Summary
Здесь представлен протокол визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии. Экспериментальная процедура включает в себя подготовку образцов, получение изображений и визуализацию.
Abstract
В качестве модельного животного позвоночных личинки рыбок данио-рерио широко используются в нейробиологии и предоставляют уникальную возможность контролировать активность всего мозга при клеточном разрешении. Здесь мы предлагаем оптимизированный протокол для выполнения визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии, включая подготовку и иммобилизацию образцов, встраивание образцов, получение изображений и визуализацию после визуализации. Текущий протокол позволяет in vivo визуализировать структуру и активность нейронов мозга личинок рыбок данио-рерио с клеточным разрешением в течение более 1 часа с использованием конфокальной микроскопии и специально разработанной флуоресцентной микроскопии. Также обсуждаются критические шаги в протоколе, включая установку и позиционирование образца, предотвращение образования пузырьков и пыли в агарозном геле, а также предотвращение движения на изображениях, вызванного неполным затвердеванием агарозного геля и параличом рыбы. Протокол был проверен и подтвержден в нескольких настройках. Этот протокол может быть легко адаптирован для визуализации других органов личинок рыбок данио.
Introduction
Рыбки данио-рерио (Danio rerio) широко используются в качестве образцовых позвоночных животных в неврологии благодаря своей оптической прозрачности на личиночной стадии, быстрому развитию, низким затратам на техническое обслуживание и наличию разнообразных генетических инструментов 1,2,3,4. В частности, оптическая прозрачность личинок в сочетании с генетически кодируемыми флуоресцентными репортерами биологических событий 5,6,7,8,9 дает уникальную возможность визуализировать как активность нейронов, так и структуру на уровне всего мозга 10,11,12,13,14 . Однако даже при использовании микроскопа, поддерживающего клеточное разрешение, полученные изображения не обязательно сохраняют информацию на уровне отдельных клеток; Качество оптического изображения может быть ухудшено из-за аберрации, вносимой агарозным гелем, используемым для монтажа образца, рыба может быть установлена под углом, таким образом, области интереса не полностью содержатся в поле зрения микроскопа, и рыба может двигаться во время записи, вызывая артефакты движения на изображениях или препятствуя точному извлечению сигнала из изображений.
Таким образом, необходим эффективный и воспроизводимый протокол для получения высококачественных данных изображения с минимальным шумом и движением. К сожалению, общедоступные протоколы визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo 15,16,17,18,19 лишь кратко описывают процедуру, оставляя существенные части деталей, таких как затвердевание агарозы, точные методы монтажа и позиционирование образца с помощью щипцов, на усмотрение каждого экспериментатора. Кроме того, несоответствия в методах концентрации агарозы и иммобилизации 10,11,14,15,16,17,18,19 могут привести к проблемам, возникающим при движении рыбы в процессе визуализации.
Здесь представлен подробный протокол визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии. На рисунке 1 представлен графический обзор протокола: подготовка и иммобилизация образцов, встраивание образцов, получение изображений и визуализация после визуализации. Структурная и функциональная визуализация мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo демонстрируется с использованием коммерческого конфокального микроскопа и специально разработанного флуоресцентного микроскопа. Этот протокол может быть адаптирован практиками для визуализации мозга с определенными сенсорными стимулами или контекстами поведения в зависимости от экспериментальных потребностей и дизайна.
Protocol
Все эксперименты с рыбками данио-рерио были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) KAIST (KA2021-125). Всего 12 взрослых рыбок данио-рерио с паннейрональной экспрессией индикатора кальция GCaMP7a [Tg(huc:GAL4); Для разведения использовались Tg(UAS:GCaMP7a)] на фоне каспера [mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)]. Эта группа состояла из восьми самок и четырех самцов в возрасте от 3 до 12 месяцев. Эксперименты с визуализацией были проведены на личинках рыбок данио-рерио через 3-4 дня после оплодотворения (d.p.f.), стадии, в течение которой их пол не может быть определен.
