Summary
Este protocolo detalla el cribado de cristalización de alto rendimiento, que va desde la preparación de la placa de microensayo de 1.536 hasta el final de una ventana de tiempo experimental de 6 semanas. Se incluyen detalles sobre la configuración de la muestra, las imágenes obtenidas y cómo los usuarios pueden realizar análisis utilizando una interfaz gráfica de usuario habilitada para inteligencia artificial para identificar rápida y eficientemente las condiciones de cristalización macromolecular.
Abstract
La cristalografía de rayos X es la técnica más comúnmente empleada para discernir estructuras macromoleculares, pero el paso crucial de cristalizar una proteína en una red ordenada susceptible de difracción sigue siendo un desafío. La cristalización de las biomoléculas se define en gran medida experimentalmente, y este proceso puede ser laborioso y prohibitivo para los investigadores de instituciones con recursos limitados. En el Centro Nacional de Cristalización de Alto Rendimiento (HTX), se han implementado métodos altamente reproducibles para facilitar el crecimiento de cristales, incluida una configuración automatizada de placa de microlote bajo aceite de 1.536 pozos de alto rendimiento diseñada para muestrear una amplia gama de parámetros de cristalización. Las placas se monitorean utilizando modalidades de imágenes de vanguardia en el transcurso de 6 semanas para proporcionar información sobre el crecimiento de cristales, así como para distinguir con precisión los valiosos impactos de cristales. Además, la implementación de un algoritmo de puntuación de inteligencia artificial entrenado para identificar impactos de cristales, junto con una interfaz de código abierto y fácil de usar para ver imágenes experimentales, agiliza el proceso de análisis de imágenes de crecimiento de cristales. Aquí, se describen los procedimientos clave y la instrumentación para la preparación de los cócteles y las placas de cristalización, la obtención de imágenes de las placas y la identificación de los éxitos de una manera que garantice la reproducibilidad y aumente la probabilidad de una cristalización exitosa.
Introduction
Incluso en una época de tremendo progreso en los métodos de biología estructural, la cristalografía de rayos X sigue siendo un método confiable y popular para generar modelos estructurales de macromoléculas de alta calidad. Más del 85% de todos los modelos estructurales tridimensionales depositados en el Banco de Datos de Proteínas (PDB) provienen de métodos estructurales basados en cristales (a partir de enero de 2023). 1 Además, la cristalografía de rayos X sigue siendo indispensable para resolver estructuras proteína-ligando, un componente crucial del proceso de descubrimiento y desarrollo de fármacos2. A pesar de que la cristalización de proteínas ha seguido siendo la técnica de biología estructural dominante durante más de medio siglo, los métodos para predecir la probabilidad de cristalización basados en las propiedades físicas3 o la secuencia 4,5 todavía están en su infancia.
La predicción de las condiciones de cristalización es aún más oscura; Se han hecho progresos limitados para predecir las condiciones probables de cristalización incluso para las proteínas modelo 6,7. Otros estudios han intentado identificar condiciones de cristalización basadas en homología de proteínas y condiciones extraídas del PDB 8,9,10. Sin embargo, el poder predictivo que se encuentra en el PDB es limitado, ya que solo se depositan las condiciones de cristalización finales y exitosas, lo que, por necesidad, pierde los experimentos de optimización a menudo extensos necesarios para ajustar el crecimiento de los cristales. Además, muchas entradas de PDB carecen de metadatos que contengan estos detalles, incluidas las fórmulas de cóctel, el formato de cristalización, la temperatura y el tiempo para cristalizar11,12. Por lo tanto, para muchas proteínas de interés, la forma más accesible de determinar las condiciones de cristalización es experimentalmente, utilizando tantas condiciones como sea posible en una amplia gama de posibilidades químicas.
Se han explorado varios enfoques para hacer que el cribado de cristalización sea lo más fructífero y minucioso posible, incluidas las matrices dispersas 13, el cribado factorial incompleto 14, los aditivos 15,16, la siembra 17 y los agentes nucleantes 18. El Centro Nacional HTX del Instituto de Investigación Médica Hauptman-Woodward (HWI) ha desarrollado una tubería eficiente para el cribado de cristalización utilizando el enfoque de microlotes bajo aceite19, que utiliza modalidades automatizadas de manejo de líquidos e imágenes para agilizar la identificación de las condiciones iniciales de cristalización utilizando volúmenes de muestra y cócteles comparativamente mínimos (Figura 1). El conjunto de 1.536 cócteles únicos se basa en condiciones previamente determinadas como propicias para el crecimiento de cristales de proteínas y están diseñados para ser químicamente diversos con el fin de muestrear una amplia gama de posibles condiciones de cristalización20,21,22. El amplio muestreo de las condiciones de cristalización aumenta la probabilidad de observar una o más pistas de cristalización.
Pocos análisis formales de cuántas condiciones son necesarias para el cribado han aparecido en la literatura. Un estudio se centró en el diseño de muestreo de diferentes pantallas y encontró que el muestreo aleatorio de componentes (similar a un factorial incompleto) representaba el método de muestreo más completo y eficiente23. Otro estudio de detección señaló que ha habido numerosos casos en que la pantalla muy completa de 1,536 ha producido solo un cristal que alcanzó24, y un estudio muy reciente destacó que la mayoría de las pantallas comerciales subestiman el espacio de cristalización que se sabe que está asociado con los golpes de detección25. No todos los cables de cristalización producirán un cristal de calidad de difracción adecuado para la recopilación de datos debido al desorden inherente dentro del cristal, las limitaciones de difracción o los defectos del cristal; Por lo tanto, lanzar una red más amplia para las condiciones tiene el beneficio adicional de proporcionar formas cristalinas alternativas para la optimización.
