). 6) Den AI-aktiverede open source GUI bruges til at se, score og analysere krystalliseringsbillederne (protokoltrin 7). Forkortelser: HTX = krystallisering med høj kapacitet; UV-TPEF = UV-to-foton exciteret fluorescens; SHG = anden harmonisk generation; AI = kunstig intelligens; GUI = grafisk brugergrænseflade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Enkelte plader med 1.536 brønde indeholdende screeningseksperimenter, afbildet ved hjælp af brightfield-, UV-TPEF- og SHG-billeddannelse. Pladerne med 1.536 brønde er vist med en amerikansk øre til skala (øverst). Hvert screeningseksperiment afbildes én gang før opsætning og seks gange efter prøvetilsætning med brightfield-billeddannelse (syv samlede brightfield-billedsæt, venstre). Pladerne gennemgår UV-TPEF (center) og SHG (højre) billeddannelse efter 4 uger eller 6 uger. Forkortelser: UV-TPEF = UV-to-foton exciteret fluorescens; SHG = anden harmonisk generation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematisk, der viser, hvordan pladerne med 1.536 brønde genereres. Seksten DW-blokke med 96 brønde bruges til at udrydde fire 384-brøndplader, hvor hver kvadrant af hver 384-brøndplade fyldes ved at dispensere krystalliseringscocktails. Fire DW-blokke med 96 brønde fylder en plade med 384 brønde (midten). Fire 384-brøndsplader bruges til at udrydde den enkelte 1.536-brøndplade (højre). Forkortelse: DW = dyb brønd. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativt tidsforløb for en enkelt brønd i et screeningseksperiment med 1.536 brønde. Pladerne afbildes før prøveopstilling (dag 0) samt med brightfield-billeddannelse på dag 1, uge 1, uge 2, uge 3, uge 4 og uge 6. Pladerne inkuberet ved 23 °C er afbildet med SONICC i uge 4. Skalastænger = 80 μm (brightfield), 200 μm (SHG, UV-TPEF). Forkortelser: SONICC = anden ordens ikke-lineær billeddannelse af chirale krystaller; UV-TPEF = UV-to-foton exciteret fluorescens; SHG = anden harmonisk generation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative billeddannelsesresultater for HT 1.536 krystalscreeningseksperimenter. Brightfield-, UV-TPEF- og SHG-billeddannelsesresultater vises for fem eksempler på brønde. (A,B) Proteinkrystaller observeret af brightfield-, UV-TPEF- og SHG-billeddannelse er tydeligt tydelige i alle tre billeddannelsesmetoder. (C) En proteinkrystal, der er skjult af film i brightfield-billeddannelse, er synlig ved UV-TPEF-billeddannelse; krystallen observeres ikke af SHG-billeddannelse på grund af punktgruppekompatibilitet. D) Eksempel på mikrokrystaller, der er verificeret ved UV-TPEF- og SHG-billeddannelse, og som ellers kan betragtes som bundfald. (E) Eksempel på saltkrystaller, der ser krystallinske ud ved brightfield- og SHG-billeddannelse, men ikke udviser et UV-TPEF-signal. Skalastænger = 200 μm. Brønddiameter = 0,9 mm. Forkortelser: UV-TPEF = UV-to-foton exciteret fluorescens; SHG = anden harmonisk generation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur S1: Åbning af billedfiler i MARCO Polo. Billedfiler kan åbnes i MARCO Polo GUI ved at navigere til Importer | Fanen Billeder øverst (a). Bemærk, at filer også kan overføres via FTP-værktøjet direkte i MARCO Polo (a) eller kan overføres via FileZilla som beskrevet i protokoltrin 7.2. Hvis du vil importere filer, der allerede er downloadet, skal du vælge Billeder | Fra Rar arkiv / bibliotek. I pop op-vinduet, der vises, skal du vælge Søg efter mappe (b) og navigere til den filmappe, hvor pladebilledfilerne gemmes. Når filerne er i vinduet Valgte stier (c), skal du markere en fil og klikke på Importer kørsler (d). MARCO Polo GUI identificerer de korrekte Cocktail File-metadata, der skal importeres med billederne. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Metoden beskriver en high-throughput pipeline til proteinkrystalliseringsscreening, der kræver så lidt som 500 μL prøve til 1.536 individuelle krystallisationseksperimenter i mikrobatch-under-olie-formatet. Rørledningen er afhængig af væskehåndteringsrobotik til hurtigt og reproducerbart at hjælpe den eksperimentelle opsætning samt den beregningsmæssige billedanalyseressource MARCO Polo, som er tilpasset til at analysere 1.536-brønds pladebilleder ved hjælp af MARCO-algoritmen til at identificere og isolere krystalhits.