1. Подготовка образцов рыбок данио-рерио
- Собирают эмбрионы после разведения взрослых рыб желаемой трансгенной линии, таких как Tg (huc: GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)20,21,22, в чашке Петри, наполненной яичной водой (см. Таблицу материалов). Поместите эмбрионы в инкубатор при температуре 28 °C и вырастите их до 3-4 д..ф. личинок23,24,25.
- Если фон рыбок данио-рерио не альбинос, чтобы подавить образование пигментации, перенесите эмбрионы через 24 ч после оплодотворения (h.p.f.) в чашку Петри, наполненную яичной водой, содержащей 200 мкМ 1-фенил-2-тиомочевины (PTU; см. Таблицу материалов)25,26. Каждые 24 часа перекладывайте рыбу в новую посуду со свежей яичной водой, содержащей 200 мкМ ПТУ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рыбки данио-рерио содержатся в стандартных условиях при 28 ° C и 14:10 ч светлый: темный. Известно, что лечение PTU влияет на поведение и функцию щитовидной железы личинок рыбок данио-рерио27,28. Поэтому важно использовать PTU с осторожностью и тщательно контролировать потенциальные мешающие факторы в любых экспериментах.
- Если фон рыбок данио-рерио не альбинос, чтобы подавить образование пигментации, перенесите эмбрионы через 24 ч после оплодотворения (h.p.f.) в чашку Петри, наполненную яичной водой, содержащей 200 мкМ 1-фенил-2-тиомочевины (PTU; см. Таблицу материалов)25,26. Каждые 24 часа перекладывайте рыбу в новую посуду со свежей яичной водой, содержащей 200 мкМ ПТУ.
- Чтобы найти образец, экспрессирующий интересующие флуоресцентные белки (например, паннейрональный GCaMP7a), проведите скрининг образца под эпифлуоресцентным микроскопом и выберите образец с яркой экспрессией.
- Подготовьте отобранный образец рыбок данио-рерио 3-4 д..ф. в чашке Петри, наполненной яичной водой (рис. 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для регистрации спонтанной активности нейронов рекомендуется использовать образцы в возрасте от 80 до 100 л.с., так как уровень спонтанной активности низок до 80 л.с., а развитие пигментации, даже на фоне Каспера, может ухудшить качество изображения после 100 л.с. - Приготовьте 0,25 мг/мл раствора бромида панкурония 14,19,29,30,31, добавив 1 мл исходного раствора 2,5 мг/мл (см. Таблицу материалов) к 10 мл яичной воды. Аликвотируйте раствор бромида панкурония в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
- Перенесите предварительно просеянный образец в чашку Петри с помощью трансферной пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Постарайтесь взять с собой минимальный объем яичной воды. - Перенесите 0,1 мл раствора бромида панкурония в чашку Петри для паралича.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бромид панкурония оказывает потенциальное демпфирующее действие на нейронную активность личинок рыбокданио-рерио 32. Важно тщательно учитывать концентрацию и продолжительность воздействия бромида панкурония.
2. Приготовление 2% (мас./об.) агарозного геля
- Включите тепловой блок и установите целевую температуру на 37 °C. Подождите, пока устройство нагреется и уравновесится при заданной температуре.
- Растворите 0,2 г порошка агарозы с низкой температурой плавления (см. Таблицу материалов) в 10 мл яичной воды.
- Нагрейте раствор агарозы в микроволновой печи и перемешайте его, встряхивая и взбалтывая, пока агароза полностью не растворится.
- Аликвотируйте агарозный гель в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и храните микроцентрифужные пробирки на тепловом блоке (рис. 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, не исчезли ли пузырьки в агарозном геле.