El formato de los experimentos de cristalización de proteínas también tiene un impacto en el éxito de la pantalla. La difusión de vapor es la configuración más utilizada para aplicaciones de cristalización de alto rendimiento y se utiliza en centros de cristalización de última generación, incluidos los centros de cribado de alto rendimiento EMBL Hamburgo e Institut Pasteur26,27,28. El Centro HTX utiliza el método de microlotes bajo aceite; Aunque menos utilizado, es un método robusto que minimiza el consumo de cócteles de muestra y cristalización20,21,22. Una ventaja del método de microlote bajo aceite, particularmente cuando se usa un aceite de parafina de alta viscosidad, es que solo se produce una ligera evaporación dentro de la gota durante el experimento, lo que significa que la concentración de equilibrio se logra al mezclar gotas. Si se observan resultados positivos de cristalización en el método de microlotes bajo aceite, la reproducción de estas condiciones suele ser más sencilla que en las configuraciones de difusión de vapor, en las que la cristalización ocurre en algún punto indefinido durante el equilibrio entre la caída de cristalización y el depósito. La reproducibilidad de los hits es deseable para los enfoques de cristalización de alto rendimiento, que producen cristales de proteínas prohibitivamente pequeños que normalmente necesitan ser optimizados para experimentos de rayos X de un solo cristal.
La pantalla de cristalización de alto rendimiento para proteínas solubles se compone de cócteles preparados internamente, pantallas comerciales preparadas y pantallas comerciales modificadas internamente22. Los cócteles se desarrollaron inicialmente utilizando la estrategia factorial incompleta utilizando cócteles de cristalización previamente exitosos20. Los reactivos en la pantalla que están disponibles comercialmente incluyen matrices de polímeros, sales de cristalización, PEG y combinaciones de iones y pantallas que utilizan enfoques factoriales incompletos y de matriz dispersa. También hay reactivos que se modifican antes de su inclusión en la pantalla: una pantalla de aditivos, una pantalla de pH y tampón, una pantalla de aditivos líquidos iónicos y una pantalla de polímero.
El poder de las condiciones y estrategias de cristalización conocidas se ha aprovechado en los 1.536 cócteles de cristalización, junto con los beneficios del sistema de microlotes bajo aceite para generar una tubería que emplea el manejo automatizado de líquidos, imágenes automatizadas de campo claro e imágenes no lineales de segundo orden de cristales quirales (SONICC). La automatización tanto del manejo de líquidos como de las imágenes proporciona los beneficios de menos horas de laboratorio húmedo y una mayor reproducibilidad. La naturaleza de alto rendimiento del cribado de cristalización automatizado requiere la automatización del proceso de monitoreo del crecimiento de cristales. Estos avances se logran con tecnologías de imagen de vanguardia para ayudar en la identificación de impactos de cristales positivos. Tanto las imágenes estándar de campo claro de placas, como los métodos multifotones para una detección mejorada, se utilizan a través de un sistema de imágenes de cristal con SONICC (Figura 2). SONICC combina microscopía de segunda generación armónica (SHG)29 y microscopía ultravioleta de fluorescencia excitada de dos fotones (UV-TPEF)30 para detectar cristales muy pequeños, así como aquellos oscurecidos por precipitado. Las imágenes de SONICC informan si los pocillos contienen proteínas (a través de UV-TPEF) y cristales (a través de SHG). Más allá de la identificación positiva de cristales de proteínas, también se puede obtener información adicional utilizando métodos de imagen de última generación. Las imágenes de solo cóctel antes de la adición de la muestra sirven como control negativo; Estas imágenes pueden identificar la apariencia del pozo antes de la adición de la muestra, incluso en términos de cristales de sal y desechos. Además, las imágenes SHG y UV-TPEF ayudan a diferenciar los cristales de proteínas de los cristales de sal y se pueden utilizar para visualizar material complejado proteína-ácido nucleico31.
Los experimentos de cristalización de alto rendimiento sometidos a monitoreo repetido a través de imágenes dan como resultado un gran volumen de imágenes que necesitan examen. Se han desarrollado métodos automatizados de puntuación de cristales para reducir la carga sobre el usuario y aumentar la probabilidad de identificar impactos positivos de cristales. El Centro HTX participó en el desarrollo del algoritmo de puntuación MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO), una arquitectura de red neuronal convolucional profunda entrenada desarrollada por un consorcio de socios académicos, sin fines de lucro, gubernamentales e industriales para clasificar imágenes de pozos de campo claro32. El algoritmo fue entrenado en casi medio millón de imágenes de campo claro de experimentos de cristalización de múltiples instituciones utilizando diferentes métodos de cristalización y diferentes generadores de imágenes. El algoritmo genera una puntuación probabilística que indica si una imagen dada cae en cuatro clases de imagen posibles: "cristal", "claro", "precipitado" y "otro". MARCO tiene una precisión de clasificación reportada del 94.5%. La detección de cristales se mejora aún más con un software que implementa el algoritmo y proporciona una interfaz gráfica de usuario (GUI) para una visualización de imágenes accesible y simple, habilitada con las capacidades de puntuación habilitadas para IA32,33. La GUI de MARCO Polo está diseñada para funcionar a la perfección con la configuración del sistema de gestión de imágenes y datos en el HTX Center para identificar impactos en la pantalla de 1.536 pocillos, con participación humana para examinar la salida de listas ordenadas. Además, como software de código abierto disponible en GitHub, la GUI está disponible para su modificación para reflejar las necesidades específicas de otros grupos de laboratorio.
Aquí, se describe el proceso de configuración de un experimento de microlote bajo aceite de alto rendimiento utilizando el manejo robótico de líquidos para entregar tanto el cóctel como la proteína. El Centro HTX tiene una variedad única de instrumentación y recursos que no se encuentran en otras instituciones, con el objetivo de proporcionar servicios de detección y recursos educativos a los usuarios interesados. Demostrar los métodos y capacidades de las técnicas de alto rendimiento habilitadas para la robótica permitirá a la comunidad tener conocimiento de las tecnologías disponibles y tomar decisiones para sus propios esfuerzos de determinación de estructuras.