Den lille mængde individuelle screeningsdråber (400 nL i alt med et forhold på 1: 1 prøve: cocktail) betyder, at der kræves ekstremt små prøvevolumener for at identificere positive krystalliseringsbetingelser. Disse små dråbestørrelser producerer nødvendigvis små krystaller, der ikke kan fiskes ved traditionel looping. Der er udviklet metoder til høst fra de 1.536 plader37; Derudover er pladerne med krystaller blevet brugt direkte ved synkrotronkilder til in situ dataindsamling38. Hvis der blev udviklet en robust metode til høst af disse krystaller, ville fremskridt inden for synkrotronteknologi og mikrofokuserede stråler yderligere gøre det muligt at opnå nyttige datasæt. Derudover kunne de opnåede krystaller potentielt bruges som frø til optimeringsindsats.
SONICC billeddannelse er klart fordelagtigt til at identificere både små proteinkrystaller og proteinkrystaller skjult under bundfald. På trods af disse fordele er ikke alle prøvetyper modtagelige for SHG- og UV-TPEF-billeddannelse. For eksempel vil proteiner med få eller ingen aromatiske tryptophanrester vise et tvetydigt UV-TPEF-signal. Desuden vil krystaller i specifikke rumgrupper, herunder centrosymmetriske grupper eller punktgruppe 432, ikke blive opdaget af SHG-billeddannelse. Prøver med fluoroforer interfererer undertiden med SHG-signalet, hvilket resulterer i annullering af signalet eller øget intensitet, hvilket betyder, at omhyggelig fortolkning af SHG-signaler er påkrævet for metalholdige proteiner og proteiner, der indeholder fluorescerende dele. I mange tilfælde er det imidlertid muligt at rationalisere fraværet af et SHG- eller UV-TPEF-signal, og manglen på disse signaler bør ikke nødvendigvis udelukke tilstedeværelsen af en proteinkrystal.
Mikrobatch-under-olie-formatet giver et alternativ til den mere almindelige dampdiffusionsmetode, der anvendes til krystallografi med høj kapacitet. Det er vigtigt, at krystalliseringsformatets indvirkning rammer identifikation39, hvilket giver en begrundelse for brugen af forskellige krystalliseringsformater til screeningsindsats med høj kapacitet. Automatiseret billeddannelse og SONICC-aktiverede modaliteter hjælper med hurtig identifikation af proteinkrystaller gennem hele det 6 ugers eksperimentelle tidsforløb. Endelig giver MARCO Polo GUI brugerne mulighed for hurtigt at analysere billeder fra 1.536 forhold for at identificere lovende hitbrønde til optimering. Funktionerne på HTX Center, herunder den robotik-aktiverede eksperimentelle opsætning med høj kapacitet, kombineret med de nyeste billeddannelses- og beregningsværktøjer til analyser, yder et stort bidrag til det strukturelle biologiske samfund ved at give forskere mulighed for effektivt at tackle en primær flaskehals i krystalbaseret strukturelt arbejde: at finde krystalliseringsbetingelser.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne udtrykke vores taknemmelighed over for vores brugere for at have betroet deres dyrebare prøver til os til krystalscreening, samt for at give kritisk feedback og anmodninger, der har hjulpet os med at forfine og udvikle vores ressourcer til bedre at tjene det strukturelle biologiske samfund. Vi vil også gerne takke Ethan Holleman, Dr. Lisa J Keefe og Dr. Erica Duguid, som drev udviklingen af MARCO Polo GUI. Vi vil gerne takke HWI-kollegerne for deres støtte og forslag, især Dr. Diana CF Monteiro. Vi anerkender økonomisk støtte fra National Institutes of Health, R24GM141256.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1536 Well Imp@ct LBR LoBase | Greiner Bio-One | 790 801 | |
| Acetic acid | Hampton Research | HR2-853 | |
| AlumaSeal II Sealing Film | Hampton Research | HR8-069 | |
| Ammonium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-247 | |
| Ammonium chloride | Hampton Research | HR2-691 | |
| Ammonium hydroxide | Hampton Research | HR2-855 | |
| Ammonium nitrate | Hampton Research | HR2-665 | |
| Ammonium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-629 | |
| Ammonium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-555 | |
| Ammonium sulfate | Hampton Research | HR2-541 | |
| Ammonium thiocyanate | Molecular Dimensions | MD2-100-301 | |
| Bicine pH 9.0 | Hampton Research | HR2-723 | |
| Bis-tris propane pH 7.0 | Hampton Research | HR2-993-08 | |
| Calcium acetate | Hampton Research | HR2-567 | |
| Calcium chloride dihydrate | Hampton Research | HR2-557 | |
| CAPS pH 10.0 | Rigaku Reagents | none given | |
| ClearSeal Film | Hampton Research | HR4-521 | |
| Cobalt sulfate heptahydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-42 | |
| Crystal Screen HT screen | Hampton Research | HR2-130 | |