3. Монтаж и позиционирование образца
- Проверьте образец под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что движение личинок прекратилось, и визуально оценить здоровье образца, проверив его сердцебиение (рис. 2C). Если сердцебиение слишком медленное, выбросьте образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердцебиение рыбы, получающей изображение, слишком медленное (например, ниже 60 ударов в минуту), может оказаться невозможным выполнить долгосрочную визуализацию. Чтобы оценить самочувствие рыбы, частоту сердечных сокращений можно визуально проверить, сравнив ее с другими рыбами в той же чашке Петри. Это поможет убедиться, что рыба, которую визуализируют, здорова и достаточно стабильна для процедуры визуализации. - Используя пипетку для переноса, поместите одну личинку рыбки данио-рерио в агарозный гель в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл (рис. 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно выбросьте пипетку после переноса образца. - Налейте агарозный гель в чашку Петри, чтобы получился слой толщиной 1-2 мм. Перенесите образец из микроцентрифужных пробирок в чашку Петри с помощью пипетки для переноса так, чтобы личинка была помещена в центр чашки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если в агарозном геле есть пыль и пузырьки, удалите их с помощью пипетки для переноса. - Используйте щипцы, чтобы расположить образец в желаемой ориентации так, чтобы голова и хвост были плоскими (рис. 2E).
- Поверните образец с помощью щипцов так, чтобы оба глаза были на одном уровне (рис. 2F).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры выравнивания (положение и вращение) должны быть завершены до того, как агарозный гель начнет затвердевать. - После выравнивания подождите, пока агарозный гель застынет (рис. 2G, H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время ожидания затвердевания агарозного геля может составлять от 5 до 10 минут, в зависимости от объема и размера геля. - После застывания агарозного геля наполните чашку Петри яичной водой и поместите чашку Петри со встроенным образцом на столик микроскопа (рис. 2I).
4. Получение изображения
- Включите систему микроскопа (например, лазеры, конфокальные контроллеры, микроскоп и компьютер; см. Таблицу материалов) и убедитесь, что вся система работает.
- Выберите объектив с малым увеличением и расположите образец в центре поля зрения.
- Выберите объектив с погружением в воду или погружение в воду с правильным увеличением (например, объектив с числовой апертурой 16x 0,8 (NA); см. Таблицу материалов). Внесите точные коррективы в поле зрения.
- Установите параметры изображения (например, размер изображения, мощность лазера, время экспозиции, количество кадров) с помощью программного обеспечения для получения изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите параметры визуализации для достижения наилучших возможных результатов для конкретных нужд (см. настройку для получения изображений в разделе репрезентативных результатов). Если изображение насыщенное, уменьшите мощность лазера. - Найдите мозг образца, перемещая предметный столик, и определите его толщину в режиме просмотра в реальном времени в программном обеспечении, изменяя фокальные плоскости вручную вверх и вниз. Установите нижнюю и верхнюю границы громкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что весь мозг находится в поле зрения как в боковом, так и в осевом направлениях. - Установите размер шага z, учитывая осевое разрешение микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный размер z-шага для визуализации мозга личинок рыбок данио-рерио зависит от метода визуализации и разрешения микроскопа. В качестве примера был использован z-шаг размером 5 мкм с учетом толщины легкого листа и среднего диаметра телклеток 10. - Продолжите получение изображения для заданного поля зрения.
- Для объемной структурной визуализации получите 3-D изображение (x, y, z) всего мозга, изменив фокальные плоскости и получив 2-D изображения каждой z-плоскости последовательно.
- Для функциональной визуализации одной z-плоскости получите изображения временных рядов (x, y, t) нейронной активности мозга на определенной глубине.
- Для объемной функциональной визуализации получите 4-D изображение (x, y, z, t) активности нейронов во всем мозге путем последовательного получения 3-D изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установите количество кадров с учетом доступного объема памяти компьютера. Рекомендуется время приобретения менее 1 ч из-за продолжительности действия бромида панкурония.
- После получения изображений сохраните результаты и запишите параметры изображения (например, размер пикселя, размер z-шага, частоту кадров, мощность лазера) для анализа изображений.