Protocol
1. Preparación o compra de cócteles para dieciséis bloques de pozos de 96 pozos de profundidad
- Prepare cócteles químicos generados internamente dispensando en bloques de pozos profundos (DW) de 96 pozos. Utilice un manipulador de líquidos robótico para dispensar y mezclar soluciones madre de sales, tampones, polímeros y agua.
- Prepare cócteles químicos modificados internamente utilizando un manipulador de líquidos robótico o una pipeta multicanal para agregar componentes adicionales a las pantallas de bloques DW de 96 pocillos que se han comprado comercialmente.
- Compre bloques DW disponibles comercialmente.
- Almacene los bloques DW etiquetados de 96 pocillos a -20 °C durante 12-18 meses.
NOTA: Los cócteles preparados en el paso 1.1. y 1.2. llenar 10/16 bloques DW de 96 pocillos y 5/16 bloques DW de 96 pocillos se utilizan tal como se compraron. Se configura un bloque DW de 96 pocillos en la pantalla en el momento de la dispensación de la placa de 1.536 pocillos para evitar la precipitación de la criba de aditivos (ver sección 3).
2. Dispensar los cócteles a platos de 384 pocillos
- Descongele los bloques DW de 96 pocillos a 4 °C durante la noche. Llevar a temperatura ambiente (20-23 °C) antes de comenzar la preparación de las placas de 384 pocillos.
NOTA: La temperatura ambiente es adecuada para preparar los platos de cóctel. La principal preocupación en la preparación de estos platos es evitar precipitados, que pueden obstruir los dispositivos de manejo de líquidos y provocar cambios impredecibles en las concentraciones de los ingredientes del cóctel. - Mezcle bien los bloques por inversión según sea necesario para disolver cualquier precipitado opaco persistente. Si algún pozo contiene precipitado, caliente los bloques a 30 ° C para disolverse.
- Administre 50 μL de solución de cóctel desde cuatro bloques DW de 96 pocillos a una placa de 384 pocillos utilizando un robot de manipulación de líquidos equipado con una jeringa de 96 o un cabezal de pipeta. Los cuatro bloques DW de 96 pocillos se estampan en la placa de 384 pocillos de tal manera que se llenan los cuadrantes (por ejemplo, A1 de 96-DW1 a A1 de 384-placa1, A1 de 96-DW2 a B1 de 384-placa1, etc.) (Figura 3).
- Entregue 15 de los 16 bloques DW de 96 pocillos a placas de 384 pocillos para su almacenamiento.
- Almacene las placas de 384 pocillos a -20 °C durante un máximo de 6 meses para utilizarlas en la preparación de las placas de 1.536 pocillos.
3. Preparación de los platos de 1.536 pocillos con cócteles de aceite y cristalización
- Suministre 5 μL de aceite de parafina a cada pocillo de una placa de 1.536 pocillos utilizando un sistema robótico de manejo de líquidos con capacidad de aspiración y entrega lentas. Conservar las placas de aceite a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
- Descongele las placas de 384 pocillos de la sección 2 a 4 °C durante la noche. Invierta las placas para mezclar las soluciones y disuelva el precipitado. Incubar las placas a 30 °C para disolver los precipitados persistentes.
- Para preparar los componentes de la criba de aditivos, utilice el bloque DW final de 96 pocillos que contiene 0,1 M HEPES pH 6,8, 30% de PEG3350 para mezclar con la criba de aditivos comercial utilizando un robot de manipulación de líquidos o una pipeta multicanal.
- Preparar las soluciones de cribado aditivo dispensando una mezcla 1:1 de la solución tamponada de PEG3350 preparada en la etapa 3.3 y la criba aditiva hasta un volumen final de 50 μL en la placa adecuada de 384 pocillos.
- Utilice un robot de manipulación de líquidos equipado con una jeringa 384 o un cabezal de pipeta para administrar 200 nL de solución de cóctel en cada pocillo de la placa de 1.536 pocillos. Coloque cuatro placas de 384 pocillos en la placa de 1.536 pocillos de tal manera que se llenen los cuadrantes (por ejemplo, A1 de la placa de 3841 a A1 de la placa de 1.536 pocillos, A2 de la placa de 384 a A3 de la placa de 1.536 pocillos, etc.) (Figura 3).
- Centrifugar las placas a 150 × g durante 5 min antes de conservarlas a 4 °C durante un máximo de 4 semanas.
4. Envío de muestras
- Para enviar una muestra, envíe un correo electrónico de reserva antes de la fecha límite de reserva para la próxima prueba. Incluya el número de experimentos de detección, el nombre, el indicador de rendimiento y la institución, así como cualquier requisito especial de manejo para la muestra. Las pruebas de detección se llevan a cabo aproximadamente una vez al mes, lo que resulta en 12 carreras al año.
- Complete un formulario de envío de muestra antes de enviar la muestra.
- Para los nuevos usuarios, elija una contraseña que se utilizará para descargar las imágenes de cristalización en la sección 7.
- Para los usuarios establecidos, use una contraseña existente o cámbiela en este paso.
- Enviar la muestra en un tubo de 1,5 ml. Asegúrese de que la macromolécula sea homogénea y esté adecuadamente concentrada para promover la cristalización. Utilice una prueba de precristalización, típicamente compuesta de sulfato de amonio o PEG 4,000, para investigar la concentración de muestra apropiada observando si las concentraciones de muestra probadas resultan en gotas claras o precipitan34.
NOTA: Las pruebas de calidad adecuadas que se pueden realizar antes del envío de la muestra para verificar la pureza y homogeneidad incluyen SDS-PAGE, filtración en gel y dispersión dinámica de luz (DLS), entre otras. La cristalización puede verse afectada por la presencia de impurezas incluso menores. Actualmente se requiere un volumen de muestra de 500 μL para instalar una placa de 1.536 pocillos. Se están realizando pruebas para disminuir el requisito de volumen de muestra.- Evite el uso de concentraciones tampón superiores a 50 mM, así como fosfatos, que pueden cristalizar dentro de la pantalla.