| Formulator | Formulatrix | ||
| Glycerol | Hampton Research | HR2-623 | |
| Gryphon liquid handling robot | Art Robbins Instruments | ||
| HEPES pH 7.0 | Hampton Research | HR2-902-03 | |
| HEPES pH 7.5 | Hampton Research | HR2-902-08 | |
| HWI HTX Center sample submission form | https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/ | ||
| Hydrochloric acid | Hampton Research | HR2-581 | |
| Index HT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
| Ionic Liquid screen | Hampton Research | HR2-214 | |
| Lithium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-312 | |
| Lithium chloride | Hampton Research | HR2-631 | |
| Lithium sulfate monohydrate | Hampton Research | HR2-545 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Hampton Research | HR2-561 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Hampton Research | HR2-559 | |
| Magnesium nitrate hexahydrate | Hampton Research | HR2-657 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Hampton Research | HR2-821 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Millipore Sigma | 63535-50G | |
| Manganese sulfate monohydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-310 | |
| MARCO Polo GUI download | https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/ | ||
| Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot | Thermo Scientific | ||
| MES pH 6.0 | Hampton Research | HR2-943-09 | |
| Mosquito liquid handling robot | SPTLabtech | ||
| Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F | Sigma Aldrich | PX0045-3 | |
| PEG 1000 | Hampton Research | HR2-523 | |
| PEG 2000 | Hampton Research | HR2-592 | |
| PEG 20000 | Hampton Research | HR2-609 | |
| PEG 3350 | Hampton Research | HR2-527 | |
| PEG 400 | Hampton Research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton Research | HR2-529 | |
| PEG 6000 | Hampton Research | HR2-533 | |
| PEG 8000 | Hampton Research | HR2-535 | |
| PEG/Ion HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRx HT screen | Hampton Research | HR2-086 | |
| Plate reservations | htslab@hwi.buffalo.edu | ||
| Potassium acetate | Hampton Research | HR2-671 | |
| Potassium bromide | Hampton Research | HR2-779 | |
| Potassium carbonate | Molecular Dimensions | MD2-100-311 | |
| Potassium chloride | Hampton Research | HR2-649 | |
| Potassium nitrate | Hampton Research | HR2-663 | |
| Potassium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-635 | |
| Potassium phosphate-monobasic | Hampton Research | HR2-553 | |
| Potassium phosphate-tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-309 | |
| Potassium thiocyanate | Hampton Research | HR2-695 | |
| Rock Imager 1000 with SONICC | Formulatrix | ||
| Rock Imager 54 | Formulatrix | ||
| Rubidium chloride | Millipore Sigma | R2252-10G | |
| SaltRx HT screen | Hampton Research | HR2-136 | |
| Silver Bullets screen | Hampton Research | HR2-096 | |
| Slice pH screen | Hampton Research | HR2-070 | |
| Sodium acetate pH 5.0 | Hampton Research | HR2-933-15 | |
| Sodium bromide | Hampton Research | HR2-699 | |
| Sodium chloride | Hampton Research | HR2-637 | |
| Sodium citrate pH 4.2 | Hampton Research | HR2-935-01 | |
| Sodium citrate pH 5.6 | Hampton Research | HR2-735 | |
| Sodium hydroxide | Hampton Research | HR2-583 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-207 | |
| Sodium nitrate | Hampton Research | HR2-661 | |
| Sodium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-551 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Molecular Dimensions | MD-100-307 | |
| StockOptions Polymer screen | Hampton Research | HR2-227 | |
| Tacsimate pH 7 | Hampton Research | HR2-755 | |
| TAPS pH 9.0 | bioWORLD | 40121071 | |
| Tris pH 8 | Hampton Research | HR2-900-11 | |
| Tris pH 8.5 | Hampton Research | HR2-725 | |
| ViaFLO 384 | Integra | ||
| ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL) | Integra | ||
| ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL) | Integra | ||
| Zinc acetate dihydrate | Hampton Research | HR2-563 |
References
- PDB data distribution by experimental method and molecular type. RCSB Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/summary (2022).
- Maveyraud, L., Mourey, L. Protein X-ray crystallography and drug discovery. Molecules. 25 (5), 1030 (2020).
- Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
- Elbasir, A., et al. DeepCrystal: A deep learning framework for sequence-based protein crystallization prediction. Bioinformatics. 35 (13), 2216-2225 (2019).
- Zucker, F. H., et al. Prediction of protein crystallization outcome using a hybrid method. Journal of Structural Biology. 171 (1), 64-73 (2010).