- Экспортируйте изображения в соответствующий формат для рендеринга данных и анализа изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется экспортировать изображения в формате файла изображения с тегами (TIF). TIF поддерживает сжатие изображений без потерь и совместим с большинством программ для обработки изображений и языков программирования. Кроме того, формат TIF поддерживает включение метаданных, таких как параметры съемки, разрешение изображения и другую соответствующую информацию, которая может помочь в интерпретации и воспроизводимости данных.
5. Настройка визуализаций с помощью napari
ПРИМЕЧАНИЕ: napari — это программа для просмотра многомерных изображений с открытым исходным кодом в среде Python с рендерингом33 на основе графического процессора (GPU). Плагин napari-animation обеспечивает программное создание фильмов. Использование Fiji, программы обработки изображений с открытым исходным кодом, рекомендуется для обработки изображений общего назначения, такой как фильтрация и геометрическое преобразование (см. Таблицу материалов). Исходный код, используемый для визуализации с помощью napari, доступен на GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization).
- Установите napari и napari-animation с помощью pip или conda. После установки создайте новый файл записной книжки jupyter.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать с записной книжкой jupyter, которая является интерактивным инструментом для Python, а не со скриптом Python. - Импорт napari и napari-animation.
6. Визуализация структур с помощью напари
- Чтобы визуализировать изображения и создать видеоролики о мозге рыбок данио, загрузите 3D-изображение (x,y,z) и откройте окно napari. Подключите плагин napari-animation (рисунок 3A).
- Задайте такие параметры, как размер вокселей, цветовая карта и пределы контрастности в элементах управления слоями.
- Отрегулируйте параметры просмотра (например, перспективу, углы) на холсте.
- Чтобы захватить визуализированное изображение, нажмите кнопку захвата в мастере анимации.
- Чтобы создать видеоролики визуализированного объема, измените настройки средства просмотра и добавьте ключевые кадры (рис. 3B).
- После добавления ключевых кадров задайте количество кадров (шагов) между ключевыми кадрами в мастере анимации. Сохраните визуализированную анимацию.
7. Обработка изображений и визуализация активности нейронов с помощью напари
ПРИМЕЧАНИЕ : Чтобы визуализировать изображения нейронной активности во временных рядах в виде наложенных изображений статического фона и активности, к необработанным изображениям должен быть применен алгоритм декомпозиции. Используйте реализацию алгоритма декомпозиции MATLAB под названием BEAR24. Версия MATLAB BEAR доступна на GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR).
- Чтобы разложить статический фон и активность нейронов, примените BEAR к необработанным изображениям временных рядов (x, y, t или x, y, z, t). После декомпозиции сохраните изображения фона и активности нейронов в виде файлов TIF (рис. 3C).
- Загрузите фоновые изображения и изображения нейронной активности и откройте окно напари. Подключите плагин napari-animation.
- Используйте серую цветовую карту для фоновых изображений и горячую цветовую карту для изображений нейронной активности (рис. 3C).
- Задайте такие параметры, как пределы непрозрачности и контрастности в элементах управления слоями.
- Чтобы создать видеоролики с активностью нейронов, измените настройки средства просмотра и добавьте ключевые кадры для рендеринга анимации.
- После добавления ключевых кадров задайте количество кадров (шагов) между ключевыми кадрами в мастере анимации. Сохраните визуализированную анимацию.
Representative Results
Структура и нейрональная активность мозга личинок рыбок данио, экспрессирующих индикатор кальция GCaMP7a (Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a))20,21,22 с фоном Каспера (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9))34 был изображен на 3-4 d.p.f. в соответствии с описанным протоколом.