- Evite el exceso de agentes solubilizantes, incluidas las concentraciones de glicerol superiores al 10% p/v.
- Empaquete la muestra para mantener de manera segura una temperatura adecuada utilizando hielo seco, hielo húmedo o paquetes de enfriamiento en un recipiente sellado.
- Envíe la prioridad de muestra durante la noche de lunes a miércoles durante la carrera.
- Envíe por correo electrónico el número de seguimiento una vez que se haya enviado la muestra.
5. Configuración de la muestra en las placas preparadas de 1.536 pocillos
- Desembalar las muestras e incubar inmediatamente a la temperatura que el usuario haya solicitado.
- Una vez descongelada, centrifugar la muestra a 10.000 × g durante 2 min a temperatura ambiente. Observe visualmente la muestra para identificar la precipitación, el color y la condición de la muestra antes de la configuración.
- Calentar la placa de 1.536 pocillos a 23 °C y centrifugar a 150 × g durante 5 min. Imagine el plato solo para cócteles utilizando imágenes de campo claro como control negativo.
NOTA: Todas las placas se visualizan con imágenes de campo claro antes de la configuración de la muestra, lo que permite la identificación de pozos que ya tienen cristales o escombros antes de la adición de la muestra como control negativo. Además, permite la identificación de pozos en los que no se ha entregado el cóctel de cristalización. El calentamiento de la placa a temperatura ambiente elimina la condensación en la superficie de la placa, lo que lleva a imágenes claras. - Dispense 200 nL de muestra a cada pocillo en la placa de 1.536 pocillos utilizando un robot de manejo de líquidos. Centrifugar la placa a 150 × g e incubar las placas a 4 °C, 14 °C o 23 °C.
NOTA: Los experimentos de microlotes bajo aceite se pueden configurar a mano dispensando la proteína y el cóctel bajo el aceite deseado. Sin embargo, se recomienda utilizar no menos de 1 μL de cada proteína y cóctel para lograr resultados reproducibles.
6. Monitoree placas de 1.536 pocillos para la formación de cristales
- Después de que la muestra se haya agregado a las placas de 1.536 pocillos, imagen con imágenes de campo claro en el día 1 y la semana 1, semana 2, semana 3, semana 4 y semana 6.
- Realice imágenes SONICC con SHG y UV-TPEF en el punto de tiempo de 4 semanas para placas que se incuban a 23 °C y en el punto de tiempo de 6 semanas para placas que se incuban a 14 °C o 4 °C.
NOTA: El momento para la obtención de imágenes SONICC está programado en los puntos de tiempo de 4 semanas y 6 semanas para la placa de microensayo de 1.536 de alto rendimiento porque, por lo general, los cristales aparecerán en esos puntos de tiempo. Para la modificación a un microlote de 96 pocillos bajo experimentos de difusión de petróleo o vapor, es aconsejable realizar las imágenes SONICC antes en la ventana de tiempo. - Acceda a las imágenes experimentales que se han transferido automáticamente a la cuenta de usuario utilizando un sistema LIMS interno. Notifique a los usuarios a través de un demonio de correo electrónico htslab automatizado que se han producido imágenes.
7. Análisis de imágenes
- Recupere las imágenes de proyección del sitio ftp de HWI para cada archivo .rar.
NOTA: La salida de imagen de la pantalla 1.536 da como resultado una serie de archivos que contienen imágenes de campo claro, imágenes SHG e imágenes UV-TPEF. Cada modalidad de imagen o punto de tiempo es un archivo .rar separado. Cada archivo .rar, cuando se desempaqueta, contiene una imagen de cada pocillo de la placa de 1.536 pocillos en un punto de tiempo específico utilizando una modalidad de imagen específica.- Utilice FileZilla Client u otras opciones para acceder a los datos ftp.
NOTA: FileZilla Client es la forma recomendada de administrar el gran volumen de transferencia de archivos para minimizar los bloqueos computacionales.- Si FileZilla Client necesita instalarse en el equipo del usuario, descargue el software FileZilla.
- Si FileZilla Client ya está instalado o durante la instalación, haga clic en el icono FileZilla para abrir el software.
- Inicie sesión en el servidor ftp remoto desde FileZilla ingresando el sitio web ftp del host, el nombre de usuario y la contraseña.
- Descargue los archivos .rar en el directorio deseado.
- Utilice FileZilla Client u otras opciones para acceder a los datos ftp.
- Utilice la GUI de código abierto habilitada para IA para ver, puntuar y analizar las imágenes de cristalización.
NOTA: La GUI se puede usar en la mayoría de los sistemas operativos (SO) Windows, Mac y Linux, y las instrucciones específicas del sistema operativo para descargar se encuentran en el sitio de GitHub. MARCO Polo es una GUI de código abierto que incorpora metadatos de la pantalla de cristalización 1.536 de alto rendimiento implementada en el HTX Center. Está disponible para que cualquiera lo descargue de GitHub para modificarlo y reflejar las necesidades específicas de otros grupos de laboratorio.- Abra el archivo .rar en la GUI después de descargar el archivo (consulte la Figura suplementaria S1).
- Haga clic en Importar, seleccione Imágenes en el menú desplegable y luego seleccione Desde archivo/directorio rar.
- Haga clic en Buscar carpeta en la ventana emergente y luego navegue hasta la carpeta que contiene las imágenes.
- Seleccione los archivos deseados e impórtelos a la GUI haciendo clic en Abrir. Espere a que los archivos aparezcan en la ventana Rutas seleccionadas . Seleccione uno o más archivos para descargar en la GUI y haga clic en Importar ejecuciones.
- Vea la imagen del primer pozo en la ventana del Visor de presentaciones de diapositivas en la GUI haciendo clic en el símbolo de > a la izquierda del nombre de la muestra y luego seleccionando la lectura apropiada haciendo doble clic en ella (las lecturas se enumeran por la fecha y el tipo de campo claro de la imagen, UV-TPEF o SHG).