- George, A., Wilson, W. W. Predicting protein crystallization from a dilute solution property. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (4), 361-365 (1994).
- Jia, Y., Liu, X. -Y. From surface self-assembly to crystallization: prediction of protein crystallization conditions. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6949-6955 (2006).
- Slabinski, L., et al. XtalPred: A web server for prediction of protein crystallizability. Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).
- Abrahams, G. J., Newman, J. BLASTing away preconceptions in crystallization trials. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (3), 184-192 (2019).
- Rosa, N., et al. Tools to ease the choice and design of protein crystallisation experiments. Crystals. 10 (2), 95 (2020).
- Newman, J., et al. On the need for an international effort to capture, share and use crystallization screening data. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (3), 253-258 (2012).
- Lynch, M. L., Dudek, M. F., Bowman, S. E. A searchable database of crystallization cocktails in the PDB: analyzing the chemical condition space. Patterns. 1 (4), 100024 (2020).
- Jancarik, J., Kim, S. -H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24 (4), 409-411 (1991).
- Carter, C. W. Efficient factorial designs and the analysis of macromolecular crystal growth conditions. Methods. 1 (1), 12-24 (1990).
- McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: An alternative strategy for crystallizing macromolecules. Journal of Structural Biology. 156 (3), 387-406 (2006).
- McPherson, A., Nguyen, C., Cudney, R., Larson, S. The role of small molecule additives and chemical modification in protein crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (5), 1469-1474 (2011).
- Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
- Thakur, A. S., et al. Improved success of sparse matrix protein crystallization screening with heterogeneous nucleating agents. PLoS One. 2 (10), 1091 (2007).
- Chayen, N. E., Stewart, P. D. S., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil-a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
- Luft, J. R., et al. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 142 (1), 170-179 (2003).
- Luft, J. R., Snell, E. H., DeTitta, G. T. Lessons from high-throughput protein crystallization screening: 10 years of practical experience. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 465-480 (2011).
- Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. , (2023).
- Segelke, B. W. Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening. Journal of Crystal Growth. 232 (1-4), 553-562 (2001).
- Luft, J. R., Newman, J., Snell, E. H. Crystallization screening: the influence of history on current practice. Acta Crystallographica Section F. 70 (7), 835-853 (2014).
- Mlynek, G., Kostan, J., Leeb, S., Djinovic-Carugo, K. Tailored suits fit better: Customized protein crystallization screens. Crystal Growth & Design. 20 (2), 984-994 (2019).
- Mueller-Dieckmann, J. The open-access high-throughput crystallization facility at EMBL Hamburg. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (12), 1446-1452 (2006).
- Weber, P., et al. High-throughput crystallization pipeline at the crystallography core facility of the Institut Pasteur. Molecules. 24 (24), 4451 (2019).
- Lin, Y. What's happened over the last five years with high-throughput protein crystallization screening. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (8), 691-695 (2018).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55 (4), 379-386 (2011).
- Madden, J. T., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Two-photon excited UV fluorescence for protein crystal detection. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 839-846 (2011).
- Fleming, A. M., et al. Second harmonic generation interrogation of the endonuclease APE1 binding interaction with G-quadruplex DNA. Analytical Chemistry. 94 (43), 15027-15032 (2022).
- Bruno, A. E., et al. Classification of crystallization outcomes using deep convolutional neural networks. PLoS One. 13 (6), 0198883 (2018).
- Holleman, E. T., Duguid, E., Keefe, L. J., Bowman, S. E. Polo: An open-source graphical user interface for crystallization screening. Journal of Applied Crystallography. 54 (2), 673-679 (2021).
- Niesen, F. H., et al. An approach to quality management in structural biology: Biophysical selection of proteins for successful crystallization. Journal of Structural Biology. 162 (3), 451-459 (2008).
- Padayatti, P., Palczewska, G., Sun, W., Palczewski, K., Salom, D. Imaging of protein crystals with two-photon microscopy. Biochemistry. 51 (8), 1625-1637 (2012).
- Haupert, L. M., DeWalt, E. L., Simpson, G. J. Modeling the SHG activities of diverse protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (11), 1513-1521 (2012).
- Luft, J. R., Grant, T. D., Wolfley, J. R., Snell, E. H. A new view on crystal harvesting. Journal of Applied Crystallography. 47 (3), 1158-1161 (2014).
- Bruno, A. E., Soares, A. S., Owen, R. L., Snell, E. H. The use of haptic interfaces and web services in crystallography: An application for a 'screen to beam' interface. Journal of Applied Crystallography. 49 (6), 2082-2090 (2016).
- Baldock, P., Mills, V., Stewart, P. S. A comparison of microbatch and vapour diffusion for initial screening of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 168 (1-4), 170-174 (1996).