Для объемной структурной визуализации образец был изображен с использованием коммерческой системы точечной сканирующей конфокальной микроскопии, оснащенной линзой для погружения в воду 16x 0,8 NA. Лазер возбуждения с длиной волны 488 нм использовался как для структурной, так и для функциональной визуализации. Частота кадров, разрешение изображения, размер пикселя и размер осевого шага составляли 0,25 Гц, 2048 x 2048, 0,34 мкм и 1,225 мкм соответственно. Получение изображения заняло примерно 1 час 20 минут. Объемное поле зрения полученного изображения охватывало области переднего, среднего и заднего мозгов (рис. 4А). Тела нейрональных клеток продолговатого мозга, мозжечковой пластинки, тектума зрительного нерва, габенулы и дорсального головного мозга во всем мозге личинок рыбок данио-рерио 4 d.p.f. были хорошо видны на изображениях конфокальной микроскопии (рис. 4B). 3D-рендеринг изображений конфокальной микроскопии был выполнен с использованием napari27 в соответствии с вышеупомянутым протоколом (рис. 4C и видео 1).
Для функциональной визуализации в 2-D образец был визуализирован с использованием той же системы конфокальной микроскопии, оснащенной линзой объектива 16x 0,8 NA, погружающейся в воду. Частота кадров, разрешение изображения и размер пикселя составляли 2 Гц, 512 x 256 и 1,5 мкм соответственно. Тела нейрональных клеток были хорошо видны как на заднем плане, так и на наложенной нейронной активности (рис. 5A, B).
Для 3-D функциональной визуализации была использована специально разработанная система 3-D микроскопии18 , которая была способна in vivo визуализировать нейронную активность всего мозга личинок рыбок данио-рерио с полем зрения 1040 мкм × 400 мкм × 235 мкм и боковым и осевым разрешениями 1,7 мкм и 5,4 мкм соответственно. Скорость визуализации составила до 4,2 объема в секунду. Подобно рендерингу данных структурной визуализации, напари использовался для 3D-рендеринга данных визуализации кальция всего мозга (рис. 5C и видео 2).
Рисунок 1: Обзор экспериментальной процедуры. Подготовка проб и парализация рыбок данио-рерио (шаг 1). Препарат 2% (мас./об.) агарозного геля (стадия 2). Монтаж и позиционирование образца (шаг 3). Получение изображения (шаг 4). Обработка изображений и визуализация структуры и активности нейронов (шаг 5-7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальная процедура подготовки визуализации всего мозга . (A) Скрининговый образец рыбок данио, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a, в чашке Петри, наполненной яичной водой. (B) Оборудование и материалы, необходимые для монтажа и позиционирования образца. (1) Тепловой блок при 37 °C; (2) 2% (мас./об.) агарозный гель; (3) микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 мл; (4) яичная вода; 5) 0,25 мг/мл раствора бромида панкурония; (6) чашка Петри; (7) щипцы; (8) Пипетка для переноса. (C) Стереомикроскопическое изображение парализованного образца. Черная стрелка указывает на сердце образца. (D) Образец в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл переносится с помощью пипетки. На врезке показан увеличенный вид коробочной области. (E) Образец (черная стрелка) помещают в центр чашки Петри с помощью щипцов. (F) Образец выравнивается с помощью щипцов. (G) Пример смещенного внедренного образца. (H) Пример выровненного встроенного образца. (I) Образец помещают на столик микроскопа под линзой объектива для получения изображения. Масштабная линейка: 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Визуализация изображений мозга личинок рыбок данио . (A) 3-D рендеринг конфокального микроскопического изображения личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f) мозга, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Для рендеринга использовался napari, многомерный просмотрщик изображений с открытым исходным кодом в среде Python. Окно napari содержит элементы управления слоями (красное прямоугольнико), список слоев (желтое прямоугольнико), холст (синее прямоугольнико) и мастер анимации (зеленое прямоугольнико). (B) Для рендеринга анимации добавлены ключевые кадры с несколькими настройками просмотра. (C) Конфокальное микроскопическое изображение 2-D покадровой визуализации активности нейронов в мозге личинок рыбок данио. Изображение разлагается на фон (слева) и активность нейронов (посередине), затем накладывается (справа). Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Визуализация структуры мозга личинок рыбок данио. (A) Проекция максимальной интенсивности (MIP) изображения конфокальной микроскопии личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f.) мозга, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Сверху: боковой MIP. Днище: осевой MIP. Каждая граница содержит передний мозг (красный), средний мозг (желтый) и задний мозг (синий). (B) В общей сложности 10 осевых срезов на разной глубине из объемного изображения мозга (при z = 25 мкм, 50 мкм, 75 мкм, 100 мкм, 125 мкм, 150 мкм, 175 мкм, 200 мкм, 225 мкм, 250 мкм, считанных сверху вниз; z = 0 мкм указывает на верхнюю поверхность мозга). Каждая белая коробка представляет область мозга (продолговатый мозг, мозжечковая пластинка, тектум зрительного нерва, габенула и дорсальный головной мозг). (C) Весь мозг визуализируется с помощью напари. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Визуализация нейронной активности мозга личинок рыбок данио . (A) Изображение конфокальной микроскопии активности нейронов в мозге личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f.), экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Масштабная линейка: 100 мкм. (B) Увеличенный вид коробочной области в А , показывающий активность нейронов в оптическом тектуме в несколько моментов времени. Масштабная линейка: 20 мкм. (C) 3D-визуализация активности нейронов всего мозга в мозге личинок рыбок данио, полученная с помощью специально разработанного микроскопа (слева: t = 133 с; справа: t = 901 с). Активность нейронов накладывается на статический фон. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Покадровая съемка с дрейфом образца и без него. (A) Покадровая визуализация мозга личинок рыбок данио, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a с дрейфом образца. Яичную воду добавляли в образец перед затвердеванием агарозного геля (этап 3.6-3.7). Рыба двигалась в боковом и осевом направлениях. (B) Покадровая съемка мозга личинок рыбок данио-рерио без дрейфа образца. Яичную воду добавляли в образец после затвердевания агарозного геля (этап 3.6-3.7). Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: 3-D рендеринг структуры всего мозга личинки рыбки данио-рерио (4 d.p.f.), мозг экспрессирует паннейрональный GCaMP7a. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: 3D-рендеринг активности нейронов всего мозга в мозге личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f.), экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Discussion
Текущий протокол позволяет in vivo визуализировать весь мозг личинок рыбок данио-рерио в течение длительного периода времени (например, более 1 часа) и визуализировать полученные данные структурной и функциональной визуализации.
Наиболее важными этапами являются монтаж и позиционирование образца. Во время заделки образца крайне важно предотвратить образование пузырьков и избежать попадания пыли в агарозный гель. Если гель содержит пузырьки воздуха и пыль, качество изображения может сильно ухудшиться. При позиционировании образца с помощью щипцов важно следить за тем, чтобы образец был ровным как по горизонтали, так и по вертикали. В противном случае интересующие области могут не содержаться в поле зрения микроскопа. Кроме того, это позиционирование должно быть выполнено в течение короткого промежутка времени до затвердевания агарозного геля, чтобы избежать повреждения его поверхности, поскольку такое повреждение ухудшает качество изображения.
Еще одна серьезная проблема заключается в том, чтобы избежать движения на изображениях, которые возникают из-за неполного затвердевания агарозного геля (рис. 6) и паралича рыбок данио. Когда яичная вода добавляется в образец до полного затвердевания геля агорсе, рыба медленно движется как в боковом, так и в осевом направлении, проявляясь в виде дрейфа образца на изображениях временных рядов (рис. 6А). Если доза паралитиков недостаточна или продолжительность эффекта заканчивается, образец может попытаться двигаться, что проявляется в виде быстрого подергивания на покадровых изображениях.