- Amplíe la imagen cambiando el tamaño de toda la ventana. El cuadro Detalles de la imagen incluye información sobre la imagen , incluida la información de puntuación (vacía hasta que se haya puntuado la lectura). El cuadro Detalles del cóctel contiene metadatos sobre los componentes del cóctel.
- Vaya al siguiente pozo haciendo clic en el botón Siguiente en el panel de navegación o presionando la tecla de flecha derecha en el teclado. Desplácese hasta un pozo específico introduciendo el número de pozo en la ventana Por número de pozo .
- Vea todas las lecturas (de las importadas a la GUI) marcando la casilla Mostrar todas las fechas .
- Vea todos los espectros (de los importados a la GUI) marcando la casilla Mostrar todos los espectros . Haga clic en el botón Intercambiar espectro para ver cada imagen de espectro individualmente.
- Abra el archivo .rar en la GUI después de descargar el archivo (consulte la Figura suplementaria S1).
- Puntúe las imágenes de cristal utilizando el algoritmo MARCO resaltando primero una ejecución específica de la lista en el lado izquierdo de la ventana. A continuación, haga clic en el botón Clasificar ejecución seleccionada . Vea la información de puntuación del MARCO en la ventana Detalles de la imagen una vez que se haya obtenido una lectura de imágenes para los 1.536 pozos.
NOTA: La clasificación normalmente tardará entre 2 y 5 minutos, dependiendo de la velocidad de la computadora y la memoria disponible. El algoritmo genera puntuaciones que clasifican los contenidos en "cristal", "claro", "precipitado" u "otras" clases. Los valores numéricos asociados con la clasificación de cada pozo reflejan la probabilidad de que el pozo contenga objetos de esa clase.- Vea un subconjunto de las imágenes puntuadas marcando las casillas deseadas en el panel Filtrado de imágenes y haciendo clic en el botón Enviar filtros . Por ejemplo, vea solo las imágenes clasificadas por MARCO como cristales marcando las casillas Cristales y MARCO y haciendo clic en Enviar filtros.
- Puntúe manualmente las imágenes de cristal para generar el conjunto de "puntuación humana". Asigne una puntuación a un pozo haciendo clic en el botón correspondiente (los botones "cristal", "claro", "precipitar" u "otros" se encuentran en el panel Clasificación en la parte inferior de la ventana). Alternativamente, use el teclado numérico en el teclado para asignar la puntuación (1 = "cristal", 2 = "claro", 3 = "precipitar", 4 = "otro"). ¿Designar una imagen con puntuación humana como "favorita" marcando Favorito? caja.
NOTA: Vea solo las imágenes clasificadas por un humano como cristales marcando las casillas Cristales y Humanos y haciendo clic en Enviar filtros. Al hacer clic en el cuadro Favoritos en el panel Filtrado , se reducen aún más las imágenes devueltas, devolviendo solo las imágenes de cristal con puntuación humana que también son favoritas. - Utilice la ficha Visor de placas para ver varios pozos a la vez. En la segunda pestaña Visor de placas del panel Controles , seleccione 16, 64 o 96 imágenes en el menú desplegable de la sección Imágenes por placa . Utilice la ficha Filtrado de imágenes para atenuar las imágenes que no son de interés. Seleccione el cuadro Aplicar filtro para filtrar las imágenes.
NOTA: Por ejemplo, seleccione las casillas "humano" y "cristal", y solo aquellos pozos que fueron marcados como cristal por un humano serán fácilmente visibles.- Navegue en la pestaña Visor de placas , haciendo clic en el botón Siguiente para ver el siguiente conjunto de imágenes 16/64/96. De forma predeterminada, las imágenes puntuadas como cristales son rojas, las puntuadas como claras son azules, las puntuadas como precipitado son verdes y las puntuadas como otras son naranjas. Cambie los colores mediante los menús desplegables.
- Seleccione la información que se mostrará en los pozos marcando varias casillas en la pestaña Etiquetas .
- Haga clic en Guardar vista para guardar un archivo de imagen de la vista actual.
- Haga clic en Swap Spectrum para alternar entre imágenes de campo claro, SHG y UV-TPEF para la imagen de múltiples pozos.
- Haga clic en Exportar y seleccione el tipo de archivo apropiado en el menú desplegable para exportar los archivos puntuados para su uso en otros programas.
NOTA: Los archivos CSV (valores separados por comas) son compatibles con programas de hojas de cálculo como Microsoft Excel o Google Sheets. Los archivos JSON (JavaScript Object Notation) se pueden abrir con la mayoría de los editores de texto. PPTX (presentación de PowerPoint) se puede utilizar para mostrar imágenes de Polo, incluida una comparación de imágenes de campo claro, UV-TPEF y SHG. Los archivos se guardan en formato .xtal para volver a abrirlos en la GUI de MARCO Polo.- Guarde un archivo de formato .xtal haciendo clic en Archivo en la parte superior de la página y, a continuación, seleccione Guardar, ejecutar o Guardar ejecutar como. Proporcione un nombre de archivo y una ubicación de directorio.
- Abra los archivos de formato .xtal haciendo clic en Importar y seleccionando Imágenes y luego Desde la ejecución guardada. Busque la ubicación de archivo adecuada, haga clic en el nombre del archivo y luego haga clic en Abrir.
Representative Results
Los resultados del experimento de cribado de cristales de 1.536 pocillos consisten en siete conjuntos completos de imágenes de campo claro recolectados en el día 0 (control negativo), día 1, semana 1, semana 2, semana 3, semana 4 y semana 6 (Figura 4). Las imágenes de SONICC se recogen en el punto de tiempo de 4 semanas para las placas incubadas a 23 °C y en el punto de tiempo de 6 semanas para las placas incubadas a 4 °C o 14 °C. En conjunto, una vez que se ha enviado una muestra, los usuarios pueden anticipar que sus placas se configurarán dentro de 1 día de su llegada. Las imágenes se cargarán a medida que se recojan. El experimento de detección de cristalización concluye después de 6 semanas.