Несмотря на важность вышеупомянутых этапов для получения высококачественных изображений без артефактов движения, общедоступные протоколы 15,16,17,18,19 дают лишь краткий обзор экспериментальной процедуры, в которых отсутствуют эти детали. Например, изображения, полученные без протоколов11 иммобилизации, страдают от существенных артефактов движения, которые затрудняют последующий анализ изображений. Интегрируя основные компоненты, такие как затвердевание агарозного геля и парализация образца, наш протокол значительно повышает согласованность качества получаемых изображений при минимизации артефактов движения.
Таким образом, описана оптимизированная и воспроизводимая экспериментальная процедура визуализации мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo. Достоверность и воспроизводимость этого протокола для визуализации активности и структуры мозга in vivo были подтверждены в нескольких условиях 14,18,29,30,31. Настоящий рабочий процесс сосредоточен на визуализации всего мозга личинок рыбок данио, но он может быть легко применен для визуализации других органов личинок рыбок данио-рерио35,36.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Линии рыбок данио, используемые для визуализации кальция, были предоставлены Центром моделирования заболеваний рыбок данио-рерио (ZCDM), Корея. Это исследование было поддержано Национальным исследовательским фондом Кореи (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
| 15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
| 16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
| 50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
| Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
| Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
| Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
| Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
| Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
| NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
| Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
| Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
| Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
| Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
| Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |
References
- Choi, T. -Y., Choi, T. -I., Lee, Y. -R., Choe, S. -K., Kim, C. -H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Experimental & Molecular Medicine. 53 (3), 310-317 (2021).
- Ahrens, M. B., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Piatkevich, K. D., et al. A robotic multidimensional directed evolution approach applied to fluorescent voltage reporters. Nature Chemical Biology. 14 (4), 352-360 (2018).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Looger, L., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Biorxiv. , (2021).
- Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nature Methods. 10 (5), 413-420 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11 (7), 727-730 (2014).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12 (12), 1171-1178 (2015).
- Ahrens, M. B., Engert, F.
- Yoon, Y. -G., et al. Sparse decomposition light-field microscopy for high speed imaging of neuronal activity. Optica. 7 (10), 1457-1468 (2020).
- Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
- Cong, L., et al. Rapid whole brain imaging of neural activity in freely behaving larval zebrafish (Danio rerio). eLife. 6, e28158 (2017).
- Bruzzone, M., et al. Whole brain functional recordings at cellular resolution in zebrafish larvae with 3D scanning multiphoton microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 11048 (2021).
- Cho, E. -S., Han, S., Lee, K. -H., Kim, C. -H., Yoon, Y. -G. 3DM: deep decomposition and deconvolution microscopy for rapid neural activity imaging. Optics Express. 29 (20), 32700-32711 (2021).
- Zhang, Z., et al. Imaging volumetric dynamics at high speed in mouse and zebrafish brain with confocal light field microscopy. NatureBiotechnology. 39 (1), 74-83 (2021).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Current Biology. 23 (4), 307-311 (2013).
- Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233 (2), 329-346 (2001).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Morsch, M., et al. Triggering cell stress and death using conventional UV laser confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Parker, M. O., Brock, A. J., Millington, M. E., Brennan, C. H. Behavioral phenotyping of casper mutant and 1-pheny-2-thiourea treated adult zebrafish. Zebrafish. 10 (4), 466-471 (2013).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Han, S., Cho, E. -S., Park, I., Shin, K., Yoon, Y. -G. Efficient neural network approximation of robust PCA for automated analysis of calcium imaging data. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. , Springer International Publishing. 595-604 (2021).
- Shin, C., et al. Three-dimensional fluorescence microscopy through virtual refocusing using a recursive light propagation network. Medical Image Analysis. 82, 102600 (2022).
- Eom, M., et al. Statistically unbiased prediction enables accurate denoising of voltage imaging data. bioRxiv. , (2022).
- Johnston, L., et al. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (81), e51065 (2013).
- Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. Zenodo. , 3555620 (2022).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Voleti, V., et al. Real-time volumetric microscopy of in vivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0. Nature Methods. 16 (10), 1054-1062 (2019).