La configuración de la placa de 1.536 pocillos permite que todos los experimentos de cribado se realicen dentro de la misma placa, lo que limita el consumo de muestras y facilita la obtención de imágenes y la comparación directa entre las modalidades de obtención de imágenes. Los resultados representativos para el curso temporal del crecimiento de cristales para una sola condición de cóctel se muestran en la Figura 4. Las imágenes automatizadas de placas a lo largo del experimento permiten la identificación de cristales de crecimiento rápido y lento mediante imágenes de campo claro. Las imágenes UV-TPEF y SHG permiten la validación cruzada de los golpes observados por imágenes de campo claro e indican que los cristales observados son proteicos y cristalinos, respectivamente (Figura 5A, B). Además, las imágenes SONICC permiten la identificación de cristales que están visualmente oscurecidos por precipitados o películas (Figura 5C) o microcristales que de otro modo podrían confundirse con precipitados (Figura 5D). Para algunos cristales, la falta de señal SHG no es descalificadora, ya que algunos grupos puntuales no producen una señal SHG35,36, como lo ejemplifica el cristal tetragonal de taumatina en la Figura 5C. Por el contrario, se debe anticipar una falta de señal UV-TPEF para las proteínas que carecen de residuos de triptófano. La observación de señales UV-TPEF y SHG también facilita la identificación de cristales de sal no proteicos, que aparecerán en campo claro y exhibirán una fuerte señal positiva de SHG pero carecerán de una señal UV-TPEF (Figura 5E).
El análisis de imágenes para la configuración de la placa se simplifica con la GUI de MARCO Polo, que también incluye la transferencia de datos ftp desde los servidores HWI (como alternativa a la transferencia de archivos con FileZilla). La GUI de MARCO Polo permite una visualización de placas e imágenes fácilmente navegable y realiza una puntuación de imagen computacional utilizando el algoritmo MARCO para que los resultados de la imagen se puedan descargar, ver y analizar rápidamente desde el Centro HTX. El algoritmo de puntuación MARCO, tal como se implementa en la GUI de Polo de MARCO, es capaz de anotar imágenes de toda la placa de 1.536 pocillos en menos de 5 minutos. Las imágenes marcadas como cristalinas por el algoritmo MARCO pueden ser clasificadas posteriormente por la GUI de Polo para su visualización. Dado que el algoritmo MARCO se optimizó para la identificación de cristales y minimizar los falsos negativos para no perder ningún golpe positivo, la puntuación puede dar lugar a falsos positivos. Sin embargo, la capacidad del MARCO para limitar el conjunto de imágenes que necesitan ser examinadas centrando la atención en los pocillos con una alta probabilidad de contener cristales resulta en una reducción sustancial de la carga de procesamiento de datos para los usuarios. La conveniente implementación del algoritmo en la plataforma de visualización MARCO Polo fácil de usar, con su capacidad para ordenar imágenes en función de las puntuaciones de MARCO, mejora en gran medida la capacidad del usuario para analizar el conjunto de datos rápidamente y determinar con precisión los impactos de cristal.
Figura 1: Esquema de un experimento de cribado de cristalización de 1.536 pocillos de alto rendimiento realizado en el Centro HTX. (1) En esta etapa, se añaden 5 μL de aceite de parafina y 200 nL de cóctel a cada pocillo (paso de protocolo 3.1 y paso 3.5). Una ilustración de dibujos animados de un pozo que contiene solo aceite y cóctel y una imagen representativa se muestran a la derecha. (2) Las muestras llegan al Centro HTX (paso de protocolo 5.1). 3) En este paso, se agregan 200 nL de muestra a cada pocillo (paso de protocolo 5.4). (4) Los 1.536 pozos se monitorean a lo largo del tiempo utilizando imágenes de campo claro, 5), así como las modalidades UV-TPEF y SHG (paso 6 del protocolo). 6) La GUI de código abierto habilitada para IA se utiliza para ver, calificar y analizar las imágenes de cristalización (paso 7 del protocolo). Abreviaturas: HTX = cristalización de alto rendimiento; UV-TPEF = fluorescencia excitada UV-dos fotones; SHG = segunda generación armónica; IA = inteligencia artificial; GUI = interfaz gráfica de usuario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Placas individuales de 1.536 pocillos que contienen experimentos de detección, imágenes mediante imágenes de campo claro, UV-TPEF y SHG. Las placas de 1.536 pocillos se muestran con un centavo estadounidense para la escala (arriba). Cada experimento de detección se visualiza una vez antes de la configuración y seis veces después de la adición de la muestra con imágenes de campo claro (siete conjuntos de imágenes de campo claro en total, izquierda). Las placas se someten a imágenes UV-TPEF (centro) y SHG (derecha) a las 4 semanas o 6 semanas. Abreviaturas: UV-TPEF = fluorescencia excitada UV-dos-fotones; SHG = segunda generación armónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema que muestra cómo se generan las placas de 1.536 pocillos. Dieciséis bloques DW de 96 pocillos se utilizan para eliminar cuatro placas de 384 pocillos, con cada cuadrante de cada placa de 384 pocillos llenados por cócteles de cristalización. Cuatro bloques DW de 96 pocillos llenan una placa de 384 pocillos (centro). Cuatro placas de 384 pocillos se utilizan para acabar con la única placa de 1.536 pocillos (derecha). Abreviatura: DW = pozo profundo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Curso de tiempo representativo de un solo pozo en un experimento de cribado de 1.536 pocillos. Las placas se visualizan antes de la configuración de la muestra (día 0), así como con imágenes de campo claro en el día 1, semana 1, semana 2, semana 3, semana 4 y semana 6. Las placas incubadas a 23 °C se visualizan con SONICC en la semana 4. Barras de escala = 80 μm (campo claro), 200 μm (SHG, UV-TPEF). Abreviaturas: SONICC = imágenes no lineales de segundo orden de cristales quirales; UV-TPEF = fluorescencia excitada UV-dos fotones; SHG = segunda generación armónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos de imágenes para los experimentos de cribado de cristales HT 1,536. Los resultados de las imágenes de campo claro, UV-TPEF y SHG se muestran para cinco pozos de ejemplo. (A,B) Los cristales de proteínas observados por imágenes de campo claro, UV-TPEF y SHG son claramente evidentes en las tres modalidades de imagen. (C) Un cristal de proteína oscurecido por la película en imágenes de campo claro es visible por imágenes UV-TPEF; el cristal no se observa mediante imágenes SHG debido a la incompatibilidad del grupo de puntos. (D) Ejemplo de microcristales verificados por imágenes UV-TPEF y SHG que de otro modo podrían considerarse precipitados. (E) Ejemplo de cristales de sal que aparecen cristalinos por imágenes de campo claro y SHG pero no exhiben una señal UV-TPEF. Barras de escala = 200 μm. Diámetro del pozo = 0,9 mm. Abreviaturas: UV-TPEF = fluorescencia excitada UV-dos-fotones; SHG = segunda generación armónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria S1: Apertura de archivos de imagen en MARCO Polo. Los archivos de imagen se pueden abrir dentro de la GUI de MARCO Polo navegando a Importar | Pestaña Imágenes en la parte superior (a). Tenga en cuenta que los archivos también se pueden transferir a través de la herramienta Desde FTP directamente en MARCO Polo (a) o se pueden transferir a través de FileZilla como se describe en el paso del protocolo 7.2. Para importar archivos que ya se han descargado, seleccione Imágenes | Desde Rar Archive/Directory. En la ventana emergente que aparece, seleccione Buscar carpeta (b) y navegue hasta el directorio de archivos donde se guardan los archivos de imagen de placa. Una vez que los archivos estén en la ventana Rutas seleccionadas (c), resalte un archivo y haga clic en Importar ejecuciones (d). La GUI de MARCO Polo identificará los metadatos correctos del archivo de cóctel para importar con las imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
El método describe una tubería de alto rendimiento para el cribado de cristalización de proteínas que requiere tan solo 500 μL de muestra para 1.536 experimentos de cristalización individuales en el formato de microlote bajo aceite. La tubería se basa en la robótica de manejo de líquidos para ayudar de manera rápida y reproducible a la configuración experimental, así como en el recurso de análisis de imágenes computacionales MARCO Polo, que está personalizado para analizar imágenes de placas de 1.536 pocillos utilizando el algoritmo MARCO para identificar y aislar impactos de cristal.
El pequeño volumen de gotas de cribado individuales (400 nL en total con una proporción de 1:1 de muestra:cóctel) significa que se requieren volúmenes de muestra extremadamente pequeños para identificar condiciones de cristalización positivas. Estos pequeños tamaños de gota necesariamente producen pequeños cristales que no pueden ser pescados por bucle tradicional. Se han desarrollado métodos para cosechar de las 1.536 placas37; Además, las placas con cristales se han utilizado directamente en fuentes de sincrotrón para la recolección de datos in situ 38. Si se desarrollara un método robusto para cosechar estos cristales, los avances en la tecnología de sincrotrón y los haces microenfocados permitirían obtener conjuntos de datos útiles. Además, los cristales obtenidos podrían usarse potencialmente como semillas para los esfuerzos de optimización.
Las imágenes SONICC son claramente ventajosas para identificar tanto pequeños cristales de proteínas como cristales de proteínas ocultos debajo del precipitado. A pesar de estas ventajas, no todos los tipos de muestras son susceptibles a imágenes SHG y UV-TPEF. Por ejemplo, las proteínas con pocos o ningún residuo de triptófano aromático mostrarán una señal UV-TPEF ambigua. Además, los cristales en grupos espaciales específicos, incluidos los grupos centrosimétricos o el grupo de puntos 432, no serán detectados por las imágenes SHG. Las muestras con fluoróforos a veces interfieren con la señal de SHG, lo que resulta en la cancelación de la señal o en un aumento de la intensidad, lo que significa que se requiere una interpretación cuidadosa de las señales de SHG para las proteínas que contienen metales y las proteínas que contienen restos fluorescentes. Sin embargo, en muchos casos, es posible racionalizar la ausencia de una señal SHG o UV-TPEF, y la falta de estas señales no necesariamente debe descartar la presencia de un cristal de proteína.
El formato de microlote bajo aceite proporciona una alternativa al método de difusión de vapor más común utilizado para la cristalografía de alto rendimiento. Es importante destacar que el formato de cristalización afecta la identificación de golpes39, lo que proporciona una justificación para el uso de diferentes formatos de cristalización para los esfuerzos de detección de alto rendimiento. Las imágenes automatizadas y las modalidades habilitadas por SONICC ayudan en la identificación rápida de cristales de proteínas a lo largo del curso experimental de 6 semanas. Finalmente, la GUI de MARCO Polo permite a los usuarios analizar rápidamente imágenes de 1.536 condiciones para identificar pozos de impacto prometedores para la optimización. Las capacidades en el Centro HTX, incluida la configuración experimental de alto rendimiento habilitada por robótica, junto con las herramientas computacionales y de imágenes de vanguardia para análisis, proporcionan una contribución importante a la comunidad de biología estructural al capacitar a los investigadores para abordar de manera efectiva un cuello de botella primario en el trabajo estructural basado en cristales: encontrar condiciones de cristalización.
Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría extender nuestra gratitud a nuestros usuarios por confiarnos sus preciosas muestras para la detección de cristales, así como por proporcionar comentarios críticos y solicitudes que nos han ayudado a refinar y desarrollar nuestros recursos para servir mejor a la comunidad de biología estructural. También nos gustaría reconocer a Ethan Holleman, la Dra. Lisa J Keefe y la Dra. Erica Duguid, quienes impulsaron el desarrollo de la GUI de MARCO Polo. Nos gustaría agradecer a los colegas de HWI por su apoyo y sugerencias, especialmente a la Dra. Diana CF Monteiro. Reconocemos el apoyo financiero de los Institutos Nacionales de Salud, R24GM141256.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1536 Well Imp@ct LBR LoBase | Greiner Bio-One | 790 801 | |
| Acetic acid | Hampton Research | HR2-853 | |
| AlumaSeal II Sealing Film | Hampton Research | HR8-069 | |
| Ammonium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-247 | |
| Ammonium chloride | Hampton Research | HR2-691 | |
| Ammonium hydroxide | Hampton Research | HR2-855 | |
| Ammonium nitrate | Hampton Research | HR2-665 | |
| Ammonium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-629 | |
| Ammonium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-555 | |
| Ammonium sulfate | Hampton Research | HR2-541 | |
| Ammonium thiocyanate | Molecular Dimensions | MD2-100-301 | |
| Bicine pH 9.0 | Hampton Research | HR2-723 | |
| Bis-tris propane pH 7.0 | Hampton Research | HR2-993-08 | |
| Calcium acetate | Hampton Research | HR2-567 | |
| Calcium chloride dihydrate | Hampton Research | HR2-557 | |
| CAPS pH 10.0 | Rigaku Reagents | none given | |
| ClearSeal Film | Hampton Research | HR4-521 | |
| Cobalt sulfate heptahydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-42 | |
| Crystal Screen HT screen | Hampton Research | HR2-130 | |
| Formulator | Formulatrix | ||
| Glycerol | Hampton Research | HR2-623 | |
| Gryphon liquid handling robot | Art Robbins Instruments | ||
| HEPES pH 7.0 | Hampton Research | HR2-902-03 | |
| HEPES pH 7.5 | Hampton Research | HR2-902-08 | |
| HWI HTX Center sample submission form | https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/ | ||
| Hydrochloric acid | Hampton Research | HR2-581 | |
| Index HT screen | Hampton Research | HR2-134 | |
| Ionic Liquid screen | Hampton Research | HR2-214 | |
| Lithium bromide | Molecular Dimensions | MD2-100-312 | |
| Lithium chloride | Hampton Research | HR2-631 | |
| Lithium sulfate monohydrate | Hampton Research | HR2-545 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Hampton Research | HR2-561 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Hampton Research | HR2-559 | |
| Magnesium nitrate hexahydrate | Hampton Research | HR2-657 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Hampton Research | HR2-821 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Millipore Sigma | 63535-50G | |
| Manganese sulfate monohydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-310 | |
| MARCO Polo GUI download | https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/ | ||
| Matrix Platemate 2 x 3 liquid handling robot | Thermo Scientific | ||
| MES pH 6.0 | Hampton Research | HR2-943-09 | |
| Mosquito liquid handling robot | SPTLabtech | ||
| Paraffin Oil/White Mineral Oil Saybolt Viscosity 340-365 at 100 °F | Sigma Aldrich | PX0045-3 | |
| PEG 1000 | Hampton Research | HR2-523 | |
| PEG 2000 | Hampton Research | HR2-592 | |
| PEG 20000 | Hampton Research | HR2-609 | |
| PEG 3350 | Hampton Research | HR2-527 | |
| PEG 400 | Hampton Research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton Research | HR2-529 | |
| PEG 6000 | Hampton Research | HR2-533 | |
| PEG 8000 | Hampton Research | HR2-535 | |
| PEG/Ion HT screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| PEGRx HT screen | Hampton Research | HR2-086 | |
| Plate reservations | htslab@hwi.buffalo.edu | ||
| Potassium acetate | Hampton Research | HR2-671 | |
| Potassium bromide | Hampton Research | HR2-779 | |
| Potassium carbonate | Molecular Dimensions | MD2-100-311 | |
| Potassium chloride | Hampton Research | HR2-649 | |
| Potassium nitrate | Hampton Research | HR2-663 | |
| Potassium phosphate dibasic | Hampton Research | HR2-635 | |
| Potassium phosphate-monobasic | Hampton Research | HR2-553 | |
| Potassium phosphate-tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-309 | |
| Potassium thiocyanate | Hampton Research | HR2-695 | |
| Rock Imager 1000 with SONICC | Formulatrix | ||
| Rock Imager 54 | Formulatrix | ||
| Rubidium chloride | Millipore Sigma | R2252-10G | |
| SaltRx HT screen | Hampton Research | HR2-136 | |
| Silver Bullets screen | Hampton Research | HR2-096 | |
| Slice pH screen | Hampton Research | HR2-070 | |
| Sodium acetate pH 5.0 | Hampton Research | HR2-933-15 | |
| Sodium bromide | Hampton Research | HR2-699 | |
| Sodium chloride | Hampton Research | HR2-637 | |
| Sodium citrate pH 4.2 | Hampton Research | HR2-935-01 | |
| Sodium citrate pH 5.6 | Hampton Research | HR2-735 | |
| Sodium hydroxide | Hampton Research | HR2-583 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Molecular Dimensions | MD2-100-207 | |
| Sodium nitrate | Hampton Research | HR2-661 | |
| Sodium phosphate monobasic | Hampton Research | HR2-551 | |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Molecular Dimensions | MD-100-307 | |
| StockOptions Polymer screen | Hampton Research | HR2-227 | |
| Tacsimate pH 7 | Hampton Research | HR2-755 | |
| TAPS pH 9.0 | bioWORLD | 40121071 | |
| Tris pH 8 | Hampton Research | HR2-900-11 | |
| Tris pH 8.5 | Hampton Research | HR2-725 | |
| ViaFLO 384 | Integra | ||
| ViaFLO 384 384 channel pipettor head (0.5-12.5µL) | Integra | ||
| ViaFLO 384 96 channel pipettor head (300µL) | Integra | ||
| Zinc acetate dihydrate | Hampton Research | HR2-563 |
References
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